Univerzitet u Novom SaduFakultet tehničkih nauka

Odsek inženjerstvo zaštite životne sredine______________________________________________________________________

PRIMENA GASNE HROMATOGRAFIJE U IZŽSPROJEKAT

Nastavnik: Prof. emeritus Mirjana Vojinović MiloradovAsistent: Radonić dr Jelena

Student: Tijana Simin 436

______________________________________________________________________Novi Sad, septembar 2009

SADRŽAJ

1.0 UVOD U HROMATOGRAFSKE METODE...........................................................32.0 OPŠTI OPIS HROMATOGRAFIJE.........................................................................3

2.1. Podela hromatografskih metoda...........................................................................32.2. Brzine kretanja analiziranih sastojaka..................................................................72.3. Dejstvo hromatografske kolone..........................................................................102.4. Optimizacija rada kolone....................................................................................182.5. Pregled važnih odnosa za hromatografiju...........................................................252.6. Primena hromatografije......................................................................................26

3.0 GASNO-TEČNA HROMATOGRAFIJA...............................................................283.1. Principi gasno-tečne hromatografije...................................................................293.2. Uređaji za gasno-tečnu hromatografiju..............................................................303.3. Tečne faze u gasno-tečnoj hromatografiji..........................................................383.4. Primena gasno-tečne hromatografije..................................................................413.5. Uobičajne primene gasne hromatografije...........................................................42

4.0 TEČNA HROMATOGRAFIJA VISOKOG DEJSTVA.........................................444.1. Uređaji za tečnu hromatografiju visoke delotvornosti........................................454.2. Visokodelotvorna razdelna hromatografija........................................................494.3. Visoko delotvorna adsorpcijska hromatografija.................................................524.4. Visoko delotvorna hromatografija jonske izmene..............................................534.5. Visokodelotvorna hromatografija na gelu..........................................................584.6. Poređenje visokodelotvorne tečne hromatografije sa gasno-tečnom hromatografijom........................................................................................................594.7. Hromatografija sa superkritičnim tečnostima.....................................................604.8. Linearna hromatografija.....................................................................................65

5.0 literatura...................................................................................................................69

2

1.0 UVOD U HROMATOGRAFSKE METODE

Hromatografska analiza služi za analizu, identifikaciju i kvantitativno određivanje hemijskih sastojaka prisutnih u složenim smešama. Nijedna druga metoda hemijske analize nije tako moćna i nema tako svestranu mogućnost primene kao hromatografija.

Hromatografiju je izumeo ruski botaničar Mikail Semenovič Cvet početkom dvadesetog veka. Primenio je hromatografsku tehniku za analizu rastvora biljnih pigmenata hlorofila i ksantofila prolaskom kroz staklenu kolonu napunjenu kalcijum-karbonatom. Razdvojeni sastojci vide se na koloni kao obojene trake po kojima je tehnika dobila naziv (grčki chroma znači boja, a graphein pisati). Hromatografija je tehnika u kojoj se sastojci smeše razdvajaju zavisno od brzina kojima ih gasna ili tečna mobilna faza nosi kroz kolonu stacionarne faze.

2.0 OPŠTI OPIS HROMATOGRAFIJE

Teško je precizno definisati reč „hromatografija“, jer se njom označava veliki broj analitičkih sistema i tehnika. Međutim, svim hromatografskim postupcima zajedničko je postojanje stacionarne (nepokretne) i mobilne (pokretne) faze. Pri hromatografskim analizama gasovita ili tečna mobilna faza nosi sastojke uzorka kroz stacionarnu fazu, a razdvajanje sastojaka temelji se na njihovim različitim brzinama kretanja kroz stacionarnu fazu.

2.1. Podela hromatografskih metoda

Postoje dve vrste hromatografskih metoda. U hromatografiji na koloni, stacionarna faza ispunjava usku cev kroz koju mobilna faza kreće pod uticajem pritiska ili gravitacije. U laminarnoj hromatografiji stacionarna je faza naneta na ploču ili u pore papira. Mobilna faza u hromatografiji na ploči prolazi kroz stacionarnu fazu pod uticajem kapilarnih sila ili gravitacije. Laminarna hromatografija i hromatografija na koloni osnivaju se na istim vrstama ravnoteže. U ovom poglavlju se potanko obrađuje hromatografija na koloni.

Tečna hromatografija izvodi se u kolonama i na ravnim površinama, a gasna hromatografija i hromatografija sa superkritičnim tečnostima ograničene su na postupke u kolonama.

Prva kolona u tabeli 2.1 prikazuje tri vrste hromatografskih metoda, u zavisnosti od prirode mobilne faze. Mobilne faze mogu biti tečnosti, gasovi i tečnosti pri superkritičnim uslovima. Druga kolona tabele 2.1 odnosi se na pet vrsta tečne hromatografije, zatim na tri vrste gasne hromatografije koje se međusobno razlikuju po prirodi stacionarne faze i vrsti ravnoteže koja se uspostavlja između mobilne i stacionarne faze.

3

Opšta podela Specifična metoda Stacionarna faza Vrsta ravnoteže

Tečna hromatografija (LC) (mobilna faza : tečnost)

Tečno-tečno, ili raspodela

Tečna-vezana faza

Tečno-čvrsto, ili apsorbcija

Jonska izmena

Razdvajanje na temelju veličine čestica

Tečnost apsorbirana na čvrstoj materiji

Organski spojevi vezani na čvrstu površinu

Čvrsta materija

Jonski izmenjivač

Tečnost u prostorima polimera

Podela između tečnosti koje se ne mešaju

Podela između tečne i vezane površine

Apsorbcija

Jonska izmena

Podela/prosejavanje

Gasna hromatografija (GC) (mobilna faza: gas)

Gasno-tečna

Gasna vezana faza

Gasno-čvrsta

Tečnost apsorbirana na čvrstoj materiji

Organski spojevi vezani na čvrstu površinu

Čvrsta materija

Podela između tečnosti koje se ne mešaju

Podela između tečne i vezane površine

ApsorbcijaHromatografija sa superkritičnom tečnošću (SFC) (mobilna faza: tečnost pri superkritičnim uslovima)

Organski spojevi vezani na čvrstu površinu

Podela između superkritične tečnosti i vezane površine

Tabela 2.1 Podela hromatografskih metoda na koloni

2.1.1. Eluacijska hromatografija Slika 2.1 je shematski prikaz razdvajanja sastojaka A i B u koloni eluacijskom hromatografijom. Eluacija je ispiranje sastojaka koji prolaze kroz kolonu, dodavanjem novih količina rastvarača. Eluacija je proces u kojem mobilna faza ispira analizirane sastojke sa stacionarne faze. Eluens je rastvarač koji nosi sastojke smeše kroz stacionarnu fazu. Na vrh kolone unese se uzorak rastvoren u mobilnoj fazi (vreme t0 na slici 2.1). sastojci A i B prolaskom kroz kolonu raspoređuju se između mobilne i stacionarne faze. Dodavanjem mobilne faze (eluensa) pomera se rastvoreni uzorak niz kolonu uz dalju raspodelu sastojaka između mobilne aze i svežeg dela stacionarne faze (vreme t1).

4

Slika 2.1 (a)dijagram pokazuje razdvajanje smeše sastojaka A i B eluacijskom hromatografijom na stubu (b)izlazni zapis odziva detektora na različitim stepenima

eluacije prikazane u (a)

Dodavanjem rastvarača molekuli uzorka putuju niz kolonu uz uspostavljanje ravnoteže između mobilne i stacionarne faze. Sastojci uzorka kreću se samo u mobilnoj fazi, pa zato, prosečna brzina kojom se sastojak kreće kroz kolonu zavisi od vremena koje provede u mobilnoj fazi. To je vreme kratko za sastojke koje snažno veže stacionarna faza (sastojak B na slici 2.1), a drugoza sastojke koje snažnije veže mobilna faza (sastojak A). Zbog različitih brzina kretanja, sastojci smeše se razdvajaju, pri čemu duž kolone nastaju trake ili zone (slika 2.2).

Slika 2.2 koncentracijski profil traka sastojaka A i B u različitim vremenima njihove eluacije niz kolonu (sa slike 2.1). Vremena t1 i t3 prikazana su na slici 2.1.

Potpuno razdvajanje sastojaka omogućeno je proticanjem dovoljne količine mobilne faze kroz kolonu. Tada iz kolone izlaze razdvojeni sastojci (trake se eluiraju iz kolone) koji se mogu skupiti u za to pripremljene posudice (vreme t3 i t4 na slici 2.1).

5

Hromatogrami

Hromatogram je zapis bilo koje funkcije koncentracije analizirane materije u zavisnosti od vremena ili volumena eluacije.Ako se na izlaz iz kolone postavi detektor, čiji odziv zavisi od koncentracije sastojka u uzorku, a koji se beleži kao funkcija vremena (ili volumena dodate mobilne faze), dobiće se niz simetričnih eluacijskih kriva odnosno pikova poput onih prikazanih na donjem delu slike 2.1. Takav prikaz, nazvan hromatogram, koristan je i za kvalitativnu i za kvalitativnu analizu. Položaj pika na vremenskoj osi može poslužiti za identifikaciju sastojaka, a iz površine ispod pika može se izračunati količina svakog razdvojenog sastojka.

Uticaj relativnih brzina kretanja i širenja zone eluiranog sastojka na razdvajanje

Slika 2.2 prikazuje koncentracijske profile trake sa sastojcima A i B u koloni sa slike 2.1 u vremenu t1 i u kasnijem vremenu t3. Stacionarna faza snažnije veže sastojak B nego A, pa zato sastojak B tokom kretanja niz kolonu zaostaje. Udaljenost između njih se povećava kako se pomeraju niz kolonu. Istovremeno se zone šire i time smanjuju dejstvo kolone kao jedinice za razdvajanje. Dakle, kao što prikazuje slika 2.2, potpuno razdvajanje sastojaka moguće je ako je kolona dovoljno dugačka.Na brzinu razdvajanja zona eluiranih sastojaka i na njihovo širenje utiče nekoliko hemijskih i fizičkih veličina. Razdvajanje se može poboljšati nadziranjem onih veličina koje ili povećavaju brzinu razdvajanja ili smanjuju brzinu njihovog širenja. Te mogućnosti pokazuje slika 2.3. Relativne brzine eluacije i širenje zona eluiranog sastojka određuju dejstvo hromatografskog razdvajanja.

Slika 2.3 Hromatogram uzorka na kojem su pokazane dve metode za poboljšanje razdvajanja: (a)izvorni hormatogram sa pikovima koji se preklapaju, (b)poboljšanje u

povećanoj razdvojenosti, (c)smanjenje širine pikova

U sledećoj glavi opisane su veličine koje utiču na relativne brzine kretanja sastojaka kroz stacionarnu fazu. Nakon toga obrađuju se veličine koje utiču na širenje zona eluiranih sastojaka.

6

2.2. Brzine kretanja analiziranih sastojaka

Dejstvo hromatografske kolone u pogledu razdvajanja sastojaka zavisi od njihovih relativnih brzina isticanja iz kolone. Te se brzine mogu odrediti iz odnosa raspodele sastojaka između stacionarne i mobilne faze.

2.2.1. Odnosi raspodele u hromatografijiSva hromatografska odvajanja temelje se na različitoj raspodeli analiziranog sastojka između mobilne i stacionarne faze. Za sastojak A ravnotežu opisuje sledeća jednačina :

Amobilna ↔ Astacionarna

Konstanta ravnoteže K te reakcije naziva se odnosom raspodele ili koeficijentom raspodele , i definiše se kao

(2.1)

pri čemu je cS molarna analitička koncentracija sastojka u stacionarnoj fazi, a cM je njegova analitička koncentracija u mobilnoj fazi. Idealno gledajući, odnos raspodele stalan je u širokom području koncentracije analiziranog sastojka, što znači da je cs

srazmeran cm. Uz visoke koncentracije analiziranog uzorka primećuje se odstupanje od linearnosti. Na sreću, većina hromatografskih analiza obavlja se pri uslovima koji zadovoljavaju jednačinu 2.1 , što pojednostavljuje izvođenje izraza kojima se opisuju procesi razdvajanja. Hromatografiju pri uslovima približnog, stalnog K nazivamo linearnom hromatografijom.

2.2.2. Vreme zadržavanjaVreme zadržavanja je vreme od unošenja uzorka u kolonu do pojave sastojka u detektoru smeštenom na izlazu iz hromatografske kolone. Slika 2.4 prikazuje tipični hromatogram dobijen za uzorak sa jednim analitom. Vreme potrebno tom analitu da nakon unošenja uzorka stigne u detektor naziva se vremenom zadržavanja i označuje se simbolom tg. Mali pik sa leve strane odnosi se na spoj koji kolona ne zadržava. Uzorak ili mobilna faza često sadrže materije koje kolona ne zadržava. Ako uzorak ne sadrži takav sastojak on se u njega može dodati, čime se olakšava identifikacija sastojka. Vreme tM koje je potrebno da materija koju kolona ne zadržava stigne u detektor katkad se zove mrtvo vreme. Brzina kretanja spoja koji kolona ne zadržava jednaka je prosečnoj brzini kretanja molekula mobilne faze.

7

Slika 2.4 Tipični hromatogram smeše koja sadrži dva sastojka. Mali pik sa leve srane predstavlja sastojak koji se ne zadržava u koloni pa u detektor dospeva neposredno nakon početka eluacije. Dakle, vreme zadržavanja tM je približno jednako vremenu

potrebnom da molekuli mobilne faze prođu kroz kolonu

Prosečna linearna brzina kretanja analiziranog sastojka, V je

(2.2)

pri čemu je L dužina punjenja u koloni. Slično tome, prosečna linearna brzina kretanja, u, molekula mobilne faze je

(2.3)

pri čemu je tM vreme potrebno da molekuli mobilne faze prođu kroz kolonu.

2.2.3. Odnos između vremena zadržavanja i odnosa raspodeleKako bismo doveli u vezu vreme zadržavanja nekog analita sa njegovim odnosom raspodele potrebno je njegovu brzinu kretanja izraziti kao deo brzine kretanja mobilne faze :

udeo vremena koje analizirani sastojak provede u mobilnoj fazi

Taj deo vremena jednak je odnosu prosečnog broja molova analiziranog sastojka u mobilnoj fazi u svakom trenutku i ukupnog broja molova tog sastojka u koloni:

Ukupni broj molova sastojka u mobilnoj fazi jednak je prizvodu molarne koncentracije cm tog sastojka u mobilnoj fazi i volumena mobilne faze Vm. Slično tome, broj molova

8

sastojka u stacionarnoj fazi dat je proizvodom koncentracije cs toga sastojka u stacionarnoj fazi i njenog volumena Vs. Iz toga sledi

.

Uvrštavanjem jednačine 2.1 u ovu jednačinu dobija se izraz za brzinu kretanja analita u funkciji njegovog odnosa raspodele i volumena stacionarne i mobilne faze

(2.4)

Volumeni stacionarne faze i mobilne faze mogu se dobiti iz postupka kojim se pravi kolona.

2.2.4. Brzina kretanja analita: faktor kapacitetaFaktor kapaciteta je važan parametar kojim se opisuje brzina kretanja analita u koloni. Za analit A faktor kapaciteta definiše se kao

(2.5)

Gde je KA odnos raspodele za analit A. Uvrštavanjem jednačine 2.5 u 2.4 nastaje

(2.6)

Da bi se pokazalo kako se može izračunati iz hromatograma, uvrste se jednačine 2.2 i 2.3 u jednačinu 2.6:

(2.7)

Ta se jednačina može napisati i kao

(2.8)

Kao što pokazuje slika 2.4, tR i tM mogu se lako očitati iz hromatograma. Kad je faktor kapaciteta nekog analita mnogo manji od jedan, eluacija je tako brza da je teško tačno očitati njegovo vreme zadržavanja. Kad je faktor kapaciteta veći od 20 ili 30, vreme

9

eluacije postaje jako dugo. Idealno je sprovoditi razdvajanja pri uslovima uz koje faktori kapaciteta za analize u smeši iznose između 1 i 5.Faktori kapaciteta u gasnoj hromatografiji menjaju se promenom temperature i punjenja kolone. Menjanjem faktora kapaciteta u tečnoj hromatografiji poboljšava se razdvajanje, a to se postiže menjanjem sastava mobilne i stacionarne faze.

2.2.5. Diferencijalne brzine kretanja: koeficijent selektivnostiKoeficijent selektivnosti kolne za dvaanalita A i B definiše se kao:

(2.9)

gde je KB odnos raspodele za snažnije zadržani analit B, a KA je odnos raspodele za slabije zadržani odnosno brže eluirani analit A. Prema toj definiciji, je uvek veće od jedan. Koeficijent selektivnosti neke hromatografske kolone izračunat za dva različita analita pokazuje koliko će dobro ta hromatografska kolona razdvojiti te sastojke. Uvrštavanjem jednačine 2.5 i iste jednačine za analit B u jednačinu 2.9, posle sređivanja dobija se odnos između koeficijenta selektivnosti i faktora kapaciteta za dva analita:

(2.10)

gde su i faktori kapaciteta za sastojak B odnosno A. Uvrštavanjem jednačine 2.8 za ta dva sastojka u jednačinu 2.10 dobija se izraz kojim se može odrediti iz hromatograma:

(2.11)

2.3. Dejstvo hromatografske kolone

Dejstvo hromatografske kolone označava veličina širenja eluirane zone sastojka. Širenje zona nastaje tokom kretanja sastojka niz kolonu. Pre definisanja dejstva kolone kvantitativnim izrazima, ispitaćemo razloge širenja zone eluiranog sastojka.

2.3.1. Kinetička teorija hromatografije

Kinetička teorija hromatografije opisuje oblik i oštrinu eluacijskih kriva kvantitativnim izrazima koji se temelje na mehanizmu slučajnog kretanja molekula tokom njihovog putovanja niz kolonu. Kvalitativno se mogu opisati uzroci širenja zona kao i varijacije koje ograničavanjem tog širenja, poboljšavaju dejstvo kolone.Ako posmatramo hromatograme prikazane u ovom i sledećem poglavlju, videćemo da eluacijske krive izgledaju kao Gausove krive grešaka. Normalna kriva grešaka može se

10

pojednostaviti uz pretpostavku da su nepouzdanosti vezane za svako pojedinačno merenje, zbir velikog broja malih, pojedinačno neodređenih i slučajnih nepuzdanosti, od kojih svaka ima istu verovatnoću da bude pozitivna ili negativna. Na sličan način, tipičan Gausov oblik hromatografske krive odnosno pika, mođe se pripisati aditivnoj kombinaciji slučajnih kretanja molekula u zoni za vreme njenog putovanja niz kolonu.Poučno je posmatrati pojedinačni molekul sastojka kako tokom eluacije prelazi više hiljada puta između stacionarne i mobilne faze. Vreme zadržavanja sastojka u stacionarnoj i mobilnoj fazi može se znatno razlikovati. Za prelaz iz jedne faze u drugu potrebna je energija koju molekul uzima iz svog okruženja. Dakle, vreme zadržavanja u datoj fazi može biti kratko za neke molekule i relativno dugo za druge. Molekul putuje niz kolonu samo dok je u mobilnoj fazi. Zato neki molekuli, zbog slučajnog boravka u mobilnoj fazi tokom dužeg vremena, putuju brzo, a drugi molekuli se ugrađuju u stacionarnu fazu više od prosečnog vremena. Rezultat tih slučajnih pojedinačnih procesa jeste simetrično razlaganje brzine oko srednje vrednosti, koja predstavlja ponašanje prosečnog molekula analita.Zone se šire kako se sastojak pomera niz kolonu. Naime, što se zona eluiranog sastojka duže nalazi u koloni, to ima na raspolaganju više vremena za širenje, zbog različitih mehanizama koji na to širenje utiču. Dakle, zona širenja je direktno srazmerna vremenu zadržavanja u koloni, a obrnuto srazmerna brzini mobilne faze.

