PREPARO DE MEIOS DE CULTURA - Oswaldo Cruz Foundationcogetes.epsjv.fiocruz.br/storage/Textos_e_materiais_de_apoio_4_An… · PREPARO DE MEIOS DE CULTURA •Para estudar um m.o. necessário

Prof. Joseli Nogueira

PREPARO DE MEIOS DE

CULTURA


PREPARO DE MEIOS DE CULTURA

• Para estudar um m.o. necessário seu

isolamento no laboratório

• Cultivo dos m.o. em condições laboratoriais

necessário o conhecimento das suas exigências

nutritivas

• Exigências mínimas atendidas conjunto de

fatores necessários “in vitro” “in vivo”

• Temperatura, umidade, pH, nutrientes, etc.


• Conhecimento resultou desenvolvimento denumerosos meios de cultura.

• Por causa da grande variação das necessidadesnutritivas das bactérias Grandes diferenças nacomposição dos meios utilizados.

• Não existe um meio de cultura “universal” p/ ocrescimento de todos agentes.

• Existem ainda algumas espécies bacterianas que sópodem ser “cultivadas” em animais experimentais

(ex. Mycobacterium leprae e Treponema pallidum)

• Outras só crescem em cultivos celulares

(Clamídias e Riquétsias).


MEIOS DE CULTURA

• Qualquer substância sólida, semi-sólida

ou líquida p/ cultivo de m.o.

• Conjunto de fontes de nutrientes p/ o m.o.


CLASSIFICAÇÃO DOS MEIOS DE CULTURA

De acordo com o agente solidificante

• Gelose

• Ágar-ágar extraído de Rhodophyceae (algas vermelhas) de espécies dos gêneros Gellidium, Acanthopeltis, Gracilaria e Euchema.

• Folhas das algas tratamento térmico retira impurezas

(ác. graxos de cadeias longas) que podem inibir os m.o.

• As fibras são compostas de 2 cadeias polissacarídicas: agarose e agaropectina + resíduos

• Subst. Coloidal, hidrofílica (grupo das mucilagens)

• Ponto fusão 100oC/solidificação 40oC ( gde)


• Meios Sólidos de 1,5g à 3,0g %

que podem ser liquefeitos

(ex: ágar nutritivo)

• Meios Semi-Sólidos 0,5% a 0,1g % o quelhes dá uma consistência típica.

• meios sólidos/semi medida do pH

50oC

• meios c/ ágar aquecidos p/ obter dissolução em água fervente até a solução tornar-se cristalina e s/ grumos

não se deve refundir várias vezes o meio (alteração no valor nutritivo, percentual de água, etc...)


• Meios Líquidos s/ adição de ágar

“caldos” ex: caldo nutritivo, caldo

simples, caldo Casoy

Meios líquidos medida de pH

temperatura ambiente


De acordo com a composição química

• Meios Sintéticos composição química de todos osseus componentes conhecida (definidos)

• Meios Complexos composição química de algunsdos seus componentes desconhecida

(geralmente quando se adiciona soro, sangue ou outrocomponente que não se tem total conhecimento dacomposição química)

• Podem ser totalmente preparados no laboratórioseguindo formulações (receitas).

• Podem ser preparados a partir de meios dessecados(geralmente só adiciona-se água e funde).

• Água limpa, recém destilada, neutra.


De acordo com o objetivo da utilização

• Meios básicos São os de uso geral podem ser

usados como base no preparo de outros meios.

• Meios de Enriquecimento A adição de sangue/ soro/

extratos de tecidos animais ou vegetais ao caldo ou ágar

nutritivos proporciona nutrientes acessórios passa a

permitir o crescimento de heterotróficos fastidiosos.

selenitoAPA

GIOLITTI-CANTONI Broth


• Meios Diferenciais ou indicadores A incorporação

de certos reagentes ou substâncias no meio pode

resultar num tipo de crescimento ou reação, após a

inoculação e a incubação, que permite ao observador

distinguir os tipos de bactérias.

ex: Lactose – e Lactose +.

