H D B M B – 4 0 G O D I N A

HRVATSKO PRIRODOSLOVNO DRU[TVO (OSNOVANO 1885.) Mjese~nik za popularizaciju

prirodnih znanosti

Godina 106., Broj 1049

25 KUNAPriroda izlazi od 1911. godine

ISSN 0351-0662

1–2/16.

Priroda

PRIRODA • SIJE�ANJ/VELJA�A • 2016.62

M O L E K U L A R N A D I J A G N O S T I K A

Karmela BARIŠI�, Zagreb

Povijesni pogled na molekularnu dijagnostiku

Molekularna dijagnostika bavi se analizom nuklein-skih kiselina u dijagnosti�ke svrhe. U akademskom i znanstvenom pogledu molekularna dijagnostika

izborila se za svoj status kao interdisciplinarno podru�je, a kao stru�no podru�je profilirala se u medicinsko-biokemijskoj dje-latnosti. Molekularna dijagnostika baštinik je razvoja moleku-

larne biologije, genetike i genomike (strukturne i funkcional-ne) u spoznajnom i metodološkom smislu.

Povijest razvoja ovoga znanstvenog podru�ja temelji se na do-stignu�ima koja su postignuta od 19. stolje�a na ovamo u po-dru�ju genetike, biologije, biokemije, molekularne biologije i medicine. Spomenimo samo neke: Mendelovi zakoni naslje�i-vanja*, identifikacija DNA kao molekule koja može transfor-mirati stanice†, rasvjetljavanje strukture DNA‡, sinteza oligo-nukleotida in vitro§, restrikcijske endonukleaze¶, lan�ana rekacija polimerazom** i DNA �ipovi††. Današnji i budu�i ra-

MOLEKULARNA DIJAGNOSTIKA:JU�ER – DANAS – SUTRA

* Gregor Mendel obrazložio je principe naslje�ivanja u predavanju Versuche über Pflanzen-Hybriden (Experiments on Plant Hybridisation) koje je održao u dva dijela 8. i 9. velja�e 1865. godine u Brnu u tamošnjem prirodoslovnom društvu.

† Oswald Avery i sur. su 1944. godine eksperimentalno utvrdili da je »transformiraju�i princip«, na koji je prethodno u svojim pokusima ukazao Frederick Griffitha (poznati pokusi ispitivanja virulentnosti dva, R i S, soja pneumokoka), molekula DNA.

‡ Strukturu DNA rasvijetlili su 1953. godine Francis Crick i James Watson.

§ Sa sintezom oligonukleotida zapo�elo se sredinom prošloga stolje�a, a od 80-ih godina prošloga stolje�a mogu�e je sintetizirati dulje oligonukleotide.

¶ Smith, Kelly i Wilcox izolirali su 1970. godine restrikcijsku endonukleazu iz klase II, HindII iz Haemophilus influenzae.

** K. Mullis, F. Faloona, S. Scharf, R. Saiki, G. Hom, H. Erlich, Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction, Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol., 1986, 51 Pt 1:263–273.

† † Stephen P. A. Fodor i suradnici razvili su tehniku za pripravu minijaturnih nizova bioloških molekula. Na njihovom radu utemeljen je prvi DNA-�ip, temeljna tehnika za genomske studije velikoga opsega.

Tablica 1. Metode koje se �esto rabe u molekularno-dijagnosti�ke svrhe

ANALIZA CILJANA NA POZNATE MUTACIJE DETEKCIJA NEPOZNATIH MUTACIJA DETEKCIJA VARIJACIJA U BROJU KOPIJA

Southern blot / Polimorfizam duljina restrikcijskih fragmenata (RFLP)

Gradijentna gel-elektroforeza Southern blot

Test ligacije oligonukleotida Konformacijski p olimorfizam jednolan�ane DNA (SSCP) MLPA – multipla ligacija uz amplifikaciju sonde

Sekvenciranje Analiza heterodupleksa SNP �ip

Pirosekvenciranje Denaturiraju�i HPLC

Lan�ana rekacija polimerazom u stvarnom vremenu

PRIRODA • SIJE�ANJ/VELJA�A • 2016. 63

M O L E K U L A R N A D I J A G N O S T I K A

zvoj molekularne dijagnostike neodvojiv je, s jedne strane, od razvoja navedenih znanstvenih disciplina, a s druge strane, od razvoja mo�nih tehnologija analize genoma.

