ZamoranoCarrera de Ciencia y Producción Agropecuaria

Laboratorio de Cultivo de Tejidos y Micropropagación

Módulo de Biotecnología AplicadaCultivo de Tejidos Vegetales y Propagación in vitro

5.7 Rescate de Embriones de OrquídeasExplante: Embriones Cigóticos

Introducción

Las semillas de orquídeas tienen requerimientos muy particulares para su germinación por lo que la germinación in vitro representa una alternativa viable en su producción. Mediante el cultivo de embriones in vitro nosotros podemos manipular las condiciones ambientales para así asegurar un alto nivel de germinación y obtener un alto número de plantas a partir de una sola cápsula.El propósito de esta práctica es proveer al estudiante con los conocimientos y habilidades necesarias para poder sembrar y germinar semillas de orquídeas in vitro.

Materiales y Métodos

1. Cápsulas2. Cultivos establecidos en etapas II/III3. Platos petri estériles4. Pinzas y bisturíes 5. Solución de 70% Ethanol6. “Solución desinfectante” preparada con 2% Ca(OCl) (hipoclorito de Ca) más 2 gotas

de tween 80 por cada 100 ml de solución.7. Agua destilada estéril para los enjuages8. 10 frascos / estudiante conteniendo medio sólido con Knudson fórmula “C” (KC) para

germinación de embriones (Etapa I)9. 10 frascos / estudiante conteniendo medio sólido para multiplicación / enraizamiento

de vitroplántulas de orquideas (Etapa II / Etapa III)10. Bandejas de celdas múltiples11. Macetas

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Procedimientos1. Obtenga la(s) cápsula(s)

2. Lavar las cápsulas con jabón, brocha y agua

3. Cortar la punta con cuidado

4. Esterilizar la cápsula con alcohol al 70% para romper las ceras durante 30 segundos a 1 minuto.

5. Colocar la cápsula en Ca(OCl) (hipoclorito de calcio) al 1% + 3 gotas de tween 80 por cada 100 ml. de solucion durante 15 minutos.

6. Colocar la cápsula en Na(OCl) (hipochlorito de sodio) al 2% + 3 gotas de tween 80 por cada 100 ml. de solucion durante 15 minutos.

7. En la cámara de transferencias colocar la cápsula en un plato Petri estéril conteniendo papel filtro.

8. Abrir la cápsula longitudinalmente y separar las dos mitades. Raspar las paredes de las dos mitades para extraer la semilla.

9. Colocar en los tubos con medio Knudson (KC).

Medio para Iniciación de OrquídeasMedio para Embriones de Orquídeas (Etapa I)

Componente 1 LitroCa(NO3)2.4H2O 1000 mg(NH4)2SO4 500 mgMgSO4.7H2O 250 mgKH2PO4 250 mgEDTAFeNa 50 mg (5 ml de Solución madre 200x)Microelementos MS 1 mL (Solución madre 1000x)Agua de Coco 100 mlSacarosa 20gPhytagel 3.75 gpH=5.5

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Medio para Multiplicación de Orquídeas (Etapa II)Componente 1 Litro

Macroelementos MS 100 ml (Solución madre 10x)EDTAFeNa 50 mg (5 ml de Solución madre 200x)Microelementos MS 1 ml (Solución madre 1000x)Inositol 100 mgCisteína 10 mgBiotina 1 ml (1:10000)Pantotenato 1 ml (1:100)Sulfato de adenina 5 mgCaseína hidrolizada 1 mgAcido nicotínico 0.01 mgPiridoxina 0.01 mgTiamina 0.1 mgPolvo de banano Zamoranoo Polvo de banano Sigma

25 g100 g

Sacarosa 30 gBAP 1 mgAIA 1 mgPhytagel 3.75 gpH=5.8

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