QUIMOTRIPSINA (ISIS, PAULINA, THALIA, CYNTHIA JAZMÍN)

Quimotripsina

Isis Avedoy Cortz; Alicia Paulina Crdenas Castro; Nitzia Thala Flores Jimnez; Cynthia Jazmn Lpez Monten. 1

INSTITUTO TECNOLGICO

DE TEPIC

DEPARTAMENTO DE INGENIERA QUMICA Y BIOQUMICA

CINTICA QUMICA BIOLGICA

UNIDAD 4: CINTICA ENZIMTICA.

QUIMOTRIPSINA

PRESENTA:

AVEDOY CORTZ ISIS.

CRDENAS CASTRO ALICIA PAULINA.

FLORES JIMNEZ NITZIA THALA.

LPEZ MONTEN CYNTHIA JAZMN.

M.C. SALVADOR YUNIOR AGUILAR RAMREZ.

Quimotripsina


INTRODUCCIN

Las enzimas son catalizadores especficos que participan y tiene vital importancia

en la regulacin qumica de las clulas y los organismos. La catlisis es esencial

para hacer que muchas reacciones bioqumicas y biolgicas de importancia crucial

se produzcan en condiciones fisiolgicas a velocidades tiles y de la manera

correcta.

La vida aprovecha hbilmente el hecho de que la mayora de las reacciones deban

estar catalizadas. En el complejo medio de la clula, hay innumerables reacciones

posibles entre las molculas. La clula se aprovecha de la catlisis especfica para

canalizar las sustancias hacia rutas que sean tiles en vez de reacciones

colaterales despilfarradoras.

Las enzimas son, entonces, unas molculas esenciales para la buena salud

producidas por el cuerpo. A cada instante millones de ellas trabajan en el

organismo para que podamos respirar, saltar o comer. Un grupo muy importante

de enzimas son las digestivas ya que favorecen la digestin y absorcin de los

nutrientes a partir de los alimentos que ingerimos. El pncreas tambin participa

en la digestin y absorcin de los alimentos mediante la secrecin de enzimas al

intestino conocidas como las enzimas pancreticas.

En la degradacin de protenas, en el aparato digestivo de mamferos y de otros

organismos, participan un cierto nmero de enzimas proteolticos1. Una de estas

enzimas es la quimotripsina; esta es una enzima digestiva (proteasa pancretica)

que rompe selectivamente los enlaces peptdicos contiguos al extremo carboxilo

de aminocidos hidrofbicos voluminosos, como triptfano, tirosina, fenilalanina y

metionina.

La quimotripsina es secretada por el pncreas como un precursor inactivo llamado

quimotripsingeno, el cual forma parte del jugo pancretico. El quimotripsingeno

(quimotripsina inactiva) es enviado a travs del ducto pancretico al duodeno

(intestino delgado) donde es activado como quimotripsina.

Quimotripsina


Esto ltimo es una de las caractersticas ms interesantes de esta enzima y es tan

slo un poco del amplio estudio que se le ha hecho a la quimotripsina.

Quimotripsina


CLASIFICACIN

Para comenzar con la amplia descripcin de la quimotripsina es necesario primero

conocer la clasificacin de esta enzima; las enzimas se clasifican de manera

general en seis grupos; en la figura 1 se muestra dicha clasificacin. El grupo al

que pertenece la quimotripsina se presenta (desglosa) en el diagrama 1.

Figura 1: Resumen de las Clases enzimticas y de las principales Subclases (Devlin, 2004).

Diagrama 1: Clasificacin de la quimotripsina.

Hidrolasas

Su accin consiste en transferir el grupo escindido del sustrato al hidroxilo del agua.

Peptidasas2 (Proteasas)

Enzimas que hidrolizan enlaces peptdicos.

Serina Proteasas

Se sintetizan en una forma inactiva denominada zimgeno. Pertenece a este grupo la quimotripsina.

Quimotripsina


Serina proteasas.

Para introducir al grupo de las serina proteasas, el porqu de su denominacin es

importante.

Se denominan serina porque tiene un mecanismo cataltico comn caracterizado

por la posesin de un residuo Ser peculiarmente reactivo que es esencial para su

actividad enzimtica. Las serina proteasas constituyen la familia de enzimas

comprendida en su totalidad como resultado de su examen extenso en un perodo

de casi 50 aos por tcnicas cinticas, qumicas, fsicas y genricas (Voet, 2006).

