PCR (polymerase chain reaction)

Chương II

Taq polymerase

Các bước PCR

1 phản ứng PCR

Nguyên tắc máy PCR

Làm thế nào để phân lập

được gen

I. Giới thiệu

Kary Mullis 1985Nobel 1993

Giới thiệu PCR: phản ứng chuỗi trùng hợp

Là kỹ thuật tổng hợp nhân tạo các đoạn DNA với tốc độ nhanh, có độ chính xác cao, không cần sự hiện diện của tế bào

Phaûn öùng PCR cho pheùp khuyeách ñaïi moät ñoaïn DNA naèm giöõa 2 moài chuyeân bieät, nhôø men DNA polymerase

Nguyên tắc• Dựa trên sự hoạt động của emzyme

• Sự hiện diện của mồi chuyên biệt

• Khả năng nối dài mồi của taq polymerase

• Các nu tự do trong môi trường

Máy PCR

Thực nghiệm Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ mỗi chu

kỳ gồm 3 bước Bước 1: Biến tính (denaturation)

94-98oC 2-5 phút

Bước 2: Gắn mồi (anneealing) 30-65oC 20s-2’

Bước 3: kéo dài (extending) 68-72oC 20s-5’

Thực nghiệm

http://users.ugent.be/~avierstr/pdf/PCR.pdf

III. THỰC NGHIỆM

http://users.ugent.be/~avierstr/principles/pcrani.html

III. THỰC NGHIỆM

http://faculty.plattsburgh.edu/donald.slish/PCRmov.html

Moài Moài (primers)(primers)

= oligonucleotide ñôn maïch (18-24 b) boå sung vôùi 2 vuøng treân trình töï DNAMoài xuoâi (sense primer hoaëc Forward) baét caëp vôùi maïch khuoân cuûa DNA vaø seõ keùo daøi theo chieàu phieân maõMoài ngöôïc (anti sense primer hoaëc Reverse) baét caëp vôùi maïch maõ cuûa DNA vaø seõ keùo daøi ngöôïc theo chieàu phieân maõ 5’

3’

3’5’

3’ 5’ 5’ 3’

THIẾT KẾ MỒI Nguyên tắc

Trình tự của mồi được thiết kế sao cho không có sự bắt cặp giữa mồi xuôi và mồi ngược, kể cả cấu trúc kẹp tóc

Nhiệt độ gắn mồi của mồi xuôi và mồi ngược không được chênh lệch quá xa (Không nên quá nhiều G hoặc C nối tiếp nhau thường tỷ lệ G, C nằm trong khoảng 30%< G+C<70%))

Không nên nhiều bắt cặp sai với DNA khuôn Các mồi được chọn phải đặc trưng cho trình tự DNA cần

khuyếch đại không trùng với các trình tự lặp lại trên DNA

Trình tự nằm giữa mồi xuôi và mồi ngược không quá lớn (<3000 tốt nhất là dưới 1000)

THIẾT KẾ MỒI

Cách thiết kế mồi: Mồi xuôi: cùng trình tự với mạch mã Mồi ngược: là trình tự ngược và bổ sung

với mạch mã Cách tính Tm (nhiệt độ gắn mồi)

Tm = 4(G+C) + 2(A+T)

Polymerase chòu Polymerase chòu nhieätnhieät

Taq-polymerase : töø Thermus aquaticusNhieät ñoä toái öu : 72CCoù hoaït tính 5'->3' polymerase Coù hoaït tính terminal transferase : theâm 1 Adenosine ôû ñaàu 3’ cuûa maïch DNA môùi. Khoâng coù khaû naêng söûa sai (2x10-5 , 0.25% sai sau 30 chu kyø)Sao cheùp ~ 2000b/min. Khoâng sao cheùp ñöôïc treân 3kbPfu-polymerase : töø Pyrococcus furiosusNhieät ñoä toái öu : 72CCoù hoaït tính 5'->3' polymerase vaø 3’-> 5’ exonucleaseTyû leä cheùp sai thaáp (1.5x10-6)Sao cheùp ~ 500b/min

