PPARA GEN I FENPROKUMON : novi prediktor varijabilnosti terapijskog odgovora

1. UVOD

1.1. Koagulacijski sistem

Hemostaza je normalan proces u organizmu koji zaustavlja krvarenje iz oštećenog krvnog

suda. Ovaj proces se odvija putem složenog sistema koji uključuje međusobnu interakciju

između endotela, sistema zgrušavanja, trombocita, sistema fibrinolize i cirkulirajućih

antikoagulansa ( antitrombin, protein C, protein S ).  Patološki proces stvaranja i širenja

ugruška u cirkulaciji se naziva tromboza. Aktivacija koagulacijskog sistema se vrši putem

vanjskog i unutrašnjeg sistema koagulacije. Oba se sistema sastaju na nivou faktora X, pri

čemu započinje zajednički put aktivacije. Aktivacijom faktora VII započinje vanjski put , a

unutrašnji aktivacijom faktora XII. Poslije aktivacije faktora X dolazi do pretvaranje

protrombina ( faktor II ) u trombin. Trombin je odgovoran za pretvaranje fibrinogena ( faktor

I ) u fibrin, koji polimerizira i stvara ugrušak. Svi se faktori koagulacije sintetiziraju u jetri

kao inaktivni proenzim, osim faktora VIII ( von wilebrandov faktor ) koji nastaje u endotelu i

megakariocitima. Laboratorijska pretraga aPTV ( aktivirano parcijalno tromboplastinsko

vrijeme ) ovisi o unutrašnjem faktoru, dok vanjski put o PV-u ( protrombinsko vrijeme )

Izražava se najčešći kao INR ( internacionalni normalizirani omjer ) i iznosi normalno 1.0

1.2. Lijekovi koji djeluju na koagulaciju krvi

A.Antikoagulansi -sprječavaju nastanak fibrina-(heparini i antagonisti vitamini K)

B.Antitrombocitni lijekovi-lijekovi koji utiču na agregaciju trombocita

C.Trombolitici (Fibrinolitici) -lijekovi koji otapaju fibrin

1.2.1. Antikoagulansi

U medicinskoj praksi spadaju među najčešće korištene lijekove jer veliki broj bolesti

uzrokuje sklonost razvoju trombozi, među kojima spadaju kardiovaskularne bolesti.

Antikoagulansi su lijekovi koji se koriste u liječenju i prevenciji razvoja tromboze i

tromboembolije. Antikoagulasi i antitrombociti čine sastavni dio kombinovane terapije kod

kardiovaskularnih oboljenja U terapiji i prevenciji venskog i arterijskog trombo-embolizma

široku primjenu su našli kumarinski antikoagulansi ( antagonisti vitamina K). Prilikom

terapije sa najčešće korištenim antikoagulansima ( varfarin, acenokumarol, fenprokumon)

dolazi do pojava komplikacija prilikom definisanja odgovarajuće doze datih lijekova kao i

pojave visoko individualne varijabilnosti u odgovoru na primjenjenu terapiju

1.2.2. Derivati kumarina

Otkriće kumarinskih antikoagulanasa prethodilo je

trovanje goveda biljkom Meliotus officinalis ( žuti

kokotac ) koja je kod njih izazvala hemoragijsku

bolest. Naknadnim istraživanjem identificirana je

tvar bishidroksikumarin, a kasnije sintetizirani

dikumarinski derivati

Slika 1. Meliotus officinalis

Fenprokumon i acenokumarol, koji predstaljaju derivate kumarina, široko se propisuju u

zemljama kontinentalne Evrope i Latinske Amerike. Međusobna razlika se ogleda u

farmakokinetičkim osobinama tako npr. acenokumarol ima znatno kraći poluživot (2-8h) u

poređenju sa varfarinom (30-45h) ili fenprokumonom (156-172h) . Doprinos genetike u

varijaciji kinetike i potrebnoj dozi je značajniji za vrafarin nego za acenokumarol ili

fenprokumon. S druge strane, prilagođavanje doze varfarina je lakše nego za fenprokumon ,

kako zbog kraćeg poluživota ,tako i vremena potrebnog za postizanje ravnotežnog stanja (3).

