i

MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO

UNIDADE ACADÊMICA ESPECIALIZADA EM CIÊNCIAS AGRÁRIAS - UAECIA

ESCOLA AGRÍCOLA DE JUNDIAÍ - EAJ

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FLORESTAIS

POTENCIAL ANTICARIOGÊNICO DE TANINOS DE ESPÉCIES FLORESTAIS

SARAH REBEKA RODRIGUES MARQUES

Macaíba/RN

Julho de 2020

ii

SARAH REBEKA RODRIGUES MARQUES

POTENCIAL ANTICARIOGÊNICO DE TANINOS DE ESPÉCIES FLORESTAIS

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de

Pós-Graduação em Ciências Florestais da

Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como

parte das exigências para obtenção do título de Mestre

em Ciências Florestais (Área de Concentração em

Ciências Florestais - Linha de Pesquisa: Tecnologia e

Utilização de Produtos Florestais).

Orientador:

Profa. Dra. Tatiane Kelly Barbosa de Azevêdo Carnaval

Coorientador:

Profa. Dra. Aline Castilho

Faculdade de Odontologia de Piracicaba - UNICAMP

Macaíba/RN

Julho de 2020

iii

Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN

Sistema de Bibliotecas - SISBI

Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial Prof. Rodolfo H

elinski - Escola Agrícola de Jundiaí - EAJ

Marques, Sarah Rebeka Rodrigues.

Potencial anticariogênico de taninos de especies florestais /

Sarah Rebeka Rodrigues Marques. - 2020.

60f.: il.

Dissertação (Mestrado) Universidade Federal do Rio Grande do

Norte, Unidade Acadêmica Especializada em Ciências

Agrárias,Programa de Pós-Graduação em Ciências Florestais,

Macaíba, RN, 2020.

Orientador: Profa. Dra. Tatiane Kelly Barbosa de Azevêdo

Carnaval.

1. Taninos Vegetais - Dissertação. 2. Substâncias Bioativas -

Dissertação. 3. Atividade Antimicrobiana - Dissertação. 4. Cáries

Dentárias - Dissertação. 5. Bactérias Cariogênicas - Dissertação.

I. Carnaval, Tatiane Kelly Barbosa de Azevêdo. II. Título.

RN/UF/BSPRH CDU 581.4

Elaborado por Valéria Maria Lima da Silva - CRB-15/451

iv

POTENCIAL ANTICARIOGÊNICO DE TANINOS DE ESPÉCIES FLORESTAIS

SARAH REBEKA RODRIGUES MARQUES

Dissertação julgada para obtenção do título de Mestre em Ciências Florestais (Área de

Concentração em Ciências Florestais - Linha de Pesquisa: Tecnologia e Utilização de

Produtos Florestais) e aprovada pela banca examinadora em 31 de julho de 2020.

Banca Examinadora

________________________________________________

Profa. Dra. Tatiane Kelly Barbosa de Azevêdo Carnaval

UAECIA/UFRN

Presidente

________________________________________________

Profa. Dra. Renata Martins Braga

UAECIA/UFRN

Examinador interno

________________________________________________

Prof. Dr. Leandro Calegari

UAEF/UFCG

UNIVERSIDADE FEDERAL DE CAMPINA GRANDE

Examinador externo ao programa

Macaíba/RN

Julho de 2020

v

Ao meu pequeno Dante,

Aos meus pais,

Aos meus irmãos,

DEDICO

vi

AGRADECIMENTOS

Agradeço ao universo por ter me trazido até aqui e pela oportunidade de evoluir

diariamente.

Aos meus pais, pelo imensurável apoio, por serem minha eterna fonte de inspiração.

Aos meus irmãos Bárbara e Charles, meus melhores amigos, os melhores

companheiros que a vida poderia ter me presenteado para compartilhar a vida.

Ao meu amado filho Dante, que me ensina tanto e me inspira ser uma pessoa melhor

a cada dia.

À Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN) e a Coordenação de

Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela oportunidade de realizar esse

estudo.

A todos do Programa de Pós-graduação em Ciências Florestais da UFRN pelo apoio.

Ao Departamento de Odontologia Infantil da Universidade Estadual de Campinas

(UNICAMP) pela ajuda na realização dos testes.

À professora Aline, pela disponibilidade em colaborar com este trabalho.

A todos os colegas do grupo de trabalho em tecnologia da madeira, “os filhos de Tati”

pela ajuda e companheirismo de sempre.

À professora Tatiane, pela profissional e pessoa incrível que é, que acreditou em mim

e se dispôs a ajudar em tudo que fosse possível.

vii

RESUMO

_________________________________________________________________________

POTENCIAL ANTICARIOGÊNICO DE TANINOS DE ESPÉCIES FLORESTAIS

Estudar os compostos provenientes do metabolismo secundário das plantas pode aumentar

a nossa capacidade de entender o potencial farmacológico da flora tropical. A presença de

taninos desperta interesse farmacêutico em diversas espécies vegetais, partindo-se do

princípio do uso popular, e das suas propriedades antimicrobiana, antioxidante, antiviral e

antitumoral dos taninos, que já são bastante conhecidas e documentadas. Este estudo

objetivou extrair, quantificar, caracterizar quimicamente e verificar se há atividade

antibacteriana frente à micro-organismos de importância odontológica em taninos extraídos

das cascas de quatro espécies florestais cultivadas em região semiárida brasileira: Acacia

mangium Willd., Azadirachta indica A. Juss Mimosa tenuiflora Willd, Mimosa caesalpiniifolia

Benth.. As extrações foram realizadas em água quente e foram determinados o teor de sólidos

totais (TST), índice de Stiasny (IS) e o teor de taninos condensados (TTC). Foi realizada a

caracterização química dos extratos mediante espectrometria de infravermelho com

transformada de Fourrier. A avaliação da atividade antibacteriana foi realizada por meio de

ensaio de Concentração Inibitória Mínima (CIM) para as espécies Streptococcus

mutans (UA159), Lactobacillus acidophilus (ATCC IAL523), Lactobacillus casei (ATCC 193)

e Candida albicans (SC5314). A quantificação dos extratos mostrou que M. tenuiflora e A.

mangium apresentaram maiores percentuais de TTC (23,40% e 12,41%, respectivamente),

indicando potencial para produção de taninos em escala industrial. Embora a M.

caesalpiniifolia tenha apresentado baixo TTC (8,38%), esta espécie apresentou alto IS

(91,27%), caracterizando-se pelo alto grau de pureza em seus taninos. Nenhum extrato

avaliado apresentou atividade inibitória contra os microrganismos testados (CIM> 2500

µg/mL). Embora tenha sido possível observar a partir do FTIR um perfil fitoquímico preliminar

dos extratos, como a presença de compostos polifenólicos complexos, a ausência de

atividade antimicrobiana para as espécies testadas pode estar relacionada à uma combinação

de fatores, como a presença de fitoquímicos com diferentes polaridades, e a características

taxonômicas especificas dos micro-organismos testados.

Palavras-chave: taninos vegetais, substâncias bioativas, atividade antimicrobiana, cáries

dentárias, bactérias cariogênicas.

viii

ABSTRACT

__________________________________________________________________________

ANTICARIOGENIC POTENTIAL OF TANNINS OF FOREST SPECIES

The study of compounds from secondary plant metabolism can increase our ability to

understand the pharmacological potential of tropical flora. The presence of tannins arouses

pharmaceutical interest in several plant species, based on the principle of popular use, and

their antimicrobial, antioxidant, antiviral and anti-tumor properties of tannins, which are already

well known and documented. This study aimed to extract, quantify, characterize chemically

and check for antibacterial activity against microorganisms of dental importance in tannins

extracted from the bark of four forest species cultivated in the Brazilian semiarid region: Acacia

mangium Willd., Azadirachta indica A. Juss Mimosa tenuiflora Willd, Mimosa caesalpiniifolia

Benth .. The extractions were carried out in hot water and the total solids content (TST), Stiasny

index (IS) and the condensed tannin content (TTC) were determined. The chemical

characterization of the extracts was carried out using infrared spectrometry with Fourrier

transform. The evaluation of antibacterial activity was performed using the Minimum Inhibitory

Concentration (MIC) assay for the species Streptococcus mutans (UA159), Lactobacillus

acidophilus (ATCC IAL523), Lactobacillus casei (ATCC 193) and Candida albicans (SC5314).

The quantification of the extracts showed that M. tenuiflora and A. mangium presented higher

percentages of TTC (23.40% and 12.41%, respectively), indicating the potential for tannin

production on an industrial scale. Although M. caesalpiniifolia had a low TTC (8.38%), this

species showed a high IS (91.27%), characterized by a high degree of purity in its tannins. No

evaluated extract showed inhibitory activity against the tested microorganisms (MIC> 2500 µg

/ mL). Although it was possible to observe from the FTIR a preliminary phytochemical profile

of the extracts, such as the presence of complex polyphenolic compounds, the ausence of

antimicrobial activity for the species tested may be related to a combination of factors that can

inhibit antimicrobial activity, such as presence of other phytochemicals with different polarities.

Key words: natural tannins, bioactive substances, antimicrobial activity, dental caries,

cariogenics bacterias.

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ............................................................................................................... 7

2. REVISÃO DE LITERATURA .......................................................................................... 9

2.1. CONSIDERAÇÕES SOBRE OS TANINOS ............................................................. 9

2.2. ESPÉCIES PRODUTORAS DE TANINOS ............................................................ 10

2.2.1. Acacia mangium (Willd) .................................................................................. 11

2.2.2. Mimosa tenuiflora (Willd.) ............................................................................... 14

2.2.3. Mimosa caesalpiniifolia Benth. ........................................................................ 16

2.2.4. Azadirachta indica A. Juss. ............................................................................. 18

2.3. CARACTERÍSTICAS QUÍMICAS DOS TANINOS VEGETAIS ............................... 19

2.3.1. Taninos hidrolisáveis ....................................................................................... 20

2.3.2. Taninos Condensados .................................................................................... 22

2.4. USO DE TANINOS PARA FINS FARMACOLÓGICOS ........................................... 23

2.5. CÁRIE DENTÁRIA ................................................................................................. 25

3. MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................................. 29

3.1 Material botânico ........................................................................................................ 29

3.2 Extrações dos taninos ................................................................................................ 29

3.2.1 Teor de sólidos totais (TST) ................................................................................. 30

3.2.2 Teor de taninos condensados (TTC) e Indice de Stiasny (IS) ............................... 30

3.3 FTIR ........................................................................................................................... 31

3.4 Ensaios antimicrobianos ............................................................................................. 31

3.4.1 Microorganismos testados ................................................................................... 31

3.4.2 Preparação dos extratos ...................................................................................... 31

3.6 Delineamento experimental e análise estatística ........................................................ 33

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................................... 34

4.1 Extração e quantificação dos taninos ......................................................................... 34

4.2 FTIR ........................................................................................................................... 36

4.3 Concentração Inibitória Mínima (CIM) ........................................................................ 41

5. CONCLUSÕES ............................................................................................................ 43

6. LITERATURA CITADA ................................................................................................. 44

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 – Aspecto morfológico do fuste (a), folha, flor (b) e árvore (c) de Acacia mangium

(Willd) ................................................................................................................................................... 13

Figura 2 – Aspecto morfológico de árvore (a) e folha (b) de Mimosa tenuiflora (Willd.) ... Erro!

