Quantifizierung prostataspezifischer

Transkripte in regionären Lymphknoten

von Patienten mit Prostatakarzinom

U. Fiedler, R. Kranz, J. Herrmann, A. Manseck, M. P. Wirth

Klinik und Poliklinik für Urologie, TU-Dresden

Einleitung

Die reverse Transkriptase Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) ist eine Technik, mit der die Expression spezifischer Gene mit sehr hoher Sensitivität und Spezifität nachgewiesen werden kann. Bei Prostatakarzinom (PCa)-Patienten sind die regionären Lymphknoten primäre Ansiedlungsorte metastasierender Tumorzellen. Eine Metastasierung der Lymph-knoten kann derzeit nur histopathologisch abgeklärt werden. Ziel der Studie ist es, mittels qualitativer oder quantitativer RT-PCR-Analysen für ausgewählte prostataspezifische Marker einen sensitiveren Nachweis für disseminierte Tumorzellen in regionären Lymphknoten zu entwickeln. Im Ergebnis dieser Studie und im Rahmen von Nachsorgeuntersuchungen könnten Schwell-werte für die einzelnen Marker bestimmt wer-den, die auf eine Metastasierung bzw. ein schlechte Prognose hinweisen. Als Marker wurden das prostataspezifische Antigen (PSA) und zwei Splice-Varianten des prostata-spezifischen Membranantigens PSM und PSM’ verwendet.

Patienten und MethodeVon 60 Prostatakarzinom-Patienten, die sich einer radikalen Prostatektomie unterzogen, wurden 2-6 regionäre Lymphknoten entnommen. Eine Gewebehälfte wurde pathologisch begutachtet, von der anderen wurde RNA isoliert. Eventuell noch vorhandene DNA wurde mittels DNase I entfernt und jeweils 4 µg RNA in cDNA umgeschrieben. Diese cDNA (jeweils 2 µl) diente als Ausgangsmaterial für die PCR-Analysen.Die PCR’s wurde mit den Primern für das house keeping Enzym GAPDH durchgeführt, um die Qualität der cDNA sowie deren Menge für die quantifizierenden Analysen zu bestimmen. Mit 60 Patienten wurden qualitative PCR-Analysen durchgeführt (Block-Cycler PCR, Produkt-Analyse im Agarosegel). 57 Patienten gingen in die quanti-fizierenden PCR-Analysen mit dem Light-Cycler der Firma Roche ein. Dabei wurden externe Stan-dards (Plasmid mit klonierten PCR-Produkten) für die Quantifizierung und spezifische Hybridisie-rungsproben für den Nachweis der PCR-Produkte verwendet. Die Menge an spezifischen Trans-kripten wurde auf eine durchschnittliche GAPDH-Transkriptmenge pro µg Gesamt-RNA bezogen.

SchlußfolgerungenWährend mit den qualitativen RT-PCR’s nur eine ja/nein-Aussage bzgl. des Vorhandenseins von spezifischen Transkripten getroffen werden kann, ermöglichen die quantitativen RT-PCR-Analysen mit dem Light-Cycler einen sehr sensitiven und spezifischen Nachweis unter Angabe der ge-nauen Transkriptmengen. Durch Auswertung des follow up’s könnten dadurch erstmalig Schwell-werte für die einzelnen Transkripte bestimmt werden, die für eine Metastasierung bedeutend sind. Für eine Verbesserung gegenüber der histopathologischen Begutachtung scheint die quantitative Bestimmung aller drei Marker not-wendig, speziell dann, wenn es sich um vorbe-handelte Patienten handelt.

10,0

0,1

1,0

4619 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45

Probe Konz. Cros.Pkt.

WasserStandard 100 pg 17,9Standard 10 pg 21,8Standard 1 pg 25,8Standard 100 fg 30,1Pos. 1:10 22,5Pos. 1:100 25,9

GAPDH-Standards l

og

F2/

F1

Flu

ore

szen

z

Anzahl der Zyklen

31

17

18

19

20

21

22

23

24

25

26

27

28

29

30

5.02.0 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 2.6 2.7 2.8 2.9 3.0 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 3.9 4.0 4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 4.6 4.7 4.8 4.9

log Zyklenzahl

cro

ssin

g p

oin

ts

Crossing points

Lineare Regression

unbekannte Konzentration

GAPDH-Standardkurve

Die Transkriptmengen wurden auf 1 µg gesamt-RNA und einen

einheitlichen GAPDH-Wert bezogen. Die angegebenen Mittelwerte

wurden aus allen Werten einschließlich der Nullwerte ermittelt.