U derivate kumarina spadaju varfarin, fenprokumon i acenokumarol koji predstavljaju oralne

antikoagulanse. Oralni antikoagulansi se koriste za različite terapije i profilakse

tromboemolijskih poremećaja

1.2.2.1. Fenprokumon

Fenprokumon se rijetko upotrebljava, ali izuzetak su neke evropske zemlje kao i nekoliko

brazilskih gradova gdje ima široku primjenu (1).

Fenprokumon spada u dugodjelujuće kumarinski antikoagulanse. Široku primjenu su pronašli

u liječenju i prevenciji tromboembolijskih bolesti, uključujući vensku trombozu,

tromboemboliju, te plućnu emboliju. Također se koristi za prevenciju i liječenje ishemijskog

infarkta kod pacijenata s atrijskom fibrilacijom. Oralna bioraspoloživost je blizu 100% s

dugim poluvremenom eliminacije (5-6 dana). Izlučivanje lijeka se djelomično odvija direktno

putem bubrega ili žuči. U urinu ili fecesu se izlučuje kao konjugirani fenprokumon i to oko

40% oralno uzete doze, dok se ostalih 60% izlučuje u obliku konjugata 4'-, 6- i 7-

hidroksifenprokumona. Eliminacija fenprokumona, u poređenju s acenokumarolom, manje je

ovisna o CYP2C9. Polimorfizmi CYP2C9 su povezani s većim rizikom od prekomjerne

antikoagulacije i krvarenja za oba lijeka .

2

Slika 2. Struktura fenprokumona ( 3D i 2D prikaz)

Eliminacija fenprokumona se u većoj mjeri odvija hepatičkom biotransformacijom u

inaktivne monohidroksilirane metabolite, a u manjoj mjeri se reducira. Uz pomoć enzima

CYP2C9 podliježe 4'-, 6- i 7-hidroksilaciji , uz doprinos i enzima CYP3A4. Glavni

metabolički put je 7-hidroksilacija, dok 8-hidroksilacija predstavlja sporedni. Svi

hidroksilirani metabololiti se konjugiraju do pripadajućih glukuronida i sulfata, te se

detektiraju u ljudskoj plazmi i urinu. 4'-, 6-, 7- i 8-hidroksilaciju S fenprokumona katalizira

polimorfni CYP2C9 , ali je ukupna količina stvorenih metabolita pod istim uvjetima

ispitavanja 5 puta manja nego kod S-varfarina. Za razliku od R-enantiomera fenprokumona,

S-fenprokumon je imao veću hidroksilacijsku stopu u ljudskim jetrenim mikrosomima.

3D D

Enzim CYP2C9 najviše doprinosi 6- i 7-hidroksilaciji za oba enantiomera fenprokumona .

Važnu ulogu u S-4'-hidroksilaciji ima enzim CYP2C8. Polimorfni enzimi CYP2C8 i CYP2C9

su katalizatori velikog afiniteta, dok enzim CYP3A4 pokazuje niski afinitet

Zbog dužeg poluživota, fenprokumon dovodi do stabilnije antikoagulacije u poređenju sa

acenokumarolom i mogu biti manje osjetljive na efekte CYP2C9 polimorfizma

1.2.2.2. Neželjena djelovanja, interakcije i kontraindikacije fenprokumona

Neželjena djelovanja fenprokumona se mogu svrstati u tri katergorije:

1. Ozbiljne i ireverzibilne koje mogu uzrokovati dodatne komplikacije kao što je

krvarenja , nekroze kože , hematom , probleme sa disanjem

2. Efekti uzrokovani nakon akutnog predoziranja fenprokumonom (melena –

crna,katranasta stolica ; hematurija , žutica , pankreatitis, krvarenja)

3. Nuspojave koje nisu ozbiljne i mogu se tretirati simptomatski (alopecija , proljev,

mučnina, povraćanje , gubitak apetita , zamagljen vid , glavobolja)

Fenprokumon je kontraindiciran u sljedećim stanjima :

o Čir, teže menstrualne tegobe, dijabetes, prilikom poremćaja rada bubrega i jetre, visok

krvni pritisak ,

o Artritis, poremećaj rada štitne žlijezde,

o Nedavna operacija, infekcije,

o U trudnoći ,tokom dojenja

o Problemi sa krvarenjem ili zgrušavanjem krvi, uzimanje varfarina kako bi se spriječilo

formiranje ugruška

Interakcije fenprokumona sa drugim lijekovima:

1. Holestiramin- Zbog enterohepatičnog kruženja i dugog poluživota fenprokumona,

interakcija između ova dva lijeka se ne može se izbjeći. Preporučuje se izbjegavanje davanja

holestiramina sa lijekovim koji podližu enetrohepatičnim kruženjem

2. Metformin (HCl)-ubrzava eliminaciju fenprokumona

3. Reviparin-Natrijum- stvara mogućnost pojačanog djelovanja lijeka

1.2.2.3. Mehanizam djelovanja fenprokumona

Mehanizam djelovanja fenprokumona je sličan mehanizmu djelovanja drugih derivata

kumarina, a zasniva se na inhibiciji redukcije vitamina K, koji dovodi do smanjenja sinteze

faktora koagulacije II, VII,IX ,X (1).

Fenprokumon djeluje kao antagonist vitamina K koji je neophodan za sintezu faktora

koagulacije II,VI,IX i X u jetri. Karboksilacija faktora zgrušavanja ovisnih o vitaminu K,

katalizirana je jetrenim enzimom karboksilazom, a pod utjecajem reduciranog oblika vitamina

K (vitamin KH2), kisika i ugljičnog dioksida. Vitamin KH2 se u toj reakciji oksidira u

vitamin K epoksid koji se reciklira u vitamin K pomoću vitamin K epoksid reduktaze, zatim

se ponovo reducira u vitamin KH2 pomoću vitamin K reduktaze. Inhibicijom vitamin K

epoksid reduktaze i vitamin K reduktaze sprječava se redukcija nastalog oksidiranog oblika

vitamina KH2 nazad u vitamin K. Rezultat je nagomilavanje epoksida i manjak vitamina K.

Fenprokumon blokira regeneraciju reducirane forme vitamina K koji je bitan koenzim u

karboksilaciji glutamatskih ostataka u prokoagulantne oblike faktora II,VI,IX i X u

koagulacijskoj kaskadi. Dolazi do smanjene produkcije aktivnih faktora koagulacije,

trombina i fibrina i inhibicije koagulacije što je i djelovanje fenprokumona

Veoma važnu ulogu u metabolizmu derivata kumarina predstavlja enzim CYP2C9. Međutim,

biotransformacija fenprokumona se većim dijelom dešava preko CYP3A4 enzima. Kao glavni

dio istraživanja mnogih lijekova su studije upravo o CYP3A4 izoenzimu

U odnosu na varfarin , kod fenprokumona je teže prilagoditi dozu, zbog kraćeg poluživota i

vremena potrebnog za postizanje ravnotežnog stanja. CYP3A4 polimorfizam ima manji

doprinos promijenjenog metabolizma fenprokumona. Zato se ponekad kod pacijenata koji su

nositelji CYP2C9*2 i CYP2C9*3 alela fenprokumon preferira kao alternativni lijek. Kod

pacijenata sa mutiranim varijantama CYP2C9 prosječno smanjenje potrebne doze

acenokumarola i fenprokumona bilo je najviše 1/3 prosječne doze primijenjene kod ispitanika

sa izvornim ''wild type'' alelom. To indicira na razliku u ovisnosti ovih lijekova o genetičkom

polimorfizmu CYP2C9 u usporedbi s varfarinom.

1.3. CYP3A4

S obzirom na istovremenu primjenu određenih lijekova, dosadašnje studije ukazuju na

ozbiljne pa čak i fatalne ishode kod pacijenata koji su na režimu istovremene primjene više

lijekova. Tako se mogu uočiti varijacije kroz pregled pacijentove trenutne terapije, s

naglaskom na biotransformaciju lijekova. Za lijekove koji se metaboliziraju preko CYP3A4 i

koji zahtjevaju periodično praćenje razine lijeka u krvi, kako bi se izbjegle interakcije s

drugim lijekovima koji se isto metaboliziraju preko CYP3A4, potrebna je kontrola

mehanizma doziranja. Kod propisivanja lijekova koji dijele zajednički put metaboliziranja

preko CYP3A4 izoenzima, problem se uočava za lijekove čije se razine ne mjere, odnosno ne