Estas enzimas se denominan proteasas porque catalizan la hidrlisis de los

enlaces peptdicos en los polipptidos y las protenas. Cada una de las serina

proteasas corta preferentemente una cadena polipeptdica en el lado carboxilo de

aminocidos especficos. Las serina proteasas hidrolizan tambin una amplia

gama de steres, hecho este que tiene poca importancia fisiolgica, pero que los

bioqumicos utilizan en los estudios cinticos. La mayora de las serina proteasas

tienen unas estructuras tridimensionales semejantes y una relacin evolutiva

evidente. Las regiones del lugar activo de todas las serina proteasas tienen

diversos factores comunes. En concreto, siempre existe un residuo de aspartato,

un residuo de histidina y un residuo de serina agrupados alrededor de la depresin

del lugar activo. Una cuarta caracterstica del lugar activo difiere de una serina

proteasa a otra. Se trata de un bolsillo que est situado siempre cerca de la

serina del lugar activo. Es la naturaleza de este bolsillo lo que le da a cada serina

proteasa su especificidad (Mathews, 2009).

Algunos miembros de la familia de las serina proteasas son la tripsina, una enzima

digestiva; la trombina, una enzima de la coagulacin y la quimotripsina, la cual,

posee un significado adicional como miembro de una familia importante de

protenas (Stryer, 1995).

Quimotripsina.

Quimotripsina


La quimotripsina es un enzima digestivo de 25 kD. El papel biolgico de la

quimotripsina consiste en catalizar la hidrlisis de protenas en el intestino

delgado.

CARACTERSTICAS DE LA ENZIMA.

La quimotripsina est constituida por tres cadenas polipeptdicas conectadas

mediante dos puentes disulfuro intercatenario3. La estructura tridimensional del

enzima fue resuelta por David Blow con una resolucin de 2 (figura 2). La

molcula es un elipsoide compacto de dimensiones 51 x 40 x 40 . La

quimotripsina contiene varias regiones de hojas plegadas antiparalelas y unas

pocas de hlice . Los residuos que se encuentran en la quimotripsina

(caractersticas de las serina proteasas) son: Asp 102, His 57 y Ser 195 (figura 3).

Figura 2: Estructura tridimensional

de la quimotripsina. Los residuos

catalticamente importantes se

sealan en color.

La quimotripsina es selectiva para los enlaces peptdicos contiguos al extremo

carboxlico de las cadenas laterales aromticas de tirosina, triptfano y fenilalanina

de grandes residuos hidrofbicos como la metionina. Esto es lo mencionado como

bolsillo (lugar activo) en las serina proteasas. En la quimotripsina, el bolsillo es

ms ancho en comparacin con el de la tripsina, el cual es profundo y estrecho,

con un carboxilato cargado negativamente en su parte inferior. El bolsillo de la

quimotripsina est recubierto de residuos hidrfobos para acomodar una cadena

lateral hidrfoba como la de la fenilalanina (figura 4).

Quimotripsina


Figura 3: Estructura de la quimotripsina.

Los aminocidos cruciales del lugar activo

se indican en rojo y azul. El bolsillo del

lugar activo se encuentra situado

inmediatamente por debajo y a la derecha

de la Ser 195

Figura 4: Bolsillos de los lugares activos

de las serina proteasas.

Proteasas pancreticas: Activacin mediante ruptura: Zimgenos.

Quimotripsina


Un tipo completamente distinto de activacin enzimtica covalente, la ruptura

proteoltica, puede describirse mediante el ejemplo de las proteasas pancreticas,

grupo al que pertenecen diversas enzimas como la tripsina, elastasa,

carboxipeptidasa y la quimotripsina. Todas se sintetizan en el pncreas, y se

segregan a travs del duodeno del intestino delgado, en respuesta a una seal

hormonal generada cuando el alimento sale del estmago. Sin embargo, no se

sintetizan en su forma final activa, puesto que una batera de potentes proteasas

libres en el pncreas causaran una digestin del jugo pancretico. En su lugar, se

elaboran en forma de molculas ligeramente ms grandes, catalticamente

inactivas, denominadas zimgenos. Los nombres que se dan a los zimgenos de

las enzimas citadas anteriormente con tripsingeno, proelastasa,

procarboxipeptidasa y quimotripsingeno respectivamente. Los zimgenos deben

romperse proteolticamente en el intestino para producir enzimas activas. Estas

enzimas se degradan tras haber cumplido sus fines, por lo que no ponen en

peligro el tejido intestinal, que tambin est, de alguna manera, protegido por su

superficie glucosilada.

