Prezentare Finala Alexandru Briciu

LOGO

STUDIUL PRIVIND INFLUENŢA VIRUSULUI PLUM POX ASUPRA

COMPOZIŢIEI CHIMICE A FRUNZELOR ŞI FRUCTELOR LA ŞASE

SOIURI ALE SPECIEI PRUNUS DOMESTICA L.

Dr. ing. BRICIU ALEXANDRU CIPRIAN

Prof. dr. PAMFIL DORU

UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ

CLUJ-NAPOCA

ŞCOALA POSTDOCTORALĂ

POSDRU/89/1.5/S/52432

www.themegallery.com

CUPRINS

1. Stadiul actual al cunoştiinţelor în domeniul strict al

temei de cercetare postdoctorale

2. Scopul şi obiectivele cercetării, materialul şi metoda

3. Rezultate şi discuţii

4. Concluzii


INTRODUCERE

Virusul Plum pox este considerat cel mai devastator patogen viral al speciilor pomicole sâmburoase. Acest fapt se datorează scăderii calităţii fructelor şi pierderilor cauzate de căderile premature ale acestora.

În România, acest virus este răspândit în toate arealele de cultură ale prunului şi provoacă pierderi masive de producţie ( Zagrai şi colab., 2006).

Cele mai recente cercetări de mare amploare din Romania au fost coordonate de către dr. ing. Zagrai Ioan, cercetător la SCDP Bistriţa. Rezultatele au arătat o situaţie dramatică şi necontrolabilă în ceea ce privesc infecţiile masive cu Plum pox din ţara noastră.

Studierea impactului PPV-ului asupra compoziţiei chimice a prunelor are un caracter limitat la nivel global. În România singurele cercetări au vizat acţiunea virusului Plum pox asupra cantităţii de substanţă uscată, pH şi aciditate titrabilă, analize efectuate pe un număr de 26 de soiuri. Rezultatele studiului au arătat o scădere a cantităţii de substanţă uscată şi a pH-lui şi o creştere a acidităţii titrabile (Maxim, 2001).


Simptomele provocate de virusul Plum pox

Plum pox este o boală foarte gravă producând simptome severe pe fructe,

frunze, sâmburi, uneori pe trunchi şi pe ramurile de schelet. Simptomele de

PPV sunt foarte evidente pe frunzele de primăvară ce se manifestă sub

forma unor decolorări de culoare verde deschis, pete clorotice, cercuri

concentrice, deformări ale frunzelor. În unele cazuri se constată o cădere

prematură a fructelor bolnave.

Prezenţa sau intensitatea simptomelor variază în funcţie de specie şi soi,

tulpina virală, starea fitosanitară a gazdei cu privire la alţi viruşi, sezon şi

locaţie. PPV influenţează într-o mică măsură vigoarea şi longevitatea

pomilor infectaţi.


Simptomele provocate de virusul Plum pox

Simptome de PPV pe frunze de prun Atac de PPV pe fructe de prun

Atac de PPV pe fructe de piersic Simptome de plum pox pe fructe de cais


Starea actuală a tulpinilor virusului Plum pox

Caracterizările serologice şi moleculare a izolatelor Plum pox virus (PPV)

efectuate de către cercetătorii din Europa Occidentală au permis stabilirea

apartenenţei izolatelor la diferite tulpini virale dar şi la identificatea unor

forme recombinate.

Cele 8 tulpini virale

ale PPV-ului

Suşa D (dideron) - Franţa

Suşa M (marcus) - Grecia

Suşa Ea (el amar) - Egipt

Suşa SoC (sour cherry) – Republica Moldova

Suşa SwC (sweet cherry) - Italia

Suşa PPV-Rec - Slovacia

PPV-W(winona) - Canada

PPV-T - Turcia


Cercetările realizate asupra rezistenţei prunului la

Plum pox pe glob şi în România

Pe plan mondial există două direcţii în ceea ce priveşte dezvoltarea

rezistenţei prunului la PPV. Prima direcţie ar fi ameliorarea clasică, ce

exploatează rezistenţa naturală. Din păcate lipsa acestei rezistenţe

naturale a împiedicat obţinerea de soiuri rezistente la PPV prin

ameliorare clasică. A doua direcţie reprezintă utilizarea ingineriei

genetice în obţinerea de plante modificate genetic, rezistente la PPV.