Buffers Có nhiều loại buffer sử dụng riêng

cho từng loại enzyme. Một số buffer chứa chất hoạt

động bề mặt có thể ảnh hưởng đến các phản ứng

Nhiều loại buffer đã có sẵn ion Mg2+

Nồng độ Mg2+ và dNTP Nồng độ ion Mg2+ cao: xuất hiện thêm các sản

phẩm không đặc hiệu. Nồng độ ion Mg2+ thấp: lượng sản phẩm PCR thấp. Nồng độ ion Mg2+ phụ thuộc vào loại DNA

polymerase, DNA mẫu và thành phần buffer gradien nồng độ từ 0.5 đến 2 mM với các khoảng

cách mỗi bước là 0.2 mM. dNTPs là loại hóa chất kém bền Lượng dNTP tối ưu là 200 µM of mỗi loại dNTP. Việc

tăng dNTP không làm tăng đáng kể lượng sản phẩm PCR so với việc hiệu chỉnh các yếu tố khác

Chất khác Đối với các DNA template lớn, giàu

GC thì có thể sử dụng các chất biến tính như DMSO, formamide, glycerol, and betaine trong thành phần PCR.

Tăng lượng DMSO trong PCR sẽ cần giảm nhiệt bắt mồi xuống.

Dầu khoáng

CÁC CHỈ TIÊU ẢNH HƯỞNG ĐẾN PHẢN ỨNG PCR

1. DNA mẫu: (100ng-1g) 2. Enzyme 3. Mồi và nhiệt độ gắn mồi (nhiệt độ lai) 4. dNTP: 20-200M/ mỗi lọai nu 5. Nồng độ Mg++ 6. Số lượng chu kỳ phản ứng 7. Thiết bị và dụng cụ cho phản ứng

Một số vấn đề thường gặp Không có sản phẩm hoặc lượng

sản phẩm quá thấp Kiểm tra lại DNA mẫu, thao tác Tăng thời gian kéo dài, số chu kỳ,

nhiệt độ biến tính Hạ nhiêt độ gắn mồi Primer, buffer

Một số vấn đề thường gặp Vệt smear kích thước lớn hơn sản

phẩm mong muốn Giảm DNA, thời gian kéo dài, số chu

kỳ Tăng nhiệt độ gắn mồi Thay đổi nồng độ Mg2+ Tăng thời gian kéo dài nếu sp mear có

kt nhỏ

Băng sản phẩm phụ rõ nét với kích thước thấp hơn sản phẩm mong muốn

Tăng nhiệt độ bắt mồi 2°C và/hoặc tăng thời gian bắt mồi

Tăng thời gian kéo dài thêm 30s. Giảm nồng độ DNA polymerase. Tối ưu hóa nồng độ Mg2+. Tinh sạch DNA template Giảm nồng độ primer. Thiết kế cặp primer mới.

Một số vấn đề thường gặp

Real-time PCRReal-time PCR

Moät maùy luaân nhieät Moät heä thoáng phaùt vaø ñoïc tín hieäu huyønh quang Chöông trình vi tính ñeå theo doõi vaø phaân tích keát quaû

Quaù trình nhaân baûn Quaù trình nhaân baûn sao ADN trong moät sao ADN trong moät phaûn öùng PCRphaûn öùng PCR

Theàm phaùt hieän

Pha log

Pha bình nguyeân

Pha chaäm

Soá

löôï

ng A

DN

Trong pha Log : Qn = Q0 (E)n

Qn = Soá baûn sao sau n chu kyøQ0 = Soá baûn sao khôûi ñaàuE = Hieäu suaát PCRn = soá chu kyø

PCR coå ñieån : keát quaû chæ ñöôïc bieát sau khi taát caû caùc voøng phaûn öùng ñaõ hoaøn thaønh .

A-6 = 10-6 ngA-5 = 10-5ngA-4 = 10-4ngA-3 = 10-3ngA-2 = 10-2ngA-1 = 10-1ngA1 = 1ng

A-6 A-5 A-4 A-3 A-2 A-1 A1

Real-Time PCR : quaù trình nhaân baûn sao ADN ñöôïc theo doõi tröïc tieáp theo töøng chu kyø. Vôùi kyõ thuaät naøy, ADN ban ñaàu ñöôïc ñònh löôïng moät caùch chính xaùc.