La activacin del quimotripsingeno a quimotripsina es uno de los ejemplos ms

complejos y mejor estudiados de la activacin proteoltica de un enzima. El

quimotripsingeno est constituido por una sola cadena polipeptdica de 245

restos que se mantiene unida mediante cinco puentes disulfuro intracatenarios.

En el primer paso, la tripsina rompe el enlace entre la arginina 15 y la isoleucina

16. El pptido N-terminal contina unido al resto de la molcula debido al enlace

disulfuro entre los residuos 1 y 122. El producto, denominado - quimotripsina, es

una enzima activa. La forma en que la ruptura de un enlace peptdico transforma

una protena totalmente inactiva en una activa puede comprenderse ahora como

resultado de los estudios de difraccin de rayos X detallados del zimgeno y la

enzima. La ruptura del enlace peptdico entre los residuos 15 y 16 crea un nuevo

residuo N-terminal cargado positivamente en Ile 16. Este residuo desplaza su

posicin y forma un puente salino con Asp 194, que es el adyacente al lugar activo

Ser 195 (vase figura 3). Este cambio desencadena a su vez otros

Quimotripsina


reordenamientos conformacionales en la proximidad del lugar activo. Estos

cambios incluyen el modelado correcto del bolsillo del lugar activo y el movimiento

de los grupos amino de la cadena principal de los residuos 193 y 195 a un lugar en

el que puedan establecer enlaces de hidrgeno con el sustrato oxianin (tomo de

oxgeno carbonlico cargado negativamente) en el estado de transicin tetradrico.

As pues, tanto el bolsillo de unin como el lugar cataltico se forman

correctamente slo despus de que se haya roto el enlace peptdico entre Arg 15

y Ile 16.

La quimotripsina no est completamente terminada con esta ruptura. Se

producen nuevas rupturas autocatalticas que eliminan de la molcula los residuos

14-15 y 147-148, para producir la -quimotripsina final, que es la forma principal y

totalmente activa de la enzima que se encuentra en el tubo digestivo (Mathews,

2009). El quimotripsingeno se convierte en -quimotripsina activa por la hidrlisis

enzimtica de cuatro enlaces peptdicos, gracias a la accin consecutiva de la

tripsina y de la quimotripsina; en esta hidrlisis se liberan dos dipptidos. La -

quimotripsina activa producida por este mtodo est constituida por tres cadenas

polipeptdicas que se mantienen unidad mediante dos puentes S-S-. As, los dos

restos especficos que son esenciales para la actividad cataltica, la histidina 57 y

la serina 195, se hallan situados en dos cadenas diferentes. Sin embargo, se ha

podido establecer directamente, mediante anlisis por rayos X de la estructura

terciaria de la quimotripsina, que ambos restos se hallan realmente muy prximos

en la conformacin del enzima nativo (Lehninger, 1991). En la figura 5 se muestra

la activacin del quimotripsingeno; en la figura 6 se muestra la representacin

lineal de la conversin del quimotripsingeno en quimotripsina.

Esta batera de enzimas, tripsina, elastasa, carboxipeptidasa y quimotripsina, junto

con la pepsina del estmago y otras proteasas secretadas por las clulas de la

pared intestinal, es capaz de digerir finalmente la mayor parte de las protenas

ingeridas a aminocidos libres, que pueden absorberse por el epitelio intestinal.

Las propias enzimas estn sometidas continuamente a una digestin mutua, y

autodigestin, de manera que nunca llegan a acumularse concentraciones

Quimotripsina


elevadas de estas enzimas en el intestino; incluso los zimgenos inactivos son

una posible fuente de peligro para el pncreas4 (Mathews, 2009).