prate. Tako može doći do toksičnosti sa vrlo ozbiljnim posljedicama, kada se dostigne

određena razina koja je neželjena

CYP3A4 ima promjenljivu intraindividualnu i interindividualnu ekspresiju gena prvenstveno

zbog nekoliko faktora: upalnih bolesti, interakcija lijekova i genetski faktori. U nedavnom

izvještaju o CYP3A4 alelu ,CYP3A4*22, se navodi da je on povezan sa djelovanjem

simvastatina i takrolimusa

Spomenuti takrolimus, supstrat je CYP3A4 izoenzima. Sok od grejpfruta može biti jeftin

način smanjenja doze takrolimusa

Slika 3. Inhibicija citohroma P450 3A4 sa sokom od grejpfruta u tankom crijevu

Ali nepredvidljivi prirodni način inhibicije njegovog mehanizma nije objašnjen u ovom

istraživanju. Dok, što se tiče simvastatina, dodavanjem u terapiju nekog od inibitora CYP3A4

izoenzima dolazi do velike mogućnosti nastanka rabdomiolize Za alelnu varijantu

CYP3A4*22, u više studija dokazano je da je povezana sa smanjenom aktivnošću CYP3A4

izoenzima. Moguće je da nositelj ovog polimorfizma zahtijeva smanjenje doze takrolima,

kako bi bilo omogućeno dostizanje ciljane rezidualne koncentracije (Co). Pacijenti sa

presađenim bubrezima su bili grupa na kojima je ispitana je ova hipoteza.

Postoji slaba povezanost ili odsutnost između polimorfizma CYP3A4 gena i doze

fenprokumona. Međutim, istraživanja nisu obuhvatila povezanost CYP3A4*22 i doziranja

fenprokumona u različitim studijama

Za CYP3A4*22 je uočeno da je povezan sa slabijom ekspresijom i aktivnošću CYP3A4

izoenzima. Istraženo je koliko se CYP3A4*22 ''single nucleotide'' polimorfizam (SNP)

odražava i utječe na serumske koncentracije, kod pacijenata koji primjenjuju lijekove koji se

metaboliziraju preko CYP3A4 i CYP2D6 izoenzima, te su uspoređeni sa utjecajem CYP2D6

polimorfizma. Također, utvrđeno je da heterozigotno prisustvo CYP3A4*22 neće dovesti do

rasta serumskih koncentracija lijekova metaboliziranih preko oba, CYP2D6 i CYP3A4, dok

polimorfizam CYP2D6 izoenzima se odražava na serumsku razinu .

U jednoj in vitro studiji cilj je bila identifikacija CYP enzima kataliziranih S- i R-

hidroksilacijom fenprokumona do inaktivnih metabolita. PPC brzina hidroksilacije znatno

korelira sa CYP2C9 i CYP3A4 aktivnošću i ekspresijom 11 različitih CYP-ova, koji su

ispitivani. Kontroliranim dodavanjem CYP3A4 specifičnog inhibitora triacetiloleandromicina

(TAO) i monoklonalnog inhibitornog antitijela, postignuta je kompletna inhibicija PPC

hidroksilacije, u odnosu na CYP2C8, 9, 18 i 19. Izuzev (R) 4'-hidroksilacije koja je bila

inhibirana sa 80% korištenog samog TAO. Kao glavni katalizatori (S) i (R) fenprokumon

hidroksilacije su CYP2C9 i CYP3A4, dok CYP2C8 jeste djelomičan katalizator, i to samo

(S)-4' hidroksilacije. Kada se radi o tretmanu sa fenprokumonom koji je kombiniran sa

drugim supstratima, induktorima ili inhibitorima ovih enzima, mora se posvetiti posebna

pažnja .

Intermolekularni gen ima važnu ulogu u regulaciji CYP3A4. Nuklearni receptor PPARA

(peroksizom proliferator-aktivirani receptor-alfa) gena je smješten na 22q13.31 hromozomu i

i sastavljen je od devet egzona. Introni rs4253728 i rs4823613 polimorfizma su povezani

smanjenjem aktivnosti i ekspresije CYP3A4 enzima(1). Do sada je dokazano da bi, budući da

CYP3A4*22 značajno utječe na ekspresiju CYP3A4, mogao biti i potencijalni biomarker za

CYP3A4 fenotip. Postoje izvještaji da alelna učestalost CYP3A4*22 iznosi 5-8 % za kavkaze,

učestalost kod američkih afrikanaca i kineza je 4,3% .