Rambach Agar

CHROMagar (cromogenic media)

TSI


•Meios Seletivos A adição de substâncias químicas

específicas ao ágar nutritivo previne o crescimento de

um grupo de bactérias sem agir sobre outras. ex1:

cristal-violeta impede o crescimento de gram-

positivos, sem afetar o desenvolvimento das gram-

negativas. ex2: alguns antibióticos podem inibir um

grupo e não outro.

•Meios de dosagem meios de composição

definida são empregados para a dosagem

de vitaminas, aminoácidos e antibióticos.

•Meios para contagem de bactérias tipos

específicos de meios são indicados para determinar o

conteúdo bacteriano de materiais como água e o leite.


• Meios de Estocagem ou Manutenção manutençãoda viabilidade e características fisiológicas de umacultura pode exigir um meio do recomendado p/crescimento ótimo. (desenvolvimento rápido rápidamorte ex: glicose crescimento > quantidades deácidos). Na preparação de um meio de estocagem épreferível omitir a glicose.

• Meios de Transporte semelhantes aos meios anteriores estes devem ter o mínimo de nutrientes para a manutenção do m.o. sem que estes se reproduzam ou acidifiquem o meio.


POSSÍVEIS DEFEITOS NO PREPARO DOS MEIOS:

• Desvios no valor do pH água não neutra; frasco mal fechado; superaquecimentodurante a preparação; meio de cultura dessecado ou c/ validade vencida.

• Turbidez e precipitação água insuficientemente deionizada; recipientes depreparo mal lavados; pH incorreto ou desajustado; superaquecimento durante apreparação; substâncias empregadas c/ impurezas.

• Ponto de solidificação muito elevado Excesso de meio dessecado; ágar-ágarnão adequado ou fora de proporção.

• Pouca estabilidade do gel proporção pequena de meio; meio incompletamentedissolvido; superaquecimento na preparação; pouco ágar-ágar ou quantidadeinadequada.

• Desvio de cor erro de pH; superaquecimento; recipiente de preparo mal limpo.

• Meios de cultura contaminados esterilização insuficiente; contaminaçãoacidental.

• Pouco crescimento de microrganismo presença de inibidores do crescimento;microrganismos já alterados no material investigado; pH incorreto; aditivos maldosificados; superaquecimento na preparação.

• Excessivo crescimento de microrganismos superaquecimento na preparaçãocom destruição de substâncias inibidoras; aditivos mal dosificados; inoculo excessivode m.o.

• Colônias irregulares superfície do meio muito úmida; superfície do meiosemeada com excesso de material.

• Crescimento atípico meio de cultivo errado ou mal preparado; com prazo devalidade vencido; condições de cultivo inadequadas.


CONSERVAÇÃO DOS MEIOS DE CULTURA

PREPARADOS

• Para períodos de tempo prolongados se recomenda seu armazenamento em temperatura de 12 a 15C.

• Os meios de cultura com ágar não devem ser guardadosabaixo de 0C para não alterar seu gel.

• Geralmente é possível sua conservação durante 1 a 2meses à temperatura ambiente. Em qualquer caso, osmeios de cultura deverão estar sempre ao abrigo da luz.

• Para não haver perda de água do meio de cultura para oambiente, sacos plásticos lacrados impermeáveis aoar. No caso de placas de petri, bordos poderão serlacrados com fita adesiva.


SUBSTÂNCIAS USADAS NO PREPARO DE

MEIOS DE CULTURA

• Os meios de cultura devem conter todos os elementos

necessários à síntese biológica de novos organismos

(Fontes de carbono, nitrogênio e outros compostos)


ALGUMAS SUBSTÂNCIAS USADAS NO

PREPARO DE MEIOS DE CULTURA:

• Bílis de boi Bílis natural purificada submetida a umprocesso de dissecação. Exerce um efeito inibidor damicrobiota Gram +. Usada em meios seletivos; [ ] de10/12g/L. Contém ácidos biliares e água.