2.3.2. Kvantitativna definicija uticaja koloneUticaj hromatografske kolone može se kvantitativno izraziti sa dve srodne veličine, a to su: (1) visina tavana H i (2) broj teorijskih tavana N. Ta dva pojma vezuje jednačina

(2.12)

gde je L dužina (najčešće u centimetrima) punjenja kolone. Kolona je delotvorna kad je H malo a N veliko. Visina odsečka H ponekad se označava kao visina ekvivalentna teorijskom tavanu.Dejstvo hromatografske kolone povećava se sa povećanjem broja tavana i sa smanjenjem njihove visine. Dejstva hromatografskih kolona mogu se međusobno znatno razlikovati, zavisno od vrste kolone i od razlika između mobilne i stacionarne faze. Ako se govori o broju tavana u kolonama, postoje kolone sa nekoliko stotina do nekoliko stotina hiljada tavana. Visine tavana mogu biti od nekoliko desetinki do nekoliko hiljada centimetara.

Definicija visine tavana

Naglasili smo da je širina Gausove krive najbolje opisana standardnim odstupanjem i varijacijom 2. Budući da hromatografske trake imaju oblik Gausove krive, a dejstvo kolone utiče na širinu hromatografskog pika, hromatografičari izražavaju dejstvo kolone varijacijom po jedinici dužine kolone. Iz toga sledi da je visina tavana H izražena jednačinom

(2.13)

11

Eksperimentalna procena H i N

Slika 2.6 prikazuje tipični hromatogram u kojem je vremenska osa apscisa. Jedinice za varijaciju pika analiziranog sastojka, koja se može izračunati jednostavnim grafičkim postupkom, su sekunde na kvadrat. Varijacija se označava sa 2 da bi se razlikovala od 2

čije su jedinice kvadratni centimetri. Standardna odstupanja i mogu se povezati izrazom:

(2.14)

pri čemu je L/tR prosečna linearna brzina kretanja analizirnog sastojka u centimetrima po sekundi.

Tangente u tačkama infleksije sa obe strane hromatografskog pika produže se do osnove hromatograma, pa tako nastaje trougao. Može se pokazati da površina tog trougla iznosi približno 96% ukupne površine ispod pika. Dakle, odsečak se nalazi na približno od maksimuma, a , pri čemu je W dužina osnove trougla. Uvrštavanjem tog izraza u jednačinu 2.14 i sređivanjem iste, dobija se:

.

Uvrštavanjem te jednačine umesto u jednačinu 2.13 dobija se:

(2.15)

N se dobije uvrštavanjem i sređivanjem jednačine 2.12:

(2.16)

Da bi se uporedili N i H za dve kolone, mora se razmatrati isti sastojak. Dakle, N se može izračunati iz dva merenja vremena, tR i W. Za izračunavanje H potrebno je imati podatak o dužini punjenja kolone dužine L. N se može približno izračunati na drugi, za neke pouzdaniji način, iz W1/2, tj. iz širine na polovini maksimalne visine pika. Tada se broj teorijskih tavana izražava kao:

(2.17)

Spomenuta dva parametra N i H često se susreću u literaturi, a proizvođači opreme pomoću njih izražavaju dejstvo svojih kolona. Da bi se tim parametrima mogle uporediti dve kolone, bitno je da se izračunati podaci odnose na isti sastav.

12

2.3.3. Kinetičke veličine koje utiču na širenje zonaŠirenje zone eluiranog sastojka posledica je konačne brzine kojom se događaju procesi prenosa mase tokom kretanja sastojaka niz kolonu. Neke od tih brzina se mogu nadzirati nameštanjem eksperimentalnim promenljivim, čime se ujedno poboljšava razdvajanje. U tablici 2.2 propisane su najvažnije od tih promenljivih. Uticaji tih veličina na dejstvo kolone, izražene visinom tavana H , opisani su u sledećim delovima.

Veličina Oznaka Uobičajene jediniceLinearna brzina mobilne faze uKoeficijent difuzije u mobilnoj fazi DM

Koeficijent difuzije u stacionarnoj fazi DS

Faktor kapaciteta(jednačina 26.8) Nema jediniceDužina zrna punjenja dp cmDebljina tečnog sloja na stacionarnoj fazi df cm

Tabela 2.2 Veličine koje utiču na dejstvo kolone

Uticaj brzine protoka mobilne fazeVeličina kinetičkog uticaja na dejstvo hromatografske kolone zavisi od vremena koje mobilna faza provede u dodiru sa stacionarnom fazom, a to vreme opet zavisi od brzine protoka mobilne faze. Iz tog razloga, proučavanja dejstva kolone uglavnom su vođena uz određivanje H (jednačina 2.16 ili 2.17, zatim 2.12) kao funkcije brzine mobilne faze. Podaci dobijeni takvim proučavanjem, grafički su prikazani na dva dijagrama na slici 2.5.

Slika 2.5 Uticaj brzine protoka mobilne faze na visinu tavana u (a)tečnoj i (b)gasnoj hromatografiji

Jedan se dijagram odnosi na tečnu a drugi na gasnu hromatografiju. Oba prikazuju minimum za visinu tavana H (ili maksimum u dejstvu) pri malim brzinama protoka.

13

Minimum za krivu visine tavana u tečnoj hromatografiji uglavno mse nalazi uz protoke, koji su mnogo manji od onih u gasnoj hromatografiji, a često su tako mali da se ne mogu opaziti pri normalnim radnim uslovima.Uopšteno, hromatogrami u tečnoj hromatografiji dobiju se uz manje brzine protoka nego u gasnoj. Nadalje, kako prikazuje slika, visine tavana za kolone u tečnoj hromatografiji su desetak puta manje od gasnohromatografskih kolona. Iz toga sledi da je nepraktična primena tečnih kolona dužih od 25 do 50 cm (zbog velikog sniženja pritiska), a gasnohromatografske kolone mogu biti duge 50 ili više metara. Posledica toga je da je ukupan broj tavana, pa prema tome i dejstvo kolone, uglavnom veći u gasnohromatografskim kolonama.

Teorija širenja zona eluiranog sastojka

Tokom zadnjih tridesetak godina radilo se mnogo na teorijskom i eksperimentalnom području sa ciljem pronalaženja kvantitativnih odnosa kojima se izražava uticaj eksperimentalnih veličina na visinu tavana za različite vrste hromatografskih kolona. Napisano je više od desetak izraza za izračunavanje visine tavana koji su primenjivani sa više ili manje uspeha. Očigledno da ni jedan od njih nije potpuno objasnio složene fizičke interakcije i uticaje koji deluju na širenje zona i time smanjuju dejstvo kolone. Neke od tih jednačina, iako nisu bez mane mnogo se primenjuju jer upućuju na bolji rad kolone. Jedna od tih jednačina je i ovde navedena.Dejstvo najvećeg broja hromatografskih kolona može se aproksimirati izrazom:

(2.18)

u toj jednačini H je visina tavana u centimetrima, a u je linearna brzina u centimetrima po sekundi. Veličina B je koeficijent longitudinalne difuzije a CS i CM su koeficijenti prenosa mase u stacionarnoj i mobilnoj fazi. Jednačine navedene u tabeli 2.3 pokazuju kako karakteristične veličine kolone utiču na tri spomenuta člana iz jednačine 2.18.

ProcesIzraz u jednačini 26.18

Izrazi koji povezuju osobine kolone* i rastvorenog sastojka

Broj jednačine

Longitudinalna difuzija2.19

Prenos mase prema i iz tečne stacionarne faze 2.20

Prenos mase prema i iz čvrste stacionarne faze 2.21

Prenos mase mobilnoj fazi 2.22

Tabela 2.3 Kinetički procesi koji doprinose širenju eluacijskih kriva

14

*u,DM,DS,df,dp, - definisani su u tablici 2.2f- funkcija odkD,q- konstantetd- prosečno vreme desorpcije analita sa površine: td = 1/kd, pri čemu je kd konstanta brzine prvog reda za desorpciju.dc- dužina koloneB- koeficijent longitudinalne difuzijeCS, CM – koeficijenti prenosa mase u stacionarnoj i mobilnoj fazi.

Longitudinalna difuzija B/u

Difuzija je proces kretanja molekula iz sredine veće koncentracije u sredinu manje koncentracije. Brzina kretanja molekula srazmerna je razlici u koncentraciji tih sredina kao i koeficijentu difuzije DM analiziranog sastojka. Koeficijent difuzije, kao mera za pokretljivost sastava u određenom medijumu, je konstanta jednaka brzini kretanja uz jedinični koncentracijski gradijent.Longitudinalnu difuziju u hromatografiji uzrokuje kretanje anliziranog sastojka od koncentrisanog centra zone prema razređenim područjima, i to u smeru kretanja mobilne faze i u suprotnom smeru. Longitudinalna difuzija je uobičajeni izvor širenja zona u gasno hromatografiji, ali ima malu važnost u tečnoj hromatografiji. Naime, u gasnoj hromatografiji brzina difuzije molekula u gasnom medijumu veoma je velika a u tečnoj hromatografiji difuzije su mnogo manje. Izraz B u jednačini 2.18 zavisi od koeficijenta difuzije DM analita u mobilnoj fazi i srazmeran je toj konstanti (2.19).Kako pokazuje jednačina 2.18, doprinos longitudinalne difuzije visini tavana obrnuto je srazmeran linearnoj brzini eluensa. Budući da je analit prisutan u koloni kraće vreme ako je brzina protoka velika, ovaj odnos ne iznenađuje. Zbog toga difuzija analita od centra prema krajevima eluacijske trake ima na raspolaganju manje vremena.Početna smanjenja H , prikazana krivama na slici 2.5 direktna su posledica longitudinalne difuzije. Treba uočiti da je uticaj longitudinalne difuzije mnogo manji u tečnoj hromatografiji, zbog mnogo manjih difuzija u tečnoj mobilnoj fazi. Razlika u visini tavana, prikazana na dve krive na slici 2.5, može se objasniti posmatranjem relativnih brzina longitudinalne difuzije u različitim mobilnim fazama. Naime, koeficijenti difuzije u gasovitom medujumu mnogo su veći nego u tečnom, pa je zato širenje zona veće u gasnoj nego u tečnoj hromatografiji.

Koeficijenti prenosa mase CS i CM

Koeficijenti prenosa mase CS i CM potrebni su u jednačini 2.18 zato što se ravnoteža između mobilne i stacionarne faze uspostavlja tako sporo da hromatografska kolona uvek radi pri neravnotežnim uslovima. Zbog toga molekuli analita odlaze sa prednjeg dela trake pre uspostavljanja ravnoteže sa stacionarnom fazom, koja bi ih mogla zadržati. Slično tome, ravnoteža se ne postiže na razvučenom kraju trake, pa molekuli analita zaostaju za mobilnm fazom, koja se brzo kreće niz kolonu.Širenje zona zbog prenosa mase nastaje zato što veliki broj tokova mobilne faze kroz kolonu i sloj nepokretne tečnosti koja čini stacionarnu fazu imaju konačne širine. Iz toga

15

sledi da je potrebno određeno vreme da molekuli sastojka difuzuju iz unutrašnjosti tih faza na površinu, gde se dešavaju prenosi. To zaostajanje podržava ne ravnotežne uslove duž cele kolone. Ako bi brzine prenosa mase u mobilnoj i stacionarnoj fazi bile beskonačne, ne bi bilo širenja zona ove vrste.Širenje zona izazvano longitudinalnom difuzijom kao i prenosom mase zavisi od brzine difuzije molekula analita ali je smer difuzije tada različit. Longitudinalno širenje potiče iz nastojanja molekula da se kreću u smeru paralelnom sa smerom protoka, a širenje izazvano prenosom mase nastaje zbog difuzije koso na smer protoka. Posledica toga je da je longitudinalno širenje uvek obrnuto srazmerno brzini protoka. Širenje trake izazvano prenosom mase je manje što je brzina protoka mobilne faze veća, jer tada za uspostavljanje ravnotee ima manje vremena. Dakle, kako pokazuju dva poslednja izraza u jednačini 2.18, delovanje prenosa mase na visinu tavana srazmerno je brzini u kretanja mobilne faze.

Izraz za prenos mase u stacionarnoj fazi CSu

Kad je stacionarna faza nepokretna tečnost, koeficijent prenosa mase je srazmeran kvadratu debljine sloja nanesenoga na zrnca čvrstog nosača df

2 , a obrnuto srazmerna koeficijentu difuzije DS analiziranog sastojka u tom sloju (jednačina 2.20). Takvo dejstvo može se objasniti činjenicom da oba prenosa smanjuju prosečnu učestalost kojom molekuli analita dolaze na površinu sa koje mogu preći u mobilnu fazu. Iz toga sledi smanjenje brzine prenosa mase i povećanje visine tavana.Kad je stacionarna faza čvrsti nosač, koeficijent prenosa mase CS srazmeran je vremenu koje je potrebno za adsorpciju ili desorpciju analiziranih sastojaka, a ono je obrnuto srazmerno konstantama brzine prvog reda (jednačina 2.21) tih procesa.

Izraz za prenos mase u mobilnoj fazi CMu

Procesi prenosa mase koji se mogu pojaviti u mobilnoj fazi suviše su složeni tako da i do danas nisu potpuno proučeni. S druge strane, veličine iz tog izvora koje utiču na širenje traka kvalitativno su dobro objašnjene, što je znatno unapredilo sve vrste hromatografskih kolona. Poznato je da je koeficijent prenosa mase CM u mobilnoj fazi obrnuto srazmeran koeficijentu difuzije analita u mobilnoj fazi DM. CM takođe zavisi od kvadrata dužine zrna punila dp

2, kvadrata dužine kolone dc2 i brzine protoka (jednačina 2.22).

Doprinos prenosa mase u mobilnoj fazi visini tavana izražava se proizvodom koeficijenta prenosa mase CM (koji je funkcija brzine protoka eluensa) i same brzine protoka rastvora. Dakle, čisti doprinos CMu visini tavana nije linearan u u (pogledati krivu označenu sa CMu na slici 2.7), ali na složen način zavisi od brzine eluensa. Zona širenja u mobilnoj fazi delimično je posledica velikog broja puteva kojima se molekuli (ili joni) mogu kretati niz punjenu kolonu. Kako prikazuje slika 2.6, dužine tih puteva mogu se međusobno znatno razlikovati. Iz toga sledi da je vreme, koje molekuli istog sastojka provedu u koloni, takođe različito. Molekuli analiziranog sastojka dospevaju na kraj kolone u određenom vremenskom periodu, što uzrokuje širenje traka.

16

Slika 2.6 Tipični putevi dva molekula tokom eluacije. Udaljenost koju pređe molekul 2 veća je od one koju prođe molekul 1

Taj uticaj, koji se ponekad zove vrtložna difuzija, ne bi zavisio od brzine protoka eluensa kad ne bi delimično bio uzrokovan običnom difuzijom. Ta difuzija naime, uzrokuje da molekuli iz struje koja sledi jedan tok prelaze u struju drugog toka. Ako je brzina protoka vrlo mala, može biti vrlo mnogo prelaza, pri čemu svaki molekul koji ide niz kolonu sledi puno puteva, kratko ostajući u svakom od njih. Posledica toga je da se brzina svakog molekula koji se kreće niz kolonu približava prosečnoj brzini. Dakle, pri malim brzinama kretanja mobilne faze, molekuli ne mogu, zbog prirode punjenja da omoguće mnoštvo puteva. Pri umerenim ili većim brzinama, nema dovoljno vremena za stvaranje prosečne difuzije, pa se događa širenje traka zbog različitih dužina puteva. Pri dovoljno velikim brzinama dejstvo vrtložne difuzije ne zavisi od brzine protoka mobilne faze. Na vrtložnu difuziju nadovezuje se dejstvo „džepova“ u stacionarnoj fazi, u kojima se zadržava mobilna faza. Dakle, kad je stacionarna faza čvrsta materija, njene pore napunjene su statičnim volumenom mobilne faze. Molekuli analita moraju difuzovati kroz te „džepove“ pre nego što je omogućen njihov prolaz između mobilne faze koja se kreće i stacionarne faze. Navedeno ne vredi samo za čvrstu stacionarnu fazu nego i za tečnu stacionarnu fazu nanesenu na providnu čvrstu materiju, jer ona najčešće ne ispunjava pore punjenja potpuno. Postojanje „džepova“ s mobilnom fazom usporava proces zamene. To utiče na visinu tavana koja je srazmerna koeficijentu difuzije za analit u mobilnoj fazi. Povećanje dužine zrna dp posredno utiče na visinu tavana jer je povećanje unutrašnjeg volumena praćeno povećanjem dimenzija zrna punjenja.

Uticaj brzine mobilne faze na izraze u jednačini 2.18

Promenu tri izraza iz jednačine 2.18 u funkciji brzine mobilne faze pokazuje slika 2.7. Kriva na vrhu je zbir navedenih dejstava. Obratite pažnju na to da postoji optimalna brzina protoka pri kojoj je visina tavana minimalna, a dejstvo razdvajanja maksimalno.

17

Zaključno o metodama koje smanjuju širenje zona

Dužina zrna punjenja i dužina kolone su dve merljive veličine koje utiču na dejstvo kolone. Dejstvo kolona povećavala se zadnjih godina primenom sve užih kolona.Uz gasove tečne faze longitudinalna difuzija može se smanjiti snižavanjem temperature, čime se smanjuje i koeficijent difuzije DM , a visine tavana postaju sve manje. To se ne primećuje u tečnoj hromatografiji, jer je difuzija dovoljno mala da izraz za longitudinalnu difuziju samo neznatno utiče na ukupnu visinu tavana.Uz tečne stacionarne faze, debljina adsorbovanog tečnog sloja mora biti minimalna jer je CS u jednačini 2.18 srazmeran kvadratu veličine df u jednačini 2.20. Širenje zona eluiranog sastojka može se smanjiti upotrebom punjenja i kolone malog prečnika. Koeficijent difuzije DM ima veći uticaj u gasnoj nego u tečnoj hromatografiji.