Indicador não definido.

Figura 3 – Aspecto morfológico de fuste (a) e folhas (b) de Mimosa caesalpiniifolia Benth. 17

Figura 4- Aspecto morfológico de tronco (a), arvore (b) e folha (c) de Azadirachta indica A.

Juss. ..................................................................................................................................................... 19

Figura 5 - Estrutura química do galotanino (A) e elagitanino (B) ............................................... 21

Figura 6 - Estrutura do flavanóide percursor dos taninos condensados. R1, R2, R3 e R4

são radicais que podem ser compostos por grupo hidroxila ou átomo de hidrogênio ............ 22

Figura 7 - . Representação da organização da placa de microdiluição de 96 poços para a

determinação da concentração inibitória mínima. E20% = etanol a 20%; E30% = etanol a

30%; D = Dimetilsulfoxido (DMSO); AD = Água destilada. .......................................................... 33

Figura 8- Espectro FTIR dos extratos tânincos de Acacia mangium Willd., Azadirachta indica

A. Juss, Mimosa tenuiflora Willd, e Mimosa caesalpiniifolia Benth. ........................................... 37

Figura 9 - Espectro FTIR dos extratos tânincos de Acacia mangium Willd., Azadirachta

indica A. Juss, Mimosa tenuiflora Willd, e Mimosa caesalpiniifolia Benth. ................................ 39

Figura 10 - Determinação da concentração inibitória mínima (CIM) das substâncias tânicas

frente as linhagens de microrganismos cariogênicos. Em que: (-)= Crescimento bacteriano;

(+)= Efeito inibitório do extrato; A= A. mangium; B= A. indica; C= M. tenuiflora; D= M.

caesalpiniifolia; 1= Streptococcus mutans; 2= Lactobacillus acidophilus; 3= Lactobacillus

casei; 4= Candida albicans; E20% = Etanol a 20%; E30%= Etanol a 30%; D=

Dimetilsulfoxido; AD= Água destilada. ............................................................................................ 41

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - TST, I e TTC (%) dos taninos de Acacia mangium Willd., Azadirachta indica A.

Juss Mimosa tenuiflora Willd, e Mimosa caesalpiniifolia Benth ................................................. 34

Tabela 2 - Resumo das atribuições dos picos dos espectros de FTIR dos taninos de Acacia

mangium Willd. (Acacia), Azadirachta indica A. Juss (Nim), Mimosa tenuiflora Willd (JP), e

Mimosa caesalpiniifolia Benth (Sabia) ............................................................................................ 40

7

1. INTRODUÇÃO

A carie dentária é uma patologia bucal biofilme dependente, infecciosa, multifatorial e

complexa, considerada como epidemia mundial e grave questão de saúde pública, devido a

seu impacto sobre os indivíduos e a sociedade, dos custos para o tratamento e de sua taxa

de prevalência. No Brasil, o índice de prevalência desta doença é de 2,1%, o que evidencia a

necessidade de alternativas terapêuticas. (PITTS e ZERO, 2016)

Detergentes catiônicos (clorexidina), têm sido comumente utilizados para tratamento de

cárie, de maneira a inibir o mecanismo de formação e crescimento do biofilme dental

(ARAUJO et al., 2018). Porém, além de possuírem efeitos colaterais como pigmentação nos

dentes, desequilíbrio da microbiota e alteração do paladar (MACÊDO-COSTA et al., 2009),

muitas vezes apresentam resistência microbiana, o que se tornou um grave problema de

saúde pública nas últimas décadas (OBEROI et al., 2015), o que motiva a busca por novas

substâncias com potencial antimicrobiano, principalmente as de origem natural, como os

taninos.

Taninos são substâncias fenólicas que possuem a propriedade de se associar, se

combinar e formar complexos insolúveis em água com proteínas e alcaloides (PIZZI, 1993a),

sendo considerados um dos mais abundantes metabólitos secundários do reino vegetal em

todo o mundo. Essas substâncias são encontradas em diversas partes do vegetal e, de

maneira geral, encontradas em maiores concentrações no cerne e na casca. São classificados

segundo sua estrutura química em hidrolisáveis ou condensados (MONTEIRO et al., 2005).

Nas plantas, a função biológica destes compostos reside principalmente em suas capacidades

defensivas contra herbívoros (HAUKIOJA, 1991).

Embora haja no Brasil várias espécies potencialmente produtoras de taninos,

pouquíssimas delas são cultivadas para esse fim. As espécies tradicionalmente exploradas

para a produção de taninos são o quebracho (Schinopsis sp.), de ocorrência na Argentina e

Paraguai, e a acácia-negra (Acacia mearnsii), que é a espécie florestal que mais se destaca

como produtora de tanino vegetal no Brasil, cultivada no Estado do Rio Grande do Sul (IBGE,

2017; AZEVÊDO et al., 2018).

Dentre diferentes formas de aplicações dos taninos, podem-se citar: dispersante no

controle da viscosidade de argilas na perfuração de poços das indústrias de petróleo,

fabricação de adesivos e tintas para madeiras e derivados, tratamento de água, curtimento de

pele animal, entre diversos outros usos (RUTLEDGE; ANDERSON, 2016; GREHS et al., 2019;

ANTOV et al., 2020; GUO et al., 2020)

Os taninos também são considerados substâncias bioativas, motivo pela qual a sua

presença desperta interesse farmacêutico em várias espécies vegetais, partindo-se do

8

princípio do uso popular. As suas propriedades antimicrobiana, antioxidante, antiviral e

antitumoral são bem conhecidas e documentadas (SAHAKYAN et al., 2020). Desse modo,

podem ser utilizados como fitoterápicos - que usam substâncias ativas de plantas e são

popularmente utilizados como alternativa eficaz para tratar diversas doenças, incluindo

patologias bucais (CARTAXO-FURTADO et al., 2017; CASTILHO et al., 2007; PEREIRA et al.,

2016).

Nesse panorama, as propriedades terapêuticas das plantas medicinais e a

possibilidade de extrair e isolar delas substâncias bioativas como os taninos, torna-se uma

promissora fonte de estudos para a diversificação de alternativas terapêuticas e possível

utilização em produtos de higiene bucal, o que representaria uma possibilidade eficaz para

controlar a formação de biofilme dental. (FREIRES et al, 2015).

Dessa forma, este estudo objetivou extrair, quantificar, caracterizar quimicamente e

verificar se há atividade antimicrobiana frente à micro-organismos de importância

odontológica em taninos extraídos das cascas de quatro espécies florestais cultivadas em

região semiárida brasileira: Acacia mangium Willd., Azadirachta indica A. Juss Mimosa

tenuiflora Willd, e Mimosa caesalpiniifolia Benth..

9

2. REVISÃO DE LITERATURA

2.1. CONSIDERAÇÕES SOBRE OS TANINOS

Os compostos fenólicos são um vasto grupo de metabólitos secundários encontrados

em todo o reino vegetal, englobando subgrupos como taninos, flavonóides, entre outros. Os

taninos formam estruturalmente o grupo mais complexo de polifenóis (SUVANTO et al., 2017),

possuindo uma grande importância econômica e ecológica. Segundo Pizzi (1993a), os taninos

são substâncias fenólicas que possuem a propriedade de se associar, se combinar e formar

complexos insolúveis em água com proteínas e alcaloides, sendo este atributo considerado a

base das suas propriedades “tanantes”. A palavra tanino é originalmente derivada deste termo

e se refere ao processo de curtimento da pele de animais, em alusão à capacidade que os

taninos têm de reagir com o colágeno e produzir couro, de acordo com Vermerris e Nicholson

(2006).

Os taninos vegetais apresentam peso molecular entre 500 e 20.000 Da (JORGE et al.,

2001). Segundo sua estrutura química, são classificados como hidrolisáveis e condensados.

Os taninos hidrolisáveis são fragmentados por enzimas e consistem em ésteres de ácidos

gálicos e ácidos elágicos glicolisados (MONTEIRO et al., 2005). Já os taninos condensados

– ou protocianidinas – são compostos por monômeros do tipo catequina conhecidos por

flavonoides (PIZZI, 1993b; AZEVÊDO, et al., 2015).

Os taninos naturais são encontrados em diversas partes do vegetal, sendo

observadas, de modo geral, maiores concentrações no cerne e na casca. Ocorre também em

tecidos foliares, gemas, tecidos de sementes, bem como em raízes (ASHOK; UPADHYAYA,

2012). A concentração desse material nos tecidos vegetais depende da idade e tamanho da

planta, da parte coletada, da época ou, ainda, do local de coleta (TEIXEIRA et al., 1990;

LARCHER, 2000). A estrutura dos taninos é variável e determinada por uma combinação de

fatores, como aqueles de sitio, genéticos, entre outros. Suas propriedades variam entre

diferentes espécies ou dentro da mesma espécie, dependendo do tecido vegetal (MORI,

2001).

Na presença de água, os taninos formam soluções coloidais que apresentam reação ácida

e forte sabor adstringente. Ademais, essas substâncias se associam às glucoproteínas

salivares, ocasionando a perda do poder lubrificante e tornando o material amargo,

adstringente e impalatável aos organismos fitófagos. (MONTEIRO et al., 2005; FERRAO,

2003), características que lhe conferem a função de inibir herbívoros.

10

2.2. ESPÉCIES PRODUTORAS DE TANINOS

Segundo Santos e Mello (1999), a ocorrência dos taninos é comum em angiospermas

e gimnospermas, principalmente em plantas lenhosas. Zucker (1983) acrescenta que os

taninos se encontram amplamente distribuídos nas plantas superiores, ocorrendo em

aproximadamente 30% das famílias, podendo representar de 2 a 40% da massa seca da

casca de várias espécies florestais.

Apesar dos taninos serem encontrados com maior frequência entre as espécies de

angiospermas, nas gimnospermas também existem alguns gêneros produtores destas

moléculas, como Pinus, Picea e Tsuga (SILVA, 2001). Entre as monocotiledôneas, os taninos

são pouco observados, sendo a família Palmaceae uma exceção, visto que tais substâncias

são encontradas em algumas espécies. Em dicotiledôneas são observadas as maiores

quantidades de taninos, sendo as famílias mais notáveis: Fabaceae, Anacardiaceae,

Combretaceae, Rizoforaceae, Mirtaceae e Poligonaceae. A família Miristicaceae se destaca,

em virtude dos tubos taníferos distintivos observados nos raios das madeiras de todas as

espécies (SILVA, 2001).

As espécies tipicamente exploradas para a produção comercial de taninos são o

quebracho (Schinopsis sp.) de ocorrência na Argentina e Paraguai, que possui em média 25%

da massa seca do cerne em taninos, e a acácia-negra (Acacia mearnsii), que segundo

Azevêdo et al. (2018) é a espécie exótica que mais se destaca como produtora de tanino

vegetal no Brasil. A casca desta espécie, de ocorrência natural na Austrália (HASLAM, 1966;

PANSHIN et al., 1962), apresenta aproximadamente 39% de taninos condensados

(CALEGARI et al., 2016) e é largamente cultivada em diversas regiões do Estado do Rio

Grande do Sul, atingindo no ano de 2016 uma produtividade de 195.913 t de casca para

produção de taninos (IBGE, 2017).