Tín hieäu huyønh quang ñöôïc ño sau giai ñoaïn keùo daøi cuûa moãi chu kyø PCRÖu ñieåm : reû, ñôn giaûnNhöôïc ñieåm : khoâng ñaëc hieäu

Phöông phaùp taïo huyønh Phöông phaùp taïo huyønh quang duøng quang duøng SYBRGreenSYBRGreen

SYBRGreen phaùt huyønh quang khi cheøn giöõa 2 maïch cuûa ADN

Kích thích 490nm

Phaùt quang 530nm

Aùp duïng cuûa PCRAùp duïng cuûa PCRTaïo doøng DNATìm hieåu möùc bieåu hieän cuûa gen (Reverse Transcription PCR)Chaån ñoaùn beänh (cuûa ngöôøi, suùc vaät, caây coái)Phaùt hieän ñoät bieánKieåm tra chaát löôïng (thöïc phaåm, GMO, oâ nhieãm nöôùc…)Phaùt hieän khaùc bieät giöõa caùc boä gen (Ña daïng gen):

aùp duïng trong noâng nghieäp ñeå choïn loïc caây, con

Daáu aán gen (Tìm cha meï, thuû phaïm vuï aùn, giaûi ñaùp nhöõng bí maät lòch söû…)

TÓM TẮT QUY TRÌNH THỰC HIỆN MỘT PHẢN ỨNG PCR

1. Thiết kế mồi2. Chuẩn bị mẫu DNA3. Pha mix với các thành phần theo thứ tự sau:

H2O tiệt trùng Buffer dNTP tổng số mồi xuôi mồi ngược taq polymerase DNA mẫu

4. Cho vào máy lập chương trình chạy phù hợp5. Kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose với sự có mặt

của thang chuẩn6. Phân tích kết quả

RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)

  Escherichia coli : 4 x 106

Saccharomyces cerevisiae : 1,4 x 107

Drosophila melanogaster : 1,6 x 108

Caenorhabditis elegans : 108

Homo sapiens : 3,4 x 109

Arabidopsis thaliana : 108

Oryza sativa 4,3 x 108

Phaseolus vulgaris (đậu) : 2 x 109

Triticum vulgare (lúa mì) 7 x 109

Tulipa 3,5 x 1010

Kích thöôùc boä gen cuûa moät Kích thöôùc boä gen cuûa moät vaøi sinh vaätvaøi sinh vaät (pb) (pb)

Arabidopsis thaliana Drosophila melanogaster Tulipa

Caenorhabditis elegans

Giới thiệuLà phương pháp phân tích đa dạng DNA khuyếch đại

ngẫu nhiên, kỹ thuật này được phát hiện vào năm 1990 (Welsh và McClelland; William và ctv.). Dùng nghiên cứu sự khác biệt di truyền của những loài khác nhau.

Kỹ thuật RAPD dựa trên kỹ thuật PCR, bằng cách sử dụng những primer ngắn (khoảng 10 nucleotide) có trình tự biết trước, bắt cặp và nhân bản ngẫu nhiên những đoạn DNA có trình tự bổ sung với trình tự của các primer

Primer RAPD Là đoạn ngắn oligonucleotide đơn (10mer)

được tổng hợp một cách ngẫu nhiên Để tìm sự khác biệt giữa các loài người ta

thường sử dụng một số lượng lớn các mồi ngẫu nhiên

Trên thị trường hiện nay có rất nhiều mồi ngẫu nhiên được tổng hợp nhân tạo

Nguyên tắc Dùng kỹ thuật PCR, sử dụng mồi là các sợi

oligonucleotide đơn gồm 10 mer có trình tự sắp xếp ngẫu nhiên

SV cùng loài sẽ có kiểu gen hoàn toàn giống nhau, sẽ khuyếch đại các đoạn DNA có kích thước giống nhau khi sử dụng bất kỳ mồi ngẫu nhiên nào để chạy PCR.

