Ps-00 Reactii de Aglutinare

SPITALUL ORASENESC DR. VALER RUSSU LUDUSLABORATOR ANALIZE MEDICALE

PROCEDURA SPECIFICA

REACTII DE AGLUTINARE ASLO, PCR,FACTOR REUMATOID, RPR,

TPHA

Cod: PS-xx

Editia: 1/Revizia: 0Data intrarii in vigoare: Pagina: 1/19

CUPRINS:1.Scop2.Domeniu de aplicare3.Documente de referinta4.Definitii si abrevieri5.Responsabilitati6.Descrierea procedurii7.Inregistrari si anexe8.Istoricul editiilor/reviziilorLista difuzare-retragere

Elaborat Verificat AprobatNume : Dr. deac Liliana Dr. Deac Liliana Dr. oltean-Petri Ioan-

HadrianFunctia : Responsabil analiza Sef Laborator Manager Semnatura:Data: 23.09.2013 23.09.2013 23.09.2013


PROCEDURA SPECIFICA


TPHA

Cod: PS-xx


1. SCOP

Procedura are ca scop descrierea reactiilor de aglutinare a anticorpilor antistreptolizinei O, a factorului reumatoid din ser, a proteinei C – reactiva şi a responsabilităţilor personalului care execută şi verifică această analize.Procedura are ca scop descrierea metodei de determinarea calitativă a prezenței anticorpilor nespecifici non-treponemici (reagine) în ser prin tehnica RPR-carbon.Procedura are ca scop descrierea metodei de testare TPHA, precum si a responsabilitatilor personalului care executa si verifica aceasta analiza.

2. DOMENIU DE APLICARE

Procedura se aplică la efectuarea tuturor reactiilor de aglutinare a anticorpilor antistreptolizinei O, a factorului reumatoid din ser, a proteinei C – reactiva, determinarea calitativă a prezentei anticorpilor nespecifici non-treponemici (reagine) în ser prin tehnica RPR-carbon si la testarea TPHA a serurilor în Laboratorul analize medicale AL Spitalului Orasenesc dr. Valer Russu Ludus.

3. DOCUMENTE DE REFERINTA

3.1. SR EN ISO 15189:2007 – Laboratorare medicale. Cerinte particulare pen-tru calitate si competenta.

3.2. Brudaşcă I. Cristea, A. „Ghid de Laborator“, Ed. Medicală Universitară „Iuliu Haţieganu“, Cluj-Napoca, 2005.

3.3. Fischbach, F. „A Manual of Laboratory & Diagnostic Tests“- Fourth edition, J.B. Lippincott Company, Philadelphia, New York, London, Hagerstown, 1992.

3.4. Kondi, V. „Laboratorul clinic. Hematologie“, Ed. Medicală, Bucureşti, 1981

3.5. Prospectele kiturilor.

3.6. Tratat de …


PROCEDURA SPECIFICA


TPHA

Cod: PS-xx


4. DEFINITII SI ABREVIERI

4.1. DEFINITII

Consumabile - toate materialele folosite în cursul operării care trebuie schimbate sau reînnoite în mod regulat (vacutainere pentru VSH), etc.

Control intern de calitate – tehnici şi activităţi operaţionale din cadrul unui laborator care sunt folosite pentru a îndeplini cerinţele calităţii. Controlul intern are atât scopul de a monitoriza procesul de verificare a faptului că rezultatele măsurării sunt suficient de sigure pentru a fi eliberate, cât şi scopul de a elimina cauzele performanţelor nesatisfăcătoare.

Evaluarea externă a calităţii – determinarea performanţei măsurărilor efectuate în laborator cu ajutorul comparărilor inter-laboratoare.

Probă – unul sau mai multe eşantioane luate dintr-un sistem şi destinate obţinerii de informaţii cu privire la acel sistem.

Probă de laborator – probă primară sau sub-probă a acesteia preparată pentru a fi trimisă sau care a fost primită de laborator pentru a fi măsurată.

Repetare - comandă de efectuare a aceleiaşi analize autorizată de utilizator din diferite motive sau efectuată de aparat în mod automat prin creşterea sau scăderea diluţiei probei.

