Presentado por: Azzam Sofía, Gentilini Lucas, Krawzcyk María y Reinert Marina.

• En eucariotas hay tres clases de RNA polimerasas, según el tipo de RNA que se va a transcribir: - RNA polimerasa I: Cataliza la síntesis del pre-rRNA (45S), en el nucléolo.- RNA polimerasa II: Responsable de la síntesis del precursor de los mRNA.-RNA polimerasa III: Produce los tRNA y el rRNA 5S.

• Sensibilidad a α- amanitina (procede del hongo Amanita phalloides) de las distintas RNA polimerasas:

I.- Sensibilidad muy baja.II.- Muy sensibleIII.- Sensibilidad intermedia

• RNA pol II esta formada por numerosas subunidades, la subunidad grande presenta numerosas repeticiones en su extremo carboxilo-terminal: secuencia CTD.

RNA polimerasas

Dominio carboxilo terminal (CTD)de RNA pol II

• Consiste en una serie de hasta 52 repeticiones de la secuencia Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser (heptena).

• Está involucrado en todas las etapas de la transcripción y su estado de fosforilación determina que se lleven a cabo eficientemente.

• Para que se inicie la transcripción el CTD no debe estar fosforilado, mientras que para que avance la ARN polimerasa II y deje el promotor, hace falta que el CTD esté fosforilado.

• Los factores encargados del procesamiento del pre-ARNm se unen al CTD para realizar su función: el agregado del CAP en el extremo 3´, la poliadenilación en el 5´ y el “splicing” de exones.

• Se ha comprobado que determinadas repeticiones del heptapéptido del CTD son necesarias para el normal crecimiento y viabilidad de las células.

SPLICING!

El Splicing alternativo permite obtener a partir de un pre-ARNm distintas moléculas de ARNm maduras. Este proceso ocurre principalmente en eucariotas, aunque también puede observarse en virus.

Mecanismo post transcripcional de corte y empalme del ARN

El splicing es frecuentemente cotranscripcional y funcionalmente acoplado a la transcripción. Sin embargo puede ocurrir independientemente in vitro, pero es menos eficiente que in vivo o que en sistemas in vitro pero acoplados a la transcripción.

De todas maneras, parece haber un alto grado de coordinación entre eventos de splicing vecinos, que pueden limitar el numero de variantes de los genes, la transcripción jugaría un papel principal en dicha coordinación.

Si bien Amoeba dubia(unicelular) tiene el genoma más grande del mundo 670.000 Mb, siendo 230 veces más grande que el humano (2900 Mb), el 60% de los genes humanos son suceptibles al splicing alternativo, lo que aumenta increíblemente el potencial codificante del genoma.

Ambos procesos comparten muchos componentes de sus maquinarias proteicas.

Dos modelos se han propuesto para explicar el fenómeno de acoplamiento splicing-transcripción.

El modelo cinético: “First come, first serve”

• Considerando la longitud media de los intrones, el periodo entre la transcripción de un exón y el siguiente es lo suficientemente larga para que el spliceosoma se una al primer exón antes de que el siguiente se presente. Esto permitiría que un exón “débil” no tenga que competir con uno “fuerte”.

• Esto deriva en que una tasa de transcripción lenta favorece la inclusión de exones débiles mientras que una tasa elevada favorece su exclusión.

Modelo cinético

El modelo de reclutamiento:

• La unión al promotor de activadores o co-activadores de la trascripción influencia diferencialmente el reclutamiento de factores de splicing.

• Las proteínas SR son factores esenciales y moduladores de splicing constitutivo y alternativo respectivamente; constituidas por 1 ó 2 dominios de unión a RNA, (amino terminal) y un dominio rico en dipéptidos repetidos de argininas y serinas, RS (carboxilo terminal).

• Son reguladas por fosforilación.

• Reconocen secuenacias potenciadoras exonicas (ESEs).

• El dominio RS se une al punto de ramificación de un pre- mRNA participando de manera importante en el splicing.

• Trabajos anteriores demostraron que SRp20 esta involucrada en el splicing alternativo de varios transcriptos, dado que su nivel de expresión influencia la selección del sitio de splicing. ( Regulated expression and RNA processing of transcripts from the Srp20 splicing factor gene during the cell cycle. H Jumaa, JL Guenet and PJ Nielsen. Max Planck Institute for Immunobiology, Freiburg im Breisgau, Germany).

