1

POLITECHNIKA GDA ŃSKA

WYDZIAŁ CHEMICZNY

KATEDRA TECHNOLOGII CHEMICZNEJ

Ćwiczenia laboratoryjne

CHEMIA I TECHNOLOGIA MATERIAŁÓW BARWNYCH

ANALIZA I CHROMATOGRAFICZNE ROZDZIELANIE BARWNIKÓW ROŚLINNYCH

GDAŃSK ROK 2011

2

1. Cel ćwiczenia

Celem ćwiczenia jest zapoznanie Studentów ze strukturą i właściwościami ważnych,

powszechnie występujących w naturze barwników organicznych oraz nabycie przez

Studentów umiejętności izolacji tych związków z surowców roślinnych z

wykorzystaniem metod chromatograficznych.

2. Wprowadzenie

2.1. Karotenoidy

Wśród organicznych barwników naturalnych, w zależności od ich struktury, można

wydzielić kilka grup, np. barwniki: izoprenoidowe, porfirynowe, flawonoidowe,

betalainowe, chinoidowe i inne.

Przykładami barwnych związków naturalnych są karotenoidy . Karotenoidy należą do

barwników polienowych czyli mających sprzężony układ wiązań podwójnych. Są to

jednocześnie związki izoprenoidowe zbudowane z ośmiu jednostek izoprenowych

połączonych w ten sposób, że układ reszt izoprenowych jest odwrócony w środku

cząsteczki.

Karotenoidy obejmują karoteny – czterdziestowęglowe związki węglowodorowe oraz

ich pochodne zawierające grupy hydroksylowe, ketonowe a także modyfikowane w

inny sposób. Tlenowe pochodne karotenów to ksantofile . Karotenoidy występują

praktycznie we wszystkich roślinach i są kumulowane w organizmach wszystkich

zwierząt. Zidentyfikowano ponad 800 karotenoidów występujących w surowcach

naturalnych.

Sumaryczny wzór wszystkich karotenów jest taki sam - C40H56, są więc izomerami,

które różnią się liczbą pierścieni i liczbą podwójnych wiązań (jedno wiązanie

podwójne odpowiada zamknięciu jednego pierścienia).

W produktach naturalnych występuje mieszanina kilku do kilkudziesięciu

karotenoidów ale są też związki charakterystyczne (dominujące) dla danego

produktu. W marchwi takim dominującym związkiem jest β-karoten , w cząsteczce

którego występuje 11 wiązań podwójnych w układzie sprzężonym powodując, że

roztwór tego związku ma barwę żółtopomarańczową (krystaliczny jest

ciemnoczerwony lub brązowy) a maksima absorpcji w widmie UV-Vis występują przy

450 i 478 nm (w heksanie). β-Karoten jest najbardziej rozpowszechnionym

karotenoidem w produktach naturalnych.

3

β-karoten

Widmo UV-Vis β-karotenu

Dla pomidorów charakterystycznym karotenem jest likopen . Jest to

jaskrawoczerwony związek z niebieskawym odcieniem (λmax=443, 471 i 502 nm w

heksanie).

likopen

Widmo UV-Vis all-trans-likopenu (linia ciągła) i równowagowa mieszanina all-trans- i 13-cis-

likopenu (linia przerywana)

W owocach papryki występuje m.in. czerwony barwnik kapsantyna .

4

2.2. Chlorofile

Do najbardziej fundamentalnych barwników na Ziemi należą porfiryny . Podstawowy

szkielet cząsteczki stanowi układ 4 pierścieni pirolowych połączonych przez grupy

metinowe. Do barwników porfirynowych zaliczany jest chlorofil . Podstawowym

układem chromoforowym chlorofili a i b jest chloryna. Jest to porfiryna, w której

zewnętrzne wiązanie jednego z pierścieni jest uwodornione. Dla chlorofilu

charakterystyczne jest występowanie dwóch grup karboksylowych, z których jedna

jest zestryfikowana dwudziestowęglowym alkoholem terpenowym – fitolem, a druga

metanolem. Niebieskozielony chlorofil a przy C-3 ma grupę metylową a żółtozielony

b grupę formylową. W widmie UV-Vis charakterystyczne pasma absorpcji występują:

dla chlorofilu a przy 428 i 661 nm a dla chlorofilu b przy 453 i 642 nm (w eterze

dietylowym).

