Proteomiğe Genel Bakış

Genomun tüm protein komplementlerini (proteom) çalışan bilim dalı Proteomiks olarak

adlandırılmaktadır. Proteomiks ve proteom terimleri Marc Wilkins ve arkadaşlarınca 1990

larda türetilmiştir. Bu kelimeler tüm bir organizmadaki tüm genlerin kolleksiyonlarını ifade

eden genomiks ve genom kelimelerinin yansımalarıdır. Omiks ‘omics’ terimi biyoloji ve

yaşayan sistemler hakkında nasıl düşündüğümüzün yeniden tanımlanmasını sembolize eder

(Şekil 1).

Şekil1: Genomiks ve proteomiksin biyokimyasal konteksti

Genom, bir organizmanın bütün DNA’sı, bir başka deyişle, genetik yapısı olarak da ifade

edilebilir. Değişik organizmaların büyüklükleri önemli farklılıklar gösterirler. Örneğin E.coli

bakterisinde genom 4,5x106 baz çiftinden oluşmuşken, insanda 3,2x109 baz çiftine ulaşır.

Bitki, hayvan gibi çok hücreli canlılarda hemen her hücre tam genomu içerir (insanda olgun

alyuvarlar genom içermezler). İnsan genomu, 50-250 milyon baz çifti içeren 24 kromozom

halinde düzenlenmiştir. Bu kromozomlara dağılmış olan genlerin sayısı, yaklaşık 35 bin

kadardır. Genler, organizmadaki işlevsel moleküller olan proteinleri kodlarlar. Bütün

genomun ancak y a k l a şı k %2’sini oluşturan genlerin içerdiği dizim hataları (mutasyonlar),

organizmalarda yapı ya da işlev bozukluklarına, bir başka deyişle hastalıklara neden

olabilirler. 1945’te ABD Kongresi,Enerji Bakanlığının yeni enerji kaynakları ve teknolojileri

geliştirmekle, bu yeni enerjilerin üretim ve kullanımının sağlık ve çevre açısından sakıncaları

olup olmadığının derinlemesine araştırılmasıyla görevlendirdi. 1986’da Enerji Bakanlğı,

belirtilen görevinin çerçevesinde insan genomu dizisinin belirlenerek bir referans oluşturması

için insan Genomu girişimini başlattı ve Ulusal Sağlık Enstitülerinin de işbirliğiyle 1990’da

“İnsan Genom Projesi" başlatıldı. İnsan Genomu Projesinin temel amacı, tüm insan

genomunun dizisini ve bütün genlerini belirleyerek bir kaynak oluşturmaktı. Bunun yanı s›ra

diğer organizmalarn da genom dizilerini belirleyerek insanınkiyle karşılaştırmak, bunun

gerçekleştirilmesi için yeni teknikler geliştirmek ve elde edilecek bilgileri tarım,sağlık, çevre,

enerji gibi alanlarda değerlendirmektir.

Genomiks ve açılımı genom projesi görevini gerçekleştirirken bu fikirden doğan proteomiks

kavramı hızla gelişmeye başladı.

1990 ları ortalarına kadar , biyokimyacılar, moleküler biyologlar ve hücre biyologları belirli

genler, proteinler ya da spesifik biyokimyasal yollorla ilişkili unsurların küçük gruplarını

çalışıyordu. Northern blot (gen ekspresyonu için) ve Westhern blot (protein düzeyleri için)

yerlerine kullanılanılabilecek yeni teknikler az miktardaki gen ya da proteinin zor analitik

işlerinden daha fazlasını yapabilmeyi sağlayacaktı.

Üç gelişim biyolojik peyzajı tamamiyle değiştirdi ve yeni biyolojinin temelini oluşturdu.