Test – operaţiune tehnică constând în determinarea uneia sau mai multor caracteristici ale unui produs, proces sau serviciu, în concordanţă cu o anumită procedură.

Aglutinare – adunare in grămezi

Antigen – particulă stăină organismului (microbiană, virală etc.) care odată introdusă în organism este capabilă să inducă formare de anticorpi.

Anticorp – răspunsul organismului (în scop de apărare) la introducerea unui stimul străin (antigen).

TPHA - este un test treponemic cu specificitate inalta, utilizat pentru confirmarea serurile reactive la VDRL / RPR.


PROCEDURA SPECIFICA


TPHA

Cod: PS-xx


Reactivi (kit) - substanţe chimice (în formă lichidă) care folosesc la determi-narea unei anumite analize. Toţi reactivii care folosesc pentru determinarea aceleiaşi analize sunt grupaţi în aceeaşi trusă (kit).

4.2. ABREVIERI

SL - Şef de Laborator

RC – Responsabilul Calităţii

SMC - Sistemul de management al calităţii

SIL – Sistemul informatic al laboratorului (programul de laborator şi reţeaua de calculatoare)

ASLO – Anticorpi antistreptolizina O

FR – Factor rheumatoid

PCR – Proteina C- reactiva

RPR – Rapid Plasma Reagin (test rapid pentru detecția reaginelor în ser sau plasmă)

VDRL – Veneral Disease Research Laboratory (test rapid pentru detecția reaginelor în ser sau plasmă) TPHA - Treponema Pallidum Haemaglutination; BFP - Biological Fals Positiv (Reactie biologica fals pozitiva);

T. pallidum – Treponema pallidum;

5. RESPONSABILITATI

5.1. Sef Laborator


PROCEDURA SPECIFICA


TPHA

Cod: PS-xx


o verifica modul de executie a analizei prin consultarea tuturor inregistrar-ilor emise sau efectuate in timpul si dupa executia analizelor medicale;

o in cazul unei executii necorepunzatoare a procedurii, va aplica procedura de controlul analizelor neconforme.

5.2. Responsabilul de Analiza

oexecuta analiza conform metodei descrise in prezenta procedura; respecta in-tocmai si in toate aspectele sale metoda de lucru;

oefectueaza toate inregistrarile privitoare la executia analizelor medicale in timp real;

oefectuează şi interpretează rezultatele controlului intern de calitate;osemnaleza SL cazul de analiza neconforma.

5.3. Executant

o analizează biletele de trimitere/ solicitările de analize;o recoltează probele biologice conform manualului de recoltare si în concor-

dantă cu cererea de analize;o numerotează probele recoltate cu un număr unic de identificare;o după terminarea programului de recoltare distribuie probele biologice în com-

partimentele corespunzătoare;

6. DESCRIERE PROCEDURA

6.1. Semnificatie clinica

Streptolizina este o hemolizina produsa de streptocoii de grup A. La pa-cientii infectati, streptolizina O actioneaza ca un antigen fata de care organismul dezvolta un raspuns umoral specific (antistreptolizina O = ASLO). Titrul ASLO incepe sa creasca la 1 saptamana dupa instalarea infectiei streptococice si atinge un maxim la 2–4 saptamani. In absenta complicatiilor sau a reinfectiei, titrul ASLO revine la normal dupa 6-12 saptamani.

Titrul ASLO este crescut in 80 - 85 % din cazurile de infectie streptococica A. Nivelul anticorpilor ASLO atinge valori foarte mari in reumatismul articular acut, de aceea titrurile persistent scazute pledeaza impotriva acestei afectiuni.


PROCEDURA SPECIFICA


TPHA

Cod: PS-xx


FR – factorii reumatoizi sunt imunoglobuline, in general de tip IgM, cu specificitate inalta fata de imunoglobulina – gama umana sau animala. La populatia sanatoasa, FR se gaseste in 3-5 % din cazuri in titruri joase. In cazul bolnavilor de ar-trita reumatoida, la 70 – 80 % este prezent in titru inalt, iar in osteoartrite si febra reumatica numai in 2 – 3 % se intalneste acest titru inalt. Poate apare si in alte boli – tbc pulmonar, lupus eritomatos, hepatita, sifilis – din care cauza pozitivitatea FR se poate aprecia numai impreuna cu alte date diagnostice.