Slika 2.7 Doprinos različitih koeficijenata prenosa mase na visinu tavana kolone

2.4. Optimizacija rada kolone

Hromatografsko razdvajanje može se optimizirati menjanjem eksperimentalnih uslova. Ti se uslovi menjaju sve dok se sastojci smeše dobro ne podele uz minimalnu potrošnju vremena. Optimizacija razdvajanja može se postići:

Smanjenjem širenja zona eluiranog sastojka Promenom relativnih brzina kretanja sastojka.

Širenje zona povećavaju one kinetičke veličine koje povećavaju visinu tavana kolone. Brzine kretanja, sa druge strane, menjaju se promenom onih veličina koje utiču na faktor kapaciteta i koeficijent selektivnosti rastvorenih sastojaka.

2.4.1. Odvajanje

Odvajanje Rs kolone je kvantitativna mera kojom se izražava sposobnost razdvajanja dva analita na toj koloni. Važnost tog izraza prikazuje slika 2.8 sa dva hromatograma za

18

sastojke A i B na tri kolone razlićite moći razdvajanja. Odvajanje svake kolone definisano je izrazom:

(2.23)

Iz slike 2.8 vidljivo je da odvajanje od 1,5 omogućava potpuno odvajanje sastojaka A i B, a odvajanje od 0,75 to ne omogućava. Uz odvajanje od 1,0 zona A ssrži otprilike 0,4% B, a zona B sadrži približno 4% A. Uz odvajanje od 1,5 preklapanje iznosi otprilike 0,3%. Odvajanje za određenu stacionarnu fazu može se poboljšati produžavanjem kolone, čime se povećava broj teorijskih tavana. Nepogodnost pri povećanju broja tavana je u produženju vremena koje je potrebno za postizanje boljeg odvajanja.

Odnosi između odvajanja i osobina kolone i osobina analita

Postoji korisna jednačina koja povezuje odvajanje kolone sa brojem tavana, faktorima kapaciteta i koeficijentima selektivnosti za dva analizirana sastojka na hromatografskoj koloni. Može e pokazati da je za dva rastvorena sastojka A i B na slici 2.1 odvajanje dato jednačinom:

(2.24)

pri čemu je faktor kapaciteta za sastav koji se pomera sporije, a je faktor selektivnosti. Ta se jednačina može preurediti da bi se dobio broj tavana potrebnih za dobijanje traženog odvajanja:

(2.25)

Odnos između odvajanja i vremena eluacije

Kao što je pre spomenuto, optimum u hromatografiji je kad se postigne najbolje moguće odvajanje u najkraćem mogućem vremenu. Na žalost, ta se dva pojma međusobno isključuju, pa je zato potrebno postići nekakav kompromis. Vreme (tR)B potrebno za eluaciju dva sastojka sa sike 2.8 uz odvajanje RS iznosi:

(2.26)

gde je u linearna brzina kretanja mobilne faze.

19

Slika 2.8 Razdvajanje na tri kolone

Primer 1.

Vreme zadržavanja sastava A i B iznose 16,40 i 17,63 minuta na koloni dužine 30 centimetara. Nezadržavana supstanca prolazi kroz kolonu za 1,30 minuta. Širina pika u bazi za A iznosi 1,11 a za B 1,21 minuta. Izračunajte:

1. odvajanje kolone2. prosečan broj tavana3. visinu tavana4. dužinu kolone potrebnu za postizanje odvajanja od 1,55. vreme potrebno za eluaciju sastojka b na dužoj koloni.

Primenom jednačine 26.16 može se izračunati N: Rs= 2(17,63-16,40)/(1,11+1,21) = 1,06 Jednačinom 26.16 može se izračunati N.

i

cm i ne menjaju se povećanjem N i L. Dakle, uvrštavanje N1 i N2 u jednačinu

26.24 i međusobno deljenje nastalih jednačina daće:

20

,

pri čemu se indeksi 1 i 2 odnose na izvornu i dužu kolonu. Uvrštavanje odgovarajućih vrednosti za N1, (Rs)1 i (Rs)2 daje

.

Ali

cm.Uvrštavanjem (Rs)1 i (Rs)2 u jednačinu 26.26 te deljenjem nastaje:

minDakle, za poboljšanje odvajanja mora se udvostručiti vreme odvajanja.

2.4.2. Tehnike optimizacije

Jednačine 2.24 i 2.26, koje se sastoje od tri dela, temeljne su jednačine za izbor uslova pri kojima se postiže željeni stepen odvajanja uz minimalno trajanje. Prvi deo izraza sa odnosno H , opisuje dejstvo kolone. Drugi deo je koeficijent koji sadrži , a predstavlja izraz za selektivnost i zavisan je od osobina oba analita. Treći deo je koeficijent koji sadrži , a odnosi se na kapacitet kolone. Ovaj izraz zavisi od osobina analita i hromatografske kolone.

Promene visine tavana

Iz jednačine 2.24 vidi se da se odvajanje kolone povećava sa povećanjem kvadratnog korena broja tavana. Primer 1 pokazuje da povećanje broja tavana prati duže trajanje analize ako se postiže produženjem kolone, a ne smanjenjem visine tavana. Optimizacija brzine protoka mobilne faze takođe doprinosi poboljšanju odvajanja. Smanjenje visine tavana se može postići smanjenjem:

Dimenzije zrna punjenja Prečnika kolone Debljine tečnog sloja (tečna hromatografija) Sniženjem temperature kolone (gasna hromatografija).

Promene faktora kapaciteta

21

Menjanjem faktora kapaciteta može se često uticati na moć odvajanja. Povećanje najčepće poboljšava odvajanje (ali na uštrb vremena). Da bi se odredilo optimalno područje za vrednosti , poželjno je jednačinu 2.24 pisati u obliku:

,

a jednačinu 2.26 kao:

gde Q i sadrže ostatak izraza te dve jednačine. Slika 2.9 prikazuje Rs/Q i u

zavisnosti od uz pretpostavku da su i približno stalni. Jasno je da treba izbegavati

vrednosti veće od 10, jer one neznatno povećavaju odvajanje, ali zato znatno produžavaju vreme potrebno za razdvajanje sastojaka. Minimum na krivi eluacija – vreme pojavljuje se pri 2. Zato je često optimalna vrednost u području između 1 i 5.

Slika 2.9 Uticaj faktora kapaciteta na razdvajanje Rs i na vreme eluacije (tR)B

Odvajanje kolone najjednostavnije se može poboljšati optimizacijom . Uz primenu gasnih mobilnih faza se može optimizovati menjanjem temperature. Promene sastava rastvora, uz tečne mobilne faze, mogu delovati na tako da se postižu bolja razdvajanja. Primer snažnog uticaja relativno male promene u sastavu rastvora pokazuje slika 2.10. Neznatne promene odnosa metanol/voda pretvaraju nezadovoljavajuće hromatograme (a i b) u hromatograme sa dobro razdvojenim pikovima svih sastojaka (c i d). Za najširu primenu često je optimalno rešenje hromatogram (c) na kojem je zadovoljavajuće razdvajanje postignuto u minimalnom vremenu.

22

Slika 2.10 Uticaj sastava eluensa na hromatograme

Promene koeficijenta selektivnosti

Optimizacija i povećanje N ne osiguravaju zadovoljavajuće razdvajanje sastojaka uzorka u razumnom vremenu kad se približava jedinici. Trebalo bi pronaći načine kojima bi se povećao , a odmah ostao između 1 i 10. to se može postići:

Promenom sastava mobilne faze Menjanjem temperature kolone Menjanjem sastava stacionarne faze Primenom posebnih hemijskih reakcija

Primer za promenu sastava mobilne faze je razdvajanje anisola (C6H5OCH3) i benzena. Uz mobilnu fazu, koja se sastoji od smeše 50% vode i 50% metanola, iznosi 4,5 za anisol i 4,7 za benzen, a je samo 1,04. Zamena vodene faze mobilnom fazom koja sadrži 37% tetrahidrofurana daje od 3,9 i 4,7 uz vrednost 1,20. Pikovi su se znatno preklapali uz sastav rastvora metanol/voda, a neznatno uz tetrahidrofuran/metanol.Manje pogodna, ali često vrlo delotvorna metoda poboljšanja odvajanja uz istovremeno održavanje u optimalnom području, sastji se u hemijskoj promeni sastava stacionarne faze. Mnoge laboratorije imaju nekoliko različitih kolona, koje se mogu relativno lako zameniti, pa se i tako mogu poboljšati odvajanja.Porast temperature često izaziva povećanje , ali neznatno utiče na vrednosti za hromatografiju u sastavu tečnost- tečnost ili tečnost- čvrsta materija. Nasuprot tome, u hromatografiji jonske izmene uticaj temperature može biti dovoljno veliki da ne treba posezati za promenom punjenja kolone.Četvrta metoda poboljšanja odvajanja sastoji se u ugradnji spojeva u stacionarnu fazu, koji sa jednim sastojkom uzorka ili više njih stvaraju komplekse ili neke druge spojeve. Dobro poznat primer takvog načina jeste kada adsorbens impregniran sa soli srebra

23

poboljšava odvajanje olefina stvaranjem kompleksa srebra jona sa nezasićenim organskim spojevima.

2.4.3. Opšti problem eluacijeNa slici 26.14 nalaze se hipotetički hromatogrami smeše kojase sastoji od šest sastojaka. Ti sastojci čine po tri para sa vrlo različitim koeficijentima raspodele, dakle i sa vrlo različitm faktorima kapaciteta. U hromatogramu (a) uslovi su tako izabrani da faktori kapaciteta za sastojke 1 i 2 ( i ) imaju optimalnu vrednost između 1 i 5. faktori za druge sastojke su pri tome mnogo veći od optimalnih. Zbog toga se pikovi sastojaka 5 i 6 pojavljuju tek nakon dosta vremena i tako su široki da se teško mgu identifikovati.Kako pokazuje hromatogram (b), promena uslova u cilju optimizacije razdvajanja sastojaka 5 i 6 skuplja pikove prva četiri sastojka tako da je njihovo odvajanje nezadovoljavajuće. Međutim, u ovom je primeru ukupno vreme eluacije idealno.Treći izbor uslova, uz koje su vrednosti za sastojke 3 i 4 optimalne, daje hromatogram (c). Ni ovde razdvajanje preostala dva para nije potpuno zadovljavajuće.

Slika 2.11 Opšti problem eluacije u hromatografiji

Fenomen prikazan na slici 2.11 susreće se tako često da zaslužuje naziv opšti problem eluacije. Razumno rešenje tog problema je u menjanju uslova koji određuju vrednost tokom samog procesa razdvajanja. Spomenute promene mogu se unositi postepeno ili neprekidno. Dakle, za smešu sa slike 2.11, na početku razdvajanja mogu se postaviti uslovi koji će dati hromatogram (a). Odmah nakon eluacije sastojaka 3 i 4 8hromatogram c) postaje optimalno. Sa pojavom tih pikova, eluacija se dovršava pri uslovima nastajanja hromatograma (b). Često se takvim pristupom postigne zadovoljavajuće razdvajanje smeše u što je moguće kraćem vremenu.U tečnoj hromatografiji promene u postižu se menjanjem sastava mobilne faze tokom eluacije (gradijentna eluacija ili programiranje rastvora). U gasnoj hromatografiji porastom temperature (temperaturno programiranje) stvaraju se optimalni uslovi za razdvajanje

24

2.5. Pregled važnih odnosa za hromatografiju

U hromatografiji postoji mnogo različitih izraza i odnoa koji ponekad mogu stvarati zabune. Tablice 2.4 i 2.5 daju pregled najvažnijih definicija i jednačina koje se spominju u ovom tekstu.

NazivOznaka za eksperi-mentalnu veličinu

Izvedeno iz

Vreme kretanja nezadržavanog sastava

tM Slika 2.11

Vreme zadržavanja, sastojci A i B (tR)A,(tR)B Slika 2.11Ispravljeno vreme zadržavanja, sastojak A

= (tR)A - tM

Širina pikova, sastojci A i B WA, WB Slika 2.11Dužina punjenja kolone L Merenja dužineBrzina protoka F Merenja protokaZapremina stacionarne faze VS Podaci iz pripreme

punjenjaKoncentracija sastojka u mobilnoj i stacionarnoj fazi

, Podaci iz analize i pripreme

Tabela 2.4 Važne eksperimentalne hromatografske veličine i odnosi Naziv Izračunavanje izvedenih veličina Veza sa ostalim veličinamaLinearna brzina mobilne fazeZapremina mobilne faze

Faktor kapaciteta

Koeficijent raspodele

Koeficjent selektivnosti

Odvajanje

Broj tavana

Visina tavana

Vreme zadržavanja

25

Tabela 2.5 Važne izračunate veličine i odnosi

2.6. Primena hromatografije

Hromatografija je postala metoda koja ima apsolutnu prednost pri razdvajanju sličnih hemijskih spojeva. Osim toga, hromatografska analiza se može primeniti za kvalitativno dokazivanje i kvantitativno određivanje razdvojenih hemijskih vrsta.

2.6.1. Kvalitativna analiza

Hromatografska analiza se uveliko primenjuje pri utvrđivanju prisutnosti ili odsutnosti nekog sastojka u smeši poznatog sastava. Na primer, 30 ili više aminokiselina u proteinskim hidrolizatima može se identifikovati na hromatogramu uz razuman stepen pouzdanosti. Sa druge strane, hromatogram pruža samo jedan podatak o svakom sastavu prisutnom u uzorku (vreme zadržavanja), pa je zato primena te tehnike na složene uzorke nepoznatog sastava ograničena. Iz tog razloga je postalo uobičajeno da se hromatografske kolone povežu sa ultraljubičastim, infracrvenim ili masenim spektometrima koji imaju veće identifikacijske sposobnosti. Tako nastali povezani uređaji odnosno kombinovane tehnike moćno su sredstvo za određivanje sastava složenih smeša. Navešćemo nekoliko kombinovanih tehnika: (1) gasna hromatografija- spektrometrija masa (GC- MS). Visoko delotvorna tečna hromatografija- spektrometrija masa (HPLC- MS). Gasna hromatografija- IR spektroskopija (GC- IR).Treba naglasiti da hromatogram ne mora nužno potvrditi prisutnost nekog sastojka, ali on sigurno potvrđuje njegovu odsutnost. Dakle, činjenica je da se na hromatogramu uzorka uz isto vreme zadržavanja koje ima standard, a pogotovo uz pretpostavku da su dobijeni uz iste radne uslove, ne nalazi pik, neosporno je potvrda da tog sastojka u uzorku nema 8ili je prisutan u koncentracijama koje su manje od praga osetljivosti primenjenog postupka).

2.6.2. Kvantitativna analiza

Hromatografija se razvila zahvaljujući svojoj brzini, jednostavnosti, relativno niskoj ceni i mogućnosti primene kao uređaja za razdvajanje. Najveća prednost hromatografije sastoji se, ipak, u mogućnosti i kvantitativne analize. Kvantitativna hromatografija temelji se na poređenju visine ili površine analiziranog pika sa visinom ili površinom pika standarda. Ako su radni uslovi hromatografske analize strogo ponovljivi, ovi se parametri menjaju linearno sa koncentracijom.

Analize koje se temelje na visini pika

Visina pika je dužina kosine spuštene od maksimuma pika do osnovne crte pika. Ta se udaljenost može izmeriti prilično tačno. Izračunati rezultati količine prisutnih sastojaka u uzorku su tačni uz pretpostavku da promene uslova, pri kojima se rade analize standarda i uzorka, ne menjaju širinu pika u vremenu potrebnom za dobijanje hromatograma uzorka i standarda. Veličine koje pri analizi treba brižljivo nadzirati su temperatura kolone, brzina protoka mobilne faze i brzina unošenja uzorka. Pored toga treba paziti da se kolona ne

26

preoptereti. Brzina unošenja uzorka posebno utiče na pikove koji se nalaze na početku hromatograma. Relativne greške od 5 do 10% nisu neuobičajene pri unošenju uzorka mikrolitarskom prskalicom.

Analize koje se temelje na površini pika

Površina pika ne zavisi od uticaja širenja zone koja uzrokuje veličine navedene u prethodnom poglavlju. Sa tog gledišta, površina za izračunavanje količine nekog sastojka je povoljniji parametar od visine pika. Sa druge strane, visinu pika je jednostavnije izmeriti od njegove površine, a osim toga, merenje visine uskih pikova tačnije je od merenja njihove površine.Mnogi savremeni hromatografski uređaji sadrže elektronske integratore kojima se mogu izmeriti relativne površine pikova. Ako takva oprema nije dostupna, mogu se napraviti ručne procene. Jednostavna metoda, koja vredi za simetrične pikove umerene širine, sastoji se u množenju visine pika sa njegovom širinom na polovini visine. Zatim, se može upotrebiti planometar, ili se dobijeni pikovi mogu iseći i izmeriti. Izmerena masa isečenog pika sa papira upoređuje se sa izmerenom masom papira poznate površine koja odgovara poznatoj koncentraciji. Ručna integriranja omogućavaju reproduktivnost izračunavanja površina od 2 do 5%, a digitalna su nekoliko desetina puta tačnija.

Baždarenje primenom standarda

Najpogodnija metoda kvantitativne hromatografske analize sastoji se u pripremi niza standardnih baždarenih rastvora koji su po sastavu slične analiziranom uzorku. Standardnom rastvoru snimi se hromatogram, a visine pikova ili njihove površine prikažu se na dijagramu u zavisnosti od koncentracije. Takvim prikazom mora se doboti pravac, koji prolazi poljem koordinatnog sistema i predstavlja temelj za kvantitativnu analizu ispitivanih uzoraka. Radi postizanja velike tačnosti, ovaj postupak je potrebno često ponavljati.Najčešći izvor grešaka u analizama metodom baždarenja sa standardima je u nepouzdanosti unešene zapremine u kolonu. Ponekad na greške utiče i brzina unošenja uzorka. Količine uzorka su često male ( ), tako da nepouzdanosti vezane za reproduktivno unošenje uzorka mogu iznositi nekoliko posto.Još su najpovoljnije okolnosti u gasno- tečnoj hromatografiji kad se uzorak unosi u zagrejani deo uređaja. Pri takvom načinu unošenja uzorka mogu se pojaviti velike razlike u unešenoj količini uzorka, zbog isparavanja na vrhu igle.Greške zbog unošenja uzorka mogu se smanjiti na 1-2% upotrebom rotacionog ventila za unošenje uzorka, prikazanog na slici 2.12.

27

Slika 2.12 Rotacioni ventil za unošenje uzorka: (a)položaj ventila za punjenje petlje ACB; (b)položaj ventila za unošenje uzorka u kolonu

Petlja ACB u (a) napunjena je tečnošću. Okretanjem ventila za 45 stepeni u struju mobilne faze unosi se reproduktivna zapremina uzorka (zapremina sadržana u ACB).

