2016-10-15

1

Przeglądanie bibliotek

Czyli jak złapać (i sklonować) ciekawy gen?

Klonowanie genów w oparciu o identyczność lub podobieństwo ich sekwencji do znanego już DNA

Sonda homologiczna (komplementarna w 100%) umożliwia klonowanie:

Genomowego klonu, gdy posiadamy klon cDNA

Klonu cDNA lub genomowego pełnej długości gdy posiadamy tylko jego fragment

Sonda heterologiczna (o znaczącym udziale zasad komplementarnych) umożliwia klonowanie:

Tego samego genu (lub cDNA) z innego organizmu

Genu (lub cDNA) syntetycznym oligonukleotydem z sekwencją zdegenerowaną (opracowaną np. na podstawie sekw. białka)

Rodziny genów z tego samego lub innego organizmu

2016-10-15

2

Liczebność biblioteki do wysiania żeby coś znaleźć

Biblioteka genomowa Klonowanie fragmentów przy konstrukcji

biblioteki jest losowe - niektóre sekwencje klonują się kilkakrotnie, niektóre wcale

liczba niezależnych rekombinantów wchodzących w skład biblioteki musi być większa niż n = wielkość genomu / średnia wielkość insertu

dla prawdopodobieństwa 95% biblioteka musi liczyć 3 x n rekombinantów, dla 99% - 5 x n (genom człowieka)

powyższe szacunki zakładają równy udział całej sekwencji (zależy np. od metody izolacji i fragmentacji).

Biblioteka cDNA Liczebność zależy

od poziomu transkrypcji poszukiwanego genu – udział w puli cDNA

Biblioteka znormalizowana –zawiera wyrównane liczebności cDNA poszczególnych genów

Czynniki wpływające na zróżnicowaną ekspresję genów: różnice gatunkowe i odmianowe stadia rozwojowe organy tkanki warunki środowiskowe inne bodźce zewnętrzne stres mutacje i zmiany epigenetyczne

Klonowanie genów w oparciu o ich zmienną transkrypcję

2016-10-15

3

NA OKO I NA OŚLEP

Przeglądanie różnicowe (differential screening) - w stosunkowo dużym zbiorze klonów (biblioteka) wyszukiwanie pojedynczych klonów, które ulegają ekspresji tylko w jednej ze sprawdzanych tkanek (organizmie, stanie fizjologicznym)

Subtrakcja - subtraction (tworzenie biblioteki subtrachowanej) - masowe i automatyczne wzbogacanie zbioru klonów cDNA w te które ulegają ekspresji (występują) tylko w jednej ze sprawdzanych tkanek

= +

Szczegóły techniczne przeglądania różnicowego

Standardowe przeglądanie biblioteki:

może być zwykła biblioteka cDNA (z mRNA „+”): poszukiwanie głównie klonów indukowanych

wysiew biblioteki i odciski replik na filtrach

konstrukcja sond molekularnych „+” i „-” (cDNA) i hybrydyzacja

Cold plaque screening -„przeglądanie zimnych łysinek” (virtual subtraction):

biblioteka cDNA z mRNA „+”, nie trzeba replik odcisków

sonda z mRNA „-”

ciekawe są te łysinki, które nie hybrydyzują

- tyle sposobów ile bibliotek (albo i więcej)

2016-10-15

4

2016-10-15

5

Nowsze (nie znaczy, że lepsze) metody przeglądania różnicowego (c.d.)

Differential display (DD - RT PCR) i pochodne metody oparte o PCR

identyfikacja klonów na podstawie długości produktów RT - PCR z dwóch starterów

starter zakotwiczający (anchoring primer) - pierwsza nić cDNA, starter arbitralny - druga nić cDNA,

amplifikacja, rozdział na żelu (100-600bp) i wybór fragmentów,

reamplifikacja, subklonowanie i sprawdzanie

metody pochodne (bez startera zakotwiczającego, 1, 2 lub 3 arbitralne w 1 reakcji, adaptor + komplementarny primer zamiast arbitralnego)

cDNA-AFLP

Odwrotna transkrypcja i trawienie cDNA dwoma enzymami dającymi fragmenty w zakresie rozdzielczości żelu akrylamidowego