Proteínas SR y SRp20

Resultados

La cola de CTD tiene algún efecto sobre el splicing alternativo?

tranfección

Hepatoma 3B

VECTOR(WTres / ∆CTD)

MINIGEN EDI (≠ promotores + EDI)

RT-PCR

0 hstransfección

24 hsα- amanitina

48 hsharvest

RT-PCR

RNA pol II + α-amanitinaRes

La cola de CTD tiene algún efecto sobre el splicing alternativo?

RNAm

∆CTD aumenta la inclusión de EDI independientemente del promotor utilizado

Control negativo

• Usan promotores constitutivos que estarán activos antes y después del tratamiento con α-amanitina.

RNAm trancripto tanto por RNA pol II endógena como exógena (WTRes / ∆CTD) antes del tratamiento.

• ∆CTD pol II tiene capacidad limitada para transcribir plásmidos transfectados.

SISTEMA INDUCIBLE

• Para ver si el efecto en el splicing alternativo visto depende del transcripto dado por ∆CTD pol II.• Controlo a nivel temporal la transcripción del minigen EDI.

SISTEMA INDUCIBLE: Tet-Off

Se basa en la activación del gen de interés por parte de la proteina de transactivación por tetraciclina (tTA).

Cuando tTa se une al DNA en el operador TRE, éste activa un promotor acoplado, induciendo la transcripción del gen de interés.

En presencia de TC, tTa pierde afinidad por el operador y la transcripción se inhibe.

Estrategia experimental

Hepatoma 3B

tTA + Gen reportero + Vector (WTs/ WTRes/ ∆CTD)

transfección en medio con tetraciclina

Analizaron actividad de luciferasa

actividad de luciferasa

Sistema inducible

¿Qué pasa con el activador utilizado en la construcción?

Activador fuerteActivador débil

Efecto de ΔCTD sobre el nivel de inclusión de EDI

La inclusión es independiente del tratamiento con α-amanitina y se ve favorecida por la ausencia de CTD.

Hepatoma 3B

tTA + construcción con minigen + Vector (WTs/ WTRes/ ∆CTD)

transfección en medio con tetraciclina

la inclusión de EDI aumenta en ausencia de CTD (ΔCTD).

RT-PCR

Real time RT- PCR del RNAm maduroPorcentaje de inhibición: 90%

¿Cuál es la intensidad de la inhibición llevada a cabo por α-amanitina?

Ahora se sabe que ∆CTD influye en el splicing alternativo, pero cómo lo hace?

Inhibición global de las reacciones de procesamiento del RNAm

• capping• poliadenilación• splicing general

El efecto de CTD sobre el splicing alternativo es independiente de su influencia sobre los mecanismos globales del procesamiento del RNAm.

No se aprecian diferencias entre ∆CTD y WTRes

CTD esta compuesta por dos fracciones:-Heptenas 1 – 25 (extremo N- terminal): esta compuesto mayoritariamente de secuencias YSPTSPS.

-Heptenas 26 – 52 (extremo C- terminal): mayoritariamente degeneradas.

-Rio abajo de la heptena 52 se encuentra un motivo de diez aminoácidos (Cter) involucrado en la estabilización del CTD.

Se transfectaron células Hep B3 con construcciones conteniendo la Pol II con fracción N- o C- terminal del CTD y con o sin el motivo Cter.

• Pol II es estable con cualquiera de las dos fracciones siempre que estén acompañadas por el motivo Cter. De lo contrario se degrada dando una forma de 180 kDa de menor posesividad.

¿La composición de las secuencias heptaméricas del CTD afectan al splicing de EDI?

Se evaluó el splicing de EDI utilizando los mutantes de CTD estables del experimento anterior.

Ambas fracciones del CTD promueven el splicing de EDI de igual forma que WT res (rescate).

La función del CTD es independiente de la composición de la fracción.

Estudios anteriores, habían producido CTDs con número variable de heptenas. Esto ocurría a través de eventos de recombinación que se daban durante la división celular.

¿El largo del CTD es importante para su rol en el splicing?

Se transfectaron células con diferentes construcciones y se evaluó el efecto sobre la inclusión de EDI.

Se demostró la integridad de la proteína en las células con las distintas construcciones.

Los CTDs cortos producían una alta inclusión de EDI, aunque menor a la de ΔCTD.