• Caseína Obtida do leite bovino, usada em p/testesc/m.o. caseolíticos. As caseínas são fontes de vitaminas efatores de crescimento. Se encontra nitrogênio, peptonas,cálcio, magnésio, etc.

• Caseína hidrolisada Obtida por hidrólise clorídrica dacaseína constituindo um bom substrato nutritivo.

• Caseína hidrolisada de pâncreas Obtida por hidróliseenzimática a partir da caseína. Para m.o. exigentes.

• Extrato de carne preparado a partir de carnesdesprovidas de tendões e gordura. Antes da extração, sesubmete a carne a uma ligeira proteólise. Constitui umabase nutritiva de alto valor.


• Extrato de levedura obtido por extração aquosa deleveduras autolisadas. Além das vitaminas excelentescondições de crescimento a muitos m.o. Normalmente éincorporada aos meios de cultivo na quantidade de 3g/litro

• Extrato de malte obtido a partir da cevada maltada.Devido ao seu elevado conteúdo em diversos carboidratos,sobre tudo maltose, é especialmente adequado apreparação de meios destinados ao cultivo de fungos.

• Peptona de carne obtido pela degradação proteolíticada carne, mediante ação de pepsina ou tripsina.

• Peptona de caseína Obtida por degradação proteolíticade caseína, mediante a tripsina. Adequado ao preparo demeios para o teste do indol.

• Peptona de cérebro bovino Obtida por digestãopapaínica de cérebro de bovinos.

• Peptona de gelatina Obtida por hidrólise da gelatina,mediante pancreatina.


SELEÇÃO DOS MEIOS DE CULTURA

PRIMÁRIOS

• Para um ótimo isolamento dos m.o. essencial inoculara amostra no meio de cultura primário apropriado

• várias centenas meios comercializados disponíveis

• seleção p/ uso diário número relativa/ pequeno demeios seletivos e não seletivos

• meio não seletivo ágar sangue (crescimento dasbactérias mais comumente encontradas)

• Seleção c/ base na fonte anatômica do material clínico eno conhecimento das espécies bacterianas comumenteencontradas nas amostras.

Mais um motivo p/

observar a suspeita

clínica do médico para

doenças incomuns



Técnicas de inoculação/semeadura

A superfície do meio sólido em placa de Petri, pode ser

inoculada c/ a amostra por métodos


Exemplo1: Técnica da semeadura por esgotamento (células separadas)

Assim é que a

Placa fica após

ser incubada

Isso é uma colônia bacteriana

Esgotamento em estrias ou estrias múltiplas: transferir uma alçada da

cultura para meio sólido e estriar com a alça bacteriológica. A placa é

dividida em 4 quadrantes e a inoculação pode ser feita de 2 tipos:

• 3 estrias: estriar em metade da placa, com movimentos de zig-zag.

Quando atingir a metade, girar a placa 90° e estriar até a metade (1/4 da

placa), girar mais 90° e estriar o meio restante.

• 4 estrias: estriar até 2/3 da metade da placa, girar 90°, estriar 2/3 do

próximo quadrante (1/4 da placa), girar 90°, estriar mais 2/3 do próximo

quadrante (1/4 da placa), girar 90° e estriar o restante do meio.

Objetivo: obtenção de colônias isoladas. É importante não cruzar as

estrias (não tocar a alça na estria anterior), para reduzir o inóculo a cada

estria e obter as colônias isoladas.

Pode-se, alternativamente, flambar a alça

entre as estrias e tocar a ponta da estria

anterior, arrastando um pequeno inóculo

para a próxima estria.


Técnica de esgotamento por meio de

estrias superficiais:

a amostra é semeada na superfície do meio

solidificado com uma alça de semeadura para

esgotar a população, assim em algumas regiões

do meio, células individuais estarão presentes


Exemplo2: Técnica da placa derramada (pour-plate)

A amostra é diluída em tubos com meios liquefeitos (45oC).

Após homogeneização são distribuídos em placas de Petri.

Após a solidificação dos meios as placas são incubadas.

As colônias se desenvolverão tanto acima quanto abaixo da

superfície (colônias internas).


