Práctica y resultados DETECCIÓN DE ADN TRANSGÉNICO (1)

“Curso de extracción y cuantificación de ADN y ARN”

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Consolidado


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Universidad del País Vasco Euskal Erriko Universitatea

MÁSTER EN CALIDAD Y SEGURIDAD ALIMENTARIA

ORGANISMOS TRANSGÉNICOS

IDENTIFICACIÓN DE ADN TRANSGÉNICO

MAESTRANTE: María Teresa Pacheco

TUTOR: Phd. MSc. Marian Pancorbo

Mayo 2012



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1. EXTRACCIÓN ORGÁNICA DE ADN: MÉTODO CTAB

Encender el baño o termomix para que alcance la temperatura de 60 ºC.

Resuspender cada muestra en 500 µl de H20 milliQ estéril. Añadir los volúmenes

correspondientes a los reactivos del buffer de lisis que se indican en la siguiente

tabla:

Reactivo Volumen

Buffer lisis CTAB 2% 1 ml

Proteinasa K 20 mg/ml 20 l

2-mercaptoetanol 20 l

Mezclar bien todos los reactivos, cerrarlos con las bridas y colocarlos en una

gradilla para incubar en el baño con agitación constante a 60 ºC durante 90

minutos.

Centrifugar durante 3 minutos aproximadamente a 13000rpm. Trasvasar el

sobrenadante a otro tubo eppendorf de 2 ml.

Añadir 1 ml de Fenol/Cloroformo-Isoamiloalcohol (25:24:1). Voltear el tubo para

homogeneizar las fases y centrifugar a 13.000 g durante 10 min.

Recuperar la fase acuosa en otro tubo eppendorf previamente etiquetado.

Precipitar el ADN añadiendo 2/3 del volumen de isopropanol y 1/10 del volumen

de acetato sódico 3M recuperado tras el fenol. Voltear varias veces (mínimo 15-20

veces) viéndose la madeja de ADN.

Seguidamente centrifugar durante 5 minutos tras lo cual el sobrenadante es

eliminado y el pellet es resuspendido en 200 µl de buffer TE 1X y tratados con 20 µl

de RNase A (10 mg/ml) para digerir cualquier contaminación con RNA.

Tras 30 minutos de incubación a 37 ºC, tratar las muestras con 200 µl de

cloroformo:isoamiloalcohol (24:1) para eliminar el enzima RNasa A.

Trasvasar la fase acuosa a un tubo eppendorf de 1,5 ml y precipitar de nuevo con

1 volumen de isopropanol y 1/10 del volumen de acetato sódico 3M. Tras una

centrifugación de 5 minutos a 13.000 rpm, el sobrenadante es eliminado y el ADN



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depositado en el fondo del tubo es resuspendido en 100 µl de H2O milliQ. Las

muestras de ADN fueron conservadas a 4 ºC hasta su análisis.

Material necesario

Reactivos y material fungible

- Gradillas de tubos eppendorf.

- Gradilla para el baño de agitación

- Puntas de 10, 200 y 1000 µl.

- Tubos eppendorf de 0,5 ml y 1,5 ml

- Pipetas Pasteur de 1 ml

- Bridas

- Buffer de lisis CTAB 2 %

- Fenol:cloroformo:isoamiloalcohol (25:24:1)

- Isopropanol

- Acetato sódico 3M (a -20 ºC)

- TE 1X

- RNase A

- Cloroformo:isoamiloalcohol (24:1)

- Agua milliQ autoclavada.

Aparatos y equipos

- Pipetas monocanal de 1 a 10, 5 a 50 y 100 a 1000 µl.

- Baño de agitación.

- Centrifuga de tubos eppendorf

- Concentrador de ADN



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2. CUANTIFICACIÓN ESPECTROFOTOMÉTRICA DE ÁCIDOS

NUCLEICOS

Es conveniente encender el espectrofotómetro 20 minutos antes de su uso para

que la lámpara de Xenón se estabilice.