Bunlardan ilki 1990lar boyunca genlerin (EST, ve protein sekans databazları) gelişimi

üzerineydi. Bu çalışmalar bir takım organizmaların eksprese ( ifade ) genlerinin kismi

katologlanmasından daima daha fafdalı hale dönüştü. 1990 ların sonlarındaki genom

sekanslama projeleri bakteri, maya, nematod, drosophila ve yakınlarda sonlanan insan

genomuyla ürnlerini verdi. Bitki genomları veya hayvanlar üzerindeki genom çalışmalarının

bir kısmıda tamamlandı. Bu genom databazları düzgün bir şekilde katologlanarak yaşayan

sistemler üzerinde bilgilerimizin çok daha fazlasını anlayabilmek için kullanılacaktır.

İkinci kilit gelişme; bu veri tabanlarından çıkarılacak bilgi için kullanımı kolay olan,

depolama temelli yöntemler üzerinde olmuştur. Bu web temelli ücretsiz yöntemler

biyologlara probe yapımı, genlerin fonksiyonu, gen ürünleri gibi pekçok veriye ulaşmasını

sağlamaktadır.

Üçüncü kilit gelişme ise oligonükleotid mikroarraylerdir. Bu yöntem bir cip üzerindeki gen

spesifik oligonükleotid veya cDNA sekanslarınının bir serisini içerir. Array’e çalışılmak

istenilen örneğin floresan işaretli DNA’ sının karışımı eklenir ve bir seferde binlerce genin

ekspresyonu incelenebilir. Bir array binlerce Northern-blot analizinin yerine geçebilir ve bir

Northern in alacağı zaman kadar bir sürede tamamlanacaktır. Bunun ötesinde iki renkli

floresans prob işaretlenerek iki farklı örneğin genlerinin ekspresyonu bir slide veya cip

üzerinden direk olarak karşılaştırılabilir.

Şekil2: Cip üzerinde mayanın genomu vardır. Bu maya cDNA microarray’i Stanford Üniversitesinde Dr. Patrict Brown’nın labratuvarında üretilmiştir. (http://cmgm.stanford.edu.pbbrown/) Sacchromyces cerevisiea genomunun 6000 geninin herbiri için özgün sekansları içeren bir

array slid şekil 2 de gösterilmektedir. Bu tek bir arrayden maya genomundaki tüm genlerin

ekspresyonları değerlendirilebilir. Böyle resimler yeni biyolojinin meydan okumasıyla bizi

yüzyüze getirir. Tüm sistemi görebiliriz ancak dataların gösterdiği bu binlerce birleştirilmiş

bilginin sezgilerle yorumlanması bizim kabiliyetlerimizin dışındadır. Yeni sınıfladırma

algoritmaları, serbest organizasyon haritaları ve benzer araçlar biyologların başarıya

ulaşabilmeleri için datalara en son yaklaşımları sunmalarını sağlayan araçlardır.

Array yönteminin en önemli özelliği büyük düşünebilme kavramına sahip olmasıdır. Bir

hücre farklı durumlarda binlerce hatta onbinlerce geni ekspresse edebilmektedir. Hücrenin

yaşam ve ölümü bu genlerin ekspresyonu ve protein ürünlerinin aktivitelerince

belirlenmektedir. Herbir protein ‘ transmembran reseptör, transkripsiyon faktörü bir protein

kinaz ya da şaperon’ aynı hücrede ekspresse olanlarda dahil bütün diğer fonksiyonların ve

aktivitelerin dışında önemli olan bir fonksiyonu gösterebilir. Şimdi biyologlar yalnızca

kompenentlerin ve komleksliğin duyarlılığından ziyade sistemi anlamaya çalışarak büyük

düşünmeye çabalıyorlar.

Protein Kimyası ve Proteomiks Arasındaki Farklar:

Yeni bir fikre terime ve yaklaşıma yaygın olarak verilen cevap şüpheyle yaklaşmaktır. Bu

nedenle proteomiks ve protein biyokimyası arasındaki farkların iyi bir şekilde açıklanması

önemlidir. Hem proteomiks hemde protein kimyası protein tanımlanmasını kapsamaktadır.