Chlorofile są związkami mało trwałymi, mogą ulegać szeregu przemianom. W

wyższych temperaturach, szczególnie w środowisku kwaśnym, „tracą” jon Mg2+.

Powstają oliwkowobrunatne feofityny a i b. Dodatkowo zachodzi hydroliza wiązań

estrowych. Natomiast w środowisku zasadowym zachodzi hydroliza wiązań

estrowych bez usuwania Mg2+. Powstające chlorofiliny zachowują barwę zieloną, a

ich sole (Na+, K+) są dobrze rozpuszczalne w wodzie. Charakterystyczną

właściwością chlorofilu jest możliwość wymiany jonów Mg2+ na jony innych metali.

Wymiana Mg(II) na Cu(II) lub Zn(II) powoduje zwiększenie stabilności zielonej barwy

chlorofilu.

Chlorofil jest podstawowym barwnikiem chloroplastów ale obok niego występują inne

barwniki, m.in. z grupy karotenoidów: karoteny i ksantofile (tlenowe pochodne

karotenów, np. luteina, wiolaksantyna czy neoksantyna).

5

Chlorofil a

Widma UV-Vis chlorofili: chlorofil a, ----- chlorofil b

6

2.3. Chromatografia kolumnowa

Chromatografia kolumnowa polega na rozdzielaniu mieszanin substancji

chemicznych poprzez wprowadzenie ich na stałą fazę stacjonarną (adsorbent)

umieszczoną w cylindrycznej kolumnie i rozdzieleniu jej na poszczególne składniki

przy użyciu ciekłej fazy ruchomej. Typowa kolumna chromatograficzna to rurka

szklana o stosunku średnicy do długości od ok. 1 : 15 do 1 : 60.

W kolumnie umieszcza się adsorbent. W chemii organicznej najczęściej stosowany

jest żel krzemionkowy (adsorbent silnie polarny). Na szczyt kolumny nanosi się

mieszaninę związków. Przez kolumnę przepuszcza się odpowiedni rozpuszczalnik

(zwany eluentem) lub mieszaninę rozpuszczalników i w wyniku istnienia różnic w sile

oddziaływań międzycząsteczkowych dla różnych związków pomiędzy składnikami

mieszaniny a fazą ruchomą oraz składnikami mieszaniny a fazą stacjonarną

następuje jej rozdzielenie na indywidualne substancje.

Związki polarne adsorbują się silniej na polarnych cząsteczkach żelu

krzemionkowego, dlatego gdy zastosujemy rozpuszczalnik mało polarny, będą

wymywane z kolumny później niż składniki mniej polarne.

Odpowiedni dobór rozpuszczalników ułatwia znajomość tak zwanego szeregu

eluotropowego , który polega na uszeregowaniu eluentów według wzrastającej mocy

elucyjnej (zależnej od stałej dielektrycznej rozpuszczalnika). Dla polarnych faz

stacjonarnych kolejność ta przedstawia się następująco:

n-pentan < n-heksan < cykloheksan < tetrachlorek w ęgla < toluen < chloroform

< dichlorometan < eter dietylowy < octan etylu < ac eton < etanol < metanol

Napełnianie kolumny

Sposób napełniania kolumny ma decydujący wpływ na poprawne rozdzielanie

substancji z użyciem chromatografii kolumnowej.

�Suchą kolumnę umieścić na statywie w pozycji pionowej. Przy wylocie kolumny

umieścić zlewkę lub kolbę stożkową do odbierania eluentu.

�Do zlewki wlać eluent i wsypać adsorbent.

�Zamieszać zawiesinę i zanim opadnie na dno, przelać do kolumny (napełnić

zawiesiną około 2/3 wysokości kolumny).

�Odczekać chwilę do „ubicia” się adsorbentu w kolumnie (ew. lekko postukać

wężykiem z PCW). W czasie napełniania kranik powinien być lekko otwarty.

7

� Spuścić eluent, aż do momentu gdy wysokość eluentu nad adsorbentem wyniesie

ok. 5 mm.

�Zamknąć kran.

Aplikacja próbki na kolumnę

�Próbka rozpuścić w możliwie jak najmniejszej ilości eluentu.

�Ostrożnie wprowadzić ją na warstwę adsorbentu.