Molekularna dijagnostika u klini�kim laboratorijima bilježi svoj uzlet u posljednja dva desetlje�a. Po�etci su bili obilježeni prijenosom tehnika analize genskih mutacija iz istraživa�kih laboratorija u klini�ko okruženje. Analize nukleinskih kiselina ponajprije su bile upotrijebljene za analizu genskih mutacija kod bolesti poput hemoglobinopatije i cisti�ne fibroze, a sam postupak temeljio se na neizravnoj detekciji genskih mutacija. Taj pristup zahtijevao je velike koli�ine pacijentove DNA te detaljne informacije o podru�ju genoma koje se analizira. �e-sto su rezultati bili komplicirani za interpretaciju.

S otkri�em lan�ane reakcije polimeraze (engl. polymerase cha-in reaction, PCR) bilo je omogu�eno umnažanje specifi�nih dijelova molekule DNA u uvjetima in vitro te analiza i izravna detekcija mutacija. Veliki broj metoda koje se od tada koriste u molekularnoj dijagnostici temelji se na analizi DNA umnožene PCR-om, a ne na analizi genomske DNA. U Tablici 1. prikaza-ne su neke od metoda koje se �esto rabe u molekularno-dija-gnosti�ke svrhe.

Nukleinske kiseline

U molekularno-dijagnosti�ke svrhe analizira se genomska DNA ili njezini specifi�ni dijelovi. Kod �ovjeka to je makromo-lekula smještena u stani�noj jezgri (naziva se i nuklearna DNA) koju �ini oko 3 milijarde parova nukleotida u stanicama s haploidnim genomom (spolne stanice). DNA se u svim eukari-otima nalazi u kompleksu sa specifi�nim proteinima. Taj se kompleks naziva kromatin. Kromatin se tijekom stani�ne dio-be strukturira u kromosome (23 para kod �ovjeka). Genomsku DNA �ovjeka predstavlja oko 25 do 30 tisu�a gena.

Kod �ovjeka je osim genomske DNA prisutna i mitohondrijska DNA. Mitohondrijska DNA je kružna molekula, veli�ine oko 16,5 tisu�a nukleotidnih parova koja nosi informacije za dio mitohondrijskih proteina. Mitohondrijska DNA zanimljiva je za molekularnu dijagnostiku u onim slu�ajevima kada se sum-nja na bolesti povezane s varijantama mitohondrijskoga geno-ma. S obzirom na to da se mitohondrijska DNA isklju�ivo na-slje�uje od majke, njezina analiza �esto se rabi u forenzici. Op�enito, kad se radi o molekuli DNA, onda se metodama koje se koristi za molekularnu dijagnostiku utvr�uje izravno (sekvenciranje) ili neizravno (temeljem veli�ine restrikcijskih fragmenata nakon digestije restrikcijskim endonukleazama ili hibridizacijom sa sljedno-specifi�nim sondama).

Osim molekule DNA, bilo nuklearne ili mitohondrijske, za molekularnu dijagnostiku važne su molekule RNA, i to one

koje pripadaju klasi glasni�kih RNA molekula (mRNA). One prenose informaciju pohranjenu u genomu do sustava za sinte-zu proteina, osiguravaju�i tako sintezu proteina po uputama pohranjenim u genima. Kad se radi o molekulama mRNA, za molekularnu dijagnostiku važna je informacija o koli�ini odre-�ene mRNA. Koli�ina mRNA govori o genskoj ekspresiji i �e-sto je klju�na informacija u dijagnostici tumorskih bolesti, od-nosno pra�enju u�inkovitosti antitumorske terapije. U tom kontekstu analizira se ekspresija onkogenskih RNA, RNA mo-lekula tumorskih supresorskih gena ili RNA za fuzijske protei-ne koji nastaju genskim translokacijama (primjerice bcr-abl kod mijeloi�ne leukemije). Osim prethodno navedenih, u novi-je vrijeme sve ve�e dijagnosti�ko zna�enje daje se posebnoj kla-si molekula RNA koje imaju regulatornu funkciju, takozvanim mikroRNA.

Osim stani�nih nukleinskih kiselina, nuklearne i mitohondrij-ske DNA te molekula RNA, u molekularnoj dijagnostici kori-ste se i nukleinske kiseline prisutne u cirkulaciji, tzv. cirkulira-ju�e nukleinske kiseline. Njihova prisutnost u cirkulaciji rezultat je raspada stanica, ali i drugih procesa, zahvaljuju�i ko-jima dospijevaju u cirkulaciju.