Haslam (1966) alude também como espécies produtoras de taninos o Eucalyptus

astringens, cuja casca contem entre 40 e 50% de taninos, o mangue-vermelho Rhizophora

candelaria, o mangue-branco Rhizophora mangle, cuja casca contém entre 20 a 30% de

taninos. Há também as espécies barbatimão (Stryphnodendron adstringens) (MORI et al.,

2003), angico branco (Anadenanthera colubrina), angico vermelho (Anadenanthera peregrina)

(MOTA, 2017), Tachigali aurea (SOUSA, 2015), aroeira (Myracrodruon urundeuva),

(QUEIROZ et al., 2002) e Astronium fraxinifolium (LORENZI, 1992).

Na região Nordeste do Brasil, o angico-vermelho (Anadenanthera colubrina var. cebil

(Griseb.) Altschul), utilizado nos curtumes tradicionais locais, é a única fonte de taninos (PAES

et al., 2006a). Segundo o IBGE (2017), no ano de 2017 foram produzidas 58 toneladas de

casca desta espécie. A prática da extração dos taninos nessa região é considerada uma

11

atividade predominantemente extrativista, uma vez que, segundo Azevêdo et al. (2017),

ocorre sem o manejo adequado e, na maioria das vezes, mata as árvores em função de seu

anelamento no momento da coleta da casca. Tal atividade pode levar ao esgotamento da

espécie e, como citam Paes et al. (2006b), esta espécie está desaparecendo do semiárido

brasileiro.

Motivados pela busca de alternativas para a redução da pressão sobre o angico

vermelho, pesquisadores estão constatando nas espécies nativas do bioma Caatinga,

possíveis produtoras de taninos vegetais (PAES et al., 2006a; CALEGARI et al., 2016;

AZEVÊDO et al., 2018). Diversas espécies estão sendo estudadas, tais como a jurema-preta

(Mimosa tenuiflora (Willd.) Poir.), cajueiro (Anacardium occidentale L,), jurema-vermelha

(Mimosa arenosa (Willd.) Poir.), sabiá (Mimosa caesalpiniifolia Benth.), entre outras. A espécie

Acacia mangium (Willd.), apesar de ser exótica, vem sendo bastante cultivada em plantios

florestais para fins madeireiros, apresentando uma boa adaptação à Caatinga. Esta espécie

apresenta expressiva quantidade de taninos condensados (20,41%) (UCELLA FILHO et al.,

2017), podendo ser uma alternativa viável para a produção de taninos em larga escala.

2.2.1. Acacia mangium (Willd)

A família Fabaceae é a terceira maior família de angiospermas, com 727 gêneros

catalogados e aproximadamente 20 mil espécies descritas, que variam desde pequenas ervas

transitórias até árvores de grande porte (ILDIS, 2018). Essa família apresenta uma ampla

distribuição geográfica, sendo encontrada em praticamente todos os continentes, segundo

Queiroz et al. (2009). No Brasil, esta família está amplamente distribuída, com cerca de 3200

espécies disseminadas em 176 gêneros (ILDIS, 2018), ocorrendo muitas vezes em sítios

abertos e degradados, o que indica que são bem adaptadas a condições precárias. Dessa

forma, é considerada uma das famílias de maior diversidade nos biomas do pais.

A Fabaceae é constituída por três subfamílias: Caesalpinoidae, Mimosoidae,e

Papilionoidae, sendo a última a maior destas, com aproximadamente dois terços de todos os

gêneros e espécies, ocorrendo em regiões temperadas, sendo a maior parte das espécies

herbáceas (ILDS, 2018). A maioria dos indivíduos de Caesalpinoidae e Mimosoidae são

árvores e arbustos tropicais e subtropicais (ILDIS, 2018).

O gênero Acacia compreende cerca de 1.300 espécies largamente distribuídas nas

regiões tropicais e subtropicais do globo, sendo a maioria pioneiras, de rápido crescimento,

adaptáveis aos mais variados tipos de solo. A maioria das espécies é observada no hemisfério

sul e o principal centro de diversidade é a Austrália. Este gênero ocorre naturalmente em

vários continentes, exceto na Europa e na Antártida (RODRIGUES et al. 2008; FOREST

12

RESEARCH INSTITUTE, 2018). Em seu ambiente natural, ocorrem em agrupamentos puros

e densos, sugerindo que podem ser plantadas em monoculturas sem problemas sérios de

pragas e doenças (NATIONAL RESEARCH COUNCIL, 1983).

Acacia mangium Willd., pertence à familia Fabaceae, e subfamília Mimosoideae, é

oriunda de florestas tropicais úmidas do nordeste da Austrália, Papua Nova Guiné e das Ilhas

Molucas do leste da Indonésia, sendo uma das espécies arbóreas mais utilizadas em

programas silviculturais em toda a Ásia e Pacífico (KRISNAWATI et al., 2011). Suas

propriedades desejáveis incluem o rápido crescimento, boa qualidade da madeira, tolerância

a solos ácidos e pobres em nutrientes, além de ser uma espécie fixadora de nitrogênio

(MATSUBARA e OHTA, 2015).

Segundo Krisnawati et al. (2011), as árvores de Acacia mangium podem crescer até

aproximadamente 30 m, apresentando fuste reto com ramificações que começam acima da

metade da altura total. Em sítios relativamente pobres, os indivíduos podem parecer um

grande arbusto com uma altura média entre 7 e 10 m, enquanto em seu habitat natural, atinge

de 25 a 30 m de altura. Essa espécie é capaz de produzir madeira de excelente qualidade,

com crescimento de aproximadamente 5 m³ / ano, possuindo interesse apícola e tanino de

boa aceitação no mercado nacional e internacional (CASTRO, 2017). A casca em árvores

jovens é lisa e esverdeada e fissuras começam a se desenvolver entre 2 ou 3 anos. Em

plantas mais velhas, a casca é áspera, dura e com fissuras perto da base, apresentando

coloração entre marrom e marrom-escuro.

13

Figura 1 – Aspecto morfológico de folhas (a), casca (b), árvore (c) e flor (d) de

Acacia mangium (Willd)

Fonte: FOREST RESEARCH INSTITUTE, online

Esta espécie tem apresentado capacidade expressiva de adaptação às condições

edafoclimáticas brasileiras, sendo, por isso, bastante utilizada em programas de recuperação

de áreas degradadas. Além disso, vem sendo cultivada em plantios destinados à produção de

lenha, polpa para celulose, madeira para construção e movelaria, consórcio com culturas

agrícolas, tanino para indústrias de adesivos e curtimento de couros (CASTRO et al., 2017;

LORENZI et al., 2003; SOUZA et al., 2004; WEBER et al., 2007; MIDGLEY e BEADLE 2006;

KAMO et al., 2009; HOONG et al., 2009). Além das características citadas, a Acacia.mangium

possui aptidão para produção de moirões, quebra-ventos, ornamentação, além de suas flores

serem melíferas. (Balieiro et al., 2004).

(a) (b)

(c) (d)

14

A extração, quantificação e caracterização de compostos provenientes do metabolismo

secundário no gênero Acacia vem sendo bastante estudados nos últimos anos (CALEGARI

et al., 2016; DAOUB et al., 2016; SANTOS et al., 2017; ALAJMI et al., 2017; SUBHAN et al.,

2018; LIN et al., 2018). Porém, os estudos limitam-se predominantemente à espécie Acacia

mearnsii, a qual possui compostos, como taninos, com atividade biológica comprovada e já

bastante descrita. Portanto, estudos com Acacia mangium são bastante necessários e

promissores, uma vez que a espécie pode possuir compostos com atividade biológica iguais

ou superiores à Acacia mearnsii.

2.2.2. Mimosa tenuiflora (Willd.)

A Mimosa tenuiflora, popularmente conhecida por “jurema-preta”, pertence à família

Fabaceae e subfamília Mimosoidae. É uma planta característica do bioma Caatinga e

apresenta alto potencial para produção de forragem, sendo uma importante fonte de

alimentação animal em regiões semiáridas do Nordeste (PINTO; CAVALCANTE; ANDRADE,

2006).

A jurema-preta é uma planta pioneira, que apresenta sistema radicular profundo,

permitindo o seu desenvolvimento em solos degradados, notadamente, na ocupação inicial e

secundária das áreas degradadas ou em processo de degradação (AZEVÊDO et al., 2012).

Além disso, esta espécie apresenta alto grau de associação com bactérias do gênero

Rhizobium e fungos micorrízicos, tornando-a capaz de colonizar sítios com severa escassez

de nitrogênio e fósforo (ALMEIDA et al.,1991; MERGULHÃO et al., 2007).

Além disso, por apresentar madeira de alta densidade, é amplamente utilizada como

combustível, bem como na medicina popular, em tratamentos de queimaduras, acne e

problemas relacionados ao tecido epitelial (MAIA, 2004) além de ser usada contra bronquite,

febre, dor de cabeça e inflamações diversas (MAGALHÃES et al., 2018).

Calegari et al. (2016) quantificaram as substâncias tânicas e não-tânicas presentes nas

cascas de jurema-preta. Os autores encontraram que os teores de tânicos presentes na

espécie ocorre em torno de 24,1%, indicando que a espécie possui grande potencialidade na

produção de taninos em função da considerável quantidade de taninos e da disponibilidade

da espécie no bioma Caatinga.

Os taninos desta espécie já foram testados para uso como componente de adesivos de

madeira. Em estudo realizado por Azevêdo et al. (2015), os autores avaliaram a qualidade

dos taninos da espécie para a produção de adesivo tanino-formaldeído, com o período de

coleta da planta. Foi observado que houve influência do período de coleta das plantas no teor

de taninos condensados. Nos adesivos produzidos com os taninos de jurema-preta, foram

15

observados teores sólidos semelhantes aos da acácia-negra (Acacia mearnsii), não havendo

diferença significativa entre os períodos de coleta para o teor sólidos e tempo de gelatinização

dos adesivos.

Lima et al. (2014) avaliaram a capacidade dos taninos de jurema-preta no curtimento de

pele animal e a comparou com o angico-vermelho, espécie utilizada nos curtumes tradicionais

do semiárido brasileiro. Os taninos da jurema-preta tiveram melhor potencial durante o

curtimento e recurtimento das peles. Os autores concluíram que esta espécie possui potencial

para ser utilizada no curtimento de peles.

O interesse fitoquímico dessa espécie aumentou consideravelmente, principalmente

devido à presença de alcaloides e taninos (RIVERA-ARCE et al., 2007). Seu potencial

antioxidante, antiinflamatório e antinociceptivo já foi relatado, sendo a abundância de taninos

e flavonoides encontrados na planta, os prováveis responsáveis pela atividade antimicrobiana,

conforme descrevem Meckes-lozoya et al. (1990).

16

Figura 2 Aspecto morfológico de folhas (a), inflorescências (d), fuste (c) e árvore (d) de

Mimosa tenuiflora Willd.

