PRACTICA No. 16 MEDIO DE CULTIVO PARA EL AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE ENTAMOEBA HISTOLYTICATipo de prctica: Individual OBJETIVOS:1. Que el alumno aprenda a realizar el medio de cultivo LES (suero de huevo

de Locke) de Boeck y Drbohlav.2. Observar las formas morfolgicas de E. histolytica en un cultivo.

INTRODUCCION: La E. histolytica es un protozoo peteneciente a la familia Entamoebidae, orden ambida, clase lobosea, phyllum sacomastigophora, descubierta en 1875 por Lsch en las heces de un ruso que presentaba disentera grave, este parasito causante de la amebiasis que es una infeccin que se manifiesta a nivel intestinal y extraintestinal ya que es invasiva y recurrente, E. histolytica ocupa el primer lugar de los protozoos entricos que atacan al hombre. E. histolytica presenta una morfologa en su trofozoto con un tamao de 15 a 20 micras, con una movilidad activa en progresin, presenta pseudpodos grandes en forma de dedos, un ncleo que difcilmente se logra observar. Los primeros xitos logrados para el cultivo de E. histolytica, los obtuvieron Boeck y Drbohlav en 1925, con su medio. Ellos han descrito dos variantes: LES (suero de huevo de Locke) y LEA (Albmina de huevo de Locke) los cuales se diferencian en la composicin del sobrenadante. Los medios de cultivo son de gran ayuda para realizar un diagnostico completo en las protozoos humanas aunque en la mayora de laboratorios de Parasitologa no se utilizan. MUESTRAS BIOLOGICAS REQUERIDAS: 1 Muestra de materia fecal

MATERIAL 1 matraz erlenmeyer 1 matraz aforado de 1000 ml 2 tubos de ensayo 2 vasos de precipitados 1 pipeta Pasteur con bulbo

3 aplicadores

4 huevos 5 perlas de vidrio REACTIVOS Alcohol

Agua destilada ............................ 1.000.0 ml Cloruro de sodio NaCl .................... 9 g Cloruro de potasio KCl .....................0.4g Cloruro de calcio anhidro.................. 0.2g Cloruro de magnesio MgCl2 ............. 0.2g Bicarbonato de sodio ........................ 0.2g Dextrosa ......................... 2.4g

Suero humano estril EQUIPO Autoclave Incubadora TECNICA: Medio de cultivo LES (suero de huevo de Locke) de Boeck y Drbohlav PROCEDIMIENTO PARA PREPARAR LA SOLUCION DE LOCKE

1. Se disuelven en 500 ml de agua destilada

1.1. 9 g de cloruro de sodio 1.2. 0.4 g de cloruro de potasio 1.3. 0.2 g de cloruro de calcio anhidro. 2. Por separado se disuelven2.1. 0.2 g de bicarbonato de sodio.

3. Se mezclan las dos soluciones3.1. Se agregan 2.4 g de dextrosa

3.2. Se vaca la mezcla a un matraz aforado de 1000 ml y se afora hasta la marca.

PROCEDIMIENTO PARA EL MEDIO DE CULTIVO 1. Se lavan 4 huevos, se limpian con alcohol, se rompen y se vacan en un matraz con perlas de vidrio 2. Se agregan 50 ml de solucin de Locke y se agita enrgicamente 3. Se coloca suficiente mezcla de huevo con Locke, de tal manera que se inclinen los tubos a 304. Se colocan los tubos en un coagulador y se calienta a 70 C hasta que se

solidifique.

Proceso de Esterilizacin1. Se sacan los tubos y se esterilizan en autoclave a 15 lbs de presin,

durante 20 min. Se prepara el sobrenadante con una mezcla de 8 partes de solucin de Locke estril son una parte de suero humano estril e inactivado a 56C durante 30 minutos.

Recomendaciones:

En caso de que se dude de la esterilidad del suero, se filtra a travs de una membrana. Se coloca el sobrenadante en cantidad suficiente para cubrir la parte inclinada. Se incuba durante 24 hrs para comprobar su esterilidad.

Sembrado El inoculo se hace de la muestra preferentemente donde haya moco, sangre o ambos.

1. Si las heces son formadas la inoculacin deber hacerse con un aplicador de madera 2. Si son liquidas con una pipeta Pasteur 2.1. Un gramo ser suficiente para la inoculacin

RESULTADOS:

Dibuje o pegue lo que observo en la prctica.

