Producción microbiana de 1,3-propanodiol a partir de ... · Método Taguchi= Arreglo ortogonal L9 = 9 experimentos. 3. Planificación y ejecución del estudio. METODO TAGUCHI. SusChem

Victoria E. Santos MazorraFisicoquímica de Procesos Industriales y

Medioambientales (FQPIMA)Departamento de Ingeniería Química

Facultad de Ciencias QuímicasUniversidad Complutense de Madrid

SusChem Plataforma Tecnológica sobre Química Sostenible

Madrid, 13 de Mayo de 2009

Producción microbiana de 1,3-propanodiol a partir de glicerol, mediante Klebsiella

oxytoca NRRL B-199

FQPIMA-UCMSusChem Madrid 13 de Mayo de 2009

Contenidos

• Introducción• Proceso de producción de 1,3-propanodiol


Introducción


Introducción

- Elección del biocatalizador

- Manipulación genética

- Estudio condiciones: medio, condiciones de operación

- Preparación Inóculo: volumen, etapas, condiciones

- Estudio importancia fenómenos físicos (fases)

- Estudio estrés hidrodinámico (daño)

- Estudio de formas de operación

- Estudio condiciones: medio, condiciones de operación

Modelo cinético del crecimiento

MODELO MACROCINÉTICO

Modelo cinético de la producción

Modelo físico del sistema

SI

NOSimulación a mayor escala

Experimentación a mayor escala

¿?

BIOCATALIZADOR

PRODUCCIÓN

Proceso Industrial

CAMBIO de ESCALAPlanta Piloto

FQPIMA- Desarrollo de Bioprocesos

Mantenimiento

PRE-INÓCULOComposición medio

Condiciones de operaciónt1

INÓCULOComposición del medio

Condiciones de operaciónCxo (g/L)t2

Biorreactor Composición del medio

Condiciones de operaciónCxo (g/L)


Introducción

Producción de Biodiesel

PRODUCCIÓN de 1,3-PROPANODIOL

GlicerolÉsteresAlcoholdoTriglicéri

OHCHI

OHCHI

OHCH

ROOC'R

ROOC'R

ROOC'R

OH'R3

ROOCCHI

ROOCCHI

ROOCCH

2

2

3

2

1

rCatalizado

32

2

12

−

−

−

+

−−

−−

−−

⎯⎯⎯ →←+

−−

−−

−−

10 Kg glicerol por 100 Kg de biodieselAPROVECHAMIENTO

del GLICEROLBiodiesel

Directiva 2003/30/CE, 8 de mayo de 2003

fomento de uso de biocarburantes (bioetanol y biodiesel) en transportes (20%) límite 2020


Introducción

Aplicaciones

estabilizante detergentescomponente mezclas anticongelantescomponente aceites lubricantescomponente tinta impresorahumectante cosméticosmonómero polímeros:

polipropilentereftalato (PPT)(propiedades químicas y mecánicas, biodegradabilidad)

1,3-propanodiol (1,3-PD)

Métodos obtención convencionales:

Hidratación acroleína (20 y 40 atm., 110 y 115ºC.)Hidrorreformilación óxido de etileno (80 a 100 atm., 125 y 180ºC)

Procesos costososCorrientes residuales con alta carga contaminante



Introducción

1,3-propanodiol por vía biotecnológica

“BIO-REFINERÍA” Sustitución proceso químico por “bioproceso”

Klebsiella

Clostridium

Citrobacter

Enterobacter

Metabolismo conocido desde s. XIX Metabolito primario, anaerobiosis

Producción asociada a crecimiento

tcrecimiento

1,3-PD

Biomasa

Cj



Introducción

DhaB

DhaT DhaK

DhaD

Patógenos

Klebsiella pneumoniae

Clostridium butyricum

Búsqueda de no patógenos

Klebsiella oxytoca NRRL B199Producción de GMO



Introducción

Carbono: GLICEROL

Nitrógeno

K, Na

Células en Crecimiento

Biomasa

1,3-PD

Ác. LácticoÁc. Succínico

Ác. AcéticoEtanol

2,3-butanodiol

P, Mg

Inhibición del crecimientoMenor producción



Desarrollo del proceso

• Protocolo experimental• Optimización del medio de cultivo• Estudio de efectos inhibitorios• Estudio condiciones de operación