Fonte: Autora, 2020

Da casca da jurema-preta já foram isoladas diversas substâncias com atividade biológica

comprovada, que vem sendo estudados nos últimos anos (BEZERRA, et al., 2011; CRUZ et

al., 2016; BORGES, 2017) sendo cada vez mais destacados os avanços do conhecimento

químico e farmacológico relacionados a essa espécie.

2.2.3. Mimosa caesalpiniifolia Benth.

Mimosa caesalpiniifolia Benth. pertence à família Fabaceae, subfamília Mimosoideae,

e é popularmente conhecida por sabiá ou sansão-do-campo. Esta espécie ocorre

naturalmente nos estados do Rio Grande do Norte, Piauí e Ceará, parte do Maranhão e de

(a) (b)

(c) (d)

17

Pernambuco, e na chapada do Araripe, na divisa com o Ceará, sendo observada com maior

frequência em sítios de solos profundos e férteis (CARVALHO, 2007).

Os indivíduos desta espécie medem entre 4 a 8 m de altura, o tronco apresenta

acúleos que desaparecem com a idade. A casca é de cor castanho claro a cinza acastanhado

(CARVALHO, 2007). O sabiá apresenta uma madeira de alta densidade (0,87 g cm³) e alto

teor de carbono fixo (aproximadamente 73%), sendo uma importante fonte de energia (carvão

e lenha) (RIBASKI et al., 2003). Além disso, é empregada na confecção de estacas, mourões,

postes e dormentes. A folhagem pode ser utilizada como forragem fresca ou fenada,

especialmente na época seca (RIZZINI, 1971).

Figura 3 – Aspecto morfológico de folhas (a) frutos (b) fuste (c) e casca (d) de Mimosa

caesalpiniifolia Benth.

Fonte: Autora, 2020

(a) (b)

(c) (d)

18

Azevêdo et al. (2018) ao analisar folhas, galhos finos e casca do sabiá quanto às suas

características como produtora de taninos vegetais, encontraram que todas as partes da

planta analisadas apresentaram taninos; porém, a casca apresentou a maior concentração de

taninos condensados (8,38%) e menor quantidade de não taninos (1,22%). Os autores

acrescentam que dentro do extrativo desta espécie, há uma menor concentração de taninos

quando comparados a espécies produtoras, como a Acacia mearnsii, por exemplo, porém

foram os taninos que apresentaram o maior grau de pureza já registrados na literatura.

2.2.4. Azadirachta indica A. Juss.

A família Meliaceae possui 51 gêneros e 550 espécies e é conhecida por possuir

compostos biologicamente ativos que influenciam no desenvolvimento de outros organismos

(RICKLI et al. 2011). As espécies mais estudadas da família são Trichilia pallida,Cinamomo

ou Santa-bárbara (Melia azedarach L.) e Azadirachta indica, popularmente conhecida como

Nim ou Neem (GONÇALVES-GERVÁSIO, 2004).

O nim (Azadirachia indica A. Juss), syn Antelara azadirachta, Melia azadirachta L., é

original do sudeste da Ásia, mais precisamente na Índia, na região de Burma e regiões áridas

do subcontinente indiano (NEVES et al., 2008), Myanmar, Ceilão, Filipinas, Indonésia e

Malásia (MARTINEZ et al., 2002; LORENZI et al., 2003). Ocorre em diversos países da África,

ilhas asiáticas, Austrália e América do Norte, América Central e América do Sul, graças à sua

rusticidade e capacidade de adaptação a regiões áridas (MARTINEZ et al., 2002). Esses

autores acrescentam que o nim indiano foi introduzido no Brasil para estudo como planta

inseticida pelo Instituto Agronômico do Paraná (IAPAR).

Essa espécie vem se desenvolvendo bem em áreas de clima tropical e subtropical

(MOSSINI et al., 2005). O porte dos indivíduos pode variar de 15 a 20 m de altura, com tronco

semi-reto a reto, de 30 a 80 cm de diâmetro, relativamente curto e duro, com fissuras e

escamas, de coloração marrom-avermelhada. O diâmetro da copa pode variar entre 8 a 12

m, podendo atingir 15 m em árvores isoladas. É uma planta perene, de clima tropical,

resistente à seca e de crescimento rápido (MARTINEZ, 2002).

De suas folhas, frutos, sementes e tronco é possível retirar extratos biologicamente

ativos e com múltiplas propriedades (ARROTEIA et al., 2007), o que faz com que esta espécie

seja comumente empregada no controle de insetos, fungos e nematóides, na indústria de

cosméticos, fertilizantes, adubo, na produção de biomassa em propriedades rurais,

reflorestamento e uso veterinário, entre outros (RICKLI et al., 2011).

19

Pandey et al. (2014), ao analisar e correlacionar os atributos fitoquímicos,

sequestrantes de radicais livres e antibacterianos de nim com o objetivo de compreender seu

potencial para curar doenças da pele, encontraram que os teores totais de fenóis, flavonóides

e taninos foram estimados em 1,03%, 5,33% e 1,83%, respectivamente. Tais resultados

sugerem que a espécie possui taninos, propondo a realização de estudos que quantifiquem

os taninos em nim em outras partes da planta, como a casca e galhos, por exemplo.

Figura 4- Aspecto morfológico de folha (a) e (d), casca (b) e fuste (c) de Azadirachta indica

A. Juss.

Fonte: Autora, 2020

2.3. CARACTERÍSTICAS QUÍMICAS DOS TANINOS VEGETAIS

(a) (b)

(d) (c)

20

As plantas contêm uma grande variedade de compostos fenólicos. Desde fenóis, que

compreendem flavonóides, estilbenos, taninos, lignanas e lignina, até compostos com ácidos

carboxílicos de cadeia longa. Estas substâncias bastante variadas têm funções importantes,

como antibióticos, pesticidas naturais, substâncias de sinalização para o estabelecimento de

simbiose com Rhizobia, atrativos para polinizadores, agentes de proteção contra luz

ultravioleta (UV), materiais isolantes para edificar paredes celulares impermeáveis ao gás e à

água, e material estrutural para dar estabilidade das plantas (HELDT e PIECHULLA, 2011).

Segundo Bucahanan et al. (2015), os compostos fenólicos representam aproximadamente

40% do carbono orgânico em plantas e são derivados principalmente de estruturas de

fenilpropanóide e acetato de fenilpropanóide, as quais possuem um núcleo fenilpropanoide

comum. Dessa forma, compartilham os quatro primeiros passos bioquímicos: a fenilalanina, o

ácido cinâmico, o ácido p-cumárico, e o cumaroil-coA - um composto reativo que pode

participar de diversas reações levando, por isso, à riqueza de compostos fenólicos que

existem nas plantas, incluindo os taninos, que se acumulam nos vacúolos.

Os taninos vegetais apresentam elevada proporção de grupos fenólicos com hidroxilas

livres e de diferentes graus de condensação ou polimerização (BROWNING, 1963), razão

pela qual são bastante reativos e formam pontes de hidrogênio intra e intermoleculares. Um

mol de taninos pode ligar-se a doze moles de proteínas (MONTEIRO et al., 2005).

Químicamente, os compostos fenólicos são definidos como substâncias que possuem

anel aromático com um ou mais substituintes hidroxílicos, incluindo seus grupos funcionais

(LEE et al., 2005). Possuem estrutura variável e, por este motivo, são multifuncionais.

Desse modo, os taninos são classificados segundo a sua estrutura química, em duas

diferentes categorias: taninos hidrolisáveis e taninos condensados (PIZZI, 1994). Para Zucker

(1983), os taninos hidrolisáveis são responsáveis pela defesa das plantas contra herbívoros,

já os taninos condensados atuam na defesa contra micro-organismos patogênicos.

2.3.1. Taninos hidrolisáveis

Os taninos hidrolisáveis são ésteres de ácidos gálicos e ácidos elágicos glicosilados,

formados a partir do chiquimato (HELDT, 1997), nos quais os grupos hidroxila do açúcar são

esterificados com os ácidos fenólicos (VICKERY, 1981). Os taninos elágicos são muito mais

frequentes que os gálicos (BRUNETON, 1991).

De acordo com Battestin, Matsuda e Macedo (2004), os taninos hidrolisáveis são

observados em folhas, galhos, cascas, frutos e cerne de várias espécies arbóreas, como, por

exemplo, as dos gêneros: Terminalia, Phyllantus e Caesalpinia, entre outros. Para Zucker

(1983) e Metche (1980), sua função nas plantas é protegê-las contra os herbívoros, tendo em

vista que estes compostos agem no processo digestivo desses animais, dificultando-o, em

21

decorrência da afinidade dos taninos com proteínas ligadas à produção de enzimas

digestivas, bem como às próprias enzimas. Segundo Queiroz et al. (2002), estes taninos

ocorrem em menores concentrações, quando comparados aos taninos condensados.

Battestin, Matsuda e Macedo (2004) elucidam que os taninos hidrolisáveis são

subdivididos em galotaninos e elagitaninos (Figura 5), consoante ao produto da hidrólise. Os

galotaninos decompõem-se em ácido gálico e açúcares, já os elagitaninos formam ácido

elágico e açúcares. Os galotaninos apresentam como núcleo a glicose, enquanto os

elagitaninos são iguais ao grupo dos galotaninos, mas que se formam com mais um grupo

hexahidroxidofenol (ácido gálico) e glicose (SILVA, 1999). Ou seja, na maioria dos galotaninos

se encontram unidades D-glucose que são unidas por ligações de éster do ácido gálico,

enquanto os elagitaninos podem ser considerados produtos da oxidação enzimática dos

galotaninos (LEWIN e GOLDSTEIN, 1991).

Os taninos hidrolisáveis possuem propriedades indesejáveis que limitam a viabilidade

para a produção de fitoterápicos, segundo Pizzi (2003), uma vez que as suas reações de

funcionalização necessitam de sítios reativos específicos. Além disso, a baixa produção

mundial é um fator limitante, vislumbrando-se a síntese do produto em grandes quantidades.

Figura 5 - Estrutura química do galotanino (A) e elagitanino (B)

Fonte: Battestin, Matsuda e Macedo (2004)

22

2.3.2. Taninos Condensados

Os taninos condensados possuem uma vasta distribuição na natureza e são constituídos

por oligômeros ou polímeros compostos de unidades monoméricas do tipo flavonóide, que

consiste em unidades tricíclicas e hidroxiladas de 15 carbonos (LAKS, 1991). Altas

concentrações desses compostos podem ser encontradas tanto na madeira quanto na casca

de diversas espécies arbóreas (PIZZI, 2003). Os taninos deste tipo também são chamados

de proantocianidinas, possivelmente pelo fato de apresentarem pigmentos avermelhados da

classe das antocianidinas, como cianidina e delfinidina (SANTOS; MELLO, 1999).