Una vez encendido, hay que elegir el tipo de ensayo (dsDNA) y el factor de

conversión (OD) que para el ADN de doble hebra es de 50 µg/µl. Otro valor que

hay que elegir es el factor de dilución. Este puede depender de la cantidad de

muestra que se haya obtenido tras la extracción. Se recomienda que la

extracción no sea menor de 1/50 y se aconseja que sea de 1/25. De esta forma

disminuyen las cuantificaciones erróneas por error de pipeteo.

La valoración se lleva a cabo analizando el espectro de absorción a 260 nm y 280

nm de la disolución que contiene el ADN problema.

El valor de absorción a 260 nm indicará la concentración de ADN en la muestra

analizada ya que 1 unidad de absorbancia a 260 nm equivale a una

concentración de ADN de doble cadena de 50 µg/ml.

Para estimar la concentración de ADN se prepara una dilución 1/25 de la muestra

problema, depositando 4µl de la muestra en 96 µl de H2O bidestilada. Como

blanco de la medición se prepara una dilución 1/25 del solvente en el que se

encuentra el ADN problema (TE o H2O).

Primeramente se mide la solución sin ADN para establecer el “blanco”: Read

blank.

A continuación se mide la dilución 1/25 de ADN muestra: Read sample.

La concentración de la muestra se calcula según las siguientes fórmulas:

ADN [µg/ml] = (Abs 260nm)x(50µg/ml)x(25/1)

ADN [µg/µl] = Valor ADN [µg/ml] obtenido / 1000



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Para conocer la pureza del ADN extraído se calcula la relación R= (Abs 260)/(Abs

280). Este valor indica si el ADN de la muestra está bien purificado, ya que la

absorbancia a 230 nm corresponde a la cantidad de sales y la absorbancia a 280

nm, a la cantidad de restos proteicos. Un ADN de cadena doble de gran pureza

proporciona valores R entre 1,8 y 2.

Notas del maestrante y resultados obtenidos:

Si se obtiene un valor de R inferior a 1,8 indica (exceso proteínas o sales) la muestra debería

purificarse o volver a obtenerse son cuidado de que hayan pérdidas de ADN.

Restos de fenol se manifestarán con picos a 270nm, y de etanol a 220nm.

El ruido de fondo se puede determinar por la relación: R=(A260 nm - A320 nm)/(A 280 nm - A320 nm).

También se puede conocer la cantidad de ADN, por PCR a tiempo real o por fluorimetría.

Al aplicar fluorimetría, se pueden usar como fluorocromos: fluoresceína o picogreen. Estos

fluorocromos se ubican en medio de la doble hélice de ADN y en consecuencia, emiten una señal de

fluorescencia proporcional a la cantidad de ADN existente en la muestra. Para aplicar este método se

debe trabajar con una λ de exitación de 356 nm y una λ de emisión de 458nm.

Grupo 1

Muestra Abs 260 Abs 280 R 260/280 Conc. Calculada(μg/μg) Conc. Nanodrop (μg/μg)

6.8.1 0,332 0,170 1,95 415,00 410,43

14.4 2,479 1,246 1,98 3098,75 2526,19

15.5 2,653 1,352 1,96 3316,25 2699,34

22.22 0,424 0,234 1,81 530,00 n. d

Grupo 4

Muestra Abs 260 Abs 280 R 260/280 Conc. Calculada(μg/μg) Conc. Nanodrop (μg/μg)

6.8.2 0,586 0,302 1,94 732,50 647,26

14.5* 0,013 0,015 0,87 16,25 n. d

15.4 1,881 1,018 1,85 2351,25 2137,82

12.22 0,301 0,247 1,22 376,25 376,25

14.4 2,479 1,246 1,98 3098,75 2526,19

*: Muestra con impurezas.



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Observaciones:

La muestra 14.5 del grupo 4, presentó un bajo valor de R, que pudo deberse a presencia de

impurezas o a pérdida de ADN durante la experimentación. En casos como este se debería

volver a obtener o purificar la muestra, y realizar la determinación con sumo cuidado.

Para poder seguir trabajando con 4 muestras, el grupo 4, consideró adicionalmente la muestra

14.4 del grupo 1.