1.4. CYP2C9

CYP2C9 ima primarnu ulogu u metabolizmu antikoagulanasa, antiinflamatornih lijekova i

hipoglikemika. Postoje identificirana tri mutirana CYP2C9 alela. CYP2C9*2 i CYP2C9*3 su

odgovorni za deficit CYP2C9, oni kodiraju sintezu enzima sa smanjenim afinitetom za

supstrate. Variranje ovih polimorfizama, kod različitih populacija, iznosi 1-13%. Kod 8-13%

bijelaca prisutan je deficit ovog enzima, 2-3 % afro-amerikanaca i manje od 1% azijata.

Poseban značaj kliničke relevantnosti CYP2C9 varijabilnosti jeste pri terapiji sa lijekovima

koji se koriste kod dijabetesa Tipa 2, jer može doći do hipoglikemije usred smanjenja klirensa

lijeka. Često su pacijenti kojima je potrebna niža doza varfarina, nositelji dvije ili više alelnih

varijantnih CYP2C9 alela i time su izloženi povećanom riziku krvarenja tijekom terapije s

varfarinom, zbog sporijeg metaboliziranja lijeka .

1.5. Peroksizomni proliferatorom aktivirani receptori

PPAR receptori ili peroksizomni proliferatorom aktivirani receptori (engl. Peroxisome

proliferator activated receptor) spadaju u podgrupu steroidnih hormonskih receptora a

njihovom stimulacijom dolazi do promjene transkripcijskog procesa. PPAR receptori se

nalaze u jezgri stanice. Poznate su tri podgrupe: PPAR α, PPAR б, PPARγ .

Sve tri podgrupe imaju ulogu kao faktor transkripcije. PPAR receptori kontroliraju i reguliraju

ekspresiju gena koji sudjeluju u reguliranju metabolizma glukoze, lipida, homeostaza,

adipogenezu, osjetljivost na inzulin i ćelijski rast i upala (Slika 4)

Slika 4. Regulacija transkripcije ciljnih gena PPAR

1.5.1. Mehanizam djelovanja PPAR

Podgrupe PPAR razlikuju se po specifičnosti liganada i distribuciji u tkivima. Vezivanjem

peroksizomni proliferatorom aktiviranih receptora dolazi do aktivacije masnih kiselina,

eikozanoida i ksenobiotika. Prije vezivanja liganda dolazi do formiranja kompleksa.

Heterodimer PPAR formira kompleks sa retinoid X receptorima(RXR). Formirani kompleks

veže se na specifične DNA sekvence poznate kao PPAR odgovorni elementi u području

promotora ciljnih gena (Slika 5). Nakon vezivanja PPAR za ligande dolazi do

konformacijskih promjena koje omogućavaju otpuštanje korepresora i jačanje koaktivatora

nakon čega se aktivira transkripcija

Slika 5. Mehanizam PPAR transkripcije gena.U inaktivnom stanju PPAR stupa u interakciju sa

korepresorima, inhibira se proces transkripcije. Nakon vezivanja egzogenog ili endogenog

liganda dolazi do jačanja koaktivatora i aktivira se proces transkripcije

Kao aktivatori PPAR identificirani su razni endogeni i egzogeni ligandi. Ligandi imaju ulogu

da jačaju koaktivatore i otpuštaju korepresore i na taj način aktiviraju transkripciju gena.

Kao endogeni ligandi najpoznatiji su dugolančane polinezasićene masne kiseline,

prostaglandini. Smatra se da se aktivacija endogenih liganada javlja tokom gladovanja.