Figura 5: Esta figura muestra esquemticamente la molcula

de quimotripsingeno. Una serie de rupturas dan lugar a la

enzima quimotripsina, con los enlaces disulfuros que continan

manteniendo la estructura unida. La ruptura inicial entre los

aminocidos 15 y 16 (flecha) da lugar a la formacin de -

quimotripsina. La posterior eliminacin de los segmentos que

se indican en negro produce -quimotripsina.

Figura 6: Representacin lineal de la

conversin del quimotripsingeno a

quimotripsina.

MECANISMO DE ACCIN

Quimotripsina


La quimotripsina, al igual que muchas proteasas, hidroliza enlaces ster adems

de los enlaces peptdicos. En la figura 7 se ilustra cmo se produce la catlisis de

la hidrlisis del enlace peptdico por una serina proteasa. En primer lugar, la

cadena polipeptdica que se rompe se una a la superficie enzimtica (paso 1). La

mayora de los polipptidos se unen de manera inespecfica, pero la cadena lateral

del residuo del lado N-terminal (Ile 16) del enlace peptdico que se va a romper

debe ajustarse al bolsillo del lugar activo. Este bolsillo define no slo la posicin

del corte, sino tambin la esteroespecificidad de las serina proteasas. Si hubiera

un aminocido D en esta posicin, la cadena lateral se proyectara en la direccin

incorrecta, alejndose del receptculo. Las serina proteasas no cortarn, pues,

cerca de los aminocidos D.

Esta unin es muy especfica de un tipo concreto de aminocido sita a la serina

del lugar activo prxima al grupo carbonilo del enlace a romper. Los residuos de

serina no suelen ser reactivos, pero ste se encuentra en un entorno poco

habitual, ya que est muy prximo a His 57. El protn de la serina se transfiere al

anillo de histidina (paso 2), dejando en la serina una carga negativa. Normalmente,

esta transferencia sera improbable debido a los pKa elevados de los grupos

alcohol-OH, pero parece facilitarse por Asp 102, que, por su carga negativa,

estabiliza la protonacin del anillo de histidina adyacente. La serina activada es un

fuerte nuclefilo y puede atacar al carbonilo del sustrato, formando el estado de

transicin tetradrico (que se muestra en el paso 2 de la figura 7). La ruptura del

enlace peptdico (paso 3) se produce en este estado activado, dado un

intermediario acilo-enzima en el que la parte N-terminal del sustrato polipeptdico

se une de forma covalente a la enzima. La porcin C-terminal del polipptido

extrae el protn (que originalmente era el protn de la serina) de la histidina, para

formar un nuevo grupo amino terminal. Esta parte de la cadena del sustrato no

est unida por si misma de manera fuerte a la enzima.

Hasta este punto, el H2O no ha entrado en accin, pero s lo hace ahora para

desplazar la porcin C-terminal de la cadena y posteriormente romper el

intermediario acilo. En el paso 4, una molcula de agua se coloca entre el grupo

Quimotripsina


acilo y la His 57; en el paso 5 se transfiere un protn a la His 57 y, a continuacin,

se une al intermediario acilo para formar un segundo estado de transicin

tetradrico. Obsrvese que este proceso es esencialmente una inversin de la

formacin del intermediario acilo inicial, y que la molcula de agua desempea el

papel de la parte liberada de la cadena polipeptdica. Por ltimo (paso 6) el protn

se transfiere desde la histidina de nuevo a la Ser 1955, y se libera el resto de la

cadena polipeptdica. La enzima vuelve a su estado original y est preparada para

catalizar la hidrlisis de otra cadena.

Figura 7: Catlisis de la

hidrlisis del enlace peptdico

por la quimotripsina. La zona

indicada en marrn

corresponde a la enzima.

Una clave de la catlisis de las serina proteasas se encuentra en la estabilidad de

los dos estados intermedios tetradricos, que son muy semejantes a los estados

de transicin esenciales. Por qu son tan estables? Una posibilidad muy

probable surge de los estudios detallados de las estructuras de rayos X de los

compuestos intermedios atrapados, que sealan que los protones amino del

esqueleto de los residuos Ser 195 y Gly 193 pueden formar enlaces de hidrgeno

con uno de los oxgenos del complejo tetradrico. Este oxgeno es el que estaba

en el carbonilo del sustrato, y el enlace de hidrgeno puede producirse slo con la

formacin del estado tetradrico. De esta forma, este enlace de hidrgenos

estabiliza dichos intermediarios (Mathews, 2009).