�Następnie należy ostrożnie dodać eluent, tak by nie dopuścić do zmieszania się z

rozdzielaną próbką.

Rozwijanie kolumny i zbieranie frakcji

�Ostrożnie otworzyć kran.

�Dolewać rozpuszczalnik starając się utrzymywać stałą jego wysokość nad fazą

stacjonarną.

�Od dołu kolumny odbierać kolejne frakcje w kolbki stożkowe.

�Proces prowadzić do czasu aż wszystkie analizowane związki opuszczą kolumnę.

Należy zapami ętać, że nie nale ży dopu ścić do obni żenia si ę poziomu

rozpuszczalnika poni żej poziomu adsorbentu!

2.4. Chromatografia cienkowarstwowa

Rozdzielanie substancji może być zrealizowane również wtedy, gdy faza stacjonarna

jest w postaci cienkiej warstwy naniesionej na powierzchnię szkła, folii aluminiowej

lub z tworzywa sztucznego. Tak realizowaną chromatografię nazywa się

chromatografią cienkowarstwową (Thin Layer Chromatography – TLC) lub planarną. I

tu najczęściej stosowanym adsorbentem jest żel krzemionkowy. Zalety TLC to

prostota wykonania rozdzielania, niski koszt wyposażenia i wykonania, duża czułość,

duża szybkość rozwijania chromatogramów, możliwość kontrolowania stopnia

rozdzielenia substancji na każdym jego etapie, możliwość przechowywania płytek z

rozdzielonymi substancjami czy też możliwość zastosowania różnych metod detekcji.

Substancje wzorcowe oraz analizowaną mieszaninę nanosi się na płytkę

dopasowaną wielkością do wielkości komory chromatograficznej oraz ilości

analizowanych substancji, np. o wymiarach 4x8 cm, punktowo (za pomocą kapilary,

plamki powinny być jak najmniejsze), na linię startu zaznaczoną ołówkiem w

odległości 0,8-1,0 cm od dolnej krawędzi płytki. Między punktami nanoszenia

poszczególnych substancji powinna być zachowana odległość 1 cm. Skrajne plamy

8

startowe powinny znajdować się w odległości nie mniejszej niż 1 cm od brzegu płytki.

W przypadku rozcieńczonych roztworów nakłada się je kilkakrotnie w to samo

miejsce (susząc płytkę po każdej takiej operacji). Następnie płytkę wstawia się do

wcześniej przygotowanej komory chromatograficznej, w której znajduje się 0,5 cm

warstwa eluentu. Komora powinna być wysycona parami eluentu (tj. pozostawiona z

eluentem na kilka minut, korzystne jest również wyłożenie komory płatkiem bibuły, co

ułatwia wysycenie komory parami rozpuszczalników).

Chromatogram rozwija się poprzez wędrówkę cieczy w górę płytki, na skutek

działania sił kapilarnych. Gdy czoło eluentu osiągnie linię mety (ok. 1 cm od górnej

krawędzi płytki) chromatogram wyjmuje się z komory i suszy. Jeśli badane

substancje nie są barwne, należy chromatogram wywołać np. za pomocą

odpowiedniego odczynnika (powszechnie stosowane jest wywoływanie

chromatogramu w parach jodu). Dogodną metodą detekcji jest światło UV. Stosuje

się wówczas żel zawierający fluoryzujące dodatki.

Cechą każdej substancji identyfikowanej metodą TLC, w określonym układzie

chromatograficznym (adsorbent i faza ruchoma) jest tzw. współczynnik Rf (ang.

retardation factor), wyznaczany jako stosunek dróg przebytych jednocześnie przez

środek strefy migrującej substancji i czoło eluentu:

Rf =a

b=

dystans przebyty przez srodek plamki

dystans przebyty przez czolo fazy ruchomej

Sposób obliczania współczynnika Rf z chromatogramu

Porównanie wartości Rf substancji badanej i wzorca w kilku układach

chromatograficznych (przynajmniej trzech) stanowi podstawę do jej identyfikacji.