Prezenta FR in serul bolnavilor care prezinta semne clinice corespunzatoare artritei reumatoide are valoare decisiva in precizarea diagnosticului. Determinarea semicantitativa a FR face posibil ca medicul sa poata aprecia evolutia bolii.

In functie de prezenta sau absenta factorului reumatoid, poliartrita reumatoida este clasificata in 2 categorii: seropozitiva sau seronegativa.

PCR (CRP) este o proteina neglicozilata cu structura pentamerica care mi-greaza electroforetic in apropierea zonei gamma. Este un reactant de faza acuta care creste rapid, dar nespecific, ca raspuns la leziuni tisulare si inflamatie, fiind un indicator mai sensibil si mai prompt decat VSH.

Rolul fiziologic al PCR este complex:oprintr-un mecanism dependent de calciu se leaga de reziduurile de fosforil –

colina ale multor fosfolipide si in special ale polizaharidului C pneumococic (de unde ii provine si numele);

ose leaga de cromatina si histone, avand rol in clearance – ul detritusurilor celu-lare;

oeste un factor major de opsonizare – se leaga de fagocite si accelereaza fago-citarea antigenelor si microorganismelor;

ose leaga de fractiunea C1q a complementului, determinand activarea comple-mentului pe calea clasica;

ose leaga de lipoproteinele LDL si detine probabil un rol in indepartarea acesto-ra de la nivelul placii aterosclerotice.

Desi principala sursa a PCR este ficatul, date recente indica faptul ca tesutul arterial poate produce atat PCR cat si proteine apartinand sistemului complementului. Nivelul PCR poate inregistra cresteri foarte mari (de 100 de ori sau chiar mai mult) dupa traumatisme severe, infectii bacteriene, inflamatii, interventii chirurgicale sau proliferari neoplazice.

PCR se poate pune in evidenta in infarctul miocardic acut si in numeroase boli maligne, mai ales in faza de metastaza.

● RPR Prezenta sau absenta reaginelor din proba analizata ajuta la diagnosticarea sifilisului. Un rezultat pozitiv cu un test nontreponemic cum este RPR, trebuie analizat si prin prisma unui test treponemic cum este TPHA, inainte de confirmarea infectiei.


PROCEDURA SPECIFICA


TPHA

Cod: PS-xx


Rezultate fals pozitive au fost raportate in anumite situatii cum ar fi dependenta de droguri, alte boli venerice, sarcina si postpartum, precum si boli autoimune. Diagnosticul clinic nu ar trebui sa se bazeze pe rezultatul unui singur test ci ar trebui sa integreze atat datele clinice, cat si pe cele furnizate de laborator.

TPHA este un test treponemic cu specificitate inalta, utilizat pentru confirmarea serurile reactive la VDRL/RPR:

- identifica anticorpii treponemici IgG si IgM ;- ca si pentru testele netreponemice, titrul variaza cu stadiul infectiei dar,

dupa o scadere spre stadiul tardiv, raman pozitive ani de zile (martor de infectie); - seroconversia se produce extrem de rar (exceptie, TPHA la pacienti HIV po-

zitiv, tratati); - nu se utilizeaza in urmarirea evolutiei bolii si dupa tratament (exceptie sifili-

sul congenital – 18-24 luni). Testul TPHA poate da reactii incrucisate cu alte forme de infectii treponemice

si de asemenea, s-au descris rezultate fals pozitive la unele cazuri de mononucleoza infectioasa, lepra, tuberculoza, boli autoimune, la persoane aparent sanatoase dupa viroze sau persoane care folosesc droguri.

6.2. Principiul determinării

Se foloseste metoda latex – imunoturbidimetrica.Particulele latex fac posibila observarea cu ochiul liber a reactiilor antigen –

anticorp. ASLO Daca serul de cercetat contine anticorpi antistreptolizina O, in cantitate

suficienta, acestea formeaza punti intre particulele de latex sensibilizate cu streptolizina O si suspensia isi pierde caracterul omogen, iar aglutinarea particulelor devine evidenta.