OptimizaciónMedio

EstudioCondiciones de Operación

ProtocoloExperimental


EstudioInhibición

1. Protocolo de conservación

2.Preparación del inóculo (1ª y 2ª

etapa de crecimiento)

3. Inoculación, Crecimiento y

producción (biorreactor)

Stock Biorreactor2 L

muestra

0,1 g/LT = 30 ºC

210 rpm en incubadora orbital

12 h 12 h12 h

OptimizaciónMedio




EstudioInhibición

Análisis de biomasa: Espectrofotometría UV/VIS; 600nm

Análisis de sustrato/productos: HPLC

Aminex HP-87H

Detector de IR

Biomasa

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0 5 10 15 t(h)

C (g

/l)

-2 0 2 4 6 8 10 12 14 16

0

5

10

15

20

25

30

35

40 Gly1,3-PD HAcHLacSucc2,3-BD EtOHC

(g/L

)

t (h)

Toma de muestra cada hora

durante 20 horas

SusChem Madrid 13 de Mayo de 2009 FQPIMA-UCM



EstudioInhibición

OptimizaciónMedio

Biomasa

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0 5 10 15 t(h)

C (g

/l)

METODO TAGUCHI

1. Diseño del sistema DEFINICIÓN DE OBJETIVOS

Maximizar el crecimiento de biomasa de K. oxytoca

Maximizar el rendimiento en la producción de 1,3-PD

2. Diseño de parámetrosIDENTIFICACIÓN de FACTORES, NIVELES Y RESPUESTAS:

ETAPAS

1. Factores Estudios bibliográficos

Ensayos previos

Concentración de glicerol

Concentración de fosfato

Relación K:Na

Concentración de MgCl

2. Niveles

FACTOR nivel 1 nivel 2 nivel 3Glicerol 20 g/L 40 g/L 80 g/LFosfato 1,5 g/L 4,5 g/L 9 g/L

K:Na 25:75 50:50 75:25Mg 0,5mM 1mM 2mM

3. Respuestas Y1: Concentración de biomasa máxima en fase estacionaria

Cxmax

Y2: Rendimiento de 1,3-PD

Ct1,3-PDY1,3-PD = C0gly- Ct

gly



OptimizaciónCondiciones de Operación

EstudioInhibición

OptimizaciónMedio

EXP

DESCRIPCION del ARREGLO ORTOGONAL L9Nivel

FactorA

Nivel Factor

B

NivelFactor

C

NivelFactor

D1 20 25/75 1,5 0,52 20 50/50 4,5 13 20 75/25 9 24 40 50/50 1,5 25 40 75/25 4,5 0,56 40 25/75 1,5 17 80 75/25 9 18 80 25/75 4,5 29 80 50/50 9 0,5

Diseño factorial 34 = 81 experimentosDiseño 34 Método Taguchi= Arreglo ortogonal L9 = 9 experimentos

3. Planificación y ejecución del estudioMETODO TAGUCHI




EstudioInhibición

OptimizaciónMedio

T1= (2, 3, 2, 2)

4. Interpretación de datos

Respuesta Y1: CXmax




EstudioInhibición

OptimizaciónMedio

EXPGlicerol

(g/L)

PO43

-

(g/L) K:NaMgCl(mM)

T1 40 9 50:50 1

T2 80 9 50:50 1

COMBINACIONES PREDICHAS POR EL MÉTODO TAGUCHI:T2 =(3, 3, 2, 2)

4. Interpretación de datosRespuesta Y2: YPD




EstudioInhibición

OptimizaciónMedio

EXP Glicerol (g/L)

PO43-

(g/L) K:Na MgCl(mM)

T1 40 9 50:50 1Exp 50 50 9 50:50 1Exp 60 60 9 50:50 1Exp 70 70 9 50:50 1

T2 80 9 50:50 1

Compuesto Concentración (g/L)