Metoda unutrašnjeg standarda

Pri hromatografskoj analizi postižese najveća preciznost primenom metode unutrašnjeg standarda. Tom se metodom izbegavaju nepouzdanosti koje nastaju zbog razlika u unešenoj količini uzorka i standarda u hromatografsku kolonu. Tom se metodom u standardni rastvor i uzorak dodaje brižljivo izmerena količina unutrašnjeg standarda. Pri tome je analitički parametar iznos površine (ili visine) pika analiziranog sastojka i površine ( ili visine) pika unutrašnjeg standarda. Da bi ta metoda bila uspešna, pik unutrašnjeg standarda mora biti dobro podeljen od pikova ostalih sastojaka (Rs>1,25) i mora se nalaziti u blizini pika analiziranog sastojka. Sa pogodnim unutrašnjim standardom mogu se postići preciznosti od 0,5 do 1%.

3.0 GASNO-TEČNA HROMATOGRAFIJA

U gasnoj hromatografiji inertni gas nosač, koji je mobilna odnosno pokretna faza, eluira sastojke smeše iz kolone napunjene stacionarnom fazom. Za razliku od tečne hromatografije u gasnoj hromatografiji analit ne reagira sa mobilnom fazom, pa zbog toga njegova brzina kretanja kroz kolonu ne zavisi od hemijske strukture mobilne faze.Stacionarna je faza u gasnoj adsorpcijskoj hromatografiji čvrsta materija velike specifične površine, na kojoj se adsorbiraju analizirani sastojci. U adsorbcijskoj hromatografiji sastojci uzorka razdvajaju se zbog razlika u položaju ravnoteže koja se uspostavlja između gasovitog sastojka uzorka i čvrste površine stacionarne faze. Primena gasne adsorbcijske hromatografije ograničena je na gasovite spojeve male molekularne mase kao što su oksidi ugljenika, kiseonik, azot i ugljovodonici. Polarniji sastojci

28

zadržavaju se polutrajno na čvrstoj površini, što najčešće sužava primenu čvrstih adsorbensa za gasno-hromatografska razdvajanja.Gasno-tečna hromatografija (gas-liquid cromatography, GLC) o kojoj je u ovom poglavlju reč analitička je tehnika sa najvećom primenom za razdvajanje i kvantitativno određivanje većine složenih smeša. Stacionarna faza je u gasno-tečnoj hromatografiji tečnost, nanesena na povšinu čvrstog nosača adsorpcijom ili hemijskim vezivanjem. Brzinu prolaza analita kroz kolonu određuje njegov raspon raspodele između pokretne gasovite faze i imobilizirane, tečne faze.Iako su model gasno-tečne hromatografije 1941. godine najavili Martin i Synge, njegova korisnost za razdvajanje srodnih hemijskih spojeva pokazana je tek desetak godina posle. Tri godine nakon prvog javnog predstavljanja, na tržištu se pojavio komercijalni gasni hromatograf. Od tog vremena se gasna hromatografija neizostavno primenjuje u analitici. Zanimljivi su podaci o broju objavljenih radova iz gasne hromatografije kojih je do 1965. godine bilo dve hiljade godišnje, a do 1985. godine taj broj se povećao na pet hiljada.

3.1. Principi gasno-tečne hromatografije

Osnovni principi hromaotgrafije iznesena u prethodnom poglavlju i matematički odnosi prikazani u tabelama 2.4 i 2.5 mogu se primeniti i na gasnu hromatogafiju uz male izmene za korekcije u pogledu mogućnosti gasnih mobilnih faza. Jednačina 2.18 za izračunavanje visine tavana može se primeniti za gasnu i za tečnu hromatografiju. Longitudinalna difuzija (B/u) iz te jednačine ima veći uticaj kad je mobilna faza gas, jer su brzine difuzije u gasovima 104 puta veće od onih u tečnostima. Zbog toga je minimum u dijagramu na kojem se prikazuje visina tavana u odnosu prema brzini protoka mnogo širi u gasnoj hromatografiji (slika 2.5 b) nego u tečnoj. To se takođe odnosi i na krive sa slike 3.1 na kojoj je pokazano kako smanjenje obima zrna punjenja povećava visinu tavana.

Slika 3.1 Uticaj veličine zrna na visinu tavana. Brojevi sa desne strane označavaju prečnike zrna

29

3.2. Uređaji za gasno-tečnu hromatografiju3.2.1. Dovod gasa nosača

Kao gas nosač, koji mora biti hemijski inertan, mogu se upotrebljavati helijum, argon,vodonik i azot. Najčešće se upotrebljava helijum. Izvor gasa nosača često zavisi od primenjenog detektora. Na dovod gasa nosača postavljaju se regulatori pritiska, ventili i merači protoka, a često i molekularna sita koja služe za uklanjanje vode i ostalih nečistoća. Brzine protoka nadziru se regulatorima pritiska. Ulazni pritisci su otprilike od 0.7 do 3.5 × 105 Pa (iznad pritiska okoline), a protoci od 25 do 150 mL/min. Brzina protoka može se izmeriti jednostavnim meračem protoka sa mehurićem sapunice. Na putu gasa nosača stvori se mehurić sapunice. Vreme, tokom kojeg se tako nastala opna pomakne između dve oznake na bireti preračuna se u brzinu protoka.

3.2.2. Sistem za ubrizgavanje uzorka

Kako bi se smanjilo širenje zone eluiranog sastojka, u kolonu treba uneti malu količinu uzorka, i to brzo. Tečni uzorak se najčešće unosi kroz gumenu ili silikonsku membranu odnosno septum u zagrejani deo uređaja smešten na vrhu kolone najčešće pomoću mikrolitarskog ubrizgivača. Mesto na kojem se unosi uzorak (slika 3.2) uglavnom se greje otprilike 50 C iznad temperature vrenja najmanje isparljivog sastojka, tako da uzorak za vreme unošenja u kolonu trenutno ispari. Količina uzorka unešena u anlitičku kolonu može biti od nekoliko desetina mikrolitara do 20 L. Pri radu sa kapilarnim kolonama u koje se unose mnogo manje količine uzorka ( L), upotrebljava se razdvajač toka gasa nosača, tako da samo vrlo mali, najčešće hiljaditi deo uzorka uđe u kolonu, a ostatak se ispušta u atmosferu.

Slika 3.2 Grejani deo za unošenje uzorka

30

Gasovite uzorke najbolje je unositi u kolonu pomoću gasnih (dozatorskih) ventila sličnih onima prikazanim na slici 2.12. Čvrsti uzorci najčešće se unose nakon rastvaranja.

3.2.3. Kolone

Prva proučavanja gasno- tečne hromatografije ranih pedesetih godina radila su se na punjenim kolonama kod kojih je sloj tečnosti bio zadržan na površini sitno mlevenog, inertnog čvrstog nosača. Teorijska razmatranja iz tog ranog perioda pokazala su da su šuplje kolone prečnika nekoliko desetina milimetara delotvornije i brže od punjenih kolona. U takvim kapilarnim kolonama stacionarna faza je jednoliki sloj tečnosti debljine nekoliko desetina milimetara kojim je jednako podvučena unutrašnji zid cevi. Kasnih 50ih godina izrađene su kolone kapilarnih dimenzija praznih cevi tzv. Cevaste otvorene kolone, a predviđeni vidovi ponašanja tih kolona tokom primene, potvrđene su u nekoliko laboratorija na kolonama sa trista hiljada tavana ili više. Uprkos tako izvanrednim vidovima ponašanja u primeni, kapilarne kolone su se masovno počele upotrebljavati tek desetak godina nakon njihovog pronalaska.Razloga za odlaganje šire primene kailarnih kolona bilo je više: mali kapacitet za uzorak, lomljivost, mehaničke poteškoće vezane sa unošenjem uzorka i spajanjem kolone na detektor, poteškoće oko reproduktivnog prevlačenja kolone, kratki vek trajanja loše pripremljenih kolona, mogućnost začepljenja i patenti koji su onemogućavali komercijalni razvoj (izvorni patent je istekao 1977. godine). Kasnih 70ih ti su problemi rešeni pa je nekoliko proizvođača hromatografa počelo nuditi kolone ove vrste po umerenoj ceni. Posledica toga bila je da se kapilarne kolone masovno primenjuju tek zadnjih nekoliko godina.

Punjene kolone

Današnje punjene kolone izrađene su od staklenih, metalnih (čelik, bakar, aluminijum) ili teflonskih cevi, uobičajene dužine 2 do 3 metra i unutrašnjeg prečnika 2 do 4 milimetra. U njih se stavlja jednako, sitnozrnasto punjenje ili čvrsti nosač na koji je nanešen tanki sloj (0,05-1 m) stacionarne tečne faze. Da bi se mogla smestiti u termostatički prostor hromatografa, hromatografska kolona mora biti savijena u spirale prečnika otprilike 15 centimetara.

Čvrsti nosač u punjenoj koloni nosi tečnu stacionarnu fazu. Stacionarna faza nanosi se tako da što je moguće veća površina te faze bude u dodiru sa mobilnom fazom. Idealni nosač sastoji se od malih jednakih loptastih zrna odgovarajuće mehaničke čvrstoće i specifične površine od najmanje 1m2/gr. Osim toga materijal od kojeg se proizvodi čvrsti nosač mora biti toplotno stabilan i jednako natopljen tečnom fazom. Do sada nije pronađena ni jedna stvar koja bi udovoljavala svim navedenim uslovima. Za izradu čvrstih nosača danas se najćešće upotrebljavaju posebno obrađene prirodne dijatomejske zemlje koju čine ostaci hiljadu vrsta jednoćelijskih biljaka koje su nastanjivale nekadašnja jezera i mora. Te su biljke primale hranljive materije i odlagale otpad molekularnom difuzijom kroz svoje pore. Budući da se gasna hromatografija

31

temelji na istoj vrsti molekularne difuzije, dijatomejska zemlja je pogodna za izradu nosača stacionarne faze u punjenim kolonama.

Dimenzije zrna nosača. Kao što prikazuje slika 3.1 , dejstvo gasno- hromatografske kolone naglo se povećala sa smanjenjem prečnika zrna punjenja. Razlika u pritisku, koja održava zadati protok, povećava se sa kvadratom prečnika zrna. Zbog te razlike postoji donja razlika prečnika zrna. Razlika u pritisku veća od 3,5 105 Pa nije pogodna za rad u gasno-hromatografskoj koloni. Optimalni prečnici zrna punjenja su prema tome 250 do 170 m ili 170 do 149 m.

Kapilarne kolone

Postoje dve osnovne vrste kapilarnih kolona. Jedna vrsta su cevi sa unutrašnjim zidom prevučenim tankim slojem stacionarne faze, ( 30 m) koju nazivamo kapilarnim kolonama. Drugu vrstu čine mikropunjene kolone koje su takođe kapilarnih dimenzija, a unutrašnji zidovi koji su prevučeni punjenjem poput dijatomejske zemlje na koje je nanešena stacionarna faza. Debljina nanešenog sloja iznosi 30 m. Ove poslednje kolone sadrže nekoliko puta veću količinu stacionarne faze od prethodnih kolona, pa zato imaju veči kapacitet za uzorak. Uopšteno, dejstvo mikropunjenih kolona manja je od dejstva kapilarnih, ali je mnogo veća od dejstva punjenih kolona. Prve kapilarne kolone napravljene su od čelika, aluminijuma, bakra ili plastike, a posle se počelo upotrebljavati staklo. Zid staklene cevi mora se prvo nagristi hlorovodonikom, jakim rastvorom solne kiseline ili kalijumovim hidrogenfluoridom, kako bi njegova površina postala gruba. Na tako obrađenu površinu stakla stacionarna faza se veže čvršće. Najnovije takve kolone, koje su se na tržištu pojavile 1979. godine, izrađene su od izvučenog kvarca. Kvarcni kapilari se izvlače iz posebno pročišćenog kvarca koji sadrži minimalne količine metalnih oksida. Zidovi tih kapilara mnogo su uži od zidova staklenih kapilara. Na spoljašnjem zidu se tokom izvlačenja dodaje zaštitni sloj poliamida. Tako dobijene kolone su fleksibilne. Mogu se saviti u zidove prečnika nekoliko centimetara. Kapilrne kolone od izvučenog kvarca dostupne su na tržištu. Njihove važne prednosti su fizička čvrstoća, manja reaktivnost prema sastojcima uzoraka i fleksibilnost. U najviše primena zamenile su starije vrste kapilarnih kolona.Najčešće upotrebljavane kapilarne kolone od izvučenog kvarca imaju unutrašnji prečnik od 320 do 250 m. Prodaju se i kolone veće moći razlaganja, prečnika od 200 do 150 m. Pri primeni tako uskih kolona ima više nepogodnosti, a zahtevnije su u pogledu sistema za unošenje uzorka i detekcije. Uz njih mora postojati razdvajač toka gasa nosača, kako bi se smanjila količina unešenog uzorka u kolonu. Detektor, kojie se upotrebljava uz te kolone mora biti osetljiv i mora pokazati brz odziv. Od nedavno su se na tržištu pojavili kapilari prečnika 530 m, nazvani megaborama kolona. U njih se mogu unositi slične količine uzorka kao i u punjenoj koloni. „Megabore“ kapilarne kolone ne pokazuju u primeni tako dobra svojstva kao kapilarne kolone manjeg prečnika, ali su mnogo bolje od punjenih kolona. U tabeli 3.1 upoređene su osobine kapilarnih kolona od izvučenog kvarca sa ostalim vrstama kapilarnih kolona kao i sa punjenim kolonama.

Vrsta hromatografske kolone

32

FSTO* WCOT** SCOT*** PunjeneDužina, m 10-100 10-100 10-100 1-6Unutrašnji prečnik, mm

0,1-0,3 0,25-0,75 0,5 2-4

Dejstvo, tavan/m

2000-4000 1000-4000 600-1200 500-1000

Količina uzorka, ng

10-75 10-1000 10-1000 10-106

Relativni pritisak

Nizak Nizak Nizak Visok

Relativna brzina

Brzo Brzo Brzo Sporo

Hemijska inertnost

Najveća Najmanje

Fleksibilnost da ne ne neTabela 3.1 Svojstva i osobine tipične gasno-hromatografske kolone

*kapilarne kolone od izvučenog kvarca (Fused-silica open tubular column)**kapilarne kolone sa prevučenim zidom (Wall- coated open tubular column)***mikropunjene kolone, unutrašnji zid prevučen punjenjem (Support- coated open tubular column)

Adsorbcija koju uzrokuje punjenje kolone na zidu kapilara. Tokom gasno-hromatografske analize polarni ili oni sastojci, koji se mogu polarizovati, kao što su alkoholi ili aromatični ugljovodinici adsorbiraju se na površini čvrstog nosača. Takvom adsorbciojm nastaju nepravilni pikovi, koji su prošireni i često pokazuju zavlačenje. Ustanovljeno je da adsorbciju uzrokuju silikatna jedinjenja koja nastaju na površini dijatomejskog silikata reakcijom sa vlagom. Potpuno hidrolizirana površina silikata ima strukturu

Jedinjenja SiOH na površini nosača snažno privlače polarne organske molekule i teže da ih zadrže adsorbcijom. Čvrsti nosač može se deaktivirati silikacijom sa dimetilhlorsilanom (DMCS). Reakcija je:

33

Prilikom ispiranja metanolom, drugi se hlorid zameni metoksi grupom.

Zaostale mineralne nečistoće u dijatomejskoj zemlji mogu izazvati adsorbciju sastojaka uzorka na silikatnom nosaču. Te se nečistoće mogu ukloniti sa nosača ispiranjem kiselinom pre silikacije. Drugo sredstvo za silikaciju je heksametildisilazan, formule (CH3)3SiNHSi(CH3)3. Punjenja obrađena sa tim reagensom imaju oznaku HMDS.

3.2.4. Termostatiranje kolone

Za precizan rad potrebno je temperaturu kolone održavati u granicama nekoliko desetina stepeni. Kolona je najčešće smeštena u termostatičkom prostoru. Optimalna temperatura kolone zavisi od vrenja uzorka i stepena traženog odvajanja. Pri temperaturi jednakoj prosečnom vrenju uzorka ili nešto višoj postiže se prihvatljivo vreme eluacije (od 2 do 30 minuta). Uzorke širokog raspona vrenja poželjno je analizirati uz programiran porast temperature, tako da se temperatura kolone povećava neprekidno ili promenljivo tokom odvajanja. Slika 3.3c prikazuje dejstvo programiranog termostatiranja u pogledu poboljšanja odvajanja.Uopšteno optimalno odvajanje povezano je sa minimalnom temperaturom. Međutim pri nižoj temperaturi trajanje eluacije je duže a time i vreme potrebno za analizu. Slike 3.3a i 3.3b pokazuju taj princip.

34

Slika 3.3 Uticaj temperature na gasne hromatograme (a)izotermno na 45 C;(b)izotermno na 145 C; programirano na 30-180 C

3.2.5. Detektori

Uređaj za detekciju u gasno-tečnoj hromatografiji mora pokazati brz odziv na male promene koncentracije sastojaka tokom njihove eluacije iz kolone. Koncentracije analiziranih sastojaka u gasu nosaču, u bilo kom trenutku, nisu veće od nekoliko promila ili su čak i manje za jedna red ili nekoliko redova veličine. Osim toga, vreme tokom kojeg pik prođe kroz detektor, najčešće iznosi 1 sekund ( ili manje), pa detektor u tom vremenu mora pokazati potpun odziv. Ostala poželjna svojstva detektora su linearni odziv, stabilnost i jednak odziv za mnoge hemijske pojave ili predvidljiv i selektivan odziv za jednu vrstu ili više spojeva. Nepotrebo je naglasiti da ni jedan detektor ne zadovoljava sve navede zahteve i mala je verovatnoća da će takv detektor ikada biti napravljen. Ovde ćemo opisati tri detektora koja se najčešće upotrebljavaju u gasnoj hromatografiji.

Detektor toplotne provodljivosti

Detektor toplotne provodljivosti ili katarometar je detektor koji se prvi upotrebljavao u gasnoj hromatografiji. Taj uređaj, koji se još često koristi, temelji se na promenama toplotne provodljivosti struje gasa nosača koja nastaje zbog prisutnosti analita. Osetljivi

35

deo detektora na principu toplotne provodljivosti sastoji se od električno ugrejanog elementa temperature kojeg uz konstantnu jačinu električne struje zavisi od toplotne provodljivosti gasa koji ga okružuje. Grejani element može biti platinumska, zlatna ili volframova žica ili poluprovodnički termistor. Temperatura detektora meri se otporom žice ili termistora. Ta temperatura delimično zavisi od brzine kojom molekuli gasa provode toplotnu energiju od elementa detektora prema zidovima metalnog bloka u kojem je element smešten. Slika 3.4 šematski prikazuje tipičan komercijalni detektor toplotne provodljivosti. U hromatografskoj primeni najčešće postoji sistem dvostrukog detektora u kojem je jedan deo smešten u struji gasa ispred dela za unošenje uzorka, a drugi neposredno iza kolone. Drugi način je da se struja gasa deli. U oba se primera toplotna provodljivost gasa nosača poništava, a uticaj promene brzine protoka, pritiska i jačine električne struje je sveden na minimum. Otpori dvostukog detektora upoređuju se ugradnjom u dve grane jednostavnog Wheatstonova mosta.