La determinación de la concentración de ADN se calculó de la siguiente manera. (Tomando

como ejemplo la muestra 6.8.2)

Conc. de ADN (μg/ml) = Abs 260 nm x 50 μg/ml x 25/1

Tanto para las muestras del grupo 1 como para las del grupo 4, los resultados obtenidos por

cálculo son similares a los obtenidos con el nanodrop.

Conclusiones:

Se pudo determinar la cantidad de ADN de diferentes muestras de maíz y soya, por valoración

espectrofotométrica y mediante el empleo de un nanodrop, obteniendo resultados similares.

Este análisis es fundamental, ya que a partir de sus resultados se puede proceder a la

identificación de muestras transgénicas y a la cuantificación de material transgénico presente en

las mismas.

Se debe recalcar la importancia de realizar una correcta extracción, purificación y manipulación

minuciosa del ADN, para poder garantizar su determinación correcta.



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3. AMPLIFICACIÓN GENÉTICA DE ORGANISMOS

GENÉTICAMENTE MODIFICADOS

Pasos previos:

Encender el termociclador y disponer el protocolo correspondiente.

Sacar del congelador de PCR los reactivos y colocarlos sobre la gradilla de tubos

eppendorf (envuelta en papel de aluminio) para que se descongelen.

El enzima Taq polimerasa se saca exclusivamente en el momento de dispensarla

en el mix de PCR, para que se mantenga el menor tiempo posible a temperatura

ambiente.

Carga del ADN en tubos de PCR

Colocar sobre una gradilla los tubos de PCR necesarios (x muestras, blanco de

extracción y negativo de PCR) y rotularlos debidamente.

En el tubo correspondiente al negativo de PCR, cargar los µl correspondientes de

la misma agua que se vaya a usar para preparar el mix de PCR.

Cargar en cada tubo 3 l de la muestra correspondiente.

Preparar el mix de PCR.

Preparación del MIX de PCR

Una vez que los reactivos se han descongelado, se agitan en el vórtex y se

someten a un pulso de centrifuga.

Preparar el mix en un tubo eppendorf de 0,5ml dependiendo del volumen final

que se obtenga.

En la siguiente tabla se indica el volumen de cada reactivo a añadir por muestra.

Estos volúmenes se multiplicarán por el número de muestras, incluyendo blanco

de extracción, negativo de PCR y extra.



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Reactivo Concentración

inicial Concentración final

Volumen de

reacción por

muestra (L)

Lec-

Zeína 35S NOS

Lec-

Zeína 35S NOS

H2O Mq 13,45 12,125 12,05

dNTPs 2,5 mM 200 M 2

MgCl2 50 mM 2 mM 3,5 mM 1 1,75

Buffer 10X 1 X 2,5

Primer F 10 µM 400 nM

500

nM 1 1,25

Primer R 10 µM

BSA 10 mg/ml 0,4 mg/ml 1

Taq 5 U/µl 0,25 U 0,625

U 1 U 0,05 0,125 0,2

Reactivo

Volumen de

reacción por

muestra (L)

Número

de

muestras

Volumen total (L)

Lec-

Zeína 35S NOS

Lec-

Zeína 35S NOS

H2O mQ 13,45 12,125 12,05 X 6 = 80,7 72,75 72,3

dNTPs 2 X 6 = 12

MgCl2 1 1,75 X 6 = 6 10,5

Buffer 2,5 X 6 = 15

Primer F 1 1,25

X 6 = 6 7,5

Primer R X 6 =

BSA 1 X 6 = 6

Taq 0,05 0,125 0,2 X 6 = 0,3 0,75 1,2

Habrá que ajustar el volumen de agua de forma que el volumen final de la

reacción de PCR sea siempre de 25 µl. Tener en cuenta que se añaden 3 l de

ADN.

Cargar la Taq polimerasa en último lugar. Agitar el mix en el vórtex y darle un

pulso de centrífuga.

Distribuir el mix cargando en primer lugar el negativo de PCR.



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Dar un pulso de centrífuga a los tubos y disponerlos en el termociclador. Pulsar

“Begin run” para que el protocolo comience:

Protocolo de amplificación

Paso Temperatura Tiempo Ciclos

Desnaturalización 95 ºC 4 min 1

Desnaturalización 95 ºC 30 seg.