Egzogene ligande predstavljaju lijekovi poput fibrata (bezafibrat, gemfibrozil, klofibrat i

fenofibrat) koji se koriste u liječenju dislipidemija i kardiovaskularnih bolesti kao i u

kombinacijama sa statinima

1.5.2. Peroksizomni proliferatorom aktivirani receptor α

PPAR-α je prvi identificirani PPAR receptor. Aktivira proliferaciju peroksizoma. Prisutan je u

tkivima, jetri, bubrezima, srcu, mišićima, stanicama krvnih žila, endotelnim stanicama i

monocitima. PPAR-α je ključni regulator gena uključenih u oksidaciju masnih kiselina koji se

nalaze u mitohondrijama, peroksizomima i mikrozomima jetre

Ima ulogu u transkripciji i nivou proteina kritičnih enzima u β-oksidacije i ω-

oksidacije,acilCoA okidaze, metabolizmu lipoproteina, katabolizmu holesterola,

glukoneogenezi, ketogenezi, i citohrom P450 enzim 4A (CYP4A)

Povećanjem ekspresije gena, PPAR-α ligandi aktiviraju oksidaciju jetrene masne kiseline.

Genetička inaktivacija PPAR-α gena dovodi do nakupljanja lipida u jetri, teške

hipoketonemija, hipoglikemija, hipotermije i povećan nivo slobodnih masnih kiselina

Slika 6: Shematski prikaz hepatocita sa različitim funkcijama PPAR α

PPAR-α reguliraju ekspresiju gena za transport proteina i enzima koji su uključeni u

procesima upale. Povećanjem β-oksidacije masnih kiselina sprječava se nakupljanje lipida i

toksičnost u stanicama. PPAR stimuliraju staničnu absorpciju masnih kiselina povećanjem

ekspresije proteina za prijenos masnih kiselina

1.5.3. Uloga PPAR-α u metabolizmu lipida

PPAR-α ima važnu ulogu u metabolizmu lipida. Uključen je mnoge procese uključujući

apsorpciju, vezivanje i oksidaciju masnih kiselina, transport lipida. Egzogeni ligandi PPAR-α

su fibrati (bezafibrat, gemfibrozil, klofibrat i fenofibrat) koji se koriste u kao hipolipemična

sredstva.PPAR-α prisutan je u jetri i aktiviranje ovog receptora potiče ekspresiju citohroma

P4504A (CYP4A). CYP4A podgrupa citokrom P450 enzima koji katalizira ω-hidroksilaciju

masnih kiselina i smanjivanje sintezu trigliceridaPPAR-α agonisti koriste se za liječenje

dislipidemija, koji karakterizira smanjen nivo triglicerida i povišen nivo HDL-C u plazmi.

Stanje dislipidemije se može postići povećanjem proizvodnje glave komponente HDL-C tj.

Apolipoprotein A-I i Apolipoprotein A-II (APO A-I i APO-II) koji ima važnu ulogu u

transportu holesterola. PPAR-α smanjuje nivo triglicerida pojačavanjem ekspresije lipoprotein

lipaze (LPL) i dovodi do inhibicije Apo C-III u jetri

1.5.4. Uloga PPAR u drugim mehanizmima

PPAR ligand ima ulogu u terapijskim područijma kao što su dijabetes, pretilost,

kardiovaskularne bolesti i upala. Diabetes mellitus je povezan sa povećanim rizikom od

razvoja ateroskleroze i infarkta miokarda. U novije vrijeme u terapiju antitromboze uključeni

su PPAR ligandi.Trombociti imaju važnu ulogu u hemostazi i trombozi, uključeni su u

mehanizme upale i odbrani domaćina. Trombociti pridonose patogenzi i progresiji

vaskularnih komplikacija u T2DM. Trombociti su stanice bez jezgre, sadrže transkripcijske

faktore, peroksizom proliferator aktivirani receptor (PPAR). Za prevenciju tromboze i

kardiovaskularnih bolesti od koristi može biti primjena protrombocitnih sredstava.Mnogi

rezultati pokazali su da agensi s aktiviranom PPARs djeluju protiv aktivnosti trombocita.

Nakupljanje trombocita olakšava aktivaciju PKCα u trombocitima. Lijekovi kao što su

simvastatin i fenofibrat inhibiraju aktivaciju trombocita inhibicijom PKCα koji su povezani s

PPAR. Selektivni PPAR-γ antagonist GW9662 i PPAR-α antagonist GW6471 pokazali su

inhibiciju o djelovanju i simvastatina i fenofibrata na funkciju trombocita. Aktivacijom

PPAR-α / -γ dolazi do nakupljanja α-liponske kiseline .