Dijagnostika i procjena terapije

U nastavku �e biti navedene neke od bolesti za �iju se dijagno-stiku koristi analiza nukleinskih kiselina. Cisti�na fibroza naj-�eš�a je genska bolest bijelaca (jedan slu�aj na oko 2500 novo-ro�en�adi). Naslje�uje se autosomno recesivno. Bolest poga�a egzokrine žljezde, a ponajprije se manifestira problemima u funkciji dišnoga i probavnoga sustava. Bolest je u oko 70 % slu�ajeva rezultat mutacije F508 (delecija od tri nukleotida koja kodiraju fenilalanin) u genu CFTR. Preostalih oko 30 % slu�a-jeva odnosi se na više od 1200 razli�itih mutacija u navedeno-me genu. Gen CFTR kodira kloridni kanal, protein odgovoran za transport kloridnih iona kroz stani�nu membranu.

Miši�ne distrofije su bolesti skeletnih miši�a. Uzrokovane su mutacijama koje se naslje�uju autosomno dominantno, autoso-mno recesivno ili spolno vezano. Mutacije su prisutne u razli�i-tim genima koji kodiraju proteine izvanstani�noga matriksa, transmembranske proteine i proteine sarkoleme, citoplazmat-ske proteaze te proteine jezgrine membrane. Naj�eš�a su dva oblika miši�nih disrofija, Duchennova i Beckerova. One su re-zultat cijeloga spektra razli�itih mutacija, delecija, duplikacija, to�kastih mutacija ili mutacija prekrajanja, u genu za distrofin, što ima za posljedicu potpuni izostanak ili male koli�ine distro-fina smanjene funkcije.

Sindrom fragilnoga x-kromosoma posljedica je dinami�ne mu-tacije u genu FMR1, koja podrazumijeva promijenjeni broj tri-pleta nukleotida CGG u regulatornom dijelu navedenoga gena

PRIRODA • SIJE�ANJ/VELJA�A • 2016.64

M O L E K U L A R N A D I J A G N O S T I K A

što se reflektira na opseg njegove ekspresije. Sindrom je pove-zan s mentalnom retardacijom i smatra se da je zna�ajno pove-zan s autizmom.

Huntingtonova bolest teška je neurodegenerativna bolest uzro-kovana dinami�nom mutacijom u genu za protein huntingtin. Radi se o promjeni broja tripleta nukleotida CAG u kodiraju�oj regiji gena. Zahvaljuju�i promijenjenom broju navedenih triple-ta nastali protein ima više aminokiseline glutamina što utje�e na njegova svojstva i funkciju i posljedi�no dovodi do neurode-generativnih promjena.

Molekularna dijagnostika bitan je dio sveukupne prenatalne dijagnostike. Iz korionskih resica ili amnijske teku�ine mogu�a je izolacija nukleinskih kiselina i potom njihova analiza s ci-ljem utvr�ivanja nasljednih bolesti.

Podru�ja medicine u kojima je analiza nukleinskih kiselina zau-zela zna�ajno mjesto svakako su dijagnostika malignih bolesti i pra�enje uspješnosti antitumorske terapije. Ilustrativan je pri-mjer kroni�ne mijeloi�ne leukemije. Kod te bolesti, u oko 95 % slu�ajeva, prisutan je takozvani Philadelphia-kromosom nastao razmjenom genetskoga materijala kromosoma 9 i 22. Ova tran-slokacija dijelova kromosoma dovodi do nastanka fuzijskoga gena BCR-ABL1 koji kodira konstitutivno aktivnu tirozinsku kinazu. Analizom DNA odnosno specifi�nih transkripata (mo-lekula RNA) može se dijagnosticirati bolest, ali se može utvrditi pravilna terapija (primjerice imatinibom, poznat pod komercijal-nim imenom Gleevec) te pratiti njezina u�inkovitost.

Analiza nukleinskih kiselina važna je i za podru�je klini�ke mikrobiologije te transfuzijske medicine (utvr�ivanje virusnih nukleinskih kisleina u uzorcima krvi dobrovoljnih davatelja).

U brojnim recentnim razmatranjima o individualnoj prilagod-bi terapije kao jednom od aspekata personalizirane medicine

zna�ajan se naglasak stavlja na farmakogeneti�ka testiranja. Ona obuhva�aju analizu genskih varijanti za one proteine koji moduliraju djelovanje lijekova, bilo kao njihovi receptori, pre-nositelji ili metaboliziraju�i enzimi. U tom podru�ju posebice su istražene i u klini�koj praksi korištene informacije o gen-skim varijantama gena za enzime citokroma P40 (CYP). CYP- -enzimi sudjeluju u metabolizmu velikoga broja lijekova, a nji-hove varijante mogu djelovati tako da ubrzavaju ili usporavaju metabolizam odre�enih lijekova. Ako je neka osoba s obzirom na utvr�enu gensku varijantu odgovaraju�ega CYP-enzima iznimno brzi metabolizator, prosje�nom dozom lijeka kod te osobe ne�e se posti�i željena terapijska koncentracija. U su-protnom slu�aju, kod osobe koja je spori metabolizator, pro-sje�nom dozom lijeka mogu�e je posti�i koncentracije lijeka koje ulaze u podru�je toksi�nih, odnosno veliki je rizik od ne-željenih nuspojava lijeka.

