Preparacion de Muestras Microscopia

8/16/2019 Preparacion de Muestras Microscopia

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4. Preparación de muestras paramicroscopía óptica


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4. Preparación de muestras

● Criterios en las técnicas de preparación

● Técnicas para luz transmitida

● Técnicas para luz reflejada


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El objetivo de la preparación de muestras paramicroscopía óptica es

permitir que las estructuras de los materiales serevelen con suficiente contraste de modo que las

características de interés sean descritas, grabadasy caracterizadas en detalles visibles a una escalamenor que la agudeza visual del ojo humano

!a escala "ltima de observación estar# limitada porla resolución del sistema de imagen delmicroscopio



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Criterios en las técnicas de preparación

●

$segurar que la muestra a observar esrepresentativa del material, objeto u organismo deprocedencia que se desea estudiar

● %acer que las características de interés seanaccesibles al sistema de imagen del microscopio

●

Cuando sea necesario, aumentar el contraste entrelos elementos estructurales de los materiales y elfondo



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Criterios en las técnicas de preparación

●

&roporcionar las condiciones suficientes para laestabilidad de las muestras, y suficiente significaproteger las muestras de decaimiento,degradación, corrosión o contaminación dentro dela escala de tiempo de la observación

● $justar la muestra a los requisitos ópticos delsistema de imagen del microscopio para proveer de

las condiciones óptimas de contraste y resolución,y evitar artefactos ópticos que pudieran aparecer yque oscurecerían la imagen o incorporarían falsosdetalles



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Técnicas de preparación para luz transmitida

●

!as muestras biológicas pueden ser e'aminadasen muchos estados como combinación de lossiguientes(

● vivas o muertas● frescas o preservadas)fijadas● enteras o en secciones● te*idas o sin te*ir ●

hidratadas o deshidratadas● opacas o aclaradas



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●

!as muestras lo suficientemente peque*as comopara ser observadas enteras pueden también serobservadas vivas, obteniéndose el contrastemediante dispositivos ópticos tales como contrastede fases o contraste interferencial u,ocasionalmente, por medio de tintes vivos+tinciones no tó'icas que tienen afinidad por ciertoscomponentes celulares



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●

-in embargo, la mayoría de los organismos, susórganos y tejidos, e incluso sus células, sondemasiado grandes para proporcionar informaciónde alta resolución con los microscopios ópticosconvencionales

● &or ello no pueden ser observados vivos sino quehay que matarlos y entonces +generalmente debenser deshidratados, incluidos, cortados, te*idos ymontados antes de su e'amen al microscopio



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.ontajes temporales de muestras vivas enteras● !as muestras que son organismos completos o

partes de organismos vivientes requieren untratamiento especial, tanto para mantenerlos vivos

durante la observación, como para asegurar que sumuerte no destruya información de interés● !as muestras e'aminadas al microscopio mientras

est#n vivas suelen ser peque*as( organismos

completos como bacterias, protozoos y peque*osanimales y plantas, o partes discretas deorganismos como células en cultivo, célulassanguíneas, granos de polen, etc



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.ontajes temporales de muestras vivas enteras● /ependiendo de la duración de la observación y de

la naturaleza de la muestra, se debe prestaratención a la provisión de suficiente o'ígeno, al

mantenimiento de la concentración de otrassustancias +por ejemplo sales y 0alimento1 , a laeliminación del C2

3 y otros residuos, al control de

la temperatura, a la provisión de luz apropiada, a la

eliminación de organismos e'tra*os odepredadores



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.ontajes temporales de muestras vivas enteras● !as muestras aquí se*aladas estar#n montadas,

normalmente, en el medio en que se danhabitualmente o ser#n cultivadas, por eso las

técnicas de preparación se limitan a montarlas enun portaobjetos, bajo un cubreobjetos, en unapeque*a gota de medio

-i la observación va a ser prolongada puede ser

necesario retardar la evaporación sellando losbordes del cubreobjetos


4 P ió d


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.ontajes temporales de muestras vivas enteras


4 P ió d


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4 P ió d t


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4 Preparación de muestras


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.ontajes permanentes de muestras no vivas● 4ijación

● /eshidratación e inclusión

● Corte

● Tinción

● .ontaje




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.ontajes permanentes de muestras no vivas● Fijación (

● !os organismos de los cuales se van a obtenermontajes permanentes deben estar necesariamente

muertos y se debe tener mucho cuidado en que elsacrificio se produzca en condiciones humanitarias ycon la menor alteración posible de la estructura

