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8/7/2019 Purificacin protica
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Fase de cultivo celular
Pregunta 1: Se hicieron dos cultivos, uno partiendo de
unacolonia no fluorescente, y otra fluorescente; qu se trata
dedemostrar haciendo esto?
Se demuestra as la funcin de la arabinosa, que activa la
sntesisde la protena GFP.
Pregunta 2: Qu papel cumplen en el proceso de clonacin
eliluminador UV, la estufa de incubacin y la agitacin mecnica
antesy durante la incubacin?
1. El iluminador se usa para seguir el rastro continuamente de
lascolonias fluorescentes (que lo son en longitudes de onda
deUV).
2. La estufa de incubacin, como tal, permite obtener
mejorescondiciones de incubacin de las colonias bacterianas.
3. La agitacin mecnica, se emplea para homogeneizar
lamuestra.
Pregunta 3: Para que se hacen crecer las bacterias en
caldonutritivo previamente a hacer la purificacin?
Para tener un crecimiento mayor de las bacterias.
Fase de concentracin celular y lisis
Pregunta 1: Indica el papel en esta fase del protocolo de
laultracentrfuga, la lisozima y el congelador.
La ultracentrfuga sirve para precipitar todas las bacterias
ensuspensin, para poder decantar posteriormente. La lisozima
sirvepara la digestin enzimtica de la pared bacteriana, mientras
que elcongelador se emplea para la rotura completa de la
bacteria.
Pregunta 2: Por qu eliminamos el sobrenadante despus de
laprimera centrifugacin?
Para tener una mayor concentracin protica.
Pregunta 3: Cmo puede la congelacin romper las
membranascelulares?
Mediante la formacin de cristales tras la digestin con la
lisozima.
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Pregunta 4: Cul es el propsito de lisar las bacterias?
Conseguir la extraccin de la protena que contiene la
bacteria.
Pregunta 5: Qu color tiene el concentrado celular? Qu
colordebera tener el sobranadante? Interpreta los resultados.
El color del concentrado ha de ser fluorescente, pues es
quiencontiene el gen GPF, mientra sque el sobrenadante no presenta
color(no se ha producido la lisis de las clulas).
Pregunta 6: Por qu eliminamos el concentrado celular en estafase
del procedimiento?
Fase de cromatografa
Pregunta 1: Describe brevemente el proceso de cromatografapor
interaccin hidrofbica. Relaciona la expliacin con el casoconcreto
de purificacin de esta prctica.
Este tipo de cromatografa separa las protenas en base a
suhidrofobicidad superficial, y se caracteriza por la adsorcin de
las
biomolculas a la superficie dbilmente hidrofbica de la resina
enuna solucin fuertemente salina y su posterior elucin mediante
ungradiente salino negativo.
Pregunta 2: Cubre la siguiente tabla indicando las
observacionesrealizadas despus de correr los tres tampones de
cromatografa.
Tubo de recogida Prediccin Observacin bajo luzUV (columna e
tubo)
#1 Sin color Sin color / color verde#2 Sin color Sin color /
color verde
#3 Con color verde Color verde / sin color
Pregunta 3: Teniendo en cuenta los resultados, indica el
papelde:
El tampn de equilibrado: estabilizar los cationes y aniones enla
columna de intercambio catdico.
El tampn de unin:
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El tampn de lavado: arrastra los restos que quedan en
lacolumna.
El tampn de elucin (TE): ayuda en la elucin de las protenas.
Pregunta 4: Qu tampones tienen concentracin salina mayor ycual
menor? Qu se puede decir sobre el papel de la salinidad?
Los primeros tienen mayor concentracin. La salinidad de
lasuperficie hidrofbica permite una mayor elucin al disminuir
laconcentracin de la sal en el tampn