Figura 6 - Estrutura do flavanóide percursor dos taninos condensados. R1, R2, R3 e R4

são radicais que podem ser compostos por grupo hidroxila ou átomo de hidrogênio

Fonte: Jorge et al (2001)

As unidades flavanóides as quais os taninos condensados são constituídos, possuem

diferentes graus de condensação sendo unidas por ligações carbono-carbono. Tais ligações

são difíceis de serem quebradas por hidrólise (ASHOK; UPADHYAYA, 2012). Dos vários tipos

de monoflavonóides que ocorrem na natureza, apenas os flavan-3-óis e os flavan-3,4-dióis

participam da gênese dos taninos, já que são os únicos com capacidade de sofrerem reações

de polimerização, constituindo-se assim como os precursores dos taninos condensados

(PIZZI, 1993).

23

Zucker (1983) menciona que os taninos condensados têm função de defesa contra

microrganismos patogênicos. Ashok e Upadhyaya (2012) acrescenta que tais taninos também

são encontrados no cerne de coníferas e podem desempenhar um papel na inibição da

atividade microbiana, resultando na durabilidade natural da madeira. A ocorrência desses

compostos é comum em angiospermas e gimnospermas, principalmente em plantas lenhosas

(SANTOS e MELLO, 1999).

Os taninos condensados são a segunda fonte de polifenóis do reino vegetal, perdendo

apenas para a lignina. Além de serem potentes antioxidantes, possuem vasta aplicação na

complexação com proteínas, sendo por esse motivo muito empregados na indústria de couros

(HAGERMAN et al.,1997)

2.4. USO DE TANINOS PARA FINS FARMACOLÓGICOS

A utilização de plantas com fins medicinais para tratamento, cura e prevenção de doenças,

é uma das mais antigas formas de prática medicinal da humanidade. Por terem em sua

composição fitoquímicos, esses vegetais melhoram o equilíbrio fisiológico dos seres humanos

e o conhecimento dessas propriedades curativas é transmitido através de gerações

(OWOLABI et al., 2018).

As aplicações de fármacos a partir de taninos estão em sua maior parte, relacionadas às

suas propriedades adstringentes, podendo ser utilizados para medicamentos antibacterianos,

antidiarreicos, hemostáticos e anti-hemorroidais (ASHOK e UPADHYAYA, 2012).

Os taninos são considerados substâncias bioativas, visto que suas propriedades

antimicrobiana, antioxidante, antiviral e antitumoral são bem conhecidas e documentadas

(OKUDA et al., 2009), podendo assim serem utilizados como fitoterápicos. Os fitoterápicos

usam substâncias ativas de plantas e são popularmente utilizados como alternativa eficaz

para tratar diversas doenças, incluindo patologias bucais (CASTILHO et al., 2007; PEREIRA

et al., 2016; CARTAXO-FURTADO et al., 2017).

Segundo Monteiro et al. (2005), se administrados por via interna, os taninos exercem efeito

antidiarreico e antisséptico; se por via externa, impermeabilizam as camadas mais expostas

da pele e mucosas, protegendo, dessa forma, as camadas subjacentes. Ademais, a

característica de precipitar proteínas confere aos taninos um potencial antimicrobiano e

antifúngico. Por serem substâncias hemostáticas, e pela propriedade de precipitar alcalóides,

os taninos podem servir também de antídoto em casos de intoxicações (BRUNETON, 1991).

Monteiro et al. (2005) cita ainda que, em virtude da capacidade de complexar proteínas,

em processos de cura de feridas, queimaduras e inflamações, os taninos formam uma camada

protetora, um complexo tanino-proteína e/ ou tanino-polissacarídeo, que age sobre tecidos

24

epiteliais lesionados. Logo abaixo dessa camada, o processo curativo pode ocorrer

naturalmente.

Um antibiótico ideal deve ser seguro, eficaz e não deve levar a bactérias resistentes,

segundo Tomiyama et al. (2016). Para tal função, os efeitos antibacterianos dos taninos são

reconhecidos há muito tempo. Estudos recentes demonstraram que tais efeitos agem na

formação de biofilmes, atribuindo aos taninos uma característica anti-biofilme na colonização

de superfície de diversos gêneros bacterianos. Essa capacidade de comprometer a adesão

bacteriana representa uma estratégia ideal para combater patogêneses bacterianas, devido à

sua ação nos estágios iniciais do processo infeccioso (TRENTIN et al., 2013).

Tahir et al. (2017) apresentaram o efeito antibacteriano de extratos de folhas de Diospyros

blancoi, Phoenix dactylifera e Morus nigra contra cárie. Segundo os autores, os resultados

evidenciaram que os taninos inibiram o crescimento de bactérias bucais responsáveis pela

cárie dentária, podendo ser utilizadas como alternativa de tratamento de cárie, minimizando o

uso de antibióticos comumente utilizados no tratamento da doença.

Em estudo realizado por Anita et al. (2014), os autores descreveram o efeito

antimicrobiano in vitro de extrato de Camellia sinensis popularmente conhecido por chá verde

e rico em taninos, sobre Streptococcus mutans e Lactobacillus acidophilus, bactérias

preponderadamente cariogênicas. Os resultados indicaram que os taninos desempenharam

expressiva atividade antibacteriana a partir de uma concentração inibitória mínima entre 0,2 e

0,3%mg/mL.

Tomiyama et al. (2016) avaliaram a atividade antibacteriana contra biofilmes

polimicrobianos de um tanino condensado extraído do fruto do Diospyros kaki, usado como

aditivo na fabricação de bebidas populares no Japão. Os resultados indicaram que os efeitos

antibacterianos dos taninos são comparáveis aos do antibiótico digluconato de clorexidina,

podendo manter a cavidade oral limpa, prevenir cárie periodontal relacionada à placa dentária,

bem como evitar doenças sistêmicas, como pneumonite por aspiração.

Wang et al. (2013) testaram a capacidade de taninos presentes em chás comerciais de

dificultar a ligação de Streptococcus mutans a superfícies e, subsequente, formação de

biofilme. Eles observaram que as células de S. mutans tratadas com extratos de chá eram

maiores e com formas mais arredondadas, indicando que os taninos presentes no material

inibiram a fixação e a formação de biofilme através da modificação das propriedades da

superfície celular e das estruturas usadas pelas bactérias para interagir com superfícies, bem

como o bloqueio da atividade de proteínas.

Lima et al. (2018) avaliaram a atividade antibacteriana e antiaderente do extrato de sabiá

sobre microrganismos do biofilme dentário, através de um estudo analítico experimental in

vitro sobre as linhagens cariogênicas e formadoras de biofilme dental Streptococcus mitis,

25

Streptococcus mutans, Streptococcus sanguis, Streptococcus sobrinus e Lactobacillus casei.

Os autores observaram que os taninos presentes na espécie estudada apresentaram ação

antimicrobiana significativa e atividade inibitória mínima da aderência in vitro sobre as

linhagens de Streptococcus mitis e Streptococcus mutans, presentes no biofilme bacteriano.

Pereira et al. (2015), estudando a atividade antimicrobiana de taninos de plantas

aromáticas do nordeste brasileiro contra linhagens bacterianas de origem animal, relataram

que a espécie M. tenuiflora inibiu o crescimento da bactéria Staphylococcus aureus,

apresentando atividade antimicrobiana de 18,11%. Os autores observaram halos de inibição

entre 10 e 22mm, com uma proporção entre diminuição do diâmetro dos halos e a diminuição

da concentração.

Embora as florestas brasileiras concentrem a maior biodiversidade do mundo e diversos

pesquisadores trabalhem na busca de substâncias bioativas em plantas, estima-se que

apenas 6% das espécies tenham sido estudadas nesse sentido até o momento (CRAGG et

al., 2013). Desse modo, estudos que identifiquem e descrevam em espécies de ocorrência

brasileira a presença de substâncias como os taninos e a sua atividade fitoterápica são muito

importantes, visto que que podem ser utilizadas na medicina, aumentando a opção terapêutica

dos profissionais de saúde, reduzindo o uso indiscriminado de antibióticos, que leva a cepas

resistentes.

2.5. CÁRIE DENTÁRIA

A cárie dentária é uma das patologias bucais mais antigas que acomete os seres humanos

e representa uma das doenças multifatoriais mais comuns, na qual os indivíduos permanecem

suscetíveis durante toda a vida (LIN et al., 2018). Segundo Pitts e Zero (2016), a cárie é uma

patologia complexa e multifatorial, que envolve interações entre a estrutura dentária, o biofilme

microbiano oral formado na superfície do dente, carboidratos na dieta, principalmente

açúcares e, em menor grau, amidos, e influências salivares e genéticas.

Sob uma perspectiva moderna de compreensão da doença, Pitts e Zero (2016) incluem

fatores comportamentais, sociais e psicológicos, os quais, segundo os autores, também estão

envolvidos na maneira como a doença se manifesta nos indivíduos. Desse modo, a cárie pode

ser entendida como um processo dinâmico que envolve ciclos de perda mineral

(desmineralização) e ganho mineral (remineralização). A superfície do dente está em um

estado saudável e de equilíbrio dinâmico com o ambiente oral quando a desmineralização e

a remineralização estão em equilíbrio ou favorecem a remineralização (PITTS e ZERO, 2016).

26

Para Bowen (2002), uma lesão cariogênica é a manifestação clínica de um quadro

patológico que pode estar ocorrendo na superfície do dente por meses ou anos. O autor

elucida que tais lesões são resultado da interação das bactérias que colonizam ou infectam a

superfície do dente com constituintes da dieta, sendo a placa dentária a primeira evidência

clínica evidente dessa interação. Embora a maior parte da atenção tenha sido focada nos

constituintes da película, há evidências inequívocas de que as bactérias constituintes estão

presentes desde os primeiros estágios da formação.

O biofilme inicial é formado por organismos colonizadores iniciais, como Streptococcus

gordonii, Streptococcus oralis, Streptococcus sanguinis e Streptococcus salivarius na película

dental e, em seguida, o Streptococcus mutans se liga ao biofilme inicial (SOCRANSKY e

HAFFAJEE, 2002).

Diante deste fato, Lee e Kim (2014) definem o S. mutans como o mais importante

contribuinte para a formação de biofilme maduro na cavidade oral, sendo considerado o

principal agente etiológico da cárie dentária em humanos. Barnabe et al. (2014) descrevem

que as células de S. mutans individuais ou agregadas se fundem com a película salivar por

mecanismos dependentes ou não de sacarose e essa capacidade de fusão é responsável

pela agregação de outras bactérias em uma matriz de polissacarídeo no esmalte dentário.

A incidência de cárie aumentou consideravelmente em sociedades pós-industriais, com o

aumento da disponibilidade e consumo excessivo de açúcar processado (LAMONT e

EGLAND, 2015). Atualmente, a cárie representa um grave problema de saúde pública, devido

ao seu efeito sobre os indivíduos e a sociedade, a sua recorrência e os custos para o

tratamento. No Brasil, o índice de prevalência desta doença é de 2,1%, (BRASIL, 2011; JOSE

et al. 2011) o que evidencia a necessidade de alternativas terapêuticas eficazes.

Segundo Strużycka (2014), os micro-organismos cariogênicos produzem os ácidos lático,

fórmico, acético e propiônico, que são produtos do metabolismo de carboidratos. A presença

desses ácidos na cavidade oral provoca uma diminuição no pH, chegando a valores inferiores

a 5,5, acarretando na desmineralização dos cristais de hidroxiapatita do esmalte dentário e

na quebra proteolítica da estrutura dos tecidos duros dos dentes.