Exemplo3: Técnica da semeadura em superfície

Técnica de semeadura em superfície uma gota da amostra

diluída é colocada na superfície do ágar e com o auxílio de

uma alça de semeadura de vidro (alça de Drigalsky) esta

gota é espalhada sobre o meio.


Em cada uma dessas técnicas o objetivo é diminuir a população microbiana, assim as células individuais estarão localizadas a uma certa distância umas das outras. As células individuais, se estiverem distante o suficiente, produzirão uma colônia que não entra em contato com outras colônias. Todas as células em uma colônia têm o mesmo parentesco.

Para isolar uma cultura pura, uma colônia individual é transferida do meio para um tubo de ensaio.


Métodos de inoculação de tubos c/ meio líquido/sólido em tubo de ensaio.

Técnica de inoculação em

caldo c/ alça:

A – Inclinar e inocular na lateral

do tubo como indicado.

B – Recolocar o tubo na

posição original (o local de

inoculação fica sob a superfície)

Técnica de inoculação em ágar

inclinado com agulha:

A – a agulha é introduzida no

meio até 2 ou 3 mm do fundo B

– em seguida é retirada e

estria-se a superfície em

movimento de “s”


• Cultura pura formada por uma população

derivada de uma única célula

• Cultura mista formada por diversas

populações de microorganismos (amostra clínica)

Uma população microbiana, sob condições naturais,

contém muitas espécies s. Os microbiologistas devem

ser capazes de isolar, enumerar, e identificar os m.o. da

amostra, para então classificá-los e caracterizá-los.



Isolamento e Cultivo de Culturas Puras

• Os micro-organismos na natureza normalmenteexistem em cultura mista, com muitas espécies sno mesmo ambiente.

• Ao determinar as características de um m.o., eledeve estar em cultura pura todas as células napopulação são idênticas no sentido de que elas seoriginaram de uma mesma célula parental.

• Em laboratório, os micro-organismos são cultivadosou desenvolvidos em material nutriente denominadomeio de cultura.


O tipo de meio a ser utilizado depende de

vários fatores:

Considerações sobre a origem do material a ser

analisado

A espécie que se imagina estar presente nesta

amostra

As necessidades nutricionais dos organismos


MEIOS DE CULTURA DESIDRATADOS

Ágar Base – base para outros meios (usado como meio

definido) - dosagem

Ágar Batata Dextrosado – Cultura e identificação de

fungos e leveduras.

Ágar Bile vermelho e violeta - Contagem de Coliformes

em águas e alimentos.

Ágar Citrato Simmons – identificação de

enterobactérias

Ágar Cled ou Brolacin - crescimento e contagem de

bactérias em urinoculturas.

Ágar Dnase – Diferenciação de estafílococos

patogênicos.

Ágar Ensaio Neomicina – Ensaio de antibióticos. Ágar Entérico Hektoen – Isolamento e diferenciação de

enterobactérias.

Ágar Eosina azul de metileno - EMB (Teague) –

Isolamento e diferenciação de enterobactérias.

Ágar Estafilococos 110 – Isolamento e investigação de

estafilococos.

Ágar Extrato glicose tripticaseína – Contagem de

bactérias em geral.

Ágar extrato de laranja – Contagem de microrganismo

em sucos cítricos.

Ágar ferro lisina (LIA)– Identificação de

enterobactérias.

Ágar ferro tríplice acúcar (TSI) – Identificação de

enterobactérias.

Ágar infuso cérebro coração - Cultura de

microrganismo exigentes .

Ágar levine eosina azul de metileno – isolamento e

diferenciação de enterobactérias.

Ágar Mac-conkey – Isolamento e diferenciação de

enterobactérias.

Ágar para métodos padronizados – Contagem de

bactérias em alimentos.

Ágar Mueller Hinton – Teste de sensibilidade a

antimicrobianos.

Ágar nutriente – Uso geral.

Ágar Sabouraud dextrosado – Cultura e isolamento de

fungos.