PCRDaca in produsul examinat cantitatea de proteina C reactiva atinge nivelul

necesar, intre particulele sensibilizate de latex se formeaza punti de antigen anticorp, suspensia isi pierde caracterul omogen si devine evidenta aglutinarea.

FRIn prezenta factorului reumatoid anticorpii antiimunoglobulinici produc punti

intre particulele de latex, suspensia isi pierde caracterul omogen, iar aglutinarea devine evidenta.


PROCEDURA SPECIFICA


TPHA

Cod: PS-xx


● RPR Treponema pallidum determină apariția a 2 tipuri de anticorpi: anticorpii diagnostici, reprezentați în principal de reagine, și anticorpii antitreponemici. Reaginele sunt induse de fracțiunea lipoproteică a Treponemei pallidum si sunt constituite din punct de vedere biochimic în special din IgM si ocazional din IgG.

RPR este un test de floculare care foloseste ca antigen cardiolipina, care are o structură chimică apropiată cu antigenii treponemici, cu adaus de colesterol si lecitină pentru cresterea sensibilitatii si a specificitatii si tratate cu microparticule de carbon pentru marirea diferentei vizuale între rezultatul pozitiv si negativ.

Astfel, dacă o picatură de ser pozitiv si o picătură de reactiv sunt amestecate pe suportul de test apar flocoane care sunt vizibile macroscopic, gratie particulelor de carbon.

Dacă reaginele nu sunt prezente în serul respectiv, flocularea nu se produce si lichidul este colorat în gri clar.

In prezenta anticorpilor pacientului fata de antigenele proprii de suprafata sau fata de antigene adsorbite pe membrana lor, hematiile aviare aglutineaza in retele caracteristice formate din complexe imune.

Anticorpii anti Treponema pallidum prezenti in serul uman produc aglutinarea eritrocitelor aviare sensibilizate cu un extract antigenic de Treponema pallidum. Ca martor sunt folosite hematii nesensibilizate (fara antigene treponemice).

In cazul reactiilor specifice, anticorpii treponemici din serurile de testat determina aglutinarea hematiilor aviare sensibilizate, intr-o retea caracteristica, iar hematiile nesensibilizate, neaglutinate, sedimenteaza sub forma unui buton compact pe fundul godeului de reactie.

6.3. Probe biologice primare

Proba biologica primara este sangele integral recoltat de catre asistentul de recoltare, in vacuete cu dop rosu (specific probelor pentru biochimie) de un volum in concordanta cu numarul si tipul analizelor ce trebuie executate pentru pacientul respectiv.

Prelucrarea probei primare se face in maximum 4 ore de la recoltare. Astfel centrifugarea probei primare (sange total) se face in decurs de maximum 3 ore, dar nu inainte de 30 de minute de la recoltare.


PROCEDURA SPECIFICA


TPHA

Cod: PS-xx


Serul se poate depozita: pentru ASLO – o saptamana la 20 – 80 C, iar congelat la - 200 C, o perioada

mai mare de timp; cu toate acestea se recomanda sa se efectueze determinarea pe probe proaspete.

pentru PCR si FR – 24 de ore la 20 – 80 C, iar congelat la - 200 C, o perioada mai mare de timp; se recomanda sa se efectueze determinarea pe probe proaspete.

pentru RPR pentru TPHA

6.4. Factori care pot influenta rezultatele

Interferente: hemoglobina pana la 20 g/l, bilirubina pana la 10 mg/dl, factorul reumatoid pana la 75 UI/ml si lipemia (trigliceride pana la 2500 mg/dl) nu interfera.

Pot apare reactii fals pozitive şi în: Mononucleoză; Lepră; Lupus eritematos; Malarie; Pneumonie virală.

Tehnica TPHA poate întâlni, rar, reacţii fals pozitive cu alte forme de infecţie treponemică sau mononucleoză infecţioasă, boli autoimune şi dependenţă de droguri.

Nu se folosesc seruri lipemice, icterice, hemolizate.