Diversas substâncias, principalmente compostos clorados do fenol e detergentes

catiônicos (clorexidina), têm sido comumente utilizados como inibidores do mecanismo de

formação e crescimento do biofilme dental (LIMA et al., 2018). Porém, efeitos colaterais como

pigmentação nos dentes, desequilíbrio da microbiota e alteração do paladar tem motivado a

busca por novos agentes antimicrobianos que ajam com eficácia na eliminação desses

microrganismos, que apresente maior atividade farmacológica, menor toxicidade, maior

biocompatibilidade e que sejam mais acessíveis à população, podendo ser usados na

composição de produtos de higiene bucal como coadjuvantes no tratamento de cárie

(MACÊDO-COSTA et al., 2009; ABREU-PINHEIRO et al., 2012; SILVA et al., 2014).

27

Diversos estudos de compostos e extratos naturais a partir de plantas tem sido realizados

(PAYNE et al., 2013; PEREIRA et al., 2015; PEREIRA et al., 2016; TOMIYAMA et al., 2016;

BORGES et al., 2017; BENZIDIA et al., 2018) sob o enfoque de suas atividades

antimicrobianas, e tem-se relatado que esses compostos e extratos apresentam altas

concentrações de substâncias bioativas como os taninos, que podem reduzir ou inibir o

crescimento de bactérias na cavidade bucal (MACÊDO-COSTA et al., 2009).

A natureza é uma rica fonte de substâncias antimicrobianas, razão pela qual os produtos

naturais têm representado uma das principais fontes de novos medicamentos aprovados pela

Food and Drug Administration nas últimas duas décadas (CRAGG e NEWMAN, 2013). Por

exemplo, eugenol e alguns extratos vegetais obtidos de Zizyphus joazeiro (juá), Mentha

piperita (menta) e Punica granatum (romã) e diversos outros extratos de outras espécies são

estudados na busca de introduzi-los em práticas clínicas.

Araujo et al. (2018) comprovaram a eficiência dos taninos de Anacardium occidentale L. e

Anadenanthera macrocarpa (Benth.) Brenan com ação inibitória contra diferentes espécies de

bactérias cariogênicas, sem causar toxicidade sobre células eucarióticas ou atividade

mutagênica.

Lima et al., (2018) avaliaram a atividade antibacteriana e antiaderente do extrato de

Mimosa caesalpiniifolia Benth sobre bactérias do biofilme dentário através de um estudo

analítico experimental in vitro. Os autores concluíram que o extrato etanólico das folhas de

Mimosa caesalpinifolia apresentou ação antimicrobiana significativa e atividade inibitória

mínima da aderência sobre as linhagens de Streptococcus mitis e Streptococcus mutans,

presentes no biofilme bacteriano.

Michelin et al. (2005) avaliaram a atividade antimicrobiana de extratos secos de Artemisia

absinthium L. (losna), Mentha pulegium L. (poejo), Punica granatum L. (romã), Xanthosema

violaceum Schott (taioba) e Syzygium cuminii L. (jambolão). Para tal, os autores realizaram o

teste de difusão em ágar, com 15 diferentes microrganismos, utilizando discos impregnados

com as dispersões aquosas dos extratos vegetais. Os autores observaram que os extratos

das espécies estudadas são capazes de inibir o crescimento microbiano, principalmente as

espécies X. violaceum e S. cuminii que inibiram, respectivamente, 8 e 6 bactérias.

Silva et al. (2014) utilizaram o método de difusão em disco para triagem de mais de 2.000

extratos de plantas da Amazônia contra Streptococcus mutans. Os autores fracionaram e

identificaram dezessete extratos ativos de plantas e suas frações, determinando suas

concentrações inibitórias mínimas e concentrações bactericidas mínimas. Os autores

observaram que o extratos obtidos a partir das espécies Casearia spruceana, Psychotria sp.

(Rubiaceae) e Ipomoea alba mostraram atividade antibacteriana significativa contra

Streptococcus mutans.

28

Os estudos citados evidenciam que diversas espécies vegetais apresentam substâncias

bioativas, as quais possuem expressivo potencial como fontes de novos agentes

antibacterianos para uso como coadjuvantes químicos em estratégias de prevenção e

tratamento de patologias biofilme-dependentes e de alta prevalência, como a cárie dentaria.

29

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Material botânico

Foram utilizadas cinco árvores adultas e saudáveis de cada espécie (Acacia mangium

Willd., Mimosa tenuiflora Willd, Mimosa caesalpiniifolia Benth, e Azadirachta indica A. Juss.),

obtidas em plantio florestal de quatro anos de idade localizados no município de Macaíba, Rio

Grande do Norte, Brasil (05 ° 51'28,8 ”S e 35 ° 21'14,4 ”W). O solo é classificado como

latossolo amarelo de textura arenosa e topografia plana (BELTRÃO et al., 1975). O clima local

é uma transição entre os tipos As e BSw caracterizado como tropical chuvoso, de acordo com

a classificação de Köppen com temperatura média anual de 27,1°C, umidade relativa anual

de 76% e precipitação pluviométrica variando entre 863,7 e 1.070,7 mm (IDEMA, 2013). Com

auxílio de um facão, as cascas foram coletadas do fuste, galhos e ramos com diâmetros

superiores 2 cm. As cascas de cada espécie foram homogeneizadas, secas ao ar e moídas

em moinho do tipo Willey, conferindo uma menor granulometria. Para as análises, os materiais

foram classificados em peneiras, utilizando-se o material retido em peneira de 2 mm. A

serragem obtida de cada espécie foi homogeneizada e o teor de umidade em base seca foi

determinado para obtenção do teor de taninos presentes em cada amostra.

3.2 Extrações dos taninos

Para a extração de taninos, foi empregada uma proporção (massa / massa) de água

destilada e casca igual a 1:10. Foram tomadas, de cada espécie, três porções de 25 g de

material seco. As amostras foram transferidas para balões de fundo chato com capacidade de

500 mL, em que foram adicionados 250 mL de água destilada e submetidas à fervura sob

refluxo por duas horas. Cada amostra foi submetida a duas extrações, a fim de se retirar a

máxima quantidade de extrativos presentes. Após cada extração, o material foi passado em

uma peneira de malha 150, e em um tecido de flanela, para a retenção de partículas finas. O

extrato obtido foi homogeneizado e filtrado em funil de vidro sintetizado de porosidade 2. Em

seguida foi concentrado para 250 mL, pela evaporação da água ao empregar um aparelho

tipo Soxhlet e retiradas três alíquotas de 50 mL de cada extrato, nas quais duas delas foram

utilizadas para a determinação do teor de taninos condensados (TTC) e uma foi evaporada

em estufa a 103 ± 2 ºC por 48 h, para a determinação da porcentagem de teor de sólidos

totais (TST).

30

3.2.1 Teor de sólidos totais (TST)

Para medir o TST, as alíquotas de 50 mL do extrato bruto foram secas em estufa a 60

+ 2 ° C e seu teor total de sólidos (TST) foi calculado através da Equação 1.

Equação 1:

𝑇𝑆𝑇 = ((𝑀1 − 𝑀2) / 𝑀1) 𝑥 100

Na qual:

TST- Teor total de sólidos em 50 mL de extrato bruto (%)

M1 - massa inicial de extrato bruto (g)

M2 - massa final de sólidos após evaporação da água (g)

3.2.2 Teor de taninos condensados (TTC) e Indice de Stiasny (IS)

Para obter o teor total de taninos condensados (TTC), primeiro o número Stiasny dos

extratos foi determinado pelo método descrito por Guangcheng et al. (1991), com quatro

repetições. Para isso, foram adicionados 4 mL de formaldeído (37% p / p) e 1 mL de ácido

clorídrico concentrado a 50 mL de extrato bruto. A mistura foi mantida sob refluxo durante 30

min. Depois disso, a mistura foi resfriada e filtrada em papel filtro e os sólidos foram secos no

forno a uma temperatura de 60 + 2 ° C por 48 h. O material seco foi pesado e o número de

Stiasny foi calculado pela Equação 2.

Equação 2:

𝐼 = (𝑀2 / 𝑀1) 𝑥 100

Na qual:

I = índice de Stiasny (%)

M1 = massa de sólidos em 50 mL de extrato bruto (g)

M2 = massa de precipitado tanino-formaldeído (g)

A partir do índice de Stiasny, o teor de taninos condensados foi calculado usando a

Equação 3 e expresso como porcentagem da massa seca da casca.

31

Equação 3:

𝑇𝑇𝐶 = (𝑇𝑆𝐶 𝑥 𝐼) / 100

Na qual:

TTC - teor de taninos condensados (%)

TST - teor total de sólidos (%)

I – índice de Stiasny (%)

3.3 FTIR

As amostras de tanino foram avaliadas por FTIR (espectroscopia no infravermelho por

transformada de Fourier). Os espectros dos taninos foram adquiridos com um espectrômetro

Shimadzu IRAffinity-1 usando pastilhas de KBr. Antes da peletização, as amostras de tanino

foram secas em estufa a 60 ° C por 3 h. Um pellet contendo apenas KBr foi utilizado para

adquirir o espectro de referência. Os outros pellets foram preparadas com KBr e 1% (p / p)

das amostras de tanino em pó. Cada espectro foi adquirido com 32 varreduras e resolução de

4 cm-1, de 4.000 a 400 cm-1.

3.4 Ensaios antimicrobianos

3.4.1 Microorganismos testados

Cepas padrão das bactérias Streptococcus mutans (UA159), Lactobacillus

acidophilus (ATCC IAL523), Lactobacillus casei (ATCC 193) e do fungo Candida

albicans (SC5314), microorganismos comumente associados a patologias bucais,

provenientes do Departamento de Farmacologia da Faculdade de Odontologia de Piracicaba

(São Paulo, Brasil) foram utilizados no presente estudo. Para os testes, as cepas foram

reativadas em caldo BHI (Brain Heart Infusion, HIMEDIA®, São Paulo, Brasil) e incubadas a

37 ° C por 24 h.

3.4.2 Preparação dos extratos

Foram utilizados 2 kg de casca moída de cada espécie, e adicionados 10 L de água

(relação 5:1). As amostras foram submetidas à fervura em autoclave a 70 ± 5 °, durante duas

horas. Cada amostra de casca foi submetida a duas extrações, a fim de se retirar a máxima

32

quantidade de substâncias presentes. Em seguida, o material foi filtrado em peneira de 150

“mesh”, para a retenção de partículas finas de casca. Por fim, os extratos foram congelados

e liofilizados para obtenção dos taninos em pó.