Mirobolan BN 4Kr

Local de Dragăşani

soiul Jojo

Rezistenţă naturală

Linia transgenică C5

Rezistenţă genetică


Cercetări privind studierea compuşilor fenolici şi a

activităţii antioxidante

Prunele conţin ceea mai mare cantitate de potasiu, fosfor, calciu şi

magneziu, fiind foarte bogate în compuşi fenolici, caracterizaţi ca

având o mare capacitate antioxidantă, mai mare decât portocalele,

merele sau strugurii (Sochor şi colab., 2010).

Compuşii fenolici naturali au continuat să atragă interesul unui număr

mare de cerectători în contextul unei scăderi a incidenţei la cancer şi

boli cardiovasculare (Long şi colab., 2001). Polifenolii s-au dovedit a fi

compuşi antimicrobiali naturali, fapt important pentru un organism

sănătos (Naidu, 2000).

Cele mai multe cercetări pe prun au vizat analizarea cantităţii de

polifenoli totali, activităţii antioxidante, pH-ul, aciditatea totală din

fructe (Gil şi colab., 2002; Cevallos-Casals şi colab., 2006).


SCOPUL CERCETĂRII

Proiectul “Studierea influenţei virusului Plum pox asupra

compoziţiei chimice a frunzelor şi fructelor la şase soiuri ale

speciei Prunus domestica L.”abordează aspecte de mare

actualitate ce asigură acumularea de cunoştinţe avansate şi

rezultate ştiinţifice într-un domeniu de mare importanţă

ştiinţifică şi economică.

Având în vedere pagubele uriaşe produse de virusul Plum

pox culturii prunului prin diminuarea semnificativă a

producţiilor de prune din ţara noastră, modul de abordare

a problematicii propuse se justifică pe deplin şi se

încadrează în politica naţională în domeniu.


OBIECTIVELE URMĂRITE

În cadrul prezentului proiect de cercetare postdoctorală am urmărit să determinăm dacă polifenolii au un rol în rezistenţa/sensibilitatea la nouă soiuri de prun privind infecţiile cu PPV.

Obiectivele secundare se referă la:

• diagnosticarea moleculară,

• diferenţierea tulpinilor PPV pentru fiecare soi în parte prin tehnicile RT-PCR şi PCR-RFLP,

• determinarea influenţei PPV-ului (tulpinilor D şi REC) asupra totalităţii polifenolilor, capacităţii antioxidante, pH-ului şi acidităţii titrabile.


MATERIAL ŞI METODE

RT-PCR P1/P2

CP P1-PD/PM

NIb mD5/Mm3

PCR-RFLP

Rsa I Alu I

Tehnici de

laborator

utilizate

Totalitatea

polifenolilor (TP)

Folin-ciocalteu

Capacitatea

antioxidantă

DPPH


REZULTATE ŞI DISCUŢII

REZULTATE PRIVIND ANALIZAREA MOLECULARĂ PRIN RT-PCR A

CELOR 36 DE PROBE RECOLTATE DE LA SCDP BISTRIŢA

Diagnosticarea moleculară

Analizarea profilului electroforetic folosind amorsele P1/P2 pentru

identificarea prezenţei sau absenţei virusului la 12 probe; L-100pb

DNA Step Ladder.

Legendă:

I1-4=Iulia

C1-4=Carpatin

A1-4=Albatros 243 pb

L I1 I2 I3 I4 C1 C2 C3 C4 A1 A2 A3 A4



Diferenţierea moleculară a tulpinilor PPV-D şi PPV-M

Analizarea profilelor electroforetice folosind perechile de amorse P1/PD şi

P1/PM în vederea diferenţierii tulpinilor PPV-D şi PPV/M la 5 probe ce aparţin

soiurilor: Iulia, Carpatin, Albatros, Diana, Minerva

P1PD P1PM

198 bp

L I C A D M L I C A D M

Legendă:

I- Iulia- 6/38

C- Carpatin-13/38

A-Albatros- 16/28

D-Diana-10/4

M-Minerva-12/1



Detecţia tulpinii recombinate PPV-Rec

Prima apariţie privind recombinarea ARN-ului în PPV a fost raportată în fosta Iugoslavie

(izolatul 06) de către Cervera şi colab., (1993) şi în Slovacia (izolatul BOR-3) de către Glasa şi

colab., (2001). La noi în ţară studiile efectuate de către Zagrai şi colab. (2006, 2008) arată o

răspândire a tulpinii PPV-Rec în toate zonele de cultură a prunului. Aceste izolate PPV-Rec

prezintă o mare similaritate cu alte izolate recombinate raportate de Glasa şi colab. (2004)

împărtăşind acelaşi punct de recombinare. L 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 C+ C-

Analizarea profilului electroforetic folosind perechea de amorse mD5m/M3

în vederea identificării tulpinii PPV-REC la 5 probe ce aparţin soiurilor:

Iulia, Carpatin, Albatros, Diana, Minerva.