2.5. Literatura

1. H.T.Quach, R.L. Steeper, G. W. Griffin, J. Chem. Educ. 81, 3 (2004)

9

2. Ćwiczenia laboratoryjne z chemii bioorganicznej, Wyd. Uniwersytetu

Opolskiego, P. Kafarski, P. Wieczorek, Opole 1997

3. http://www.chem.uw.edu.pl/zcho/IIIrok/IZO/izolabB.pdf

4. Ćwiczenia z biochemii, L. Kłyszejko-Stefanowicz; Wydawnictwo Naukowe

PWN, Warszawa 1999

5. Chemia ogólna, Ćwiczenia Laboratoryjne, red. E. Luboch, M. Bocheńska,

J.F. Biernat, Wyd. PG, Gdańsk 2003

Zagadnienia , na które należy zwrócić szczególną uwagę przygotowując się do

zaliczenia ćwiczenia to:

• Budowa chemiczna takich barwnych związków naturalnych, jak: β-karoten, likopen i

w uproszczeniu chlorofil (układ porfirynowy). Jakie elementy struktury są

odpowiedzialne za barwność tych związków?

• Chromatografia kolumnowa i szereg eluotropowy rozpuszczalników.

• Technika chromatografii cienkowarstwowej, wyznaczanie współczynnika Rf.

3. Metodyka badawcza

W części praktycznej ćwiczenia studenci w największym stopniu będą wykorzystywali

techniki chromatograficzne (grawitacyjna, adsorpcyjna chromatografia kolumnowa,

chromatografia cienkowarstwowa) a także metody ekstrakcyjne, w celu wyizolowania

z surowców naturalnych barwnych substancji organicznych. Do zatężania i

odparowywania roztworów wykorzystają odparowywacz rotacyjny. Dodatkowo

zarejestrowane zostaną widma UV-Vis wyizolowanych i rozdzielonych substancji. W

tym celu wykorzystany zostanie spektrofotometr UNICAM UV300 series.

4. Wykonanie do świadcze ń

4.1. Wydzielanie i rozdzielanie barwników z papryki

5 g suchej, sproszkowanej papryki miesza się, silnie wstrząsając, ze 100 ml chlorku

metylenu przez ok. 15 min. Po usunięciu nierozpuszczalnej pozostałości z przesączu

usuwa się rozpuszczalnik za pomocą rotatora i sporządza widmo UV-Vis mieszaniny

produktów barwnych. Mieszaninę tą analizuje się za pomocą chromatografii

cienkowarstwowej, używając płytek pokrytych żelem krzemionkowym. Chromatogram

dodatkowo wywołuje się parami jodu.

10

Rozdzielania mieszaniny dokonuje się za pomocą chromatografii kolumnowej. W tym

celu do kolumny wlewa się mieszaninę żelu krzemionkowego w chlorku metylenu. Po

przygotowaniu kolumny na jej szczyt nanosi się mieszaninę barwników papryki w 2

ml chlorku metylenu i prowadzi się elucję tym rozpuszczalnikiem. Zbiera się

poszczególne barwne frakcje i bada ich czystość za pomocą chromatografii

cienkowarstwowej i spektrofotometrii UV-Vis.

4.2. Wydzielanie i rozdzielanie barwników ze szpina ku

a). Próbkę rozmrożonego szpinaku należy dobrze odcisnąć między warstwami

bibuły. Odważyć 10 g odciśniętego szpinaku i umieścić go w moździerzu. Dodać do

niego ok. 15 g bezwodnego siarczanu magnezu (w celu usunięcia reszty wody) i

ucierać ok. 10 minut aż do uzyskania pudrowej, gładkiej konsystencji szpinaku

(dokonujemy w ten sposób mechanicznej lizy komórek roślinnych, co ułatwi

ekstrakcję barwników). Po uzyskaniu jasnozielonej mieszaniny, zawartość

moździerza należy przenieść do zlewki i dobrze rozmieszać z ok. 40 ml acetonu.

Odstawić na ok. 10 minut, aby osad mógł swobodnie opaść. Następnie należy

zdekantować warstwę acetonową do przygotowanej kolbki okrągłodennej (niewielką

ilość mieszaniny należy przenieść do fiolki i wykorzystywać tą próbkę do analizy

chromatograficznej TLC) i rozpuszczalnik odparować na rotatorze „do sucha” w

możliwie niskiej temperaturze. Pozostałość rozpuścić w ok. 2 ml acetonu i nanieść na

szczyt kolumny chromatograficznej wypełnionej żelem krzemionkowym w eterze

naftowym. Kolumnę eluować eterem naftowym, który wymyje z niej karoteny (można

też zastosować mieszaninę eter naftowy- aceton 20:1).