Ágar sal manitol – Isolamento e identificação de

estafilococos. (Chapman)

Ágar Salmonella Shigella (Ágar SS) – Isolamento de

Salmonella e Shigella.

Ágar seletivo para Bacillus cereus – Isolamento e

diferenciação de Bacillus cereus.

Ágar setivo para fungos – Cultura de fungos

patogênicos.

Ágar seletivo para Pseudomonas – Isolamento seletivo

de pseudomonas.

Ágar soja tripticaseína – Uso geral. Ágar Bordet Gengou – Bordettela pertussis

Ágar verde brilhante – Isolamento de Salmonella,

exceto Salmonella typhi.

Ágar Vogel johnson – Isolamento e identificação de

estafilococos.


Base ágar baird – Parker – Isolamento e

contagem de estafilococos.

Ágar cetrimida – Isolamento Seletivo de

Pseudomonas aeruginosa.

Ágar columbia – Cultura de microorganismos

exigentes.

Ágar GC – Isolamento de neisserias

patogênicas.

Ágar sangue – Determinação da atividade

hemolitica.

Ágar sangue com azida – Isolamento de

estreptococos.

Caldo Rappaport – Enrequecimento seletivo

de salmonella exceto Samonella Typhi.

Caldo tetrationato – Enriquecimento seletivo

de Salmonella. (Kauffman)

Caldo lactosado – Detecção e contagem do

NMP de coliformes.

Caldo Lauril sulfato de Sódio – Detecção de

coliformes em águas e alimentos.

Caldo lisina Descarboxilase – Identificação

de enterobactérias. (arginina e ornitina)

Caldo nutriente – Uso geral.

Caldo Sabouraud dextrosado – Cultura de

fungos e leveduras.

Caldo Selenito cistina – Enriquecimento

seletivo de Salmonella.

Caldo Selenito de sódio – Enriquecimento

seletivo de Salmonella.

Agar chocolate – agar sangue aquecido –

microorganimos exigentes

TCBS – Tiosulfato citrato bile sacarose –

família Vibrionaceae

Caldo verde brilhante - Pesquisa de

coliformes em águas e alimentos.

Infuso cérebro coração (BHI) –

Desenvolvimento de bactérias exigentes.

Meio diferencial Chromagar – indicador de

vários gêneros bacterianos

Caldo tioglicolato – Prova de esterilidade de

produtos básicos e farmacêuticos e culturas

de aeróbios , anaeróbios e microaerófilos.

Água peptonada alcalina – pré-

enriquecimento de Vibrio

Agar campylobacter – rico - Campylobacter Meio Mio – Identificação de Enterobactérias.

Meio MRVP – Identificação de

Enterobactérias.

Meio sim - Identificação de Enterobactérias.

MEIOS DE CULTURA DESIDRATADOS

Ágar XLD (Xilose , Lisina, Desoxicolato) -

Isolamento de enterobactérias .

Água peptonada tamponada - Pré –

enriquecimento para Salmonella em

alimentos.


Conservação das Culturas Puras

• Uma vez que os micro-organismos tenham sido isoladosem cultura pura, é necessário manter as culturas vivaspor um período de tempo com o objetivo de estudá-las.

• Para armazenar por um período curto, as culturas podem ser repicadas periodicamente, mantidas em meio mínimo ou à temperatura de refrigeradores (4 a 10oC).


• Para armazenar por período longo, mantemos as culturas

em nitrogênio líquido (-196oC) ou freezer (-70 a -20oC),

ou ainda congeladas (-20oC) com substâncias protetoras.

• Outro processo muito usado é congelar a amostra,

desidratar e fechadar a vácuo em um processo

denominado liofilização.


As coleções de culturas são bancos de m.o. e outras células que estão à disposição de pesquisadores, professores, investigadores de patentes, e todos aqueles que necessitem estudar um tipo particular de m.o. um conjunto de células de referência de uma coleção de cultura padrão.

As células são congeladas em cubas de nitrogênio líquido ou liofilizadas para resistir a qualquer variação que possa destruir a identidade da célula original.

Coleções de cultura



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