● Tan pronto como sea posible después de la muerte

y, en algunos casos, simult#neamente, los tejidosdeben ser fijados, un proceso que mata las células,inactiva sus enzimas, y precipita y entrecruza lasmoléculas que est#n en solución o suspensióndentro de las células




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.ontajes permanentes de muestras no vivas● Fijación (

● Todas estas acciones estabilizan la estructura frentea da*os en el procesado posterior

● !a fijación también debe actuar como preservativofrente al ataque microbiano y puede mejorar laafinidad de la muestra por ciertas tinciones

● !a fijación se lleva a cabo generalmente por

tratamiento químico aunque en ciertascircunstancias se puede usar la fijación física porcalentamiento o por congelación r#pida




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.ontajes permanentes de muestras no vivas● Deshidratación e inclusión (

● $ las células les falta rigidez y se les proporcionaartificialmente con el soporte adecuado antes del

corte, convencionalmente por inclusión● 5n medio de inclusión debe ser capaz de infiltrar el

tejido en medio líquido y entonces solidificarse porenfriamiento o polimerización para dar el soporte

necesario a los peque*os detalles del interior de lamuestra




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● El medio m#s utilizado para la inclusión es laparafina, de un grado que funde a unos 67 8C

● -in embargo, la parafina no es miscible con losfluidos acuosos en los que la muestra se encuentray requiere que ésta sea deshidratada, generalmenteen pasos a través de concentraciones crecientes deetanol hasta llegar al absoluto, 9::;




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● El etanol es un agente deshidratante muy buenopero no es miscible con la parafina fundida, así que

hay que reemplazar el etanol con un fluido detransición miscible con él y con la parafina( 'ileno,tolueno o compuestos menos tó'icos

● 5na vez reemplazado el etanol con este fluido, eltejido se sumerge en parafina fundida un período detiempo y ésta infiltra el tejido

● 4inalmente el tejido se transfiere a parafina fresca yse deja que ésta solidifique




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.ontajes permanentes de muestras no vivas● Corte (

● &uede ser posible cortar secciones a mano, sinembargo, la mayoría de las secciones se cortan con

la ayuda de un microtomo




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.icrotomos

p



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● Con una buena técnica se pueden obtenersecciones de unas 6 µ m e incluso menores en

algunos casos● /urante el corte las secciones forman una fila unas

pegadas a otras que es cómoda de manejar ymontar

p



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p



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● !os cortes se colocan en un porta de microscopíalimpio, generalmente flot#ndolos en una gota de

disolución diluida de alb"mina, se calienta en unaplaca hasta que la parafina se reblandezca +sinfundir para eliminar las arrugas en las secciones yse deja secar en un sitio c#lido



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.ontajes permanentes de muestras no vivas● Tinción (

● $ las secciones cortadas en parafina se les debeeliminar ésta por inmersión en el disolventeapropiado, tradicionalmente 'ileno

● Esto se sigue de una sucesión en aumento deconcentración de disoluciones acuosas de etanolhasta que la muestra est# completamente

hidratada, ya que la tinción se suele aplicar enmedio acuoso



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● 5na vez que el soporte de la parafina se haeliminado no se debe permitir que la muestra se

seque porque se causarían da*os por tensiónsuperficial

● !a tinción e'plota la afinidad química entre el tinte ylas sustancias presentes en la muestra

● El uso sucesivo o combinado de varios tintes,incluyendo la hemato'ilina o eosina, cada uno consu afinidad específica, da una coloración tricolor om#s compleja a los diversos componentes tisulares



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● !a hemato'ilina es un tinte b#sico +catiónicoque se une electrost#ticamente a sitios #cidos

+aniónicos de los #cidos nucleicos +/


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● En el microscopio, las estructuras ricas en#cidos nucleicos, como los n"cleos celulares,

tienen el color azul de la hemato'ilina, mientrasque las regiones ricas en proteínas delcitoplasma muestran la tinción roja de la eosina



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● !a forma m#s específica de tinción se da en lainmunocitoquímica donde los marcadores se

unen específicamente a moléculas objetivodentro de la muestra por reaccionesinmunológicas

!a técnica requiere anticuerpos específicos de la

sustancia en estudio junto con una manera delocalizar el anticuerpo usando un marcadorfluorescente u otro marcador



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.ontajes permanentes de muestras no vivas● Montaje (