Gdy eluat stanie się bezbarwny, należy wymienić odbieralnik i wyeluować chlorofile

za pomocą acetonu. Następnie należy zbadać skład poszczególnych frakcji

(mieszanina nanoszona na kolumnę, poszczególne frakcje z kolumny i wzorcowy β-

11

karoten) za pomocą chromatografii cienkowarstwowej (obliczyć wartość Rf dla

poszczególnych barwnych plam) i poddać je analizie spektrofotometrycznej.

Przykładowy chromatogram początkowej mieszaniny, w układzie eter etylowy:

cykloheksan : octan etylu : aceton : metanol (60:16:10:10:4), pokazano poniżej:

Przykładowe, literaturowe wartości Rf barwników liści w układzie heksan:aceton (7:3)

Barwnik Barwa Warto ść Rf

β-karoten żółto-pomarańczowy 0,91

Feofityna szary 0,75

chlorofil a niebiesko-zielony 0,63

chlorofil b zielony 0,58

ksantofile żółte 0,53; 0,47; 0,32

b). 10 g odciśniętych liści mrożonego szpinaku ucierać w moździerzu

porcelanowym z 20 ml acetonu. Acetonową zawiesinę przesączyć. Operację

ucierania powtórzyć jeszcze dwukrotnie. Połączone ekstrakty acetonowe

przenieść do rozdzielacza i ekstrahować kilkakrotnie eterem naftowym.

Oddzielone frakcje eteru naftowego przenieść ponownie do rozdzielacza i

przemyć je dwukrotnie małymi porcjami wody. Oddzielić warstwę organiczną i

wysuszyć ją MgSO4 lub Na2SO4. Osuszony roztwór barwników zatężyć

odparowując rozpuszczalnik na rotatorze i nanieść go na kolumnę

chromatograficzną. Dalej postępować jak w punkcie a).

4.3. Otrzymywanie kompleksu feofityny z miedzi ą

Inne proponowane układy do rozdzielania:

- heksan : aceton 70 : 30

- i-oktan : aceton : eter naftowy 60 : 20 : 20

- cykloheksan : aceton : eter naftowy 50 : 25 : 25

12

Pocięte na paski liście ogrzewać w 10% roztworze kwasu octowego zawierającym

chlorek miedzi. Równolegle ogrzewać liście tylko w roztworze kwasu octowego

(próba kontrolna). Obserwować zmiany zachodzące w obu roztworach.

4.4. Rozdzielanie barwników zawartych w koncentraci e

pomidorowym (likopen i β-karoten) metod ą TLC

a). Ok. 10 g koncentratu pomidorowego umieścić w rozdzielaczu, do którego wlano

uprzednio ok. 50 ml chlorku metylenu. Wyekstrahować barwniki do fazy organicznej i

odebrać ją do kolbki okrągłodennej o pojemności 100 ml. Rozpuszczalnik odparować

na rotatorze. Do pozostałości dodać niewielką ilość chlorku metylenu i zanalizować

jej zawartość metodą TLC odnosząc dodatkowo na płytce wzorzec β-karotenu

(dobrać odpowiedni układ chromatograficzny).

b). Na płytkę do preparatywnej TLC o wielkości 20x20cm nałożyć pasmowo

uzyskany w punkcie a) roztwór i rozwijać w dużej komorze chromatograficznej w

dobranym w punkcie a) układzie. Po wysuszeniu płyty wyskrobać pasmo

wytypowane jako likopen i odmyć żel krzemionkowy chlorkiem metylenu. Roztwór

zanalizować wykonując TLC oraz widmo UV-Vis. Porównać uzyskane widmo z

widmem literaturowym.

5. Opracowanie wyników

W sprawozdaniu należy podać wzory strukturalne barwnych związków naturalnych,

które były przedmiotem wykonywanych ćwiczeń, opisać te ćwiczenia (łącznie z

zamieszczeniem schematycznych rysunków uzyskanych chromatogramów). Omówić

skuteczność rozdzielania barwników przy użyciu chromatografii kolumnowej na

podstawie wykonanej analizy TLC. Krótko omówić uzyskane widma UV-Vis (sczytać

maksima absorpcji i porównać widma z literaturowymi).