Slika 3.4 Uobičajeni detektor toplotne provodljivosti

Toplotna provodljivost vodonika i helijuma približno su 6 do 10 puta veće od toplotne provodljivosti ostalih organskih spojeva. Dakle, prisutnost malih količina organskih materija izazvaće relativno veliko smanjenje toplotne provodljivosti gasa u kolone, zbog čega će se povećati temeperatura detektora, provodljivost ostalih gasova nosača sličnije su provodljivostima organskih sastojaka, pa je zbog toga az detektor toplotne provodljivosti neophodno upotrebiti vodonik ili helijum. Prednosti detektora toplotne provodljivosti su njegova jednostavnost, veliko linearno dinamičko područje ( 105), odaziv na organske i neorganske spojeve i nerazarajuća priroda koja omogućava skupljanje sastojaka nakon detekcije. Ograničenje detektora toplotne provodljivosti je u relativno niskoj osetljivosti ( 10-8 g sastojka/mL gasa nosača). Osetljivost drugih detektora je 104 do 107 puta veća. Treba naglasiti da mala osetljivost detektora toplotne provodljivosti sprečava njegovu primenu uz kapilarne kolone, jer se u njih mogu uneti vrlo male količine uzorka.

Plamenojonizirajući detektor

Najviše organskih spojeva pri sagorevanju na temperaturi plamena vodonik/vazduh stvara jonske međuspojeve i elektrone, čime nastaje mehanizam kojim se elektricitet

36

prenosi plazmom. Plamenikom poput onog na slici 3.5, sabirna elektroda, privuče i prihvati naelektrisane čestice, a struja nastalih jona se pojačava i beleži. Električni su otpori u plazmi plamena veliki (možda 1012 ), pa su zato nastale struje vrlo male.

Slika 3.5 Tipični plamenoizolacijski detektor

Jonizacija uglejnikovih jedinjenja u plamenu još nije dobro objašnjen proces, iako je primećeno da je broj nastalih jona srazmeran broju redukovanih ugljenikovih atoma u plazmi. Funkcionalna jedinjenja, kao što su karbonska, alkoholna, halogena i aminska, stvaraju malo ili uopšte ne stvaraju jone. Detektor je nadalje ne osetljiv na gasove koji ne gore poput H2O, CO2, SO2 i NOx. Ta svojstva čine plamenojonizirajući detektor primenljivim za većinu organskih jedinjenja, uključujući i one neočišćene vodom te azotovim i sumpornim oksidima. Široku primenu plamenojonizirajući detektor mora najpre zahvaliti svojoj velikoj osetljivosti ( 10-13gr/mL), velikom linearnog odziva ( 107), malom šumu, jednostavnom upotrebom i rukovanjem. Taj se detektor upotrebljava uz kapilarne kolone. Nepogodnost plamenojonizirajučeg detektora svakako je u razaranju uzorka.

Detektor apsorbcije elektrona

U detektoru apsorbcije elektrona gas prolazi preko beta emitera (radioaktivni spoj koji emituje elektrone) kao što nikl- 63 ili tricijum (adsorbiran na platinastoj ili titanijumskoj foliji). Emitovani elektroni jonizuju gas nosač (često azot), čime nastaje snop elektrona. Kad u gasu nosaču nisu prisutni organska jedinjenja, između elektroda se pojavljuje stalna struja koja rezultuje iz spomenute jonizacije. U prisutnosti organskih molekula, koje nastoje da uhvate elektrone, struja se smanjuje. Odziv je nelinearan, ako potensijal duž detektora nije pulsirajući.Odziv detektora apsorbcije elektrona selektivan je i vrlo osetljiv na elektronegativna funkcionalna jedinjenja kao što su halogeni, peroksidi, kinoni i nitro jedinjenja. Neosetljiv je na amine, alkohole i ugljovodonike. Detektor apsorbcije elektrona naročito je pogodan za detekciju i kvantitativno određivanje hloriranih pesticida.Detektor apsorbcije elektrona je vrlo osetljiv, a njegova prednost je u tome što ne razara uzorak (nasuprot plamenojonizujućem detektoru).

37

Selektivni detektori

Gasna hromatografija često se povezuje sa selektivnim tehnikama spektroskopije i elektrohemije. Tako nastaju povezane ili kombinovane tehnike koje hemičaru pružaju velike mogućnosti za određivanje sastojaka složenih smeša.Tokom primene prvih kombinovanih tehnika, eluati odvojenih sastojaka hvatali su se kao posebne frakcije u ohlađene posudice, a nedestruktivni, neselektivni detektori su beležili njihovu prisutnost. Sastav svake frakcije bi se zatim ispitao nuklearnom magnetskom rezonancom, IR, ili masenom spektroskopijom odnosno elektrohemijskim merenjima. Ozbiljno ograničenje takvom pristupu je mala (najčešće mikrokolarna) količina sastojka koju je sadržavala svaka frakcija. Ipak opšti postupak pokazao se vrlo korisnim za kvalitativnu analizu višekomponentskih smeša. Danas se četo upotrebljavaju spektroskopski ili elektroanalitički detektori koji neprekidno snimaju izlazni tok iz kolone. Takav postupak zahteva kompjuterizovane uređaje sa velikom memorijom za čuvanje spektralnih i elektrohemijskih podataka za prikaz spektara i hromatograma.

3.3. Tečne faze u gasno-tečnoj hromatografiji

Poželjna svojstva imobiliziranih tečnih faza u gasno-tečnoj hromatografiji su: (1) mala isparljivost (vrenje tečnosti moralo bi biti barem 100 C iznad maksimalne radne temperature kolone); (2) toplotna stabilnost; (3) hemijska inertnost; (4) takve osobine rastvora da su i vrednosti sastojka koji se odvaja u odgovarajućem području.Tokom razvitka gasno-tečne hromatografije ispitano je mnogo stacionarnih faza. Danas, za najveći broj primena dosta je 12 ili manje različitih faza. Uspeh odvajanja često zavisi od pravilnog izbora stacionarne faze. Postoje opšta uputstva koja pomažu pri izboru optimalne faze, ali ipak je najpouzdanije izabrati stacionarnu fazu nakon provere u laboratoriji.Vreme zadržavanja sastojka na koloni zavisi od odnosa raspodele (jednačina 2.1), koji je povezan sa hemijskom prirodom stacionarne faze. Jasno je da gasno-tečna hromatografija može biti uspešna ako izabrana stacionarna faza daje različite odnose raspodele za različite analizirane sastojke. Osim toga, odnosi raspodele ne smeju biti ni preveliki ni premali. Preveliki uzrokuju neprihvatljivo dugo vreme analiza, a vreme zadržavanja uz male odnose raspodele tako su kratka da odvajanje sastojaka nije potpuno.Za postizanje prihvatljivog vremena zadržavanja u koloni potrebno je da analizirani sastojci pokazuju određeni stepen sličnosti sa stacionarnom fazom. Ovde vredi princip „slično rastvara slično“, pri čemu se pojam slično odnosi na polarnost sastojka i imobilizirane tečnosti. Pod pojmom polarnosti podrazumeva se delovanje električnog polja u neposrednoj blizini molekula, a meri se njenim dipolnim momentom. Polarne stacionarne faze sadrže funkcionalna jedinjenja –CN, -CO i –OH. U ugljovodonične stacionarne faze i dialkil siloksani su nepolarni, a poliestarske faze su jako polarne. Polarni spojevi su etri, ketoni i aldehidi. Zasićeni ugljovodonici su nepolarni. Uopšteno uzevši, polarnost stacionarne faze mora se slagati sa polarnošću sastojka uzorka. Ako je slaganje dobro, redosled eluacije zavisi od vrenja sastojka.

38

Neke stacionarne faze koje se često upotrebljavaju

Tabela 3.2 navodi najčešće upotrebljavane stacionarne faze za punjene i kapilarne hromatografske kolone prema rastućoj polarnosti. Tih šest navedenih tečnosti omogućuje zadovoljavajuća deljenja za više od 90% uzoraka zanimljivih za naučno ispitivanje. Pet navedenih tečnosti u tablici 3.2 su polidimetil siloksani opšte strukture

Stacionarna fazaUobičajeno trgovačko ime

Maksimalna temperatura, C

Uobičajene primene

polidimetilsiloksan OV-1,SE-30

350

Nepolarna faza opšte namene: ugljovodonici; polinuklearni aromati; droge; steroidi; PCB-i

5% fenilpolidimetilsiloksan OV-3,SE-52

350

Metilni estri masnih kiselina; alkaloidi; droge; halogena jedinjenja

50% fenilpolidimetilsiloksan OV-17250

Droge; steroidi; pesticidi; glikoli

50% trifluoropropilpolidimetilsiloksan

OV-210200

Hlorirani aromati; nitroaromati; alkil-supstituirani benzeni

polietilenglikol Carbowax 20M

250

Slobodne kiseline; alkoholi; etri; esencijalna ulja; glikoli

50% cijanopropilpolidimetilsiloksan

OV-275

240

Nezasićene masne kiseline; kisele smole; slobodne kiseline; alkoholi

Tabela 3.2 Nekoliko uobičajenih stacionarnih faza za gasno-tečnu hromatografiju

39

U polidimetilsiloksanu sva –R jedinjenja su –CH3, pa su tečnosti relativno nepolarne. Kod drugih polisiloksana iz tabele deo metilnih jedinjenja zamenjen je funkcionalnim jedinjenjima fenil (-C6H5), cijanopropil (-C3H6CN) i trifluoropropil (-C3H6CF3). Oznaka procenta ispred navedenog jedinjenja pokazuje stepen zamene metilnog jedinjenja naznačenim jedinjenjem na osnovnom skeletu polisiloksana. Dakle, u 5%-tnom fenilpolidimetilsiloksanu, fenilni prstenovi su vezani na 5% silicijumovih atoma u polimeru. Polarnost tečnosti se povećava takvim zamenama do različitog stepena. U petom redu tablice 27.2 naveden je polietilenglikol sledeće strukture:

HO--CH2--CH2--(O--CH2--CH2)n—OH

Polietilenglikol često se upotrebljava za odvajanje polarnih jedinjenja. Slika 3.6 prikazuje primenu faza iz tabele 3.2 u kapilarnim kolonama.

Slika 3.6 Tipični hromatogrami dobijeni primenom kapilarne kolone sa: (a)polidimetilsiloksanom,(b)5%-tnim fenil polidimeilsiloksanom,(c)50%-tnim

trifluorpropildimetilsiloksanom,(e)polietilenglikolom, i (f)50%-tnim cijanopropilpolidimetilsiloksanom

Vezane i umrežene stacionarne faze

Komercijalne kolone reklamiraju se činjenicom postojanja vezanih ili umreženih stacionarnih faza. Svrha vezivanja i umrežavanja je produžavanje veka trajanja stacionarnih faza koje se mogu ispirati sa rastvorom nakon onečišćavanja kolone. Poznato je da neobrađene kolone tokom upotrebe gube stacionarnu fazu zbog „curenja“. Posledica curenja stacionarne faze jeste brza promena osobina i kratak vek trajanja

40

kolone. To se curenje naročito pojačava tokom ispiranja kolone rastvorom radi uklanjanja onečišćenja. Vezivanje je postupak kojim se monomolekularni sloj stacionarne faze pričvršćuje na silikatnu površinu u koloni hemijskom reakcijom. Hemizam ove reakcije često je tajna proizvođača.Umređavanje se sprovodi in-situ nakon prevlačenja kolone jednim od polimera iz tabele 3.2. Jedan od načina prevlačenja sastoji se u ugradnji peroksida u imobiliziranu tečnost. Pri grejanju sloja, reakcija između metilnih jedinjenja i polimernog lanca započinje mehanizmom slobodnih radikala. Molekuli polimera umrežuju se vezama ugljenik-ugljenik. Nastali se slojevi ne mogu lako ekstrahovati i toplinski su znatno stabilniji od neobrađenih slojeva. Umrežavanje takođe može početi izlaganjem prevučenih kolona gama zračenju.

Debljina sloja

Debljina sloja stacionarne faze u kolonama koje s emogu kupiti na tržištu iznosi od 0.1 do 5 m. Debljina sloja ponajpre utiče na karakteristike zadržavanja i na kapacitet kolone. Debeli slojevi upotrebljavaju se pri analizi vrlo halapljivih uzoraka jer oni sastojke uzorka duže zadržavaju. Dužim zadržavanjem sastojaka u koloni omogućuje se njihovo bolje razdvajanje. Tanki slojevi pogodni su za razdvajanje slabo halapljivih spojeva u razumnom vremenu. U kolonama prečnika 0.25-0.32 mm preporučuje se debljina sloja od 0.25 m. U „ megabore “ kolonama debljina sloja iznosi 1-1.5 m. Danas se mogu kupiti i kolone sa debljinom sloja 8 m.

3.4. Primena gasno-tečne hromatografije

Da bi se procenila važnost plinsko-tečne hromatografije, treba razlikovati dve uloge te metode. Jedna uloga gasne hromatografije je razdvajanje, i u toj ulozi je ona neizbežan deo celokupne analize složenih organskih organometalnih i biohemijskih smeša. Njena druga, bitno različita uloga, je sama analiza. Vremena zadržavanja pritom služe za kvalitativnu identifikaciju, a visine ili površine pika daju kvantitativne podatke. Gasno-tečna hromatografija ima mnogo veća ograničenja u pogledu kvalitativne analize od većine spektroskopskih metoda. Da bi se uklonila ta nepogodnost ulažu se veliki napori za kombinaciju posebnih sposobnosti razdvajanja koje poseduje tehnika gasne hromatografije sa posebnim sposobnostima određivanja masene, IR ili NMR spektroskopije.

3.4.1. Kvalitativna analiza

Gasna hromatografija se često upotrebljava za proveru stepena čistoće organskih jedinjenja. Onečišćenja se na hromatogramu pojavljuju kao dodatni pikovi. Ta je tehnika takođe pogodna za proveru postupka pročišćavanja. Teorijski bi vremena zadržavanja trebala biti korisna pri određivanju sastojaka smeša. U stvarnosti, primenu tih podataka ograničavaju mnogi parametri koje treba nadzirati da bi se dobili reproduktivni rezultati. Uprkos tome, gasna hromatografija pouzdano potvrđuje prisutnost ili odsutnost sastojaka u smeši. Hromatogram smeše standarda i ispitivanog

41

uzorka ne sme sadržati različite pikove. Na hromatogramu se takođe mora uočiti povećanje postojećeg pika. Postojanje nekog sastojka potpuno je sigurno kad se njegova prisutnost potvrdi u različitim kolonama i pri različitim temperaturama. Videli smo da je koeficijent selektivnosti za sastojke A i B izraženo odnosom

Ako je izabrani standardni spoj sastojak B, onda je indeks za određivanje sastojka A. On zavisi uglavnom od temperature kolone ali ne i od drugih veličina. Iz toga sledi da se koeficijent selektivnosti čistih jedninjenja mogu prikazati tabelarno u odnosu prema zahedničkom standardu. Te se tablice mogu primeniti za karakterizaciju analiziranih sastojaka. Do sada u literaturi nije objavljeno mnogo takvih podataka.

3.4.2. Kvantitativna analiza

Kvantitativna i semikvantitativna analiza temenlje se na odzivu detektora smeštenog na izlazu iz hromatografske kolone. Pri brižljivo nadziranim uslovima gasnohromaotografske analize može se postići tačnost od 1-3%. Važan deo pri određivanju moguće tačnosti ima priroda uzorka.

3.5. Uobičajne primene gasne hromatografije

Slika 3.7 prikazuje uobičajene primene gasne hromatografije za rešavanje analitičkog problema. Sve primene se temenlje na gasno-tečnoj ravnoteži osim one na slici 3.7a gde se kolone upotrebljavaju u nizu pri čemu je prva gasno-tečna, a druga adsorpcijska. Gasno-tečna kolona zadržava samo ugljen-dioksid, a preostali gasovi prolaze kolonom bez zadržavanja. Dok ugljen-dioksid izlazi iz prve kolone, promeni se smer protoka kroz drugu kolonu, čime se sprečava stalna adsorpcija tog gasa na čvrsto punjenje. Nakon vraćanja odziva ugljen-dioksida na nulu, protok gasa se vrati na drugu kolonu i time se omogući razdvajanje preostalih sastojaka uzorka. Slika 3.7f naročito je vredna jer pokazuje moć i brzinu razdvajanja kapilarnih kolona. Naime, razdvajanje metana i devet izomera heptana postiže se tokom najviše jedne minute. Podaci o uslovima rada uz koje su dobijeni hromatogrami na slici 3.7 nalazi se u tabeli 3.3.

42

Slika 3.7 Nekoliko primera gasnohromatografskih razdvajanja

43

Hromatogram

Kolona* Punjenje DetektorTemperatura, 0C

Gas nosač

Protok,mL/min

a

Chromosorb 102

Molekularno sito

TCD 65-2000 He 30

b5A1,5% OV-17 na Chromosorb G

ECD 220

c Chromosorb W TCD 190 He 30

d1.5% OV-17 na HP Chromosorb G

FID 180-230

e5% OV-510, 2.5% OV-17 na Supelcoport G

ECD 260 A

f Skvalene FID 20 H2

Tabela 3.3* S = punjena čelična kolona (packed stainless steel); G = punjena staklena kolona (packet glass); FSOT = kapilarna kolona od taljenog kvarca (fused silica open tubular)

4.0 TEČNA HROMATOGRAFIJA VISOKOG DEJSTVA

Najveći deo ovog poglavlja obrađuje četiri vrste hromatografije na stubu sa tečnom mobilnom fazom. To su: razdelna hromatografija ili hromatografija u sastavu tečnost-tečnost; adsorpcijska hromatografija ili hromatografija u sastavu tečnost-čvrsta materija; hromatografija jonske izmene i hromatografija na gelu odnosno hromatografija isključenjem. Na kraju poglavnja ukratko se spominju laminarna hromatografija i hromatografija kod koje je mobilna faza tečnost pri superkritčnim uslovima.Prve hromatografske analize, uključujući i Tswettov izvorni rad, izvodile su se u staklenim kolonama prečnika 1-5 cmi dužine 50-500cm. Da bi brzine protoka kroz kolone bile prihvatljive prečnici zrna stacionarne faze iznosili su od 150 do 200 m. Brzine protoka iznosile su tek nekoliko desetina mililitra u minuti. Vremena razdvajanja su, dakle, bila vrlo duga, čak nekoliko sati. Nastojanja za ubrzanjem protoka klasičnom primenom vakuuma ili pumpanjem, nisu bila delotvorna jer se povećanjem brzine protoka povećava visina tavana ispod minimuma na tipičnoj krivi zavisnosti visine tavana od protoka (slika 2.5a) a time se dejstvo hromatografske kolone smanjuje.Na početku tečne hromatografije primećeno je da se najveće dejstvo hromatografske kolone postiže smanjenjem dimenzija zrna punjenja, kako to pokazuje slika 4.1. treba uočiti da ni u jednom od tih dijagrama nije postignut minimum sa slike 4.1a, jer se on u ovoj vrsti hromatografije pojavljuje uz nedopušteno male brzine protoka.