Peki farklılık nerededir?

Tablo 1

Protein Kimyası ve Proteomiks Arasındaki Farklılıklar

Protein Kimyası Proteomiks

•Yalnızca Proteinler • Kompleks karışımlar

• Tüm sekans analizi • Kısmi sekans analizi

• Yapı ve fonksiyon üzerinde önem • Databaz eşleştirmeleri

üzerinde önem

• Yapısal biyoloji • Sistemlerin biyolojisi

Tablo 1’de, dikkate alınan kilit özellikler kısaca özetlenmektedir. Protein kimyası, protein

yapısı ve fonksiyonunun çalışmalarını kapsar ve yaygın olarak fiziksel biyokimya ya da

mekhanistik enzimolojinin alanıdır. Çalışma genelde yapının fonksiyonu nasıl yönettiğini

araştırmak için komple sekans analizi,yapısal belirleme ve modelleme çalışmalarını

gerektirir. Fiziksel biyokimyacılar ve enzimolojistler tipik olarak bir protein ya da bir

zamanda çok altüniteli protein kompleksini çalışırlar.

Proteomiks çoklu protein sistemlerini inceler. Çoklu sistemlerin karşılıklı etkileşimlerini ,

geniş sistem veya networklerin bir parçası olarak bunların rollerindeki farklı proteinleri

inceler. Analiz direk olarak kompleks karışımdır fakat komple sekans analizi değildir. Bunun

yerine databazın eşleştirme araçlarının yardımıyla kısmi sekans analizleriyle analizler yapılır.

Proteomiks kavramı yapısal biyoloji yerine sistemlerin biyolojisidir. Diğer bir deyişle

proteomiksin gösterdiği herhangi tek bir komponentin davranışı yerine sistemin davranışını

karakterize etmektir.

Gen Ekspresyon Düzeyini Ölçebilirken Neden Proteomiksle Uğraşarak

Kendimize Acı Çektiriyoruz ?

Gen microarrayleri bir hücredeki genlerin bir kısmı ya da hepsinin ekspresyonunu hızlı bir

şekilde eldesini sağlamaktadır. Şübhesizki mRNAnın düzeyi bir hücrede yerine geçen

proteinin düzeyini tahminde yeterli değildir. mRNA stabilitesindeki farklılıklar ve

translasyon etkinliğindeki farklılıklar yeni proteinlerin üretimini etkilemektedir. Bir

yapılanmada proteinler stabilite ve turn over oranlarında önemli ölçüde farklılık gösterir.

Sinyal transdüksiyonu, transkripsiyonal – faktör düzenlemesi ve hücre döngüsünde gerekli

birtakım proteinlerin aktivitelerini düzenleme manasında çevrimleri hızlıdır. mRNA

düzeyleri; aktiviteleri ve fonsiyonları birtakım iç posttranslasyonel modifikasyonlara ve

çevresel ajanlar tarafından diğer modifikasyonlara belirlenen yerlerine geçen proteinlerin

düzenleyici durumu hakkında hiçbirşey söylemez.

Proteomiks : Analitik bir Meydan Okuma

Bir organizmadaki genlerin bir kısmının ya da tümünün ekspresyonlarının nasıl ölçüleceği

problemi cDNA veya oligonükleotid mikroarray tekniklerinin kullanımı ile çözülmüştür. Gen

ekspresyonunun mikroarrayler ve bağıntılı metodlarla analizleri PCR ve komplementer

sekansların oligonükleotidlerle hibridizasyonu tekniklerine bağlıdır. Şübhesizki protein

analizleri için buna anolog bir araç yoktur. İlk olarak PCR’ın protein için bir eş anlamlısı

yoktur. Yani PCR ile polipeptid moleküllerinin kendilerini çoğaltmaları diye bir şey söz

konusu değildir.

İkinci olarak komplementer aminoasid sekanslarının spesifik olarak hibridizasyonu yoktur.