6.5. Echipamente si resurse

ASLO/FR– suspensie de latex sensibilizat cu streptolizina O/IgG uman in tampon

glicina – NaCl pH 8,6 concentrat;– ser fiziologic;– control pozitiv ;– control negativ ;– placi de unica folosinta / placa impartita in 6 campuri;– pipete serologice sau automate;– ceas de laborator, centrifuga.

PCRo reactiv PCR – latex;o tampon glicina – NaCl pH 8,6 concentrat;


PROCEDURA SPECIFICA


TPHA

Cod: PS-xx


o control ser pozitiv;o control ser negativ;o placa impartita in 6 campuri;o pipete de unica folosinta.

o pipeta automata de 20-200 µl;o varfuri galbene pentru pipeta automata;o microplaci cu fundul in U.

6.6. Reactivi, calibratori si materiale de control

Trusa de RPR-carbon contine reactiv (suspensie stabilizată de lipide si carbon), control pozitiv şi negativ, carduri test, beţişoare pentru amestecare, flacon şi ac de pipetare.

Trusa se va depozita la 2-8°C. Cardurile, betisoarele, flaconul si acul de pipetare pot fi pastrate la temperatura camerei.

Reactivul si controalele sunt stabile pana la data marcata pe eticheta daca recipientele sunt pastrate bine inchise si daca este prevenita contaminarea in timpul utilizarii lor. Indicii privind deteriorarea:

Reactiv: aglutinare vizibila in flacon. Controale: prezenta de particule.

PREPARAREA REACTIVILOR:

reactivul: agitati flaconul pana ce se obtine o suspensie omogena; montati acul pe flaconul de pipetare si aspirati cantitatea necesara de ractiv.

Controalele sunt gata de utilizare.

Controalele pozitiv (C+) si negativ (C-) trebuie testate impreuna cu probele pacientilor, pentru a verifica performantele testului. Controlul pozitiv (C+) trebuie sa produca o aglutinare clara si vizibila a particulelor de carbon. Controlul negativ (C-) nu trebuie sa produca aglutinarea particulelor de carbon.

TPHA Reactivi si controalele sunt incluse in kit. Avem 2 nivele de control: negativ si pozitiv.

Continutul Kitului de TPHA:


PROCEDURA SPECIFICA


TPHA

Cod: PS-xx


A.Celule sensibilizate. 2 x 7.5ml. Suspensie stabilizata de eritrocite aviare sen-sibilizate cu antigen de T.Pallidum, azida de sodiu 0.95 g/l.

B.Celule de control. 2 x 7.5ml. Suspensie stabilizata de eritrocite aviare, azida de sodiu 0.95 g/l.

C-. Control negativ. 1 ml ser, azida de sodiu 0.95 g/l.C+.Control pozitiv. 1 ml ser animal imun, azida de sodiu 0.95 g/l.D.Reactiv. 40 ml.Tampon salin fosfat, pH 7.2, extract de T.Pallidum (Reiter),

azida de sodiu 0.95 g/l.

Kitul se depoziteaza la 2-8ºC. Flacoanele trebuie depozitate in pozitie vertica-la, altfel exista posibilitatea formarii agragatelor celulare. Suspensiile de celulele si controalele sunt stabile pana la data marcata pe eticheta daca recipientele sunt pas-trate bine inchise si daca este prevenita contaminarea in timpul utilizarii lor.

Indicii privind deteriorarea reactivilor : celulele : aglutinare vizibila in flacon. reactiv si controale : prezenta de particule.

Prepararea reactivilor :Reactivii A si B : se agita flaconul pana se obtine o suspensie omogena.Reactivul si controalele sunt gata de utilizare.

6.7. Testare

ASLOo se lasa reactivii sa ajunga la temperatura camerei;o se omogenizeaza reactivul latex prin agitare usoara;o in cercul trasat pe lama se pune o picatura (50 µl) din serul de

cercetat nediluat;o se pune o picatura de reactiv latex peste picatura de ser aflata pe

placa;o se amesteca cele doua picaturi cu capatul plat al pipetei astfel incat

sa acopere toata suprafata cercului;o se roteste exact 2 minute;o se urmareste aparitia sau absenta aglutinarii;o citirea se efectueaza in doua minute dupa incetarea rotirii lamei.