OBSERVACIONES

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CONCLUSIONES __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________

CUESTIONARIO 1. De acuerdo al control de esterilidad cuales son los factores a los que se debe de conservar el cultivo? Debe incubarse durante 24 horas a 37 C2. Cul es la fase infectante de E. histolytica?

El quiste tetranucleado3. Durante que periodos de tiempo un cultivo de E. histolytica debe ser

analizado? Se revisan microscpicamente a las 24, 48 y 72 horas, tomando una gota del sedimento que se forma en el fondo del bisel para buscar trofozotos, generalmente un cultivo positivo aparece a ms tardar a las 48 horas.

MEDIDAS DE SEGURIDAD Y SALUD OCUPACIONAL A. Materiales y Equipo de Uso Personal 1. Bata de Laboratorio - Durante todo el tiempo que est llevando a cabo su ejercicio de laboratorio, debe utilizar bata de laboratorio. La misma tiene que estar abrochada para que pueda proteger su ropa y su piel en caso de que alguna sustancia qumica o de organismos vivos se derrame sobre usted. 2. Vestimenta - La vestimenta deber ser apropiada para trabajar en el laboratorio. NO se permite dejar al descubierto reas considerables de su piel cuando utiliza pantalones, faldas o blusas cortas. El calzado tambin est incluido con la vestimenta. Todo estudiante que tenga sandalias, chancletas o zapatos abiertos en la cual su piel queda expuesta, no podr hacer su experimento. 3. Gafas de Seguridad - Todo el tiempo que permanezca en el laboratorio, deber tener sus gafas de seguridad adecuadas. Los espejuelos recetados no sustituirn las mismas. Tampoco puede utilizar los lentes de contacto. Entre el ojo y el lente puede alojarse alguna sustancia nociva causando dao permanente a su visin, as como tambin pueden reaccionar con algn compuesto voltil. 4. Cabello Largo - Si tiene cabello largo, el mismo tiene que estar recogido todo el tiempo que trabaje en el laboratorio. B. Manejo y Localizacin del Equipo de Seguridad - Es indispensable que conozca donde estn los equipos de seguridad del laboratorio. Entre ellos puede encontrar: extintor de incendio, ducha de seguridad y lavadero de cara y ojos, frazada (manta) para sofocar llamas en la ropa. De tener alguna duda de su localizacin o uso, no dudes en preguntar al instructor del laboratorio. Siempre que utilice cualquier sustancia qumica, debe manejar la misma en las campanas de extraccin localizadas en el laboratorio, de esta manera se minimiza la posibilidad de que caiga sobre las personas si ocurre un accidente y evitar cualquier intoxicacin con los gases o vapores de los qumicos. C. Higiene - Se recomienda que lave sus manos frecuentemente. Antes, durante y despus de terminar su prctica de laboratorio. Recuerde que fumar, comer o beber envuelve el acercar las manos a la boca, siendo sta la manera ms directa de intoxicarse con sustancias qumicas o infecciosas. Ingerir cualquier tipo de alimento y fumar, estn estrictamente PROHIBIDO mientras usted est en el rea de los laboratorios y pasillos cercanos. DISPOSICION DE DESECHOS QUIMICOS, FISICOS Y BIOLGICOS E. Desperdicios - Se prohbe descartar reactivos por los fregaderos. El instructor proveer envases adecuados previamente rotulados para dicho propsito. Los desperdicios biomdicos deben ser depositados en las bolsas rotuladas y

destinadas para dicho propsito. Colocar en tres vasos desechables solucin e hipoclorito de sodio a una concentracin de 5000 ppm y en uno colocar los tubos y lavar muy bien con hipoclorito de sodio para quitarle los residuos de materia fecal, en otro vaso se debe de colocar los aplicadores de madera durante unos 30 minutos aproximadamente. El frasco que contiene materia fecal adicionarle solucin de hipoclorito de sodio a 5000 ppm o cal, cerrar el frasco y desechar a la basura comn.

BIBLIOGRAFIA1. De Haro Arteaga, Salazar Schettino, Paz Mara y Cabrera Bravo Margarita. Diagnstico morfolgico de las parasitosis. Segunda edicin. Editorial Mndez Editores. 2003. 2. Marco Antonio Becerril. Parasitologa Mdica. Segunda edicin. Editorial: Mac Graw Hill 2008.

3. DAVID BOTERO MARCOS RESTREPO. Parasitosis Humana. TERCERA EDICION.Medelln, Colombia. 1998.