Nükleotid sekanslarının bu komplementer hibridizasyon karekterleri microarray teknolojisinin

kullanımını olasıkılmaktadır. Antibady ve oligonükleotid aptamerleri (Şekil 3) spesifik

peptid veya proteinleri tanıyabilsede tanıma oligonükleotidlerde olduğu gibi sekans

temelinde basitce bir tanıma değildir.

Şekil 3: a) Fonksiyonel protein mikroaray b) Fonksiyonel protein mikroaray

Proteomikte karşılaşılan diğer bir problemde her bir protein gen ürününün hücre içinde

yalnızca bir molekül girişiyle kaçınılmaz olarak yükselme vermemesidir. Çünkü proteinler

posttranslasyonel modifiyedirler. Geniş ve değişik modifikasyon çeşitleri belirli proteinler

için, hücredeki düzenleyici mekanizmalar için ve çevresel faktörlere göre farklılık gösterir.

Sonuç olarak bazı proteinler çoklu formda bulunur. Özel bir genin çoklu protein ürünleri

arasındaki farklılıklarının belirlenmesinin gereksinimi proteomikin analitik meydan

okumasına bir ilavedir.

Proteom analizleri gen ekspresyon analizlerine göre daha fazla farklı grupta yöntem gerektirir.

Proteomun karakterizasyon işi modifiye ve modifiye olmamış formların tesbiti ve miktarının

tayini için analitik metodlara gereksinim duyar.

Proteomiks Araçları :

Analitik proteomiksin daha önce tanımlanmış dezavantajlarına karşın proteom ve onun

kompenetlerinin karakterizasyonu işi pratikte yapılabilinmektedir. Bu; dört temel yöntemin

araştırmacılar tarafından geliştirilmesi ile başarılmıştır. İlk yöntem organizmanın eksprese

olan proteinlerinin tümünün tam kataloğunu sağlayan protein, EST ve komple genom

databazlarıdır. Drosophilanın tüm kodlayıcı sekansları temel alındığında ; EGF benzeri

domainli proteinleri kodlayan 110 geni biliyoruz. Buna göre Drosophila da proteomiks

yaparken geniş fakat olası proteinleri bildiğimiz bir indeksi tarıyor olacağız.

İkinci yöntem kütle spektrofotometrisidir (mass spectrometry:MS). Son yıllarda MS

ölçümleri köklü değişiklikler geçirdi. Yüksek duyarlılıkta ve robotlaşmaşmada son noktaya

ulaşmış bu yöntem; özellikle protein ve peptidlerin analizinde oldukça güvenilir bir

yöntemdir. Bu yöntem 100kDa veya daha üstü intak proteinlerin moleküler kütle ölçümlerini

doğru olarak sağlayabilmektedir. Böylece protein kütlelerini belirlemek için SDS page de

yürütmek yerine tercih edilmektedir. Yüksek doğrulukta protein kütle ölçümlerinin

genellikle faydaları limitlidir. Çünkü bunlar sıklıkla yeterince duyarlı değildir ve net kütle

sıklıkla protein tanımlanmasında istenmeyen eksikliktedir. MS aynı zamanda proteolitik

olarak parçalanmış polipeptidlerin ölçümünde de kullanılır. Tüm protein kütle ölçümünün

aksine peptid kütle ölçümleri daha duyarlı ve kütle daha doğrudur. MS analizi kullanılarak

proteolitik kesime uğratılmış peptidlerin kesin sekans analizleri elde edilebilmektedir.

Şekil 4: Proteomikste kullanılan yöntemler ve fonksiyonal genomiksle etkileşimleri

Üçüncü yöntem databazdaki spesifik protein sekansları ile MS datalarını eşleştirebilen

yazılımları ortaya çıkarmaktır. Daha önce belirtildiği gibi MS datalarından bir peptidin

sekansının belirlenebilmesi mümkündür. Bununla birlikte bu de nova sekans yorumu kısman

zahmetli bir iştir. Bu software töntemi yorumlanmış datayı alır ve protein sekansları, EST ve

özelleşmiş algritmaları ekleyerek genom sekan databazı ile eşleştirir. Bu yöntemin en büyük

kullanışlığı çok fazla MS datasını protein sekansları ile eşleştirirken otomasyonu getirmesidir.