Doklejenie różnych adaptorów do różnych lepkich końców

identyfikacja klonów na podstawie długości produktów PCR ze starterów komplementarnych do adaptorów plus 2 zasady selektywne na końcu 3’: razem 4x4 [starter forward] x 4x4 [starter reverse] = 256 kombinacji

Transkryptom jest podzielony na max 256 podgrup

Differential Display – DD RT-PCR• starter zakotwiczający• starter arbitralny• brak podziału tkanek na tester i driver

2016-10-15

6

Wykonała mgr M. Święcicka - KGHiBR

2016-10-15

7

Metody oparte o sekwencjonowanie cDNA Ilość sekwencji pochodzących od transkryptów tego samego genu w jednej puli

cDNA może być porównana do drugiej puli cDNA

Metody oparte o masowe sekwencjonowanie cDNA RNA-Seq to też sekwencjonowanie cDNA

2016-10-15

8

Metody oparte o masowe sekwencjonowanie cDNA RNA-Seq to też sekwencjonowanie cDNA

Znajomość sekwencji pozwala oprócz analizy ilościowej (wzrost/spadek) pogrupować zidentyfikowane geny na kategorie (regulowane procesy, specyficzne kompartmenty czy rodziny genów). Np. analiza programem MapMan

16

Col0 lsd1(Col0)

Wykonał mgr Mateusz Matuszkiewicz KGHiBR

Obecność funkcjonalnego białka LSD1 zmienia reakcję korzeni na ataknicieni pasożytniczych.

2016-10-15

9

Metody oparte o analizę makro- i mikroukładówWymagają wcześniejszej znajomości i adnotacji większej ilości cDNAlub genomu danego organizmu

Produktem subtrakcji jest zbiór fragmentów, które po umieszczeniu w wektorze są biblioteką

Konwencjonalna biblioteka subtrachowana

dwie tkanki, dwie pule mRNA: „+” i „-”

synteza sscDNA „+” i hybrydyzacja z nadmiarem mRNA „-”

oddzielenie niezhybrydyzowanego sscDNA od dwuniciowych hybryd -teoretycznie tylko geny indukowane

synteza dscDNA i ligacjado wektora

Subtrakcja w oparciu o PCR –supression subtractive hybridization (SSH) i representational difference analysis (RDA)

synteza cDNA tester (+) i driver (-) możliwość amplifikacji pierwotnego

cDNA - mała ilość startowego mRNA

cięcie na krótsze fragmenty enzymem 4-ro tnącym

ligacja adaptorów do cDNA testera hybrydyzacja testera z driverem zagnieżdżony PCR (nested)

2016-10-15

10

2016-10-15

11

SSH – subtractive suppressionhybridization (supresyjnahybrydyzacja odejmująca)

TESTER – próbka badanaDRIVER – próbka kontrolna

PCR suppression by inverted terminal repeats

NIEDOGODNOŚCI

skrócenie sklonowanych fragmentów (degradacja, cięcie),

błędy PCR i innych polimeraz, subtrakcja daje „tylko”

wzbogacenie mieszaniny w specyficzne cząsteczki,

brak skutecznych w 100% metod masowego potwierdzania skuteczności strategii (że dane klony są istotnie specyficzne),

zmiany ilościowe często nieuchwytne,

trudno wyłowić gen ulegający alternatywnemu montażowi (alternative splicing),

większość metod umożliwia badanie zróżnicowanej ekspresji na poziomie transkrypcji,

zwykle żmudna, wieloetapowa i wielodniowa procedura.

2016-10-15

12

DEFINICJE

pfu (plaque forming unit) - jednostka tworząca łysinkę, najczęściej pojedynczy fag, ale nie zawsze.

Miano biblioteki - ilość pfu na jednostkę objętości (np. pfu/ml).

Jednostka aktywności enzymu (jednostka, unit- U) - taka ilość białka enzymatycznego, która strawi całkowicie 1 mg DNA dzikiego bakteriofaga lambda w ciągu 1 godziny w optymalnych warunkach (bufor, temperatura).