SV khác nhau ít nhiều về kiểu gen _ đa dạng về sinh hoc, thì với một số mồi ngẫu nhiên nào đó các đoạn DNA được khuyếch đại sẽ có kích thước khác nhau.

Ứng dụng

Nghiên cứu đa dạng di truyền Phát hiện sự liên kết giữa gen với tính trạng Thiết lập bản đồ di truyền Phát hiện đột biến

Ưu điểm Dễ thực hiện và dễ thành công do không cần biết

trước trình tự bộ gene của đối tượng cần nghiên cứu, thao tác đơn giản

Chất lượng DNA khuôn không cần độ tinh sạch cao. Thời gian thực hiện nhanh. Khả năng nhân bản cao

Chi phí thực hiện thấp. sử dụng kết hợp với những kỹ thuật cao cấp khác để

đánh giá đa dạng di truyền và nhận diện chỉ thị phân tử có độ tin cậy cao

Hạn chế Kỹ thuật RAPD có độ chính xác không cao,

không ổn định Khả năng nhân bản trong phản ứng PCR

cao nhưng khả năng xuất hiện đa hình thấp và độ tin cậy không cao

Khả năng nhận diện chỉ thị phân tử thấp và có độ tin cậy không cao

Sản phẩm điện di RAPD

Hãy thiết kế mồi để khuyếch đại đoạn DNA sau, tính Tm của mồi?

5’aagcgtattgatgttcagaataatgaaaccactaattcaagagtattgtgtgtatgccttgttatttcttcatgatccaagggtttctcgcgtcaacagtatgttctgagctttttgttgttgtcatatctacttattcatgtttggaatgaaatgtcaattgtctcatcttcctaaagtgtatacaagtttttgttctacaatagaactctacaacagctgaatataatgataaaaatagatattttcttggctctttttttcattttacttttcttgacttctcatatggaaccacctccagcaacaaacggacctgttattgcaggttactttgctaattggtaacattgcataacaaaggcaaaaggggagcttaactcaactaactagaatgtaataggggaatctacgatagaaaatacaatgttgttgatgtagctactcaagccaataagttgactcatattttatatgcatttgctaatgtccaaccggatggtcaagttgttcttggggtagtataaattattgcaagatatagaatataataataataattataaatataggacgcttatgcagatattgaaaagcattttccagcaagtaaaaaaataataataaacaaatataaaacctctccctaattcatacataatatgtagaccaagcagtcaaccgaaaagaagatggatggaatgatccaggcaagaacctttacggtaactttaagcagttctatttactcaagcaacaacaccgtcatctcaaagtgtcgcttagcattggcggatatacatggtccactcattttggcccggttgcgcgtgatcctcagaaacgcagattgtttgtagatagcagcatcaaacacctagccaacttgggtctggacgggctagatattgactgggagtaccccaaagatgatgaggaagcgttttattatgtgcatctgctctatgagttgcgactggcgcttgacagatatcaacaacagtgccaacaactgattcagtcgcgactattactcacagtagccgtgccttgtggccctgaccattatcgtaaattgagattgaccgaaatgcaaccttacgtggacctattttacctcatggcatacgactatgctggttcatgggattctttcgcagatcatcaagcggctgtttatggtggcagattgaatacagaacaagcagtacagcactatatcgcctgtggtatccctccatataagctagtcgtaggcatgcctttatatggtcgaggattctgcaatacggcggggccaggtcatcctttccaaggactgcctcgcggtacctgggaagagggtcaatttaattacaagacattgccaaaaccgggcgctgtagaataccacgactttaatcgactagcctcatggtcttatgaccctcaggctcgtgaatttatcacctatgatactacgagatacattaacgt 3’

kết quả

Mồi xuôi: 5’ AAG CGT ATT GAT GTT CAG 3’

Mồi ngược: 5’ ACG TTA ATG TAT CTC GTA 3’

Tm (mồi xuôi) = 4x 7 + 2 x 11 = 50 Tm (mồi ngược) = 4x 6 + 2 x 12 = 48