Proteomik için dördüncü yöntem analitik protein ayrım teknolojisidir. Protein ayrımı

proteomikste iki amaca hizmet eder. İlki kompleks protein karışımlarımlarını belli

proteinlere ya da proteinlerin küçük gruplarına çözerek onları basitleştirir. İkincisi bu aynı

zamanda iki örnek arasında karşılaştırma yaparak protein düzeylerindeki açık farklılığıda

gösterir. Protein analitik ayrımı araştırıcıya analizi için spesifik proteinleri hedeflemesini

sağlar. 2D SDS page proteomiksle ilişkilendirilmiş en yaygın yöntemdir. İki boyutlu jel

kompleks örneklerin proteinlerinin çözümü için muhtemelen en iyi yötem olarak taktim

edilebilir. Bununla birlikte diğer protein ayırma teknikleri 1D- SDS- PAGE , HPLC, kapiler

elektroforez, izoelektrik fokuslama ve affinite kromotografisi analitik proteomiks için

kullanışlı yöntemlerdir.

Bu dört yöntemin birbirleri ile etkileşimleri proteomiksin günümüzdeki teknoşojisini meydana

getirmiştir.

Şekil 5 : Maya data setlerinin geniş ölçekte etkileşimleri biraraya getirilerek canlandırma

yapılmıştır. GRID databazından sağlanan 14.000 fiziksel etkileşim Osprey network gösterim

sistemiyle (bak http://biodata.mshri.on.ca/grid) gösterildi. Grafikteki herbir kenar Gen

ontoloji (GO) fonksiyonel kurallarına göre renklendirilmiş nodlar arasındaki ilişkiyi

simgelemektedir. Data setleri içindeki komplekslerin fazlalığı, merkezi kütlenin çevresinde

görünen, diğer kompleks üyeler içerisinde en az üçünü paylaşan nodlardan kaynaklıdır. Tüm

grafik 4.543 nodu bu da maya genomundan kodlanan yaklaşık 6000 proteini göstermektedir.

20 yüksek etkileşimli kompleks 340 geni , 1,835 bağlantı ve 5.39 ortalama bağlanabilirliği

içermektedir.

Proteomiksin Uygulama Alanları

Proteomiks teknolojisi gerçekten etkileyicidir. Günümüzde pratikte dört temel uygulamayı

kapsamaktadır. Bunlar 1) mining (örnekteki proteinlerin tümü) 2) protein ekspresyon

profili, 3) protein network haritalaması ve 4) protein modifikasyon haritalamasıdır.

1) Mining bir örnekteki proteinlerinin tümünün (olabildiğince) tanımlanabilmesi çabasıdır.

Miningte işaret edilen ; genlerin ekspresyon datalarından (mikroaraylar gibi) çıkarılan

proteom dataları yerine direk olarak proteomu katologlamaktır. Mining proteomiksteki

“kaba kuvvet” çalışmalarının en sonudur. Basitce çözümlenmiş proteinler için geniş boyutta

olasılıklar vardır. MS kullanımı ve ilişkili databazlar ve softwarelerle ne bulunduğu

tanımlanabilir. Mining için çeşitli yaklaşımlar ve herbirinin avantajları mevcuttur.

2) Protein ekspresyon profilinde; organizmanın ya da hücrenin belirli bir durumdaki

(diferensiyasyon, gelişme durumu veya hastalık durumu gibi) ya da bir ilaç, kimyasal veya

fiziksel stimüle edici ile karşılaşmadaki fonksiyonu gibi belirli örneklerdeki proteinlerin

tanımlanmasıdır.