44

Slika 4.1 Uticaj dimenzija zrna punjenja i brzine protoka na visinu tavana u tečnoj hromatografiji. Dimenzije kolone 30cm 2.4mm. Analizirani sastojak: N, N-

dietilaminobenzen. Mobilna faza: smeša heksana, metil hlorida, izopropil alkohola

Tehnologija proizvodnje i primena punjenja prečnika 10 m razvila se tek kasnih 60-ih godina. Za primenu te tehnologije bili su potrebni mnogo složeniji uređaji od jednostavnih staklenih kolona, koje su se primenjivale u klasičnoj tečnoj hromatografiji. Nazivom tečnahromatografija visoke delotvornosti (engl. High-Performance Liquid Chromatography, HPLC) želi se naglasiti razliak između tih novijih postupaka i klasičnih metoda, koje se još primenjuju u preparativne svrhe.

4.1. Uređaji za tečnu hromatografiju visoke delotvornosti

Za postizanje dovoljnih brzina protoka u kolonama punjenim savremenim punjenjem za tečnu hromatografiju sa prečnikom zrna od 10 m ili manje, neophodni su pritisci od nekoliko miliona Pa. Tako visoki pritisci zahtevaju mnogo složeniju i skuplju opremu od one koja se susreće kod drugih vrsta hromatografije. Slika 4.2 prikazuje delove tipičnog tečnog hromatografa velike efikasnosti.

45

Slika 4.2 Šematski prikaz uređaja za tečnu hromatografiju velike efikasnosti

4.1.1. Rezervoar mobilne faze i sistem za obradu rastvora

Savremeni uređaji za tečnu hromatografiju velike efikasnosti, kako pokazuje slika 4.2, sastoji se od jednog staklenog ili čeličnog rezervoara, ili više, od 500 mL ili više, u kojima se nalazi rastvor. Često se u sklopu sistema nalazi oprema za uklanjanje gasova i čvrstih čestica, iz tečnosti. Gasovi, zbog stvaranja mehura, mogu prouzrokovati širenje zona eluiranog sastojka, a mehuri i čestice mogu ometati rad detektora. Odstranjivači gasa mogu se sastojati od sistema vakuum pumpi, destilacijskog uređaja, grejača i mešalice ili, kako pokazuje slika 4.2, sistema za degazaciju u kojem se rastvoreni gasovi odstranjuju iz rastvora nošeni mehurićima inertnog plina nerastvorljivog u mobilnoj fazi.Najjednostavniji način razdvajanja tečnom hromatografijom je izokratička eluacija, pri kojoj analit kroz kolonu nosi jedan rastvarač. Pri izokratičkoj eluaciji u HPLC ne menja se sastav mobilne faze tokom eluacije. Međutim, često se bolji hromatogram dobije gradijentnom eluacijom uz upotrebu dva (nekad i više) sistema rastvarača polarnosti koje se međusobno znatno razlikuju. Pri gradijentnoj eluaciji u HPLC sastav mobilne faze menja se tokom eluacije kontinuirano ili promenljivo. Odnos zapremine dva rastvora menja se na unapred utvrđen način, i to ponekad neprekidno, a ponekad u nizu koraka. Gradijentna eluacija često poboljšava delotvornost razdvajanja poput programiranog povećanja temperature u gasnoj hromatografiji. Savremeni tečni hromatografi često su opremljeni ventilima za unošenje tečnosti iz dva ili više rezervoara, brzinama koje se mogu neprestano menjati (slika 4.2).

4.1.2. Pumpe

46

Zahtevi kojima moraju udovoljavati pumpe u tečnom hromatografu vrlo su strogi: (1) pritisci do 40 miliona Pa, (2) izlaz bez pulsiranaj pritiska, (3) brzina protoka od 0,1 do 10 mL/min, (4) produktivnost protoka od 99,5% ili bolja i (5) otpornost na koroziju izazvanu različitim rastvorima.Za primenu u tečnoj hromatografiji pogodne su dve mehaničkih pumpi: pumpa sa pogonom na vijak i recipročna pumpa (slika 4.3). Protok tečnosti koji stvara pumpa sa pogonom na vijak ravnomeran je i može se jednostavno nadzirati. Nedostatak tih pumpi je mali kapacitet ( 250mL) i nepogodnost za promenu rastvora. Recipročne pumpe upotrebljavaju se češće. Sastoje se od male komore u obliku cilindra koji se puni i prazni pomeranjem klipa napred-nazad. Pomeanje klipa stvara veliki protok koji treba smanjiti. Prednosti tih pumpi su mala unutrašnja zapremina, visok spoljašnji pritisak (70 miliona Pa), mogućnost primene za gradijentnu eluaciju, stalni protoci koji ne zavise ni od povratnog pritiska u koloni, ni od viskoznosti rastvarača.

Slika 4.3 Šematski prikaz recipročne pumpe za HPLC

U neke uređaje ugrađene su pneumatske pumpe, koje se u najjednostavnijem obliku sastoje od rezervoara za rastvor smeštenog u posudu na koju se može vršiti pritisak komprimovanim vazduhom. Pumpe te vrste su jednostavne, jeftine i rade bez promene. Njihov nedostatak je u ograničenom kapacitetu i pritisku na izlazu i u brzinama crpljenja koje zavise od viskoznosti rastvora. Osim toga one se ne mogu upotrebljavati uz gradijentnu eluaciju.Treba naglasiti da visoki pritisci, koje stvaraju pumpe u tečnim hromatogramima, ne predstavljaju opasnost od eksplozije jer se na tečnost ne može vršiti dodatni pritisak. Ali zbog visokog pritiska, tečnosti mogu procuriti što ipak može prouzrokovati požar.

4.1.3. Sistem za unošenje uzorka

Unošenje uzorka krozelastičnu membranu, tzv. septum, često se primenjuje u tečnoj hromatografiji zbog jednostavnosti. Taj način nije posebno reproduktivan pa je ograničen na pritiske niže od 10 miliona Pa. Pri unošenju uzorka uz zaustavljanje protoka pomeri se matica na početku kolone, a uzorak se inekcijskim ubrizgivačem unese na početak punjenja. U tečnoj hromatografiji uzorak se u kolonu najčešće unosi putem gasnog ventila, poput onog na slici 4.4. Gasni ventil je često sastavni deo opreme savrmeenog tečnog hromatografa. Uz njega se nalazi više promenljivih petlji kojiam se u kolonu mogu unositi količine uzorka od 5 do 500 L. Preciznost unošenja uzorka preko uobičajene petlje za uzorak u granicama je nekoliko desetina procenata.

47

Slika 4.4 Uređaj za unošenje uzorka u tečni hromatograf

4.1.4. Kolone za visokodelotvornu tečnu hromatografiju

Kolone koje se upotrebljavaju u visokodelotvornoj tečnoj hromatografiji najčešće su izrađene od čeličnih cevi, iako se ponekad, uz niske pritiske (< 4 miliona Pa), upotrebljavaju i staklene cevi debljih zidova. Kolone su najčešće duge 10-30 cm, unutrašnjeg prečnika 4-10 mm. Prečnik zrna punjenja najčešće iznosi od 5 do 10 m. Takve kolone najčešće imaju od 40000 do 60000 tavana/m. Od nedavno su na tržištu dostupne visoko delotvorne mikrokolone, unutrašnjeg prečnika 1-4,6 mm i dužine 3-7,5 cm. Te kolone, punjene zrncima prečnika od 3 do 5 m sadrže i do 100000 tavana po metru i imaju prednsot u pogledu brzine i potrošnje rastvora.Punjenje, koje se najčešće upotrebljava u tečnoj hromatografiji, je silikatni gel. Ta se zrnca sintetišu iz čestica submikrometarskih dimenzija pri uslovima koji odgovaraju nastajanju većih agregata vrlo sličnih prečnika. Nastali proizvod se zatim prevuče tankim organskim slojem, koji se hemijski ili fizički veže na površinu punjenja. Upotrebljavaju se i punjenja koja sadrže glinicu, porozne polimere i jonske izmenjivače.

4.1.5. Detektori

U tečnoj hromatografiji ne postoji univerzalni sistem detektora poput onog u gasnoj hromatografiji. Naime, detektorski sistem zavisi od prirode uzorka. Tabela 28.1 prikazuje neke uobičajene detektore i njihova svojstva. Detektori koji se u tečnoj hromatografiji najčešće upotrebljavaju temelje se na apsorbcji ultraljubičastog ili vidljivog zračenja. Na tržištu su dostupni fotometri i spektrofotometri posebni oblika za primenu uz hromatografske kolone. U fotometrima se često upotrebljavaju linije 254 i 280 – nm iz živine sijalice, jer organska funkcionalna jedinjenja često apsorbiraju u tom području. Deuterijski i volframovi izvori sa interferencijskim filterima jednostavno su sredstvo za detekciju sastojaka koji apsorbiraju to područje. U neke savremene uređaje ugrađen je točak sa filterima. Vrtenjem tog točka izabere se željeni filter. Spektrofotometrijski detektori su svestraniji od fotometara pa se takođe često upotrebljavaju u uređajima za visoku delotvornost tečne hromatografije.

48

Detektor Dostupan na tržištu

Granica dokazivanja (komercijalni detektori)a

Granica dokazivanja (sadašnje stanje)b

Absorbancija dac 100 pg - 1ng 1 pgFluorescencija dac 1- 10 pg 10 fgElektrohemijski dac 10 pg- 1ng 100 fgIndeks loma da 100 ng- 1 g 10 ngProvodljivost da 500 pg- 1 ng 500 ngSpektrometrija mase

dad 100 pg- 1 ng 1 pg

FT-IR dac 1 g 100 ngRaspršivanje svetlostie

da 10 g 500 ng

Optički aktivitet ne - 1 ngSelektivni elementi ne - 10 ngFotojonizacija ne - 1 pg – 1 ng

Tabela 4.1 Osobine detektora u tečnoj hromatografiji

a granica dokazivanja izračunata je za unesenu masu koja daje odziv jednak peterostrukom šuma, uz molarnu masu od 200 gr/mol, 10 L uzorka ubrizgava za konvencionalne i 1 L za „microbore“ kolone u tečnoj hromatografijib ista definicija kao u a , ali je unesena zapremina uglavnom manjac na tržištu su dostupni i za kapilarne koloned dostupne na tržištu, ali skupee uključujući nisko raspršujuću svetlost i nefelometriju

Druga vrsta detektora, koja se često upotrebljava u ovoj tehnici meri promene u indeksu loma rastvora prouzrokovanih prisutnošću molekula analita. Nasuprot drugim detektorima navedenim u tabeli 4.1, detektor na osnovi indeksa loma je opšti a ne selektivan, tj. pokazuje odziv na sve sastojke iz uzorka. Nedostatak tog detektora je njegova nešto manja osetljivost.

4.2. Visokodelotvorna razdelna hromatografija

Razdelna hromatografija, koja se od svih postupaka tečne hromatografije najviše primenjuje, obično se deli na hromatografiju u sistemu tečno-tečno i na hromatografiju u sistemu vezane faze . Te dve vrste hromatografije razlikuju se po načinu na koji je stacionarna faza vezana na punjenju. Zadržavanje sastojaka na punjenjima u sistemu tečnost-tečnost, temelji se na fizičkoj adsorpciji, a kod punjenja u sistemu vezane faze nastaju kovalentne veze. Kad se počela primenjivati, razdelna hrmatografija se temeljila isključivo na sistemu tečnost-tečnost. Danas preovladavaju metode vezane faze, a hromatografija u sistemu tečnost-tečnost se primenjuje samo u izuzecima.

49

4.2.1. Punjenja sa vezanom fazom

Najviše punjenja sa vezanom fazom dobija se reakcijom organohlorsilana sa –OH jedinjenjima nastalim na površini silikatnog gela hidrolizom u toploj razređenoj hlorovodoničnoj kiselini. Tom reakcijom nastaje organosiloksan. Reakcije za jedno takvo SiOH jedinjenje na površini čestice se može napisati kao

pri čemu je R često ravan lanac oktil ili oktildecil jedinjenja (C8H17-- ili C18H37--). Na površinu sorbensa mogu se vezati i druga organska funkcionalna jedinjenja kao što su alifatični amini, etri, nitrili, i aromatični ugljovodonici. Može se primetiti da se polarnosti stacionarnih faza međusobno znatno razlikuju. Punjenja sa vezanom fazom mnogo su stabilnija od punjenja na kojima se stacionarna faza zadržava isključivo fizičkim silama. Punjenja sa stacionarnim fazama, koja su na njih vezana isključivo fizičkim silama, potrebno je povremeno ponovo prevlačiti. Naime, stacionarnu fazu sa čvrstog nosača postupno ispira mobilna faza. Gradijentna eluacija nije pogodna za rad sa punjenjima iz sistema tečnost-tečnost, i to zbog gubitaka stacionarne faze koji nastaju zbog njenog topljenja u mobilnoj fazi. Glavni nedostatak punjenja sa vezanom fazom jeste njihov mali kapacitet za uzorak.

4.2.2. Punjenja sa normalnom i reverznom fazom

U zavisnosti od relativne polarnosti mobilne i stacionarne faze, razlikuju se dve vrste razdelne hromatografije. U prvim radovima iz tečne hromatografije upotrebljavale su se vrlo polarne stacionarne faze kao što su trietilenglikol ili voda i relativno nepolarne mobilne faze poput heksana ili i-propil etara. Iz istorijskih razloga, ta se vrsta hromatografije sada naziva normalna hromatografija. U reverznoj hromatografiji stacionarna faza je nepolarna npr. ugljovodonik, a mobilna faza je relativno polarni rastvarač poput vode, metanola ili acetonitrila. U normalnoj hromatografiji najmanji polaran sastojak eluira prvi. Povećanjem polarnosti mobilne faze smanjuje se vreme eluacije. Nasuprot tome, u reverznoj hromatografiji najpolarniji sastojak eluira prvi, a povećanje polarnosti mobilne faze produžuje se vreme eluacije.Procenjuje se da tri četvrtine odvajanja tehnikom visoko delotvorne tečne hromatografije obavlja reverznom hromatografijom, i to na punjenjima sa vezanim oktil ili oktildecilsiloksanom. Uz određeni način pripreme, jedinjenja ugljovodonika sa dugačkim lancima poravnavaju se uporedo jedno sa drugim i koso na površinu zrna, čime nastaje nepolarna površina ugljovodonika slična četki. Mobilna faza, koja se upotrebljava uz takva punjenja najčešće je vodeni rastvor koji sadrži različite koncentracije rastvora poput metanola, acetonitrila i tetrahidrofurana.

50

4.2.3. Izbor mobilne i stacionarne faze

Da bi razdelna hromatografija bila uspešna, potrebno je uspostaviti odgovarajuću ravnotežu međumolekularnih sila između tri učesnika procesa odvajanja sastojka, mobilne faze i stacionarne faze. Te međumolekularne sile kvalitativno opisuju izrazi relativnih polarnosti reaktanata. Uopšteno, relativne polarnosti organskih funkcionalnih jedinjenja u rastućem nizu su: alifatični ugljovodonici<olefini<aromatični ugljovodonici<halidi<sulfidi<etri<nitrojedinjenja<estri<aldehidi ketoni<alkoholi amini<sulfoni<sufoksidi<amidi<karboksilne kiseline<voda. Može se reći da i ovde vredi „pravilo sličnosti“. Naime, najbolja hromatografska odvajanja postižu se uz slaganje polarnosti analita stacionarne faze a da je pri tom polarnost mobilne faze veoma različita od polarnosti sastojaka. Taj je poredak uspešniji od onog kad se polarnosti analita i mobilne faze slažu, a istovremeno razlikuju od polarnosti stacionarne faze. Stacionarna faza tada često ne može zadovoljiti uslove za uspešno odvajanje sastojaka uzorka, a vremena zadržavanja postaju prekratka za praktičnu primenu. Druga krajnost je da su polarnosti analita i stacionarne faze previše slične, pa tada vremena zadržavanja postaju preduga.

4.2.4. Primene

Slika 4.5 prikazuje tipične primere primene razdelne hromatografije.

Slika 4.5 (a)aditivi za voćne sokove. Kolona: 4.6mm 250mm punjena vezanim polarnim (cijano) punjenjem. Izokratička eluacija: 6% HOAc/94% H2O. Brzina protoka: 1,0

mL/min, (b) Organofosfatni insekticidi. Kolona: 4,5 min 250mm, punjena C8 vezanim zrnima dimenzije 5 m

51

Tablica 4.2 prikazuje ranolikost uzorka na kome se ta tehnika može primeniti.

Područje Tipične smešeFarmacija Antibiotici, sedativi, steroidi, analgeticiBiohemija Amino kiseline, belančevine,

ugljovodonici, lipidiŽivotne namirnice Veštački zaslađivači, antioksidanti,

aflatoksin, aditiviIndustrijski hemijski proizvodi Kondenzovani aromati, premazi,

promotori, bojeZagađivači Pesticidi, herbicidi, fenoli, polihlorirani

bifeniliSudska hemija Droge, otrovi, alkoholi u krvi, narkoticiKlinička medicina Žučne masne kiseline, metaboliti droga,

urinski ekstrakti, estrogeniTabela 4.2 Uobičajene primene visokodelotvorne razdelne hromatografije

4.3. Visoko delotvorna adsorpcijska hromatografija

Sav pionirski rad na području hromatografije temeljio se na adsorpciji u sistemu tečnost-čvrsta materija, u kojem je stacionarna faza bila fino usitnjena polarna čvrsta materija. Na takvom punjenju analit ulazi u pore na površini punjenja a njegovo je zadržavanje rezultat adsorpcijskih sila.

4.3.1. Stacionarne i mobilne faze

Fino usitnjeni silikatni gel i glinica jedine su stacionarne faze koje su našle primenu u adsorpcijskoj hromatografiji. Silikatni gel se može upotrebiti za gotovo sva odvajanja zahvaljujući velikom kapacitetu za uzorak i velikom broju primenjivih oblika. Adsorpcijska svojstva tih supstanci međusobno su slična. Kod obe vremena zadržavanja postaju duža sa povećanjem polarnosti analita.U adsorpcijskoj hromatografiji jedina promenljiva koja utiče na odnos raspodele analita je sastav mobilne faze (nasuprot razdelnoj hromatografiji u kojoj je i polarnost stacionarne faze jedna od promenljivih). Promenom sastava eluensa menjaju se faktor kapaciteta i koeficijent selektivnosti, a time i odvajanje, pa se ponekad događa da se ne može naći pogodna mobilna faza za željeno odvajanje.