605 pb

L I C A D M

Legendă:

I- Iulia- 6/38

C- Carpatin-13/38

A-Albatros- 16/28

D-Diana-10/4

M-Minerva-12/1



L 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 C+ C-

L I C A D M

Rezultatele analizelor moleculare la cele 36 de probe prelevate de la noua soiuri de

prun cultivate la Staţiunea de Cercetare şi Dezvoltare Pomicolă Bistriţa

Soiul

Variety

Tulpina

Strain

Iulia Carpatin Cacanska

Rana

Albatros Romaner Oneida Diana Minerva Ivan

free free free free free free free free free

PPV-D PPV-D PPV-D PPV-D PPV-

D+REC

PPV-

REC

PPV-

REC

PPV-REC PPV-REC

PPV-

REC

PPV-

REC

PPV-REC PPV-

REC

PPV-

D+REC

PPV-

REC

PPV-

REC

PPV-REC PPV-REC

PPV-

D+RE

C

PPV-

D+REC

PPV-

D+REC

PPV-

D+REC

PPV-

D+REC

PPV-

REC

PPV-

D+RE

C

PPV-

D+REC

PPV-REC


REZULTATE PRIVIND ANALIZAREA MOLECULARĂ PRIN PCR-RFLP A CELOR

36 DE PROBE RECOLTATE DE LA SCDP BISTRIŢA

Diferenţierea moleculară a tulpinilor virale PPV-D şi PPV-M prin digestia

enzimatică cu enzima Rsa I

L A1 A2 A3 R1 R2 R3 C1 C2 C3

Diferenţierea tulpinilor virale cu ajutorul tehnicii PCR-RFLP,

utilizând enzima de restricţie RsaI (probele A1-3= Albatros,

R1-3= Romaner, C1-3= Carpatin), L- Ladder pUC 18 DNA

Msp I Digest

Legendă:

A1-3=Albatros

R1-3=Romaner

C1-3=Carpatin


61 bp

182 bp

243 bp


REZULTATE PRIVIND ANALIZAREA MOLECULARĂ PRIN PCR-RFLP A CELOR

36 DE PROBE RECOLTATE DE LA SCDP BISTRIŢA

Identificarea eventualelor mutaţii suferite de tulpinile virale la nivelul

situsului de restricţie al regiunii genei care codifică proteina capsidală

L A1 A2 A3 R1 R2 R3 C1 C2 C3 L A1 A2 A3 R1 R2 R3 C1 C2 C3

Produşii PCR digeraţi cu enzima de restricţie AluI

pentru probele A1-3= Albatros, R1-3= Romaner, C1-3=

Carpatin, L- Ladder pUC 18 DNA Msp I Digest

Legendă:

A1-3=Albatros

R1-3=Romaner

C1-3=Carpatin


61 bp

182 bp


REZULTATE PRIVIND ANALIZAREA INFLUENŢEI VIRUSULUI

PLUM POX ASUPRA POLIFENOLILOR TOTALI ŞI A

CAPACITĂŢII ANTIOXIDANTE LA FRUNZELE DE PRUN

Analizarea celor doi parametri biochimici (pH şi TA) la fruzele de prun

recoltate de la cele nouă soiuri

În cazul celor nouă soiuri s-a constatat o scădere a valorilor

pH-ului şi o creştere a acidităţii titrabile la probele infectate în

comparaţie cu cele neinfectate. Cele mai mari diferenţe faţă de

proba neinfectată s-au obsevat la probele infectate cu tulpina REC,

dar mai ales la infecţiile mixte. Virusul Plum pox a influenţat

semnificativ pH-ul şi aciditatea, soiurile sensibile fiind mai

afectate decât cele tolerante.


REZULTATE PRIVIND ANALIZAREA INFLUENŢEI VIRUSULUI

PLUM POX ASUPRA POLIFENOLILOR TOTALI ŞI A

CAPACITĂŢII ANTIOXIDANTE LA FRUNZELE DE PRUN

Conţinutul de polifenoli totali din frunzele de prun

Determinarea valorilor de polifenoli totali au fost re-calculate pe baza acidului galic

(GA), care au variat de la 768,9 la 994,0 mg GA • 100 g-1 (FW) şi oferă informaţii cu privire la

conţinutul de polifenoli din frunzele de prun (tab. 3).Valorile cele mai mari de polifenoli totali

au fost determinate la genotipul Iulia (PPV-D + REC-994,0 mg GA • 100 g-1 FW şi PPV-REC -