Şekil6 : Kütle spektrofotometre görüntüleri; rat beyninin enine kesitleri üzerinde ortalama

protein profilini çıkarmak için kullanılmıştır 15 lazer çekimi ve atomatik imajlama computer

algoritmaları kullanılarak tarama işlemi tamamlanmıştır. Beklendiği gibi bazı proteinlerin

çalışılan beyin bölgesine oldukça spesifik olduğu bulundu.

Ekspresyon profili aslında miningin özelleşmiş formudur. Yaygın olarak belirli bir sistemin

iki durumunun karşılaştırılmasında farklı analizler olarak uygulanabilir. Örneğin normal ve

hastalıklı hücre veya dokular bir durum diğeriyle karşılaştırılarak proteinlerin farklı

ekspresyonları belirlenebilir. Bu bilgiler hastalıklarda ilaç terapilerinin potansiyellerinin

tespiti anlamında müthiş bir çekiciliğe sahiptir.

Protein network, haritaları yaşayan sistemelerde hangi proteinlerin birbirleriyle etkileşimde

olduklarını belirleyen proteomiks yaklaşımlarıdır. Bir çok protein fonksiyonlarını diğer

proteinler ile etkileşimleriyle ortaya çıkarırlar. Bu etkileşimler, sinyal transdüksiyon yolu ve

kompleks biyosentetik veya degredasyon yolları gibi proteinlerin fonksiyonal networklerinin

fonksiyonlarını belirleyen etkileşimlerdir. Birçoğu bireylerle, pürifiye proteinlerle ve yeast

two hyprid sistemleri ile yapılan in vitro çalışmalarla elde edilen protein – protein

etkileşimlerinden öğrenilmiştir. Bununla birlikte proteomiks yaklaşımları analitik proteomiks

metodlarıyla birleşmiş afinite capture teknolojisinin yaratıcı çiftlerinin sayesinde daha

kompleks networklerin kurulmasının fırsatlarını sunmuştur. Proteomiks yaklaşımları çoklu

protein komplekslerinin kompenentlerinin tanımlanmasında kullanılmaktadır. Çoklu

kompleksler hücrede noktadan noktaya sinyal transdüksiyon yolunda devreye girmektedir.

Protein network profili bu yoldaki katılımcıların tümünün bir durumlarını hesap edebilmeyi

sağlar. Bunun gibi, protein network profillemesi proteomiksin gelecekteki uygulamalarında

potansiyel olarak bir güç sunmaktadır.

Protein modifikasyonlarının haritalanması, proteinlerin nasıl ve nerde modifiye olduklarının

belirlenmesi işidir. Birçok yaygın posttranslasyonel modifikasyon proteinlerin hedefleme,

yapı, fonksiyon ve turoverını yönetir. Buna ilaveten birçok çevresel kimyasal , ilaçlar endojen

kimyasallar reaktif elektrofillere yol açarak proteinleri modifiye ederler. Analitik yöntemlerin

çeşitliliği modifiye proteinler ve modifikasyonların doğasının tanımlanmasını geliştirdi.

Modifiye proteinler antibadiler ile (spesifik fosforlanmış aminoasid reziduoları için) tespit

edilebilir fakat spesifik modifikasyonun kesin sekans bölgesi sıklıkla bilinemez. Proteomiks

yaklaşımları posttranslasyonel modifikasyonların hem dağal hemde sekans spesifitelerini

sağlama anlamında en iyiyi sunar. Bir networkdeki regule olmuş proteinlerin modifikasyon

durumlarının simultene olarak karakterize edilmeleri için bu yaklaşımdaki genişleme yine

proteomiks teknolojisindeki kuvvetli bir gelişme ile sunulur. Bu yaklaşımlar proteomun

kimyasal modifikasyonlarının yaşayan sistemleri nası etkilediği sorusuna yaklaşımda yeni

yollar sunacaktır.