A medida que aumentaba la longitud del CTD la inclusión del EDI se restituía, disminuyendo hasta los valores normales (WTres).

Una longitud mínima de 19 heptenas es necesaria para que se produzca el splicing normal del exón.

La ausencia del CTD podría afectar el reclutamiento de factores de splicing de modo de favorecer la inclusion del exón.

La mayoría de los factores que afectan el splicing de EDI estimulan la inclusión del exón. Siendo SF2/ASF el de mayor efecto activador.

Solo se conoce una proteína SR capaz de inhibir la inclusión de EDI, SRp20.

2 Hipótesis planteadas

La ausencia CTD podría favorecer el reclutamiento de

factores activadores de

splicing.

La ausencia del CTD no permitiera el reclutamiento de inhibidores del

splicing.

ó…

¿Qué efecto tiene la sobreexpresión de estas proteínas en el splicing de EDI?

Se transfectaron células con el plásmido pSVEDA/FN solo o en combinacion con vectores de expresion para SF2/ASF o SRp20.

La sobreexpresión de SF2/ASF aumenta la inclusion de EDI. Esto se revierte al sobreexpresar SRp20

Sabiendo ahora lo que ocurre con la sobreexpresión, se decidió testear el efecto sobre el splicing en el caso contrario, bajando los niveles de pt.

¿Qué es el RNAinterferencia?

Es un mecanismo que permite suprimir la expresión de genes específicos, impidiendo la traducción de los mensajeros correspondientes. Esto se conoce como KNOCK DOWN.

Los principales actores son las moléculas de RNA interferentes. Las que hay de 3 tipos:

siRNA Moléculas de ARN doble cadena de 20-30 nt. Tienen dos nucleótidos desapareados (3´overhangs).

miRNA

ARN simple cadena de 21-25 nt. Son codificados por el genoma.

piRNA

ARN simple cadena de 24-31 nt. Biogénesis y mecanismo de acción poco conocidos.

El proceso de RNAi por siRNAs se puede dividir en 5 pasos

1- Un ARN doble cadena que es expresado o introducido en la célula, es procesado a smallRNAs (doble cadena) por DICER (una RNasaIII-específicas de corte RNAdc)

2- El duplex es reconocico por un conjunto de proteínas que promueve la separación de las hebras.

3- El complejo ribonucleoproteico ( o RISC, RNA-induced silencing complex, contiene RNA guía) realiza una búsqueda del transcriptoma (conjunto de ARNms de una célula en un momento y condiciones dadas) para encontrar ARNms target.

4-El RNA guía dirije una endonucleasa llamada SLICER (Argonauta, presente en el complejo RISC) para que clive al ARNm.

5-Luego del clivaje, el ARNm ahora sin CAP ni cola POLY A es degradado por la maquinaria de la célula.

El sistema funciona para ambos SRp, ya que estos logran inhibir tanto la expresión endógena como exógena de la proteína blanco.

¿Funciona el knock down de SF2/ASF y SRp20 con siRNAs para estas proteínas?

siLuc como control negativo: si no hay siRNA contra los factores de splicing, estos tienen que aparecer en el Western blot. El sistema de siRNA no interfiere inespecíficamente. Las abundancias de proteínas SR fueron normalizadas a la de ERK-2 (kinasa que participa en la activación y proliferación de linfocitos T). Prot. Endógenas con

anticuerpo anti la proteína correspondiente.

Contra las recombinantes se usó un ab para su T7tag

El knock down de SF2/ASF induce la reducción de la inclusión de EDI, tanto en presencia como en ausencia del CTD.

SF2/ASF no actuaria interaccionando con CTD

El knock down de SRp20 aumenta la inclusión de EDI. Este efecto se anula en ausencia de CTD.

SRp20 inhibe la inlcuisón de EDI dependiendo de la presencia de CTD.

La inclusion de EDI estaría regulada, en parte, por un mecanismo que implica el reclutamiento de factores de splicing mediado por la CTD.

¿Qué efecto tiene el knock down de SF2/ASF y SRp20 sobre el splicing de EDI?

DRB: inhibe la CDK9 kinasa CDK9 kinasa: fosforila la CTD en Ser2.C4: polimerasa de elongación lenta.

Se sabe que CTD permite la unión de factores positivos y negativos para la elongación. Además CTD es necesaria para la transición desde iniciación hacia la elongación.