Budu�nost molekularne dijagnostike

Podru�ja znanosti poput proteomike, genomike, transkripto-mike i razli�itih drugih »omika« intenzivno se razvijaju zahva-ljuju�i, izme�u ostaloga, i mo�nim tehnologijama koje ve� da-nas omogu�uju brzu analizu pojedina�noga proteoma, genoma ili transkriptoma. Uklju�ivanje znanstvenih postignu�a ovih disciplina u klini�koj laboratorijskoj praksi bit �e i dalje obra-zac po kojem �e se razvijati molekularna dijagnostika. U tom kontekstu u bliskoj budu�nosti za o�ekivati je da pretraživanje cjelokupnih individualnih genoma zamijeni analize diskretnih dijelova genoma te da se dijagnosti�ki i terapijski postupci indi-vidualno dimenzioniraju.

Literatura

1. S. A. Kidd i sur. Fragile X syndrome: a review of associated medical problems. Pediatrics 134 (5) (2014) 995–1005.

2. L. Buckingham, Molecular Diagnostics Fundamentals, Methods, and Clinical Applications. 2012, 2nd ed., Philadelphia: F. A. Davis Co., str. 35

3. T. Ong, B. W. Ramsey. Update in Cystic Fibrosis, American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine 192 (6) (2014) 669–675.

4. F. O. Walker, Huntington’s disease. Lancet 369 (9557) (2007) 218–228.

5. M. W. Moore, D. Babu, P. D. Cotter. Companion diagnostics and personalized medicine: A review of molecular diagnostics applicati-ons, Current Topics in Genetics 5 (2012) 23–30.

6. W. E. Evans, M. V. Relling, Moving towards individualized medicine with pharmacogenomics, Nature 429 (2004) 464–468.

7. R. Kuzmani� Šamija, Miši�ne distrofije – dijagnostika i terapija, Pedi-atr. Croat. 57 Supl. 1 (2013) 57–6.

TKO JE AUTORICA OVOGA �LANKA?

Dr. sc. Karmela Bariši� je redovita profesorica u trajnom zvanju na Za-vodu za medicinsku biokemiju i hematologiju Farmaceutsko-biokemij-skog fakulteta Sveu�ilišta u Zagrebu. Sudjeluje u izvo�enju kolegija Biokemija, Molekularna dijagnostika, Farmakogenetika, Molekulske osnove bolesti i terapije na diplomskim studijima te u nastavi na dok-torskom i specijalisti�kim poslijediplomskim studijima. Znanstveni in-teres usmjeren joj je na istraživanje stresnih proteina, apoptoze, signal-nih putova, stani�nog skeleta te biološkog i dijagnosti�kog zna�enja regulacijskih RNA molekula. Aktivna je �lanica Hrvatskoga društva za biokemiju i molekularnu biologiju. U dva mandata (2001.–2005.) obna-šala je dužnost predsjednice Društva. Tako�er, u razdoblju 2009.–2013. bila ja �lanica Odbora za edukaciju federacije europskih biokemijskih društava (FEBS).

KAKO ]ETE POSTATI PRETPLATNIK »PRIRODE«?

1. Po{aljite nam svoju adresu obi~nom po{tom (̂ asopis Priroda, Hrvatsko prirodoslovno dru{tvo, Trg žrtava fašizma 10, 10000 Zagreb), telefo-nom (01-468-0240) ili elektroničkom po{tom (priroda hpd.hr).

2. ̂ ekajte da vam do|e prvi broj Prirode s uplatnicom. Kada je uplatite, postali ste na{ pretplatnik!

ŽELITE LI KUPITI OVAJ BROJ »PRIRODE« JAVITE NAM SE TELEFONOM (01-468-0240)

ILI ELEKTRONIČKOM POŠTOM (priroda hpd.hr). POŽURITE BROJ PRIMJERAKA JE OGRANIČEN.

ŽELITE LI PODRŽATI ČASOPIS »PRIRODA«, JEDAN OD STARIJIH ČASOPISA ZA POPULARIZACIJU

ZNANOSTI U SVIJETU, POSTANITE NAŠ PRETPLATNIK!