Quimotripsina


PARMETROS CINTICOS

La quimotripsina cataliza la hidrlisis de enlaces peptdicos o ster en dos etapas

distintas. Esto fue descubierto, en primer lugar, mediante la investigacin sobre la

cintica de hidrlisis del acetato de p-nitrofenilo. Cuando se emplean grandes

cantidades de enzimas se produce una explosin rpida inicial del producto p-

nitrofenol, seguida por la formacin del producto a una velocidad mucho ms lenta

en rgimen de estado estacionario (figura 8). La primera etapa es la combinacin

del acetato de p-nitrofenilo con la quimotripsina para formar el complejo enzima-

sustrato (ES). El enlace ster del sustrato se rompe. Uno de los productos, el p-

nitrofenol, queda liberado de la enzima mientras que el grupo acetilo del sustrato

queda ligado al enzima de forma covalente (figura 9). El agua ataca entonces, el

complejo acetil-enzima para producir in acetato y regenerar el enzima (figura 10)

la produccin rpida explosiva inicial de p-nitrofenol corresponde a la formacin

del complejo acetil-enzima. Esta etapa es la denominada de acilacin. La

produccin ms lenta de p-nitrofenol, en el estado estacionario, corresponde a la

hidrlisis del complejo acetil-enzima para regenerar el enzima libre.

Esta segunda etapa denominada desacilacin, es mucho ms lenta que la

primera, pero eso es lo que determina la velocidad total de hidrlisis de steres

por quimotripsina. De hecho, el complejo acetil-enzima es lo suficientemente

estable para poder ser aislados bajo condiciones apropiadas. De esta manera, el

mecanismo cataltico de la quimotripsina puede representarse por el esquema

adyacente, donde P1 es el fragmento amina (o alcohol) del sustrato, E-P2, es el

intermediario covalente y P2 el fragmento cido del sustrato (figura 11 y 12).

Un aspecto caracterstico de este mecanismo es la aparicin de un intermediario

covalente. En la reaccin comentada con anterioridad un grupo acetilo queda

unido covalentemente al enzima. En general, el grupo ligado a la quimotripsina E-

P2 es un grupo acilo. Por ello, E-P2 es un intermediario acil-enzima (Stryer, 1995).

Quimotripsina


Figura 8: Al mezclar quimotripsina

y acetato de p-nitrofenilo se

distinguen dos fases en la

formacin de p-nitrofenol

Figura 9: Acilacin: formacin del

intermediario acetil-enzima en la

catlisis por quimotripsina.

Figura 10: Desacilacin:

hidrlisis del intermediario

acetil-enzima.

Figura 11: Esquema del mecanismo

cataltico.

Quimotripsina


Figura 12: Catlisis

covalente en el

centro activo de la

quimotripsina.

Quimotripsina


Cul es la estructura del ster intermediario que se forma con la enzima?

Para dar respuesta a esto se crea una concentracin

estacionaria apreciable del ster intermediario, que puede

aislarse si se detiene la reaccin con cido. El anlisis

secuencial del ster de la enzima demostr que el grupo acetilo del sustrato

estaba unido a la Ser 195; por tanto, la enzima reacciona en el grupo OH de

dicho aminocido en particular.

No obstante, hay pruebas de que otros residuos de aminocidos tambin son

vitales para la accin enzimtica. La velocidad de la hidrlisis por la catlisis

enzimtica cambia con la variacin de la acides del medio reaccionante. Si se

construye el grfico de la velocidad de hidrlisis en funcin del pH de la solucin,

se obtiene una curva con forma de campana: a medida que aumenta el pH, la

velocidad alcanza un mximo, para luego decaer. La velocidad es mxima para un

pH de 7.4 (el pH fisiolgico) y es ms lenta tanto en solucin ms cida como ms

bsica. El anlisis de los resultados experimentales indica lo siguiente: la hidrlisis

requiere de la presencia de una base libre, de Kb alrededor de 10-7, y de una base

protonada, de Kb de aproximadamente 3 x 10-5. A pH bajo (solucin cida), ambas

bases estn protonadas; a pH elevado (solucin bsica), ambas estn libres. La

hidrlisis alcanza su velocidad mxima cuando la base ms dbil est

mayormente libre y cuando la ms fuerte se encuentra casi totalmente protonada.