3.4.3 Determinação da concentração inibitória mínima (CIM)

Para a determinação da concentração inibitória mínima (CIM) foi utilizado o método de

diluição de caldo seguindo especificações pré-estabelecidas pelo Clinical and Laboratory

Standards Institute (CLSI, 2018). Os taninos liofilizados de todas as espécies foram

solubilizados nos veículos: a) etanol a 20%; b) etanol a 30%; c) Dimetilsulfoxido (DMSO); d)

água destilada. A CIM foi realizada em placas de microdiluição de 96 poços (BMG Fluostar

Optima, Bmg Labtech, Brasil), com o intuito de determinar a menor concentração do extrato

em mg.mL-1, capaz de inibir o crescimento microbiano. Cada poço continha 100 μL do extrato

tânico, 100 μL do BHI (Brain Heart Infusion, HIMEDIA®, São Paulo, Brasil) e 100 μL de cada

microrganismo testado (5 × 105 ufc / mL), a partir da concentração inicial de 2,5 mg/mL a

0,0012207 mg/mL (Figura 7). Digluconato de clorexidina a 0,12% (Sigma-Aldrich, St. Louis,

MO, EUA) foi usado como controle positivo, e os poços sem extrato foram usado como

controle negativo. As placas foram incubadas a 37 ° C e 5% CO2 por 24 h, e o crescimento

microbiano foi determinado por absorbância em um leitor automático de microplacas (BIO-

RAD, modelo 3550-UV, Microplate Reader, Hércules, Califórnia, EUA). Por fim, após o período

de incubação, a CIM foi descrita como a concentração mais baixa dos extratos para inibição

do crescimento visível dos microrganismos (MACIÀ et al., 2014). Os testes foram realizados

em triplicatas.

33

Figura 7 - . Representação da organização da placa de microdiluição de 96 poços para a

determinação da concentração inibitória mínima.

3.6 Delineamento experimental e análise estatística

O delineamento experimental foi inteiramente casualizado, com quatro espécies

florestais e avaliação de cinco repetições (4 tratamentos x 5 repetições). Os dados

experimentais foram submetidos à análise de variância e, quando foram detectadas

diferenças estatísticas, as médias foram comparadas pelo teste de Scott-Knott com 95% de

probabilidade. Para análise estatística, os valores de teor de sólidos totais (TST), índice de

Stiasny (IS) e teor de taninos condensados (TTC) foram convertidos em arcseno [√ (x / 100)],

conforme sugerido por Steel e Torrie (1980), para homogeneizar as variâncias. As médias

experimentais foram comparadas pelo teste T com 95% de probabilidade. Todas as análises

estatísticas foram realizadas com o software Assistat 7.0.

34

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1 Extração e quantificação dos taninos

As porcentagens de teor de sólidos totais (TST), índice de Stiasny (I) e teor de taninos

condensados (TTC) observados no presente trabalho estão apresentados na Tabela 1.

Tabela 1 - TST, I e TTC (%) dos taninos de Acacia mangium Willd., Azadirachta indica A.

Juss Mimosa tenuiflora Willd, e Mimosa caesalpiniifolia Benth

ESPÉCIE TST (%) I (%) TTC (%)

Mimosa tenuiflora 27,79 a 83,39 b 23,40 a

Mimosa caesalpiniifolia 9,18 c 91,27 a 8,38 c

Acacia mangium 14,80 b 83,89 b 12,41 b

Azadirachta indica 7,11 c 73,18 c 5,02 d

Em que: TST = Teor de sólidos totais; I = Índice de Stiasny; TTC = Teor de taninos

condensados. *As médias seguidas por uma mesma letra, para cada parâmetro avaliado, não

diferem estatisticamente (Scott-Knott; p > 0,05).

Segundo Medeiros et al. (2019), o teor de sólidos totais (TST) refere-se aos sólidos

capazes de serem extraídos da casca por água quente, porém além dos taninos, vários outros

compostos podem estar presentes. Portanto, altos valores de TST nem sempre estão

associados a um alto teor de taninos, visto que isto depende da espécie, local de coleta,

temperatura de extração, entre outros fatores. Deste modo, dentre as espécies avaliadas a

Mimosa tenuiflora apresentou a maior quantidade de sólidos (27,79%), seguida da Acacia

mangium (14,80%), Mimosa caesalpiniifolia (9,18%) e Azadirachta indica (7,11%),

respectivamente (Tabela 1). As duas últimas espécies não diferiram estatisticamente.

O TST observado no presente estudo para M. tenuiflora é inferior ao determinado por

Medeiros et al. (2018), os quais observaram um valor de 44,6% para a mesma espécie. Essas

diferenças no teor de sólidos da casca podem estar relacionadas às condições

edafoclimáticas e fatores genéticos. O TST da M. tenuiflora foi semelhante ao encontrado por

35

Medeiros et al. (2019) nos frutos desta espécie (27,7%) e inferiores aos observados pelos

autores na casca (42%). Esta diferença pode estar relacionada ao período de coleta da casca,

a características do sitio, a idade das plantas, entre outros fatores.

O índice de Stiasny (I) se refere aos taninos do tipo flavanol, os quais são precipitados

através da condensação com formaldeído em meio ácido, sendo estes de elevado peso

molecular e de difícil dissolução (MEDEIROS et al., 2019). Dessa forma, quanto maior o índice

de Stiasny, maior a quantidade de polifenóis, o que indica maior grau de pureza em taninos

condensáveis nos extratos. Para esta variável, a M. caesalpiniifolia apresentou a maior

porcentagem (91,27%), seguido da M. tenuiflora (83,39%), A. mangium (83,89%), e A. indica

(73,18%), respectivamente (Tabela 1).

Os valores de I encontrados no presente trabalho foram superiores aos verificados por

Paes et al. (2006a), que observaram valores de 22,04 a 73,48% para seis espécies cultivadas

no semiárido brasileiro. Um destaque deve ser dado à M. caesalpiniifolia, que apesar de conter

baixa concentração de taninos condensados na casca, apresentou o mais alto grau de pureza

para esses compostos, com valor de I de 91,27%, como citado acima. Esse resultado indica

que os taninos desta espécie podem vir a ser destinados para fins os quais se exige taninos

com maior grau de pureza, como a indústria de fármacos, ou adesivos de madeira, por

exemplo.

O teor de taninos condensados (TTC) representa o conteúdo real em taninos

condensados existentes na casca de uma determinada espécie florestal, porém, ele pode

variar dependendo do método empregado para sua determinação. Para esta variável também

a espécie M. tenuiflora apresentou o valor mais alto, conteúdo próximo ao da acácia negra

(Acacia mearnsii), a fonte mais importante de taninos nas florestas brasileiras, sendo a

principal espécie da cadeia produtiva de taninos no Brasil (CALEGARI et al., 2016).

A alta concentração de taninos condensados observadas no presente estudo em M.

tenuiflora aponta a espécie como uma potencial fonte de taninos condensados em larga

escala, com a possibilidade de expandir a produção desse produto não madeireiro,

diversificando a cadeia produtiva de taninos no Brasil e diminuindo a pressão sobre as poucas

espécies que são tradicionalmente exploradas.

No entanto, é preciso ter atenção ao período de coleta das cascas, uma vez que,

conforme descrito por Azevêdo et al. (2017), o teor de taninos pode variar em função da

fenofase da planta, sendo maior no final da estação chuvosa, quando a arvore possui um

número maior de folhas verdes. No presente trabalho, a coleta de cascas foi realizada no final

36

da estação chuvosa e o valor de TTC (23,40%) aqui determinado é próximo ao encontrado

pelos autores citados, de 21,90%.

Para as outras espécies florestais, o TTC apresentou valores de 12,41, 8,38 e 5,02%

para A. mangium, M. caesalpiniifolia e A. indica, respectivamente. Para a casca de M.

caesalpiniifolia, por exemplo, o valor determinado neste estudo para o teor de taninos

condensados está de acordo com o valor de 8,38% observado por Azevêdo et al. (2017). Essa

semelhança pode estar relacionada à idade igual das árvores (5 anos) e também aos métodos

de quantificação utilizados.

4.2 FTIR

Os grupos funcionais dos extratos tânicos de Acacia mangium Willd., Mimosa

tenuiflora Willd, Mimosa caesalpiniifolia Benth, e Azadirachta indica A. Juss. foram analisados

por FTIR. O espectro é apresentado nas Figuras 8 e 9 e as atribuições na Tabela 2.

Devido ao fato de que os extratos vegetais geralmente ocorrem como uma combinação

de vários tipos de compostos bioativos e fitoquímicos com diferentes polaridades, a

separação, identificação e caracterização de compostos é um grande desafio. Desse modo,

a caracterização química apresentada no presente estudo é preliminar, uma vez que, por meio

de FTIR não é possível elucidar completamente a composição química dos taninos, e sim, ter

ideia acerca dos principais grupos funcionais presentes (SASIDHARAN et al., 2011; RICCI et

al., 2015).

Segundo Kassim et al. (2011), o formato da banda de alongamento O-H fornece

informações preliminares sobre a ocorrência de um processo de polimerização. Taninos

vegetais exibem uma variação do grau de polimerizações variando de monômeros únicos, a

oligômeros, a frações com altos graus de polimerização, o que resulta em uma banda larga

distribuída na região espectral 3700 a 3000 cm-1.

Neste estudo, essas bandas referentes à vibração de estiramento O-H em estruturas

fenólicas e alifáticas foi identificada em 3418 cm-1 para A. mangium; 3452 cm-1 para A. indica;

3418 cm-1 para M. caesalpiniifolia 3429 cm-1 e para M. tenuiflora. Essa típica banda larga para

estiramento de O-H observadas nos espectros, segundo Bulut et al. (2009), é a consequência

de uma confluência de bandas substituintes O-H em diferentes posições, em moléculas com

diferentes graus de polimerização, e de múltiplas interações das moléculas de tanino com um

substrato específico.

37

A região de alongamento C-H para compostos aromáticos ocorre na região entre 3100

a 3000 cm-1, podendo estender-se até valores proximos a 2800 cm-1. Neste estudo foram

observados pequenas bandas de vibração em torno de 2925 a 2852 cm-1 em M. tenuiflora, e

entre 2928 a 2799 cm-1 em A. indica, que dizem respeito à movimentos vibracionais de

alongamento C-H. Muito provavelmente, para ambos os tipos de taninos, as bandas

representavam picos menores, uma vez que a ocorrência das interações e o grau de

polimerização não afetaram significativamente as frequências vibracionais das estruturas

moleculares, e a posição e intensidades das bandas não foram altamente modificadas, como

descrito também por diversos outros estudos (COCCIARDI et al., 2005; SOTO et al., 2005;

JAHANSHAEI et al., 2012; CHUPIN et al., 2013; FARIS et al., 2016).

Segundo Ricci et al. (2015), a região de alongamento alifático é diagnóstica, pois pode

fornecer informações sobre a metilação dos taninos condensados e hidrolisáveis. O

alongamento de grupos CH alifáticos exibe bandas finas típicas na região espectral entre 3000

a 2850 cm-1, mais especificamente em torno de 2970 a 2929 cm-1 para grupos metil e em torno

de 2920 a 2780 cm-1 para substituintes metileno, o que foi observado no presente trabalho.