PCR / FR- se lasa reactivii sa ajunga la temperatura camerei;- se omogenizeaza reactivul latex prin agitare usoara;


PROCEDURA SPECIFICA


TPHA

Cod: PS-xx


- reactivul din picurator se impinge inapoi de doua ori, apoi se umple din nou picuratorul;o se pune o picatura (50 µl) din serul de cercetat nediluat;o se pune o picatura de reactiv latex peste picatura de ser aflata pe

placa;o se amesteca cele doua picaturi cu capatul plat al pipetei astfel incat

sa acopere toata suprafata cercului;o se roteste lama manual timp de 2 minute;o se urmareste aparitia sau absenta aglutinarii;o citirea se efectueaza in 3 minute dupa incetarea rotirii lamei.

Evaluarea de dupa uscarea picaturii da rezultate eronate, pentru toate determinarile. La fiecare serie de determinari se vor lucra controalele (pozitiv si negativ).

Pentru a lucra testul RPR-carbon se parcurg umătorii paşi:

1. Aduceti reactivii si probele la temperatura camerei.

2. Plasati 50 µl de proba si cate o picatura din fiecare control in cercuri separate pe suprafata cardului de test.

3. Agitati usor flaconul de pipetare ce contine reactiv. Atasati acul de pipetare pe gura flaconului. Inversati flaconul cu acul atasat si presati-l usor pentru a elimina bulele de aer ramase in interiorul acului.

4. Plasati acul in pozitie verticala deasupra cardului de test si adaugati o picatura de reactiv in fiecare cerc, langa picatura de proba ce urmeaza a fi testata.

5. Amestecati cele doua picaturi cu betisoarele de unica folosinta furnizate, distribuind amestecul pe intreaga suprafata a cercului (nu depasiti marginea). Utilizati cate un betisor pentru fiecare proba.

6. Rotiti cardurile timp de 8 minute.

7. Se citeşte rezultatul la terminarea celor 8 min.

TPHA Se foloseşte ser proaspăt de pacient. Serul poate fi depozitat la 2-8ºC timp de 5 zile. Pentru perioade mai lungi, eşantioanele de ser trebuie îngheţate la – 20ºC.

Controlul calităţii kitului:


PROCEDURA SPECIFICA


TPHA

Cod: PS-xx


Înainte de a realiza un set de determinări se recomandă testarea reactivilor cu fiecare dintre controalele incluse în kit, urmărind paşii menţionaţi în secţiunea corespunzătoare. Dacă nu se obţin rezultatele aşteptate, nu se va introduce kitul in lucru.

Utilizarea controalelor pozitiv si negativ:Controalele pozitiv si negativ furnizate in kit, trebuie testate impreuna cu

probele pacientilor, pentru a verifica performantele testului, luând în considerare că aceştia sunt prediluaţi la 1:20. Se adaugă 25 µl din fiecare reactiv de control direct în godeurile 3 şi 4. Nu se adaugă nici o soluţie de diluare.

Controlul pozitiv trebuie să prezinte aglutinare clara si vizibila cu celulele sensibilizate A dar nu si cu cele B în testul calitativ şi o reacţie pozitivă la titrul menţionat în prospect ± o diluare dublată în testul cantitativ.

Controlul negativ nu trebuie să prezinte aglutinare cu niciuna din tipurile de celule.

Se pun separat controalele, in godeul 1si 2 contol negativ si in 3 si 4 control pozitiv.

Se adauga apoi in godeurile 1 si 3 reactiv de control si in godeurile 2 si 4 reactiv antigen.

Testul calitativ: Se aduc reactivii la temperatura camerei, asigurându-se că antigenul şi

reactivii de control sunt complet resuspendaţi. Fiecare test necesită 4 godeuri, 2 din ele vor fi folosite pentru a dilua proba.