● El paso final en la preparación de una muestraes montarla en una l#mina de vidrio,

generalmente de 36 mm ' @7 mm, elportaobjetos

● El material de montaje utilizado, el montante,puede ser b#lsamo de Canad#, glicerina,

aceites, líquidos acuosos, etc● 5na vez colocada la muestra en el portaobjetos

y con el montante, se cubre con una l#mina,disco o placa de vidrio fino, el cubreobjetos



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● El grosor del portaobjetos, el del cubreobjetos yel índice de refracción del material de montaje y

su adecuación a la muestra, son factores que sedeben tener en cuenta

● El grosor del cubre es convencionalmente :,9@mm

● El montante debe ser inerte o actuar comopreservativo frente a la degradación de lamuestra dentro de la escala de tiempo de laobservación



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.uestras no biológicas● !os materiales no biológicos en partículas +como

granos de minerales no requieren preparaciónanterior al montaje

● En situaciones en las que se requiere mantener ladistribución de los granos +arcillas o cer#micasporosas la muestra original se debe impregnar conresina y preparar una l#mina delgada

●

!as secciones finas de materiales blandos comopolímeros se pueden preparar usando unmicrotomo



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.uestras no biológicas● !as secciones finas de materiales duros +minerales,

rocas, cer#micas, cer#micas impregnadas conresina se preparan seg"n la secuencia de pasossiguiente(

9 -e corta una l#mina de 9 mm de grosor o sedesprende un fragmento del material original

3 -e monta la l#mina en un porta usando !aAeside

u otro cementoB -e pule un lado de la l#mina



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.uestras no biológicas

> -e monta la l#mina boca abajo en otro porta y seretira el primero

6 -e pule la parte superior hasta el grosor

requerido7 -e pega el cubre en la superficie superior



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Técnicas de preparación para luz reflejada

&reparación inicial y montaje(● &ara facilitar el manejo, por un lado, y para

proporcionar una superficie de muestra suficientementegrande, por el otro, las dimensiones de la muestradeben ser del orden de 6 a 96 mm en la superficiepreparada y de 9 a 9: mm de grosor

● El corte de esta muestra a partir de una pieza m#sgrande de roca o de metal, por ejemplo, se debe hacercon mucho cuidado

● En muchos casos la orientación de la superficie de lamuestra +por ejemplo en relación con la roca origen o elcomponente met#lico es importante y debe quedarregistrada



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&reparación inicial y montaje(● &ara el corte de la muestra lo m#s apropiado y lo que

da lugar a una menor deformación en la superficie decorte es un abrasivo en h"medo como una rueda demetal o baAelita impregnada con al"mina, nitruro deboro, carburo de silicio o diamante



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&ulido(● El pulido se lleva a cabo a mano usando tiras de papel

abrasivo o utilizando discos abrasivos montados enuna rueda con sucesivos grados de grit cada vez m#sfinos, normalmente carburo de silicio para los gradosm#s gruesos, y α ? y γ ?al"mina y diamante para lospulidos m#s finos

● El carburo de silicio se utiliza entre 6 y 96 µ m de gritEn las etapas finales el α ?al"mina de 9: a 9 µ m y la γ ?al"mina de unos :,B µ m o bien el diamante de 7 a 9µ m



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Tratamiento superficial(● &ara muchos materiales +como rocas o cer#micas no

es necesario m#s tratamiento y las fasesconstituyentes pueden estar suficientemente reveladaspor sus diferencias de color, birreflectancia o te'turasuperficial

● &ara los metales y aleaciones se requierentratamientos de etching

● En cualquier caso todos los materiales debene'aminarse en las condiciones de recién pulido paracomprobar que no e'isten artefactos y detectarinclusiones gruesas o porosidad que puedan influir enel proceso de etching



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Tratamiento superficial(● El etching se puede definir como un ataque selectivo

de los granos o de las fronteras interfase y)o el ataqueselectivo de las propias fases

●

!os atacantes son disoluciones acuosas o alcohólicas ymezclas de sales, #cidos y bases, etc Cuanto m#sresistentes a la corrosión son los metales y lasaleaciones, naturalmente requerir#n disoluciones m#sagresivas



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Tratamiento superficial(● El proceso de etching consiste simplemente en

sumergir la muestra en el atacante, o por electrolisishacer de la muestra el #nodo de una cuba electrolítica

●

Deneralmente se requiere un proceso de pulido finaldespués del etching

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