Figura 8- Espectro FTIR dos extratos tânicos de Acacia mangium Willd., Azadirachta indica

A. Juss, Mimosa tenuiflora Willd, e Mimosa caesalpiniifolia Benth.

38

Silverstein (1981) define que a região espectral entre 1620 a 1400 cm-1 refere-se

principalmente a movimentos vibracionais dos grupos C = C nos anéis aromáticos com várias

bandas de características fortes a médias. Segundo Ricci et al. (2015), nos taninos

condensados, ocorre uma absorção dupla ou uma banda forte com um ombro entre 1620 e

1610 cm-1. Nos extratos analisados neste estudo, esses eventos ocorreram nas bandas de

vibração 1605, 1607 e 1604 cm-1 para M. caesalpiniifolia e M. tenuiflora, A. indica e A.

mangium, respectivamente (Figura 8). O alongamento aromático C = C foi observado para os

taninos de todas as espécies deste estudo, nas regiões espectrais 1580 a 1615 cm-1 e 1450

a 1510 cm-1. De acordo com Fernández e Agostin (2007), essas estruturas não são

significativamente afetadas por modificações estruturais devido a diferentes substituintes e

graus de polimerização.

Os taninos de M. caesalpiniifolia apresentaram as bandas C = C mais intensos. Esta

informação combinada com o maior índice de Stiasny aqui determinado para os extratos desta

espécie, reflete a alta pureza desses extratos. O alto índice de Stiasny combinado com altos

picos C = C pode ser considerado como um indicador de pureza dos extratos de taninos de

água quente, conforme relatado por Ntenga et al. (2017).

Os picos observados em 1.567 cm-1 para M. caesalpiniifolia e A. indica, 1.468 cm-1

para M. tenuiflora e 1.566 cm-1 para A. mangium confirmam a vibração de alongamento das

ligações dos anéis aromáticos C = C presentes nos taninos condensados ( NTENGA et al.,

2017; SARTORI et al., 2018). Os picos localizados em 1.450 cm-1 (M. caesalpiniifolia), 1.447

cm-1 (A. indica) e 1.454 cm-1 (A. mangium) resultam particularmente da combinação de flexão

aromática de C-H, alongamento de C-O e deformação de C-OH (KONAI et al., 2017). A banda

de 1.450 cm-1 observada no espectro de M. caesalpiniifolia pode estar relacionada à flexão

assimétrica de CH3 do material proteico liberado junto com os taninos durante o processo de

extração em água quente (KUMAR et al., 2012).

Diversos autores atribuem bandas entre 1.451 a 1.340 cm-1 a deformações

vibracionais de grupos metileno e metila (BADDI et al., 2004; EASTON et al., 2009;

SIRVAITYTE et al., 2011). Eles argumentam que a presença simultânea de alongamento

nítido na região espectral de 2.970 e 2.870 cm-1 e a ocorrência de bandas associadas a

movimentos de flexão específicos observados de 1.460 a 1.380 e 1.330 cm-1, geralmente

denominados deformação de guarda-chuva, constituem fortes evidências de presença de

estruturas metiladas em taninos condensados.

39

Os picos observados entre 1.332 e 1.337 cm-1 para M. tenuiflora e A. mangium (Figura

2), respectivamente, podem ser atribuídos à vibração de flexão plana, como também descrito

por Ping et al. (2012). O pico 1280 cm-1 dos taninos de A. indica corresponde ao trecho C-O

da parte derivada de pirano dos taninos à base de flavan-3-ol. Por sua vez, o pico de 1.240

cm-1 observado no espectro dos taninos de M. tenuiflora representa o alongamento do grupo

C = O dos grupos carboxila, o que pode indicar a presença de resíduos de ácido gálico (KONAI

et al., 2017). A região entre 1.350 e 1.100 cm-1 está relacionada às vibrações de alongamento

do CO, e entre 1.300 e 1.200 cm-1 às vibrações do anel B do tanino, enquanto a faixa de 1.200

a 1.100 cm-1 contém vibrações do anel A (JENSEN et al., 2008; TONDI et al., 2015).

Segundo Socrates (2000) e Konai et al. (2017), os picos que ocorrem entre 1.275 e

1.246 cm-1 são atribuidos à presença de catequina e proantocianidinas. Eles podem ser

claramente observados nos espectros de taninos de M. caesalpiniifolia, A. indica (1.203 a

1.143 cm-1) e A. mangium (1.194 a 1.156 cm-1). Finalmente, picos localizados na região de

900 a 740 cm-1 são atribuídos a movimentos de OH de álcoois aromáticos e à flexão fora do

plano de C-H aromático. Esses tipos de picos estão presentes nos espectros de todos os

taninos avaliados aqui (Figura 9).

Figura 9 - Espectro FTIR dos extratos tânicos de Acacia mangium Willd., Azadirachta indica

A. Juss, Mimosa tenuiflora Willd, e Mimosa caesalpiniifolia Benth.

40

Tabela 2 - Resumo das atribuições dos picos dos espectros de FTIR dos taninos de Acacia

mangium Willd. (AM), Azadirachta indica A. Juss (AI), Mimosa tenuiflora Willd (MT), e

Mimosa caesalpiniifolia Benth (MC)

PICO (cm-1) EVENTO

AM AI MT MC

3425 3439 3438 3418 Estiramento de OH em ligações de hidrogênio

2925 - 2927 - Estiramento C-H em grupos metoxil aromáticos e em grupos metil

e metileno de cadeias laterais

2852 - 2799 - Estiramento C-H em grupos metoxil aromáticos e em grupos metil

e metileno de cadeias laterais

2360 2356 2357 2361 -

2336 2332 2335 2335 -

1605 1605 1607 1604 Ligações C=C aromaticas

1567 1568 1567 1566 Ligações C=C aromaticas

1450 1515 1447 1454 Movimentos vibracionais dos grupos C = C nos anéis aromáticos,

flexão aromática C-H, alongamento C-O e deformação C-OH

1427 1454 1395 1399 Movimentos vibracionais dos grupos C = C nos anéis aromáticos,

flexão aromática C-H, alongamento C-O e deformação C-OH

1410 1332 1280 1337 Região de deformação de CH

1275 1240 1203 1194 Extensão C-O da parte derivada de pirano dos taninos à base de

flavonóides

1248 1153 1143 1156 Extensão C-O da parte derivada de pirano dos taninos à base de

flavonóides

826 793 806 793 Movimentos de deformação do anel aromático de CH

41

4.3 Concentração Inibitória Mínima (CIM)

Os taninos das espécies em estudo, solubilizados em etanol a 20 e 30%,

Dimetilsulfoxido (DMSO) e água destilada, não apresentaram efeito inibitório frente as

bactérias Streptococcus mutans, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei e a levedura

Candida albicans (Figura 10). Desse modo, os resultados encontrados não confirmaram o

potencial antimicrobiano observados em extratos da casca de M. tenuiflora frente a

Streptococcus mutans e Lactobacillus casei (MACÊDO-COSTA et al., 2018); e frente a

Candida albicans (LIBERATO, 2019). Também não estão em conformidade com Lakshmi e

Kumar (2012), Mandava et al (2019), e Prashant et al., (2007), os quais observaram forte

atividade antimicrobiana em extratos de folhas de A. indica frente a S. mutans. Callou et al.,

(2012) também observaram forte atividade antifúngica do extrato bruto da casca Mimosa

caesalpiniifolia Benth frente a C. albicans, o que não foi observado neste estudo.

Figura 10 - Determinação da concentração inibitória mínima (CIM) das substâncias tânicas

frente as linhagens de microrganismos cariogênicos. Em que: (-)= Crescimento bacteriano;

(+)= Efeito inibitório do extrato; A= A. mangium; B= A. indica; C= M. tenuiflora; D= M.

caesalpiniifolia; 1= Streptococcus mutans; 2= Lactobacillus acidophilus; 3= Lactobacillus

casei; 4= Candida albicans; E20% = Etanol a 20%; E30%= Etanol a 30%; D= Dimetilsulfoxido;

AD= Água destilada.

Embora na literatura seja relatado resultados promissores sobre a atividade

antimicrobiana dos extratos vegetais, as diferenças observadas no presente estudo podem

estar relacionadas à complexidade dos extratos e à natureza química dos componentes, uma

42

vez que não é possível elucidar a composição química dos extratos por meio de FTIR. Além

disso, a composição química de extratos vegetais é influenciada por muitos fatores, incluindo

localização geográfica, efeitos sazonais e diversidade biológica, visto que a biodiversidade é

fortemente influenciada pela localização geográfica (JEON et al., 2011).

Embora o efeito das plantas etno-farmacológicas seja de conhecimento popular, a

exemplo do extrato de A. indica que é usado para doenças bucais na Medicina Ayurvédica

(RAJARAJAN et al., 2006), a atividade antimicrobiana de extratos vegetais é inerente à

inúmeros fatores, dentre os quais pode-se citar: características taxonômicas dos

microrganismos testados, a técnica aplicada, características de sítio do local de coleta da

planta, a época da coleta, fenofase da planta, se os extratos foram preparados a partir de

plantas frescas ou secas , a quantidade de extrato testada, às polaridades das substâncias

que compõem os extratos testados, entre outros (FENNEL et al., 2004; OSTROSKY et al.,

2008; SAXENA, 2013).

O efeito inibitório em um antimicrobiano é dependente de características especificas

como: a concentração ideal, a capacidade de atravessar a parede celular, a afinidade pelo

sítio de ligação no interior do micro-organismo e do tempo de exposição. Além disso, o

mecanismo de resistência bacteriano mais frequente é a degradação do antimicrobiano por

enzimas. Considerando que os micro-organismos testados são considerados multirresistentes

na área odontológica, a ausência de atividade antimicrobiana nos extratos analisados pode

estar relacionada ao fato de que os taninos extraídos em agua quente possuem grande

polaridade, são muito reativos e são facilmente oxidáveis através de enzimas, sendo

susceptíveis à ação dessas substâncias (MONTEIRO et al., 2005; RICE, 2006).

Os resultados do presente estudo estão de acordo com Rajarajan et al (2006), Barad

et al, (2014), e Dedhia et al. (2018), os quais não observaram atividade antibacteriana em

extratos tânicos de A. indica, frente a S. mutans, L. casei e C. albicans. Não foram encontrados

na literatura relatos da atividade antimicrobiana de Acacia mangium, o que torna a realização

deste trabalho importante, por ser o primeiro a avaliar o extrato desta espécie frente a micro-

organismos de importância odontológica.

43

5. CONCLUSÕES

A casca de M. tenuiflora apresentou potencial como fonte de taninos em escala comercial

devido ao seu alto rendimento, e que embora a casca de M. caesalpiniifolia tenha apresentado

baixo rendimento de taninos extraíveis, estes apresentam o mais alto grau de pureza,

indicando a possibilidade de direcioná-los para usos finais nos quais essa qualidade é

desejável, como a indústria farmacêutica, por exemplo.

Embora tenha sido possível observar a presença de compostos polifenólicos complexos,

a ausência de atividade antimicrobiana para as espécies testadas pode estar relacionada à

uma combinação de fatores, relacionados tanto a características químicas dos extratos,

quanto a características taxonômicas especificas dos microrganismos testados.

Desse modo, sugere-se a realização de estudos com outras aplicações farmacológicas

para os taninos de M. caesalpiniifolia, como atividade anticarcinogênica, antioxidante, antiviral

e antitumoral, visto que esta espécie apresentou o maior grau de pureza em taninos

condensáveis dentre as espécies avaliadas.

44

6. LITERATURA CITADA

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