- Se adaugă 25 µl de diluent în godeul 1; 100 µl în godeul 2 şi câte 25 µl în godeurile 3 şi 4;

- Se adaugă 25 µl de probă (ser) în godeul 1. Se amestecă conţinutul godeului 1 şi se transferă 25 µl în godeul 2. Se amestecă şi se transferă 25 µl din godeul 2 în godeul 3, se amestecă şi se descarcă 25 µl din godeul 3;

- În continuare se transferă 25 µl din godeul 2 în 4, se amestecă şi se descarcă 25 µl din godeul 4;

- Se adaugă 75 µl de reactiv control în godeul 3 şi 75 µl de reactiv antigenic în godeul 4;

- Se amestecă conţinutul din godeuri prin rotire manuală pe o suprafaţă plană timp de 30 secunde;

- Se acoperă placa şi se incubează 45 minute la temperatura camerei, pe o masa de lucru plana, ferita de vibratii;

- După expirarea timpului se citesc rezultatele.

Testul cantitativ:


PROCEDURA SPECIFICA


TPHA

Cod: PS-xx


Fiecare test necesită 8 godeuri. Se foloseşte ser uman diluat 1:10 preparat iniţial pentru testul calitativ (1 parte ser uman, 9 părţi ser fiziologic 0,9%).

-Se adaugă 25 µl de diluent în godeurile1 si apoi 3-12-In godeul 2 se pune 100µl de diluent -Se amesteca 25µl de ser in primul godeu si se transfera in al doilea,apoi se

amesteca si 25µl de amestec se trasnsfera in al treilea iar de aici se arunca 25µl amestec.

-Se preia 25µl de amestec din godeul 2 si se tranfera in al 4 lea,si apoi se continua dilutiile binare,in godeurile 5-12

-Se adaugă 75 µl de reactiv de control in godeul 3-Se adauga 75 µl reactiv antigen in godeurile 4-12-Se amestecă conţinuturile din godeuri prin agitare uşoară pe o suprafaţă

plană timp de 30 secunde; -Se acopera placa şi se incubează 60 min. la temperatura camerei; dupa

expirarea timpului se citesc rezultatele.

La fiecare serie de pacienti pentru testat, se efectueaza controlul negativ si pozitiv.Controlul pozitiv trebuie să prezinte aglutinare clara si vizibila cu celulele sensibilizate A dar nu si cu cele B în testul calitativ şi o reacţie pozitivă la titrul menţionat în prospect ± o diluare dublată în testul cantitativ.Controlul negativ nu trebuie să prezinte aglutinare cu niciuna din tipurile de celule.Orice aglutinare observata cu celulele de control B reprezinta aglutinare nespecifica. O proba de acest fel nu poate fi testata cu acest kit.

6.8. Evaluare externa a calitatii

Se face conform programului de comparări interlaboratoare al organizatorului de schemă stabilit anual.

6.9. SPECIFICATII DE PERFORMANTA

TPHA Metoda are o sensibilitate analitica echivalenta cu aceea observata cand se utilizeaza WHO Reference Serun for Diagnostic Test for Treponemal Infections.

6.10. Rezultate

RPR


PROCEDURA SPECIFICA


TPHA

Cod: PS-xx


Rezultatele testului: Aglutinare = reacție pozitivă; Lipsa aglutinării = recție negativă

Citirea se face imediat după trecerea celor 8 min. de agitare, cu ochiul liber, de preferat în lumină naturală.

Rezultatul negativ apare ca un punct format din microparticule de carbon concentrate în mijlocul cercului de testare, sau ca o suspensie omogenă în tot cercul de testare.

Rezultatul slab pozitiv este caracterizat de o concentrare de agregate fine înconjurată de o zonă difuză de agregate fine negre.

Rezultatul pozitiv este caracterizat de prezenţa agregatelor negre răspândite generalizat pe toată suprafaţa cercului de testare.

TPHACitirea rezultatelor:

Se examineaza prezenta si modul in care s-a produs aglutinarea celulelor. Se compara modul de aglutinare observat in godeurile ce contin celule sensibilizate cu modul de aglutinare observat in godeurile ce contin celule de control.

Controlul negativ nu trebuie să prezinte aglutinare cu niciuna din tipurile de celule.

Controlul pozitiv trebuie să prezinte aglutinare clara si vizibila cu celulele sensibilizate A dar nu si cu cele B în testul calitativ şi o reacţie pozitivă la titrul menţionat în prospect ± o diluare dublată în testul cantitativ.

Testul calitativ:

Un rezultat pozitiv indică prezenţa anticorpilor de Treponema pallidum dintr-o infecţie trecută sau prezentă.