¿Podría ser que los resultados observados con ΔCTD se deban a una menor elongación por parte de la polimerasa?

La ausencia de SRp20 sobre polimerasa defectuosas para la elongación produce el mismo efecto que sobre polimerasas WT.

No hay elongación normal en estos tratamiento

El efecto observado de siSRp20 en ΔCTD (no aumenta la inclusion de EDI) no se debe a una elongación deficiente por parte de la polimerasa.

Al deletar CTD el aumento de la inclusión es mayor (5-7)que si solamente se trata con siSRP20 células con WT res (5-6).

Si la interacción del CTD con SRp20 fuera la única causa de la exclusión de EDI, el efecto observado en las calles 6 y 7 debería ser el mismo.

Debe haber otro factor actuando en CTD que favorece la exclusión.

El efecto de siRNA sobre EDI con ∆CTD se debe exclusivamente a SRp20?

Por lo tanto; la alta inclusion de EDI observada en mutantes ΔCTD puede atribuirse en su totalidad a su incapacidad de mediar la inhibición provocada por SRp20.

Proceden a realizar el mismo experimento que antes pero cosechando las células a 96 hs después de la transfección, para asegurarse de alcanzar un nivel de interferencia de SRp20 mayor.

Los niveles de inclusion son los mismos en ambos tratamientos.

Como se vio anteriormente (fig. 1) el efecto de ΔCTD sobre el splicing de EDI es independiente del promotor.

Los experimentos de Knock Down se realizaron

siempre en sistemas inducibles, entonces...

¿Podría ser que el efecto del K.D. de SRp20 dependa de las características del promotor?

Independientemente del promotor,el K.D de SRp20 aumenta la inclusión de EDI solo cuando la polimerasa tiene CTD.

Al realizar Knock Down de SRp20 cuando EDI estaba bajo el control de distintos promotores, se vio que el efecto sobre la inclusión del exón era el mismo que el observado en el sistema inducible.

¿Podría ser que el efecto del KD de SRp20 dependa de las características del promotor?

Podría ser, que los niveles de inclusión de EDI cuando la polimerasa carece de ΔCTD sean tan altos que impongan un umbral sobre el cual mayores incrementos se vean obstaculizados.

Esto explicaría porqué al hacer K.D. de SRp20 en células con ΔCTD no se observó un aumento en la inclusión de EDI

¿Realmente el efecto de SRp20 es dependiente de la presencia de CTD en la RNA pol II?

Se diseño un sistema con el que se reducían los niveles basales de inclusión de EDI para poder revelar si existen efectos de SRp20 independientes de ΔCTD

ΔESEMutantes con una deleción de la región

enhancer de EDI. SF2/ASF pierde afinidad para promover la

inclusión de EDI.

¿Realmente el efecto de SRp20 es dependiente de la presencia de CTD en la RNA pol?

Se comparó el efecto del KD de SRp20 partiendo de similares niveles basales de inclusión de EDI.

Se confirman que el efecto de SRp20 en la inclusión de EDI depende de CTD. Y que los niveles basales de EDI no inducen una inclusión diferencial por parte de ΔCTD.

Incluso a bajos niveles basales de inclusión, el KD de SRp20 no aumenta la inclusión de EDI cuando la polimerasa es ΔCTD pero si cuando es WT.

Conclusiones:

•La transcripción por la RNA pol II mutante (ΔCTD) aumenta la inclusión del exón EDI sin afectar la eficiencia general del splicing.

•El número de heptenas y no su composición es la causa de la funcionalidad del CTD en el splicing de EDI. Siendo 19 la cantidad mínima para una función normal.

•El aumento en la inclusión del EDI promovido por la proteína SF2/ASF no se ve afectada por la deleción del CTD.

•La inhibición de la inclusión del EDI por el factor SRp20 depende absolutamente del CTD.

•La acción de SRp20 mediante el CTD no depende de la tasa de elongación de la polimerasa.

•El efecto producido por la ΔCTD en el splicing puede atribuirse por completo a que la enzima es incapaz de mediar la inhibición por SRp20.

•El mecanismo mediante el cual SRp20 inhibe la inclusión de EDI aún no se conoce.

La tasa de elongación y el reclutamiento de factores de

splicing, (el modelo cinético y el de reclutamiento) contribuyen de manera independiente al control

transcripcional del splicing alternativo.

EDI