976,0 GA • 100 g-1 FW), iar cel mai mic nivel la soiul Albatros (PPV-D - 768,9 mg GA • 100 g-

1 FW şi PPV-REC - 782,5 mg GA • 100 g-1 FW).

Capacitatea antioxidantă a frunzelor de prun

Valorile capacităţii antioxidante au variat de la 131,9 la 285,8 mmol·L-1 de produs

vegetal proaspăt (FW). Cele mai mari valori ale capacităţii antioxidante au fost puse în

evidenţă la genotipul Iulia (PPV-D+REC- 285,8 mmol·L-1and PPV-REC - 272,8 mmol·L-1),

iar cele mai mici la genotipul Romaner (PPV-D + REC – 131,9 mmol·L-1) şi Carpatin (PPV-D

– 135,3 mmol·L-1).


REZULTATE PRIVIND ANALIZAREA

INFLUENŢEI VIRUSULUI PLUM POX ASUPRA

POLIFENOLILOR TOTALI ŞI A CAPACITĂŢII

ANTIOXIDANTE LA FRUNZELE DE PRUN

Corelaţia dintre conţinutul polifenolilor totali (TP) şi capacitatea antioxidantă a

frunzelor de prun.

0

200

400

600

800

1000

1200

0 50 100 150 200 250 300 350

Activitatea antioxidantă exprimată prin concentraţia Troloxului (mmol•L-1 )

Antioxidant activity expressed as concentration of Trolox (mmol•L-1 )

TP

ex

pri

ma

t p

rin

co

nţi

nu

tul d

e a

cid

ga

lic

(m

g G

A.1

00

g-1

)

TP

ex

pre

ss

ed

as

co

nte

nt

of

ga

llic

ac

id

(mg

GA

.10

0g

-1 )

Corelaţia dintre conţinutul polifenolilor totali (TP) şi capacitatea

antioxidantă a frunzelor de prun.





ANTIOXIDANTE LA FRUNZELE DE PRUN

Corelaţia dintre conţinutul polifenolilor totali (TP) şi capacitatea antioxidantă a

frunzelor de prun.

Continuare

Între capacitatea antioxidantă şi cantitatea de polifenolic total (TP) s-a evidenţiat o

corelaţie pozitivă (r=0,71).

Valorile polifenolilor totali au fost mai mari la probele infectate faţă de cele free, mai

ales la soiurile tolerante. Acest lucru dovedeşte faptul că polifenolii pot avea un rol

important în rezistenţa/sensibilitatea soiurilor de prun la PPV.

Rezultatele noastre sunt în concordanţă cu literatura de specialitate (Gunen, 2005;

Honty, 2010), indicând faptul că polifenolii totali pot fi consideraţi markeri biochimici;

putând fi utilizaţi în diferenţierea soiurilor tolerante şi rezistente la PPV. Diferenţierea

tulpinilor D şi REC ne-a indicat faptul că cea mai mare influenţă a avut-o tulpina REC şi

infecţiile mixte (D+REC), mai ales la varietăţile sensibile.


REZULTATE PRIVIND ANALIZAREA INFLUENŢEI

VIRUSULUI PLUM POX ASUPRA POLIFENOLILOR

TOTALI ŞI A CAPACITĂŢII ANTIOXIDANTE LA

PRUNE

Determinarea valorilor pH-lui din prune

În cazul celor două soiuri s-a constatat o scădere a valorilor

pH-ului la probele infectate în comparaţie cu cele neinfectate. Cele

mai mari diferenţe faţă de proba neinfectată s-au obsevat la

probele infectate cu tulpina REC, dar mai ales la infecţiile mixte.

Virusul Plum pox a influenţat semnificativ pH-ul şi aciditatea,

soiurile sensibile fiind mai afectate decât cele tolerante.




TOTALI ŞI A CAPACITĂŢII ANTIOXIDANTE LA PRUNE

Valorile pH-lui din prune la soiurile de prun studiate

Nr.crt.

No.

Soiul

Variety

pH-ul

1 Carpatin-Free 3,27

2 Carpatin-D+REC 3,17

5 Diana-Free 3,67

6 Diana-D+REC 3,45




TOTALI ŞI A CAPACITĂŢII ANTIOXIDANTE LA

PRUNE

Cantitatea de polifenoli totali şi capacitatea antioxidantă din

prune

În cazul prunelor, infecţia cu PPV a determinat o creştere a cantităţii

de polifenoli totali. Diferenţele dintre proba free şi cea infectată cu tulpina

D+REC sunt mai mari la soiul Carpatin, considerat a fi tolerant la acest virus.