4.3.2. Primena adsorpcijske hromatografije

Danas se visoko delotvorna adsorpcijska tečna hromatografija usistemu tečnost-čvrsta materija upotrebljava za odvajanje relativno nepolarnih organskih jedinjenja nerastvorljivih u vodi, molekularne mase manje od 5000. Jedna od najvažnijih osobina adsorpcijske hromatografije, koje nemaju ostale vrste hromatografija,je sposobnost odvajanja smeša izomera poput metasupstituiranih i parasupstituiranih derivata benzena.

52

4.4. Visoko delotvorna hromatografija jonske izmene

Jonski izmenjivači predstavljaju stacionarnu fazu u hromatografiji jonske izmene. Hromatografija jonske izmene je postupak odvajanja kojim se joni sličnog naelektrisanja odvajaju eluacijom iz kolone punjene fino usitnjenim zrncima jonskih izmenjivača.

4.4.1. Jonski izmenjivači

Sintetički jonski izmenjivači su polimerne materije velike molekularne mase koji sadrže mnoga funkcionalna jedinjenja po molekulu. Katjonski izmenjivači mogu biti ili jake kiseline sa sulfonskim kiselim jedinjenjima (RSO-

3H+) ili slabe kiseline sa karboksilnim kiselim jedinjenjima (RCOOH). Jonski izmenjivači sa jakim kiselinama imaju širu primenu (slika 4.6). Anjonski izmenjivači sadrže bazne aminska funkcionalna jedinjenja vezana na polimerni molekul. Izmenjivači sa jakim bazama su kvarterni amini [RN(CH3)+

3OH-]. Jonski izmenjivači sa slabim bazama sadrže sekundarne ili tercijalne amine.

Slika 4.6 Struktur apolistirenskog umreženog jonskog izmenjivača

Važna osobina svih izmenjivača jeste da uglavnom nisu rastvorljivi u vodenom rastvoru. Dakle, ubrzo nakon uranjanja katjonskog izmenjivača u vodeni rastvor u kome se nalazi katjoni M+, uspostavlja se ravnoteža izmene između čvrste faze i faze rastvora:

čvrsta rastvor čvrsta rastvor materija materija

pri čemu je Mx+ katjon, a R je deo molekula izmenjivača koji sadrži jednu sulfonsku grupu. Odgovarajući proces jonske izmene sa jonskim izmenjivačima može se pisati kao

čvrsta rastvor čvrsta rastvor materija materija

53

pri čemu je Ax- anjon.

4.4.2. Ravnoteža jonske izmene

Ravnoteža jonske izmene može se objasniti zakonom o delovanju masa. Na primer, pri dodiru razređenog rastvora kalcijumovih jona sa smolom sulfatne kiseline uspostavlja se sledeća ravnoteža:

Ca2+ (aq) + 2H+ (smola) Ca2+ (smola) + 2 H+ (aq)

Primenom zakona o delovanju masa dobija se:

Uglastim zagradama je izraz za molarne koncentracije (tačnije, aktivitete). Treba obratiti pažnju na to da su [Ca2+(smola)] i [H+(smola)] koncentracije dva jona u čvrstoj fazi. Te se koncentracije mogu menjati od nule do neke maksimalne vrednosti pri kojoj sve pore u izmenjivaču zauzimaju samo jedan sastojak. Razdvajanje na jonskim izmenjivačima najčešće se sprovode u uslovim kad jedna vrsta jona preovlađuje u obe faze. Na primer, pri uklanjanju kalcijumovih jona iz razređenog i slabo kiselog rastvora, koncentracija kalcijumovih jona mnogo je manja od koncdentracije vodonikovih jona, i to u vodenoj fazi i u izmenjivaču. Iz toga sledi da se koncentracija vodonikovih jona tokom procesa izmene menja neznatno. Uz takve uslove [Ca2+ (smola)] << [H+ (smola)] i [Ca2+ (aq)] << [H+ (aq)] , pa se napisani izraz za konstantu ravnoteže može napisati i srediti kao:

(4.1)

U ovom izrazu K je obim raspodele kako ga definiše jednačina 2.1. Obratite pažnju na to da je u jednačini 4.1 K afinitet izmenjivača za kalcijumov jon u odnosu prema drugom jonu (H+). Uopšteno, kad je K za neki jon velik, onda stacionarna fazasnažno zadržava taj jon. Kad je K mali, onda važi suprotno. Izbor zajedničkog referentnog jona (H+) omogućava poređenje obima raspodele za različite jone na određenoj vrsti izmenjivača. Takvi eksperimenti pokazuju da se polivalentni joni snažnije vežu sa jonskim izmenjivačem nego jednostruko naelektrisani joni. Grupe istog naelektrisanja mogu imati različite K, što se povezuje sa veličinom hidratiziranog jona kao i sa nekim drugim svojstvima. Dakle, uz tipični katjonski izmenjivač sa sulfatnom kiselinom vrednosti K za jednovalentne jone smanjuju se u sledećem nizu Ag+ > Cs+ > Rb+ > K+> NH4

+ > Na+ > H+

> Li+. Za dvovalentne katjone niz je sledeći : Ba2+ > Pb2+ > Sr2+ > Ca2+ > Ni2+ > Cd2+ >

54

Cu2+ > Co2+ > Zn2+ > Mg2+ > UO22+. Jonski izmenjivači snažnije vežu viševalentne nego

jednovalentne jone.

4.4.3. Primena jonskih izmenjivača u hromatografiji

U hromatografiji jonske izmene joni analita uzorka unose se na početak kolone napunjene pogodnim jonskim izmenjivačem. Joni uzorka istiskuju jone eluensa sa mesta gde se nalaze nabijena jedinjenja na sorbensu. Na primer, anjoni poput hlorida, tiocijanata, sulfata i fosfata mogu se razdvojiti na anjonskim izmenjivačima u njihov osnovni oblik. Pri toj primeni uzorak se unosi u kolonu u kojoj se anjoni zadržavaju sledećom reakcijom :

Eluacija se zatim nastavlja razređenim rastvorom baze, koja navedenu reakciju čini suprotnom i pri čemu se otpuštaju anjoni. Budući da se obimi raspodele različitih anjona međusobno razlikuju, tokom eluacije pojavljuje se frakcionacija. Jedna od većih prednosti hromatografije jonske izmene jeste mogućnost merenja provodljivosti eluensa koji izlazi iz kolone, što je pogodna metoda za detekciju i određivanje koncentracije eluiranih sastojaka. Hromatografija jonske izmene uz konduktivnu detekciju jona eluiranih iz kolone prvi put je opisana 1975. godine i do danas se razvila u moćnu i važnu tehniku za kvantitativno određivanje neorganskih i organskih naelektrisanih grupa. Danas se primenjuju dve vrste hromatografije na punjenjima sa jonskim izmenjivačima: hromatografija na koloni uz prigušenja eluensa i jonska hromatografija na jednoj koloni. Te dve tehnike razlikuju se u načinu kojim se sprečavaju interakcije što uzrokuju provodljivost eluensa iz kolone pri merenju provodljivosti analita.

4.4.4. Hromatografija jonske izmene sa prigušivanjem eluensa

Detektori električne provodljivosti imaju mnoge osobine idealnog detektora. Osetljivi su na sve prisutne sastojke u ispitivanom uzorku, a osim toga njihov se odziv, izazvan promenom koncentracije, može predvideti. Nadalje, sa takvim detektorima rukovanje je jednostavno, njihovo izrađivanje i održavanje su jeftini, mali su, njihov vek trajanja je dug i ne zahtevaju često servisiranje. Jedino što je sprečavalo njihovu veću primenu do sredine 1970-ih, bile su velike koncentracije elektrolita u mobilnoj fazi nužne za eluaciju jona analita u prihvatljivom vremenu. Zbog toga na izmerenu provodljivost eluensa iz kolone može uticati provodljivost sastojaka iz mobilne faze, a ne samo provodljivost sastojaka iz uzorka, što znatno smanjuje osetljivost detektora. Poteškoća izazvana velikom provodljivošću eluensa rešena je 1975. postavljanjem kolone za prigušivanje eluensa odmah iza kolone sa jonskim izmenjivačem. Kolona za prigušivanje eluensa napunjena je jonskim izmenjivačem različitim od onog u analitičkoj koloni. Taj jonski izmenjivač efikasno pretvara jone prisutne u eluensu, koji izlaze iz kolone, u molekularne vrste ograničene jonizacije koje ne utiču na provodljivost jona iz analiziranog uzorka. Na primer, pri odvajanju i određivanju katjona, hlorovodonična kiselina je izabrani eluens, a

55

u koloni za prigušivanje nalazi se jonski izmenjivač u hidroksidnom obliku. Proizvod reakcije između eluensa i prigušivača je voda:

H+ (aq) + Cl- (aq) + smola+OH- (s) smola+ Cl- (s) + H2O

Anjonska jedinjenja, naravno, ne zadržavaju katjone analita u toj drugoj koloni. Za anjonska odvajanja punjenje prigušivača je kiseli oblik katjonskog izmenjivača uz eluens natrijum-hidrogenkarbonat ili karbonat. Reakcija u prigušivaču je sledeća:

Na+(aq) + HCO3- (aq) + smola- H+(s) smola- Na+ (s) + H2CO3 (aq)

Najvećim delom nedisosovana karbonska kiselina ne utiče značajno na izmerenu provodljivost.Nepogodnost vezana za kolone sa prigušivačem sastoji se u povremenoj potrebi njihove regeneracije (uobičajeno, svakih 8-10 sati) kako bi se vratili u početni kiseli ili bazni oblik. Odnedavno se na tržištu mogu kupiti i mikromembranski prigušivači. Pri odstranjivanju, na primer, natrijum karbonata ili natrijum hidrogen karbonata, eluens prelazi preko vrlo kratkih membranskih katjonskih izmenjivača koji ih razdvajaju iz struje kiselog rastvora za regeneraciju, a koja neprekidno teče u suprotnom smeru. Natrijumovi joni iz eluensa zamenjuju se sa vodonikovim jonima na unutršnjoj površini membrane izmenjivača nakon čega migriraju na drugu površinu kako bi se zamenili sa vodonikovim jonima iz reagensa za regeneraciju. Vodonikovi joni iz rastvora za regeneraciju migriraju u suprotnom smeru i tako čuvaju električnu neutralnost.Slika 4.7 prikazuje dve promene jonske hromatografije u kolonama sa prigušivačem i konduktivnom detekcijom. U obe primene, joni su prisutni u koncentracijama reda veličine ppm. Količina uzorka iznosi 50 L odnosno 20 L. Ta metoda je posebno važna za analizu anjona, jer se nekom drugom metodom takvi uzorci ne bi mogli uspešno analizirati.

56

Slika 4.7a Razdvajanje anjona na koloni sa anjonskim izmenjivačima. Gradijentni eluens: od 0,00075 do 0,85M NaOH. Količina uzorka: 20 L

Slika 4.7b Razdvajanje katjona na koloni sa katjonskim izmenjivačima. Eluens: 1:0,012M HCl, 0,00025M hidrohlorid diaminopropionske kiseline i 0,00025 M histidinov

hidrohlorid i 0,0004M histidinov hidrohlorid. Količina uzorka: 50 L. Detektor električne provodljivosti za oba uzorka.

57

4.4.5. Hromatografija jonske izmene sa jednom kolonom

U novije vreme na tržištu je dostupna oprema za jonsku hromatografiju bez kolona sa prigušivačima. Mogućnost rada bez kolone sa prigušivačima postoji zahvaljujući malim razlikama u provodljivosti između jona iz uzorka i jona koji potiču iz eluensa, a kojih ima mnogo više. Da bi se te razlike povećale, upotrebljavaju se jonski izmenjivači malog kapaciteta izmene koji omogućavaju eluaciju sa razređenim rastvorima eluensa. Nadalje, biraju se eluensi sa malom ekvivalentnom provodljivosti. Hromatografija jonske izmene sa jednom kolonom pogodna je zbog toga što ne zahteva posebnu opremu za prigušivanje provodljivosti eluensa. No, ona je nešto manje osetljiva za određivanje anjona od metode u kojoj se upotrebljava kolona za prigušivanje.

4.5. Visokodelotvorna hromatografija na gelu

Hromatografija na gelu, ili ekskluzijska hromatografija, kod koje proces razdvajanja zavisi od veličine molekula analiziranih sastojaka, posebno je pogodna za analizu jedinjenja velike molekularne mase. Metode hromatografije na gelu proširile su primenu hromatografije na jedinjenja velike molekularne mase.

4.5.1. Punjenja Punjenja za ovu vrstu hromatografije sastoje se od malih ( 10 m) zrna silikatnog gela ili polimera koji stvaraju mrežu pora jednake veličine. U te pore mogu difundirati molekuli uzorka i eluensa. Dok borave u porama punjenja, molekuli nisu prisutni u toku mobilne faze. Prosečno vreme zadržavanja molekula uzorka u porama punjenja zavisi od njihove veličine. Veliki molekuli koji su mnogo veći od pora ne mogu u njih ući pa se bez zadržavanja kreću dalje. One se, dakle, kroz kolonu kreću brzinom mobilne faze. Mali molekuli, mnogo manji od pora, ulaze u pore i zadržavaju se u njima najduže vremena, tj. najmanji molekuli uzorka zadnji izlaze iz kolone. Između te dve krajnosti nalaze se molekuli srednje veličine čije prosečno zadržavanje u porama zavisi od njihovog prečnika. Razdvajanje koje otpočinje u uzorku povezano je sa veličinom molekula i donekle sa njihovim oblikom. Procesi razdvajanja prethodno opisanih sistema temeljili su se na različitosti pojedinih hemijskih i fizičkih osobina molekula uzorka. U hromatografiji na gelu susrećemo se sa sistemom kod kojeg proces razdvajanja zavisi samo od veličine molekula uzorka i tokom tog procesa nema hemijskih i fizičkih reakcija između molekula uzorka i stacionarne faze. Zapravo, čine se napori da se te interakcije spreče jer smanjuju dejstvo kolone.Na tržištu postoje mnoga punjenja za tu vrstu hromatografije. Hidrofilna punjenja upotrebljavaju se sa vodenim mobilnim fazama, a hidrofobna sa nepolarnim organskim fazama. Hromatografija u kojoj se upotrebljavaju hidrofilna punjenja naziva se ponekad gel filtraciona , a ona sa hidrofobnim punjenjem naziva se gel permeabilna. Gel-filtracija je hromatografija koja se temelji na razlikama u veličini čestica prisutnih u uzorku na hidrofilnom punjenju. Upotrebljava se za razdvajanje polarnih jedinjenja. Gel-permeabilna je hromatografija koja se temelji na razlikama u veličini čestica u uzorku na hidrofobnom punjenju. Upotrebljava se za razdvajanje nepolarnih jedinjenja. Na tržištu su dostupna hidrofobna i hidrofilna punjenja širokog raspona prečnika pora. Srednja

58

molekularna masa sastojaka analiziranog uzorka, pogodna za određeno punjenje, može iznositi nekoliko stotina do nekoliko miliona. Jedno punjenje može zadovoljiti raspon molekularnih masa od 20 do 25 puta.

4.5.2. Primena

Slika 4.8a pokazuje primenu gel filtracione hromatografije za određivanje tri šećera u vodenom medijumu. Hidrofilnim punjenjem se ne mogu razdvajati sastojci molekularne mase veće od 1000. Na slici 4.8b , prikazan je hromatogram dobijen hidrofobnim punjenjem u kome je eluens bio tetrahidrofuran. Uzorak je bio komercijalna epoksi smola u kojoj je svaka monomerna jedinica imala molekularnu masu 280.

Slika 4.8 Primena hromatografije na gelu; (a)Gel- filtraciono određivanje glukoze (G), fruktoze (F) i saharoze (S) u sokovima. Kolona dužine 25 cm napuni se česticama

hidrofilnog sulfatnog polimera sa granicom isključenja 1000; (b)Gel- permeacijska analiza komercijalne epoksi-smole (n= broj monomernih jedinica u polimeru). Porozna

kolona punjenja silikatnim gelom, 6,2 mm 250mm, mobilna faza tetrahidrofuran

Druga važna primena ekskluzijske hromatografije je brzo određivanje molekularne mase ili raspodele molekularnih masa velikih polimera ili prirodnih proizvoda. U ovoj se metodi eluacijska zapremina uzorka poredi sa eluacijskom zapreminom za niz standardnih jedinjenja koji imaju iste hemijske oznake kao i uzorak.

4.6. Poređenje visokodelotvorne tečne hromatografije sa gasno-tečnom hromatografijom

Poređenje visokodelotvorne tečne hromatografije sa gasno-tečnom hromatografijom pokazuje tabela 4.3. Tečna hromatografija se može primeniti za analizu neisparljivih (uključujući neorganske jone) i toplotno nestabilnih materija koje se ne mogu analizirati gasnom hromatografijom. Ipak, moć odvajanja gasno-tečne hromatografije, posebno uz kapilarne kolone, veća je od moći odvajanja visokodelotvorne tečne hromatografije. Kad se obe tehnike mogu primeniti za određeno razdvajanje, gasno-tečna hromatografija pruža prednost u pogledu brzine i jednostavnosti opreme. Inače su ove metode komplementarne, tj. one se nadopunjuju.

59

Karakteristike obe metode:Delotvorne, veoma selektivne, mogućnost široke primeneMala količina uzorkaMog ubiti nedestruktivne za uzorakLako primenljive za kvantitativnu analizuPrednosti HPLC:Primenljiva za neisparljive i toplotno nestabilne uzorkeOpšta primena za neorganske jonePrednosti GLC:Jednostavna i jeftina opremaBrzaJako dobro odvajanje sa kapilarnim kolonamaLako se spaja sa spektroskopijom masa

Tabela 4.3 Poređenje visokodelotvorne tečne hromatografije (HPLC) sa gasno.tečnom hromatografijom (GLC)

4.7. Hromatografija sa superkritičnim tečnostima

Hromatografija sa superkritičnim tečnostima (engl. Supercritical- Fluid Chromatography, SFC) je hibrid gasne i tečne hromatografije. Ona objedinjuje neke prednosti tih tehnika. Još je u razvoju, mada se čini da će za neke primene biti u prednosti i pred gasno-tečnom i pred visokodelotvornom tečnom hromatografijom.

4.7.1. Važne osobine superkritičnih tečnosti

Superkritične tečnosti nastaju uvek kad se supstanca greje iznad svoje kritične temperature. Na kritičnoj temperaturi se supstanca ne može pritiskom kondenzovati u tečno stanje. Na primer, ugljen-dioksid postaje superkritična tečnost na temperaturi većoj od 31 C. U tom stanju, molekuli ugljen-dioksida deluju nezavisno jedna od druge baš kao i u gasu.Kako pokazuju podaci u tabeli 4.4 , fizička svojstva supstanci u superkritičnom tečnom stanju mogu se znatno razlikovati od istih svojstava u tečnom ili gasnom stanju. Na primer, gustina superkritičnih tečnosti uglavnom je 200- 400 puta veća od one koja odgovara gasu i približava se njihovoj gustini u tečnom stanju. U tabeli 4.4 upoređene su osobine važne za gasnu hromatografiju, tečnu hromatografiju i hromatografiju sa superkritičnim tečnostima.