Glicerol 60

NaH(PO4)·12H2O 4,5

PO4H2K 4,5

Cl2Ca 1

NH4Cl 2

KCl 7

MgSO4 24,6

Extracto delevadura 1,5

Cxmax = 1,276 g/L

YPD = 0,719 g/g



OptimizaciónMedio


EstudioInhibición

0 2 4 6 8 10 12 14 16

0

2

4

6

8

10

12

1,3-PD Lac Ace Succ 2,3-BD EtOH

Cx

(g/L

)

t(h)

Planificación de los experimentosElección de la concentración de los agentes inhibitorios:

C1,3-PD =11.5 g/LCacetic = 1.45 g/LClactic = 0,125 g/LCsuccinic = 0,133 g/LC2,3-BD = 0,51 g/LCEtOH = 0,098 g/L



OptimizaciónMedio


EstudioInhibición

14 Experimentos

Exp 1,3-PD (g/L)

HAc (g/L)

Hlac(g/L)

Hsucc(g/L)

2,3-BD (g/L)

EtOH(g/L)

1 0 0 0 0 0 02 8 0 0 0 0 03 16 0 0 0 0 04 20 0 0 0 0 05 0 1 0 0 0 06 0 2 0 0 0 07 0 0 0.1 0 0 08 0 0 0.3 0 0 09 0 0 0 0.1 0 0

10 0 0 0 0.3 0 011 0 0 0 0 0.4 012 0 0 0 0 0.8 013 0 0 0 0 0 0.0814 0 0 0 0 0 0.1



OptimizaciónMedio


EstudioInhibición

μ: velocidad específica de crecimiento

YPG: rendimiento en 1,3-PD

))·exp((

)··exp(

,

tCC

tCC

mX

Xo

Xox

μ

μ

−⋅−=

11

Go

PPG C

CYmax

=0 5 10 15 20 25

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

Cx

(g/L

)t(h)

Cx,m

Cx,0

μ

EcuaciónLogística

2 parámetros para evaluar el efecto de la inhibición



OptimizaciónMedio


EstudioInhibición

Efecto en la velocidad específica de crecimiento, μ.

• Ácido Succínico es el agente inhibitorio más importante

• Todos los compuestos inhiben el crecimiento de K. oxytoca

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

1,3-PD (g/L)

μ (h

-1) 0 g/L

8 g/L16 g/L20 g/L

• Concentraciones diferentes de cada compuesto no produce un incremento significativo en el efecto inhibitorio.



OptimizaciónMedio


EstudioInhibición

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

1,3-PD g/L

YPG

(g/g

)

0 g/L8 g/L16 g/L20 g/L

•Con la concentración inicial más alta de cada compuesto se obtiene el menor valor de YPG

• La mayor influencia sobre YPG se observa cuando se estudia EtOH como agente inhibidor

•Cuando C1,3-PD > 8 g/L el efecto inhibitorio es muy significativo

Rendimiento de Glicerol en 1,3-PD, YPG



OptimizaciónMedio

EstudioInhibición


Microorganismo afectado por la velocidad de

agitación

Stress hidrodinámico

Variables estudiadas: T, N (rpm)

Exp N(rpm)1 Incubadora

(210)2 503 1004 1505 210

Estudio de la Velocidad de agitación



OptimizaciónMedio

EstudioInhibición


Aumento de agitación: perfil

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

0 5 10 15 200

2

4

6

8

10

12

14

50

60

70

80

90

100

C X( (

g/L)

incubadora biorreactor

t (h)

CP(

g/L)

perfil de agitación

Estudio de la Velocidad de agitación



OptimizaciónMedio

EstudioInhibición


30 32 34 37 38 390,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Valo

r del

par

ámet

ro

Temperatura (ºC)

YXG(g/g) Rdto P (g/g) qp(g 1,3-PD/g biomasa·h)

A 30, 34 y 37 ºC se obtienemayor rendimiento

A 37 ºC se obtiene mayorvelocidad de producción

Temperatura óptima 37 ºC :

- Mayor rendimiento

- Mayor velocidad de producción

Estudio de la Temperatura (de 30 a 39 ºC)


Gracias por su atención

Documents

Producción microbiana de 1,3-propanodiol a partir de ... · Método Taguchi= Arreglo ortogonal L9 = 9 experimentos. 3. Planificación y ejecución del estudio. METODO TAGUCHI. SusChem