La Kb de la base ms dbil iguala la del anillo imidazlico de la histidina y hay

pruebas adicionales de que es efectivamente sta la base: por ejemplo, estudios

que comprenden la catlisis por medio del propio imidazol. Ahora bien, el examen

de la conformacin de la quimotripsina demuestra que hay un residuo histidina

muy cercano a la Ser 195: His 57, de la que se cree que es la implicada en la

actividad enzimtica.

Qu hay acerca de la base ms fuerte que, segn la cintica, estara involucrada

en forma protonada? Su Kb se ajusta al grupo amino de la mayora de los

aminocidos, esto es, a un grupo amino que no est comprometido en una unin

Quimotripsina


peptdica. Sin embargo, pueden acetilarse todos los grupos amino (libres) en la

quimotripsina, sin que se pierda la actividad por completo, salvo uno: isoleucina

16, la unidad N-terminal de la cadena B. Luego, se supone que este grupo amino

no debe acetilarse, sino quedar libre para que pueda protonarse cumpliendo as

con su parte de la tarea (Morrison y Boyd, 1990).

Estabilizacin del estado de transicin. Dado que el centro activo fija el estado de

transicin con una mayor afinidad que el sustrato, la pequea fraccin de

molculas de sustrato que existe con la geometra del estado de transicin ser

convertida rpidamente en producto. De este modo, por accin de masas, todo el

sustrato puede ser convertido rpidamente en producto. Cualquier factor que

incremente la poblacin de molculas de sustrato que se asemeja al estado de

transicin contribuir a la catlisis. Los intermediarios tetradricos formados se

ilustran en la figura 13 (Devlin, 2004).

(a) (b)

Figura 13: Intermedios tetradricos. (a) Modelo de intermedio tetradrico #1 que precede a la

formacin del intermedio de acil-enzima (b) Modelo de intermedio tetradrico #2 resultante del

ataque del agua sobre el intermedio de acil-enzima, respectivamente.

Quimotripsina


En resumen.

El estudio cuantitativo de este efecto conduce a la conclusin de que la hidrolisis

del ster se verifica en dos etapas:

1) Quimotripsina + acetato de p-nitrofenilo acetil-quimotripsina + p-nitrofenol

2) Acetil-quimotripsina + H2O acetato + quimotripsina

En la figura 14 se detalla de manera resumida el mecanismo de accin de la

quimotripsina. El paso (a) de la figura muestra el complejo inicial enzima-sustrato.

El Asp 102, la Hs 57 y la Ser 195 estn alineados. Adems, el anillo aromtico del

residuo de fenilalanina del sustrato est asentado en un bolsillo de unin

hidrfobo, y el enlace peptdico del sustrato tiene un enlace de hidrgeno con los

grupos NH amida de la Ser 195 y la Gly 193. El oxgeno del hidroxilo nuclefilo de

la Ser 195 desencadena un ataque nuclefilo sobre el carbono carbonilo, est

estabilizado por enlaces de hidrgeno con el NH amida de la Ser 195 y la Gly 193.

El intermediario tetradrico, que se muestra en el paso (b), se descompone para

formar el intermediario acil-enzima unido covalentemente paso (c). La His 57,

actuando como cido general, se cree que facilita esta descomposicin. En los

pasos (d) y (e), se invierten los dos pasos previos. Con el agua actuando como

nuclefilo atacante, se forma un intermediario tetradrico (oxianin). En el paso (f)

(el complejo final enzima-producto) se ha roto el enlace entre el oxgeno de la

serina y el carbono carbonilo. La serina vuelve a formar un enlace de hidrgeno

con la His 57 (Mckee, 2003).

En ausencia de enzimas, la hidrlisis de los enlaces peptdicos precisa de

concentraciones muy elevadas de H+ o de OH-, de perodos de reaccin

prolongados y de temperaturas elevadas, mientras que la hidrlisis de los enlaces

peptdicos por la quimotripsina se realiza rpidamente a pH neutro, promovida por

la catlisis acido-base general en el centro activo (Lehninger, 1991).

Quimotripsina


Figura 14: Mecanismo probable de la accin de la quimotripsina.