LK: Lymphknoten

TK: Transkriptmengen

vb: hormonell vorbehandelt

Übersicht der positiven quantitativen Lymphknoten PCR‘s

ErgebnisseDie qualitativen RT-PCR-Analysen brachten hin-sichtlich des Markers PSA keine Verbesserung gegenüber der histopathologischen Untersu-chung. Besonders bei vorbehandelten N+-Pa-tienten konnte nicht immer ein PSA-Signal er-halten werden. PSM-Transkripte wurden in fast allen (57/60) und PSM’-Transkripte in 37/60 Pa-tienten nachgewiesen. Mit den quantitativen Analysen wurden in allen Lymphknoten PSA-Transkripte, in allen N+ und in 35/40 N0 PSM-Transkripte sowie in 10/14 N+ und 9/40 N0-Patienten PSM’-Transkripte festgestellt. Die Menge an PSA-Transkripten betrug in N+-Patienten durchschnittlich 1,7xE106/µg RNA und sank bei hormonell vorbehandelten N+-Patienten auf 1,4xE105. Dagegen sank die Menge an PSM und PSM‘-Transkripten in N+-Patienten bei Vor-behandlung nur geringfügig von 1,0xE106 bzw. 2,6x10E6 auf 8,3xE105 bzw. 1,8x10E6. Die PSA und PSM’-Bestimmungen ergaben, daß N+-Pa-tienten durchschnittlich 4,5-5 mal mehr Trans-kripte als N0-Patienten haben.

Quantitative PCR-Analytik

Übersicht der positiven qualitativen Lymphknoten PCR‘s

Bestimmung der Transkriptmengen in den Lymphknoten

Tab. 1: Übersicht der positiven qualitativen Lymphknoten PCR‘s.

PSA-Analysen

Probe Konz. Cros. pt.

WasserStandard 10 pg 17,0Standard 1 pg 20,6Standard 100 fg 24,3Standard 10 fg 27,91 21,42 18,53 20,34 21,85 21,46 21,27 21,48 32,8

10,0

0,1

1,0

4619 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45

1 2 3 4 5 6 7 8 M

Vergleich der quantitativen (Light-Cycler) und qualitativen (Agarosegel) PCR-Analysen für den Marker PSA.

log

F2/

F1

Anzahl der Zyklen

PSM-Analysen

1 2 3 4 5 6 7 8 M

Probe Konz. Cros. pt.

WasserStandard 100 pg 19,8Standard 10 pg 23,6Standard 100 fg 27,51 27,92 25,43 23,84 21,85 25,16 21,67 25,78 35,9

10,0

0,1

1,0

4621 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45

Vergleich der quantitativen (Light-Cycler) und qualitativen(Agarosegel) PCR-Analysen für den Marker PSM.

log

F2/

F1

Anzahl der Zyklen

n

GAPDH-

PCR+

n

PSA-

PCR+

PSA-TK

n

PSM-

PCR +

PSM-TK

n

PSM‘-

PCR +

PSM‘-TK

PCa

N1

13 13/13 19/19 LK

1,7 x 10E6

13/13 17/19

1,0 x 10E6

8/13 9/19

2,6 x 10E6

vb

PCa

N1

4 4/4 10/10 LK

1,4 x 10E5

4/4 10/10

8,3 x 10E5

2/4 4/10

1,8 x 10E6

PCa

N0

29 29/29 44/46 LK

3,8 x 10E5

24/29 33/46

5,5 x 10E5

8/29 11/46

5,3 x 10E5

vb

PCa

N0

11 11/11 18/18 LK

5,7 x 10E5

9/11 13/18

7,0 x 10E5

1/11 2/18

2,9 x 10E5