Un rezultat negativ indică absenţa anticorpilor de Treponema pallidum. Un rezultat dubios (la limită) poate corespunde unui nivel scăzut de anticorpi

în fazele timpurii de sifilis sau a unor anticorpi reziduali în sifilisul tratat. În acest


PROCEDURA SPECIFICA


TPHA

Cod: PS-xx


caz, o altă probă ar trebui testată pentru a demonstra o creştere a titrului de anticorpi.

6.11.Interval biologic de referinta

VDRL – NEGATIV

Tabel pentru aprecierea rezultatelor TPHA calitativ.

Grad de aglutinare Citire Interpretare

Strat neted de celule ce acopera complet fundul godeului 4+

Pozitiv - prezenti anticorpi T. Pallidum= infectie activa sau in antecedente

Strat neted de celule ce acopera partial fundul godeului

3+Pozitiv

Reteaua de glutinare este inconjurata de un inel de hematii

2+Pozitiv

Reteaua de glutinare de diametru redus, inconjurata de un inel gros de hematii

1+Pozitiv

Buton de hematii cu o deschidere in centru

+/- La limita - nivel de anticorpi scazut sau rezidual (se repeta)

Buton de hematii cu/fara o foarte mica gaura in centru -

Negativ - absenti anticorpi T. pallidum

Testul cantitativ:

Titrul aproximativ este dat de cea mai mare diluţie în godeul în care apare o reacţie pozitivă.

6.12.Raportarea rezultatelor

Rezultatele analizelor sunt introduse manual în SIL.


PROCEDURA SPECIFICA


TPHA

Cod: PS-xx


După introducerea în SIL, rezultatele sunt verificate de catre SL prin sondaj. Rezultatele sunt raportate pe Buletine de analize medicale.Acest buletin este autorizat a fi eliberat de către SL, care poate adăuga şi observaţii sau recomandări cu privire la aceste rezultate.

TPHA Rezultatele se inscriu pe Lista de lucru zilnica apoi se introduc manual, in SIL, unde sunt validate de catre RA si listate.

Rezultat negativ pentru testarile calitative: negativ.

Rezultat pozitiv pentru testarile calitative: pozitiv (+/++/+++/++++).

Rezultat pozitiv pentru testari semicantitative: pozitiv la dilutia 1/80 sau 1/160,1/320,1/640,1/1280,1/2560,1/5120,1/10240,1/20480 (gradul dilutiei la care inca este pozitiv).

6.13.Siguranta, precautii si consideratii privind mediul

Probele trebuie manipulate ca fiind potenţial infecţioase (nivel II de biosecuritate).

Personalul implicat în efectuarea analizelor trebuie să ţină seama de următoarele aspecte referitoare la securitate şi protecţie:

o Se foloseşte echipament de protecţie (mănuşi şi halate) în timpul lucrului.

o Nu se mănâncă, nu se bea şi nu se fumează în camera de lucru.

o Se evită contactul sângelui cu pielea şi cu mucoasele.

7. INREGISTRARI SI ANEXE

7.1. INREGISTRARI

7.1.1.Lista de lucru zilnica

7.1.2.Registru calibrari si control intern

7.1.3.Registru control extern

7.2. ANEXE


PROCEDURA SPECIFICA


TPHA

Cod: PS-xx


N/A

8. ISTORICUL EDITIILOR/REVIZIILOR

Editia/Revizia

Data editiei/Reviziei

Descrierea modificarii

Nume si prenume

Elaborat Verificat

Aprobat

1/0 23.09.2013 Prima aparitie Dr. Deac Liliana

RA

Dr. Deac

Liliana SL

Dr. Oltean-Petria Ioan-

HadrianMA


PROCEDURA SPECIFICA


TPHA

Cod: PS-xx


LISTA DIFUZARE - RETRAGERE

Cod document

Editia/Revizia

Copia nr. Difuzare Retragere

Nume Prenume/ Functia

Semnatura/Data

Nume Prenume/ Functia

Semnatura/Data

PS-xx 1/0 1 ???

PS-xx 1/0 RENAR N/A

Documents

Ps-00 Reactii de Aglutinare