35 Annealing *ºC 30 seg.

Elongación 72 ºC 45 seg.

Elongación 72 ºC 7 min 1

Stand by 4 ºC 1

*La temperatura de annealing varía según el marcador,

así para la lectina es de 65ºC, para la zeína de 63ºC, para

el promotor 35S 62ºC y para el terminador NOS 64ºC.

El protocolo de amplificación se encuentra en el termociclador BioRad, User:

OGMs, protocolo OGM 35S NOS (se trata de un protocolo de gradiente de

temperatura, Cada marcador irá en la fila con la temperatura que le

corresponda. Los negativos irán en la fila con la menor temperatura).

Observaciones:

Para la preparación de diluciones, es necesario tener en cuenta que:

1 ml = 1000 μl = 1000 μg

1 μg = 1000 ng

1 ml = 1’000 000 ng

Fue necesario diluir la cantidad de ADN de cada muestra, a fin de obtener 50 μl a una

concentración de 30 ng / μl. Para ello se aplicó la relación: V1 x C1 = V2 x C2

Tomando como ejemplo el cálculo para la muestra 6.8.2 del grupo 4:



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V1 x C1 = V2 x C2

V1 (647,26 ng / μl ) = 50 μl x (30 ng / μl)

V1 = 2,3 ≈ 2 μl de la sol.de ADN + 48 μl de H2O

El cálculo de cada uno de los otros componentes de los 25 μl del mix de PCR, también se

realizó mediante la fórmula anterior. Ejemplo para el cálculo de dNTPs :

V1 x C1 = V2 x C2

V1 (2,5 mM) = 25 μl x 200 μM

V1 (2,5 mM) = 25 μl x 0,2 mM

V1 = 2 μl de dNTPs

Para cada caso (Lec-Zeína, 35S y NOS) se preparó 25 μl del mix de PCR. Dicho mix se obtuvo

añadiendo en un tubo eppendorf: todos los elementos enlistados en la tabla más 3 μl de ADN,

1.25 μg de Mg y la cantidad de agua necesaria para completar los 25 μl en cada tubo.

La cantidad de agua necesaria para el mix de Lec-Zeína, 35S y NOS fue: 13.2, 12.1 y 12.1

respectivamente.



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4. COMPROBACIÓN DEL PRODUCTO AMPLIFICADO

Preparación del gel de agarosa

Preparar un gel de agarosa al 1,5 % para un volumen de 100 ml.

Disponer el soporte de agarosa en la campana de humos con dos peines de 20

pocillos. Comprobar que la cuba está equilibrada. Sacar el EtBr de la nevera e

introducirlo en la campana de humos.

Pesar en la balanza los gr. de agarosa correspondientes y añadirlos a 100 ml de

buffer TBE 1x en un bote de cristal PYREX.

Agitar el bote e introducirlo en el microondas hasta que hierva vigorosamente. En

ese momento sacarlo y agitarlo. Repetir este paso hasta que la solución esté bien

disuelta (3-4 veces).

Pasar la solución a un vaso de precipitados de plástico e introducir el

termómetro. Enfriar la solución hasta que el termómetro baje por debajo de los

70ºC (por encima de esa Tª el EtBr se degrada). Dentro de la campana de

humos, añadir el EtBr (el volumen dependerá de la cantidad de gel de azarosa) y

agitar vigorosamente.

Verter la solución sobre la cuba dispuesta. Asegurarse de que no se forman

burbujas, especialmente en la zona del peine que formará los pocillos. Dejar

enfriar el gel para que la agarosa polimerice.

Carga del producto amplificado en el gel

Una vez que el gel ha solidificado, sacar la cuba de la campana de humos,

retirar los peines y verter el buffer 1X.

Sobre un trozo de plástico dispensar una gota (0,5 a 1 µl) de solución de carga

por cada muestra, incluyendo el ladder.

Mezclar 5 µl de producto amplificado con la solución de carga y dispensar la

mezcla en el pocillo correspondiente. Cargar 2 µl de ladder.