Soiul Diana confirmă faptul că este sensibil deoarece cantitatea de polifenoli

totali este mai mică, neputându-se proteja împotriva infecţiei.

Valorile polifenolilor totali în cazul altor studii au variat de la 42.0

(soiul Wickson) la 109,2 mg/100g material proaspăt (soiul Black Beaut) (Gil şi

colab., 2002); 14–109 mg/100 g (Gil şi colab., 2002); 125–373 mg/100 g (Kim

şi colab., 2003). Aceste comparaţii ne indică faptul că soiurile studiate de noi

au un conţinut mai mic de polifenoli totali.



INFLUENŢEI VIRUSULUI PLUM POX

ASUPRA POLIFENOLILOR TOTALI ŞI A

CAPACITĂŢII ANTIOXIDANTE LA

PRUNE

Nr.crt.

No.

Soiul

Variety

Totalitatea polifenolilor

Total polyphenols

mg GA.100g

-1 FW

DPPH

mg Trolox.100g

-1 FW

1 Carpatin-Free 45,2 70,6

2 Carpatin-D+REC 74,0 82,6

3 Diana-Free 32,7 61,3

4 Diana-D+REC 37,2 67,1





ANTIOXIDANTE LA PRUNE

Corelaţia dintre conţinutul polifenolilor totali (TP) şi capacitatea

antioxidantă a frunzelor de prun.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

Activitatea antioxidantă exprimată prin concentraţia Troloxului (mmol•L-1 )

Antioxidant activity expressed as concentration of Trolox (mmol•L-1 )

TP

exp

rim

at

pri

n c

on

ţin

utu

l d

e

acid

galic (

mg

GA

.100g

-1 )

TP

exp

ressed

as c

on

ten

t o

f g

allic

acid

(m

g G

A.1

00g

-1 )

Între cantitatea de polifenoli totali şi activitatea antioxidantă (fig. 11) s-a stabilit

o corelaţie foarte pozitivă (r=0.95).

Rezultatele noastre sunt confirmate de literatura de specialitate, sugerând

faptul că cele două metode sunt cele mai recomandate a fi folosite în aceste analize.

Această corelaţie pozitivă dintre TP şi DPPH indică o posibilă asociere a acestora cu

rezistenţa la PPV. Acest fapt este confirmat şi în literatura de specialitate (Sochor şi

colab., 2010; Honty, 2010).


CONCLUZII

În cazul studiului realizat pe frunzele şi fructe, rezultatele au dovedit faptul

că virusul Plum pox a determinat o scădere a valorilor pH-lui şi o creştere a

acidităţii titrabile la probele infectate în comparaţie cu cele neinfectate.

Valorile polifenolilor totali pentru probele infectate faţă de cele free au fost

mai mari la soiurile tolerante, în comparaţie cu cele sensibile. Aceste rezultate

confirmă faptul că polifenolii pot avea un rol important în

rezistenţa/sensibilitatea soiurilor de prun la virusul Plum pox.

În cazul frunzelor a fost stabilită o corelaţie pozitivă între activitatea

antioxidantă şi cantitatea totală de polifenoli (r=0.71). Rezultatele noastre sunt

în concordanţă cu literatura de specialitate (Gunen, 2005; Honty, 2010),

indicând faptul că polifenolii totali pot fi consideraţi markeri biochimici,

putând fi utilizaţi în diferenţierea soiurilor tolerante şi rezistente la PPV.

În cazul prunelor corelaţia dintre cantitatea de polifenoli totali şi

activitatea antioxidantă a avut o valoare foarte pozitivă (r=0.95).

Corelaţii pozitive au fost obţinute în literatura de specialitate şi

de către Gil şi colab.( 2002), Cevallos-Casals şi colab. (2006).


CONCLUZII

Atât frunzele, cât şi fructele sunt potrivite pentru testarea

rezistenţei/sensibilităţii soiurilor de prun la virusul Plum pox.

Tehnicile moleculare RT-PCR şi PCR-RFLP s-au dovedit a fi foarte eficiente

în diagnosticarea şi diferenţierea tulpinilor virale, indicând o foarte bună

corelaţie. Toate izolatele diagnosticate ca fiind PPV-M în regiunea (Cter)CP s-

au dovedit a fi PPV-Rec în regiunea (Cter) Nib – (Nter)CP.

Diferenţierea tulpinilor D şi REC ne-a indicat faptul că cea mai mare influenţă

a avut-o tulpina REC şi infecţiile mixte (D+REC), mai ales la varietăţile sensibile.

LOGO

Documents

Prezentare Finala Alexandru Briciu