GasSuperkritična

tečnostTečnost

Gustina, g/cm3 (0,6-2) 10-3 0,2 - 0,5 0,6-1,6Koeficijent difuzije, cm2 s-1 (1-4) 10-1 10-3 - 10-4 (0,2-2) 10-5

Viskoznost, g cm-1 s-1 (1-3) 10-4 (1-3) 10-4 (0,2-3) 10-2

Tabela 4.4 Poređenje osobina superkritičnih tečnosti, tečnosti i gasova*svi podaci predstavljaju samo red veličine

60

Važna osobina superkritičnih tečnosti povezana sa velikim gustinama (0,2-0,5g/cm3) je njihova sposobnost rastvaranja velikih neisparljivih molekula. Na primer, superkritični ugljenik-dioksid dobro rastvara n- alkane sa 5-22 ugljenikovaatoma u lancu, dialkilftalate u kojima alkil grupe sadrže 4-16ugljenikova atoma i različite policiklične aromatilne ugljovodonike koji u molekulu sadrže nekoliko benzenskih jezgara.Kritične temperature tečnosti upotrebljavanih u hromatografiji međusobno se razlikuju i to od 30 C do više od 200 C. Niže kritične temperature imaju prednost zbog nekoliko razloga. Jedna od tih razloga je taj što su se hromatografske analize sa superkritičnim tečnostima do sada radile uz ugljen-dioksid (31 C), etan (32 C) i oksid azota (37 C). Obratite pažnju na to da su te temperature, kao i pritisci pri tim temperaturama, slične radnim uslovima uobičajene visokodelotvorne tečne hromatografije.

4.7.2. Uređaj za hromatografiju sa superkritičnim tečnostima i veličine koje utiču na njihov rad

Uređaji sa kojima se izvodi hromatografija sa super kritičnom tečnosti slični su uređajima za visokodelotvorno tečnu hromatografiju, osim načina nadzora i merenja pritiska u koloni. Nekoliko proizvođača je počelo proizvoditi takve hromatografe za tržište sredinom 1980 –ih godina.

Efikasnost pritiska Gustina superkritičnih tečnosti povećava se brzo i nelinearno sa porastom pritiska.Povećavanje gustine menja faktor kapaciteta ( ), a time i vreme eluacije. Na primer, vreme eluacije heksadekana smanji se od 25 na 5 minuta kad se pritisak ugljen-dioksida poveća od 7 106 - 9 106 Pa. Gradijentna eluacija može se postići i linearnim povećanjem pritiska u koloni, ili takvim nameštanjem pritiska da se gustina eluensa povećava linearno. Linearno povećanje gustine pokazano je na slici 4.11a gde je gustina ugljen-dioksida kao mobilne faze povećava na linearno od 0,225 do 0,70 g/ml(povećanje pritiska od 7,3 106 do 1,1 107 Pa.Gradijentna eluacija u superkritičnoj hromatografiji može se postići sistemskim menjanjem pritiska kolone ili gustine superkritične tečnosti. Postoji sličnost između gradijentne eluacije uz nameštanje pritiska ili gustine superkritične tečnosti i temperaturne gradijentne eluacije u gasno-tečne hromatografije, odnosno gradijentne eluacije uz različite rastvore u tečnoj hromatografiji.

Kolone

Hromatografske analize u kojima se upotrebljavaju superkritične tečnosti obavljaju se u punjenim i kapilarnim kolonama. Kapilarne kolone imaju prednost pred punjenima jer mogu biti duže, a time i delotvornije. Uobičajene kolone slične su kapilarnim kolonama od taljenog kvarca (FSOT) opisani u tablici 3.1. Zbog male viskoznosti superkritičnih tečnosti, kolone mogu biti mnogo duže od onih u tečnoj hromatografiji, pa se uobičajeno upotrebljavaju kolone dužine 10 ili 20 metara unutrašnjeg prečnika od 50 do 100 m. Zahtevna razdvajanja mogu se obavljati u kolonama dužine 60m i dužima.

61

U hromatografiji sa superkritičnim tečnostima mogu se upotrebljavati mnoga punjenja koja se upotrebljavaju i u tečnoj hromatografiji. To su najčešće polisiloksani koji se hemijski vežu na unutrašnji zid kapilarne cevi. Debljine sloja iznose od 0,05 do 0,4 m.

Mobilna faza

Kao mobilna faza u hromatografiji sa superkritičnim tečnostima najčešće se upotrebljava ugljen-dioksid. On dobro rastvara mnogo organskih molekula. Osim toga propušta ultraljubičasto zračenje, bez mirisa je, nije otrovan, dostupan je na tržištu i mnogo je jeftiniji od drugih hromatografskih eluensa. Njegova kritična temperatura je 31 C, a pritisak od 7,3 106 Pa na kritičnoj temperaturi omogućava veliki izbor temperatura i pritisaka, a sve u granicama radnih uslova za savremenu opremu visokodelotvorne tečne hromatografije. Za neke primene dodaju se male koncentracije polarnih organskih modifikatora ( 1%) poput metanola, kako bi se uticalo na vrednost analita.U superkritičnoj hromatografiji se kao mobilne faze upotrebljavaju još i etan, pentan, diklorodifluorometan, dietiletar i tetrahidrofuran.

Detektori

Osetljivi i univerzalni detektori iz gasno-tečne hromatografije mogu se upotrebljavati i u hromatografiji sa superkritičnim tečnostima pa je to velika prednost ove tehike. Na primer, vrlo pogodan plamenojonizirajući detektor iz gasno-tečne hromatografije može se primeniti na taj način da se superkritičnom nosaču omogući širenje kroz sapunicu u vodonikov plamen, pri čemu joni nastali iz analiziranog uzorka menjaju električnu provodljivost medijuma.

4.7.3. Poređenje superkritične hromatografije sa ostalim kolonskim metodama

Podaci iz tablie 4.4, kao i oni drugi, pkazuju da se nekoliko fizičkih osobina superkritičnih tečnosti nalazi između osobina gasova i tečnosti. Iz toga sledi da ta nova vrsta hormatografije sjedinjuje osobine gasne i tečne hromatografije. Dakle, poput gasne, superkritična hromatografija je mnogo beža od tečne hromatografije zahvaljujući malim viskoznostima i većim brzinama difuzije u mobilnoj fazi. Međutim, velika sposobnost difuzije deluje na longitudinalno širenje traka, što je izraženo u gasnoj, ali ne i u tečnoj hromatografiji. Dakle, srednje veličine difuzije i viskoznosti superkritičnih tečnosti rezultuju bržim razdvajanjem od onih koja se postižu tečnom hromatografijom, ali su zato praćena širenjem zona, što se susreće u gasnoj hromatografiji.

62

Slika 4.9 Karakteristike rada kolone punjene zrnima dimenzija 5- m kad uzorak eluira sa uobičajenom mobilnom fazom (HPLC) ili sa ugljenik(IV)oksidom pri superkritičnim

uslovima(SFC)

Slika 4.9 upoređuje vrednosti primene punjene kolone kad se kao mobilna faza koristi ugljenik-dioksid i konvencionalni eluens. Obratite pažnju na to da superkritična kolona daje visinu tavana od približno 0,013 mm uz brzinu protoka mobilne faze od 0,6 cm/s, a uz istu je brzinu protoka visina tavana konvencionalne kolone tri puta veća, odnosno 0,039 mm. Time bi se širina pika trebala smanjiti za (jednačina 2.16). Alternativno, na visini tavana koja odgovara minimumu na krivi za HPLC ( 0,012 mm), brzina mobilne faze u superkritičnoj hromatografiji je četiri puta veća od one u HPLC sistemu. Time se trajanje analize smanjuje četiri puta. Te prednosti superkritične hromatografije mogu se videti na slici 4.10.

63

Slika 4.10 Poređenje hromatograma dobijenih uobičajenom razdelnom hromatografijom (HPLC) i hromatografijom sa superkritičnom tečnošću (SFC). Kolona: 20cm 4,6mm punjena vezanim punjenjem reverzne faze dimenzija zrna 10 m. Sastojci: (1) bifenil;

(2)terfenilPri HPLC, mobilna faza: 65% CH3OH-35% H2O; brzina protoka: 4mL/min; linearna

brzina: 0,55 cm/s; količina uzorka: 10 L.Pri SFC, mobilna faza: CO2; brzina protoka: 5,4mL/min; linearna brzina: 0,76cm/s;

količina uzorka: 3 L

4.7.4. Primena

Hromatografija sa superkritičnim tečnostima, posebno ona u kapilarnim kolonama, ubraja se među hromatografske metode na koloni jer se može primeniti na one vrste jedinjenja koja se ne mogu primereno analizirati ni gasno-tečnom ni tečnom hromatografijom. Hromatografija sa superkritičnom tečnosti sa plamenojonizirajućim detektorom pogodna je za detekciju neisparljivih ili toplotno nestabilnih jedinjenja koja ne sadrže obojena jedinjenja potrebna za fotometrijsku detekciju. Među tim jedinjenjima su ona koja nisu isparljiva ili su toplotno nestabilna, a osim toga ne sadrže hromoforne grupe koje se mogu koristiti pri fotometrijskoj detekciji. Takva se jedinjenja mogu razdvojiti primenom superkritičnih tečnosti na temperaturama nižim od 100 C, a njihova se detekcija može obaviti vrlo osetljivim plamenojonizirajućim detektorom. Kako pokazuje slika 4.11, delotvornost kapilarnih superkritičnih kolona iz gasno-tečne hromatografije. Obratite pažnju na to da je superkritični hromatogram dobijen pri 40 C, što jasno pokazuje da se ta tehnika može primentiti za analizu toplotno nestabilnih sastojaka.Treba napomenuti da je dodatna prednost superkritičnih kolona u tome što se mogu mnogo jednostavnije povezati sa spektrometrom masa nego tečne hromatografske kolone.

64

Slika 4.11 Poređenje superkritičnog i gasno-tečnog hromatograma alifatske frakcije dobijene rafinacijom ugljenika rastvorom

(a) SFC hromatogram, mobilna faza je CO2 pri 40 C; unutrašnji prečnik kapilarne kolone je 50 m a dužina 34 m, kolona je presvučena sa filmom umreženog SE-54, plamenoizolacijski detektor, linearno programirana

gustina od 0,225 g/mL (7,4 106 Pa) do 0,70 g/mL (1,1 107Pa)(b) Kapilarna gasno- tečna hromatografija; gas nosač je H2, kolona dužine 20

m unutrašnjeg prečnika 300 m, presvučena filmom umreženog SE-54 debljine 0,25 m, plamenoizolacijski detektor, temperatura linearno

programirana od 50 do 250 C

4.8. Linearna hromatografija

Metode linearne hromatografije čine tankoslojna hromatografija, papirna hromatografija i elektrohromatografija. U svakoj od njih upotrebljava se ravan, relativno tanak sloj materije koji je samonosiv ili je nanesen na staklenu, palstičnu ili metalnu površinu. Mobilna faza se pomera kroz stacionarnu fazu kapilarnim silama, a ponekad i uz pomoć gravitacije ili električnog potencijala. Linearna hromatografija se ponekad naziva i dvodimenzionalnom hromatografijom, iako taj pristup nije potpuno ispravan jer stacionarna faza ima konačnu debljinu.Danas se najviše upotrebljava linearna hromatografija koja se temelji na tehnici tankoslojne hromatografije. Tankoslojna hromatografija je brža, ima bolje odvajanje i osetljivija je od papirne hromatografije. U ovoj glavi obrađuju se metode tankoslojne hromatografije.

4.8.1. Tankoslojna hromatografija

Sa teorijske strane, vrste stacionarne i mobilne faze i primene, tankoslojna i tečna hromatografija vrlo su slične. Zapravo, tankoslojna hromatorafija može poslužiti za pronalaženje optimalnih uslova razdvajanja u kolonskoj tečnoj hromatografiji. Prednosti takvog postupka su brzina i niska cena izvođenja eksperimenta tankoslojnom hromatografijom. Neki hromatografičari smatraju da eksperimenti tankoslojnom hromatografijom moraju uvek prethoditi analizi u koloni.

65

Tankoslojna hromatografija postala je nezaobilazna tehnika u industriji lekova za sva važna proveravanja čistoće proizvoda. Takođe se često upotrebljava u kliničkim laboratorijama, a temelj je mnogih hemijskih i biohemijskih proučavanja. Procenjuje se da je broj analiza izveden tankoslojnom hromatografijom, zahvaljujući velikom području primene, jednak broju analiza napravljenih visokodelotvornom tečnom hromatografijom.

4.8.2. Principi tankoslojne hromatografije

Tipična razdvajanja tankoslojnom hromatografijom obavljaju se na staklenoj ploči prevučenoj tankim slojem fino usitnjenih zrnaca koja na nju prijanjaju. Taj je sloj stacionarna faza. Zrnca, koja čine stacionarnu fazu u tankoslojnoj hromatografiji podsećaju na ona opisana u raspravama o adsorpciji, normalnoj i reverznoj hromatografiji i hromatografiji na gelu. Mobilne faze su takođe slične onima koje se upotrebljavaju u visokodelotvornoj tečnoj hromatografiji.

Priprema ploča za tankoslojnu hromatografiju

Hromatografske ploče se mogu napraviti raspršivanjem vodenog mulja fino usitnjene osnovne čvrste materije na čisu površinu staklene il iplastične ploče odnosno mikroskopske ploče. Često se u mulj dodaju veziva koja poboljšavaju međusobno povezivanje zrnaca ili njihovo povezivanje sa staklenom površinom. Ploča se nakon toga ostavlja dok se sloj ne slegne i dk ne očvrsne. Ponekad se ploča može sušiti u sušioniku nekoliko sati. Na tržištu postoje gotove ploče različitih vrsta.

Razvijanje hromatograma

Razvijanje hromatograma je onaj proces u hromatografskoj analizi u kojem uzorak putuje stacionarnom fazom nošen mobilnom fazom. Taj proces je jednak procesu eluacije u tečnoj hromatografiji. Većinom se uzorak na polazni položaj nanosi kao rastvor u tačku blizu jednog kraja ploče (najčešće dimenzije ploče su 5 20 ili 20 20cm). To se mesto označi olovkom. Nakon isparavanja rastvora sa površine ploče, ploča se postavi u zatvorenu komoru zasićenu parom razvijača. Jedna strana ploče uroni se u razvijač, pri čemu treba obratiti pažnju na to da uzorak ne dođe u direktan dodir sa razvijačem (slika 4.12). Pošto je razvijač prošao pola ili dve trećine dužine ploče, ploča se izvadi iz komore i suši. Položaji razdvojenih sastojaka određuju se na nekoliko načina.

66

Slika 4.12 (a) komora za uzlazno razvijanje hromatograma, (b)komora za vodoravno razvijanje hromatograma, pri kojem se uzorci nanose na oba ugla ploče i razvijaju

prema sredini omogućavajući istu analizu dvostruko većeg broja uzorka

Slika 4.13 pokazuje razdvajanje smeše aminokiselina razvijanjem hromatograma u dva smera (dvodimenzionalna linearna hromatografija). Nanesena smeša se u jednom uglu ploče najpre rastvara u jednom smeru razvijačem A. Taj razvijač zatim ispari, ploča se okrene za 90 stepeni, a zatim se hromatogram razvija u kosom smeru na prvi smer razvijanja drugim rastvaračem. Nakon isparavanja drugog razvijača, mrlje aminokiselina izazivaju se ninhidrinom. Naime, ninhidrin sa aminokiselinama stvara jedinjenja ljubičaste do purpurne boje. Tako dobijene mrlje na ploči određuju se poređenjem položaja mrlje na hromatogramu nepoznatih aminokiselina sa položajem mrlja niza poznatih čistih jedinjenja.

Slika 4.13 Dvodimenzionalni tankoslojni hromatogram (silikatni gel) nekih aminokiselina. Razvijač A: toluen/2-hloretanol/piridin. Razvijač B: hloroform/benzil

alkohol/sirćetna kiselina.Aminokiseline: 1-asparginska, 2-glutaminska, 3-serin, 4- -alanin, 5–glicin, 6–alanin, 7–

metionin, 8 –valin, 9–izoleucin, 10-cistein

Pronalaženje analita na hromatogramima

Većina materija koje se ispituju tankoslojnom hromatografijom su neobojena, pa je nakon završenog hromatografskog procesa potrebno razdvojena jedinjenja na hromatogramu na neki način detektovati. Jedna se metoda, koja se može primeniti za većinu organskih smeša, sastoji u prskanju hromatograma jodom ili sumpornom kiselinom koji reaguju sa organskim jedninjenjima stvarajući nove, tamno obojene proizvode. U t usvrhu često se upotrebljavaju i indikatori ili reagensi poput ninhidrina.

67

Drugi se način sastoji u dodavanju fluoroscentnog indikatora tokom pripreme sloja. Nakon razvijanja, takav se hromatogram posmatra pod UV- svetlom. Pri tome cela ploča fluorescencira, osim onih delova gde se nalaze razdvojene mrlje koje ne fluoresciraju.

Kvantitativna analiza

Semikvantitativna procena količine sastojka prisutnog u uzorku može se dobiti upoređivanjem površine mrlja ispitivanog uzorka sa površinama referentnih mrlja. Pouzdaniji podaci mog use dobiti struganjem sloja na onom delu hromatograma na kojem se nalazi ispitivani sastojak, zatim ekstrakcijom sastojka sa čvrste stacionarne faze i njegovim određivanjem primenom neke pogodne fizičke ili hemijske metode. Osim te dve mogućnosti, može se direktno na hromatogramu izmeriti zračenje iz mrlje fluorescencijom il irefleksijom pomoću skenirajućeg denzitometra.

4.8.3. Papirna hromatografija

Proces razdvajanja papirnom hromatografijom jednak je procesu razdvajanja u tankoslojnoj hromatografiji. Papiri, koji se upotrebljavaju u papirnoj hromatografiji proizvode se često od vrlo čiste celuloze uz strogu proveru poroznosti i debljine. Takvi papiri sadrže dovoljnu količinu vode, tako da se stacionarna faza može smatrati vodenom. Druge tečnosti mogu istisnuti vodu, pa se tako mogu dobiti različite stacionarne faze. Na primer, papir obrađen silikonskim ili parafinskim uljem omogućava papirnu hromatografiju reverzne faze u kojoj je mobilna faza polarna tečnost. Na tržištu se takođe mogu kupiti specijalni papiri koji sadrže adsorbens ili jonski izmenjivač, i tako omogućavaju adsorpcijsku ili jonsku papirnu hromatografiju.

68

5.0 LITERATURA Douglas A. Skoog, Donald M. West, F. James Holler – Osnove Analitičke Kemije, 1999. Školska knjiga, Šesto izdanje (englesko), Pro izdanje (hrvatsko), Zagreb, Hrvatska

69