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La migración se realiza a un voltaje constante de 100 V y por un tiempo de 30

minutos.

Comprobación en sistema de fotodocumentación

Una vez que la migración electroforética ha concluido, colocar el gel en una

bandeja y trasladarlo hasta el sistema de fotodocumentación UVIDOC.

Conectar la luz ultravioleta, ajustar el zoom, la intensidad y el enfoque.

Pulsando “Live Sat” se comprobará si la foto está saturada; el ladder no deberá

estar saturado para que posteriormente se pueda hacer una valoración

aproximada de la cantidad de ADN que hay en las bandas de interés (la banda

de 500 pb del ladder contiene 5,1 gr. de ADN/µl).

Pulsando “Freeze Save” la imagen queda congelada. Pulsando una segunda vez

la imagen se guarda en el disquete de 3,5”. Comprobar en un PC que la imagen

ha sido guardada antes de desechar el gel.

Material necesario

- Gradilla de tubos eppendorf

- Gradilla de tubos de PCR

- Puntas con filtro de 10 y 200 µl

- Tubos eppendorf de 0,5 ml autoclavados

- Tubos de PCR de 0,2 ml autoclavados

- Rotulador indeleble.

- Agua milliQ autoclavada

- dNTPs (2,5 mM)

- MgCl2 (Cloruro de magnesio) a 50 mM

- Buffer 10 X

- Primers a 10 µM

- BSA (Seroalbumina bovina) a 10 mg/ml

- Enzima Taq polimerasa (5 U/µl)

- Puntas autoclavadas



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- Guantes de látex

- Bote de cristal Pyrex para preparar gel de agarosa

- Termómetro

- Vaso de precipitados de plástico.

- Gafas protectoras.

- Guante termorresistente

- Agarosa

- Buffer TBE 1X

- Bromuro de Etidio (altamente TÓXICO)

- Ladder de 100 pb

- Solución de carga

Aparatos y equipos

- Vórtex

- Minicentrífuga de tubos eppendorf

- Micropipetas de 0,5 a 10 µl, y de 10 a 100 µl

- Termociclador iCycler (BioRad)

- Balanza

- Microondas.

- Fuente de alimentación

- Cubeta de electroforesis

- Sistema de fotodocumentación UVIDOC



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Experimento Electroforesis

FECHA: 3 de abril del 2012 Tiempo de migración: 30 min

NOMBRE: M. Teresa Pacheco Miliamperios: 130 a 134 A

MARCADOR: NOS Voltaje: 100 V

Agar: 1,5 %

Pocillo Muestra

1 Lec. (-)

2 6

3 14

4 15

5 22

6 Zei. 6

7 14

8 15

9 22

10 Ladder

11 6

12 14

13 15

14 22

15 NOS 6

16 14

17 15

18 22

19 Zei. (-)

20 35S (-)



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Observaciones y Conclusiones:

La electroforesis se realizó con mucho éxito, sin embargo, no se reportan los resultados de la

identificación de ADN transgénico debido a que el termociclador no funcionó correctamente.

No obstante; pudimos aprender que si las señales de amplificación corresponden a:

Lectina, se trata de una muestra de soya.

Zeina, se trata de una muestra de maíz.

35S, se trata de ADN transgénico.

Además, pudimos recordar que la electroforesis es una técnica basada en la migración de

moléculas dependiendo de su tamaño o peso. Cuanto mayor sea la concentración de gel de

agarosa, mayor será la migración de moléculas pequeñas a través del gel. Por lo tanto existirá

una concentración específica para un determinado tamaño de secuencias amplificadas.

Una vez determinado el tipo de ADN, se puede proceder a su cuantificación mediante

fluorescencia, empleando diluciones sucesivas del patrón correspondiente y una curva de

calibración.

De acuerdo a la Normativa de la U. E. se admite que un alimento posea hasta un 0,5 % de ADN

transgénico si ha llegado al alimento de manera accidental. Alimentos que contengan tADN por

encima del 0,9 %, deben reportarlo en su etiqueta.

Es indispensable trabajar con precisión para no introducir error de medida y seguir el protocolo

que indique la normativa para el caso específico en cuestión.

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