Quimotripsina


TIPOS DE INHIBICIN

Las serina proteasas se inhiben de forma irreversible por el diisopropilfluorofosfato

(DFP). En las enzimas inhibidas por el DFP, el inhibidor est unido de forma

covalente slo a la Ser 195 y no a ninguna otra de las otras 29 serinas.

Un residuo importante por su actividad cataltica se descubri por medio de la

marcacin por afinidad. En esta tcnica, un anlogo del sustrato que posee un

grupo reactivo de fija de modo especfico en el sitio activo de la enzima, donde

reacciona para formar un enlace covalente estable con un grupo susceptible

cercano (por consiguiente, estos anlogos de sustrato reactivos se describieron

como los caballos de Troya de la bioqumica). Los grupos marcados por afinidad

pueden identificarse con posterioridad por un mapeo del pptido. La quimotripsina

fija en forma especfica la tosil-L-fenilalaninaclorometil cetona (TCPK) (figura 15).

Figura 15: TCPK.

Por su semejanza con el residuo Fe (fenilalanina, uno de los residuos preferidos

de la quimotripsina). El grupo clorometilcetona fijado al sitio activo es un agente

alquilante fuerte; reacciona con His 57 (figura 16), de ese modo inactiva la enzima.

La reaccin TCPK es inhibida por -fenilpropianato (figura 17), un inhibidor

competitivo de la quimotripsina que tal vez compita con TCPK por su sitio de

fijacin enzimtico. Es ms, la reaccin TCPK no se produce en urea 8M, un

reactivo desnaturalizante, o con DIP-quimotripsina, en la que se bloquea el sitio

activo. Estas observaciones establecen que His 57 es un residuo del sitio activo

esencial de la quimotripsina.

Un inhibidor irreversible es la N-tosil-L-fenilalaninaclorometil cetona (TCPK). La

TCPK es un excelente inhibidor de la quimotripsina, puesto que el grupo fenilo se

Quimotripsina


ajusta exactamente en el bolsillo del lugar activo, colocando el cloro para el

desplazamiento nuclefilo por un nitrgeno del anillo imidazol de la His 57.

Figura 16: Reaccin de TCPK con quimotripsina para formar un alquilo de la His 57.

Figura 17: -fenilpropianato.

Quimotripsina


MTODOS DE EXTRACCIN

Mtodo de extraccin y purificacin, total o parcial, de tripsina y

quimotripsina a partir de tejido pancretico porcion o bovino.

Ambas protenas, tienen carcter hidrofbico, por lo que se estudi la posibilidad

de realizar su purificacin mediante la utilizacin de resinas de intercambio

hidrofbicas. El mtodo de obtencin comprende i) una etapa de extraccin y

purificacin parcial, y ii) una etapa de purificacin adicional, la cual segn las

condiciones de trabajo, puede utilizarse para realizar una purificacin parcial

regulando las condiciones para que slo se una la quimotripsina a la columna

cromatogrfica, o para una purificacin total de ambas protenas. La tripsina y la

quimotripsina as obtenidas, tanto en la forma cruda como la purificada, se

emplean en la preparacin de composiciones farmacuticas de dosificacin oral o

inyectable, respectivamente

Un mtodo de obtencin y quimotripsina a partir de tejido pancretico animal

comprende: I) una etapa de extraccin y purificacin parcial que comprende los

pasos de: i) obtencin de un extracto de pncreas ii)precipitacin a partir del

extracto original utilizando una concentracin de sulfato de amonio que puede

variar entre 360 y 400 g/dm3; iii) recuperacin del slido por filtracin; iv)

suspensin con 2,2 volmenes d agua acidulada -etapa N-,ajustando la

concentracin final de sulfato de amonio a 200 g/dm3 V) precipitacin mediante

tratamiento con cloruro de calcio del lquido recuperado para eliminar el ion

sulfato; vi.) eliminacin del slido por filtracin; vii) concentracin mediante ultra

filtracin del lquido obtenido hasta llegar a una concentracin de slidos disueltos

del 20 a 25% en peso; viii) activacin de los zimogenos (si se requiere); ix)

diafiltracin, ajuste de la concentracin final de slidos en el orden de 20-25% y

secado final -si requiere-; y II) una etapa de purificacin adicional que comprende

los pasos de: i) montar, empacar y preparar una columna cromatogrfica con una

resina de tipo hidrofbica determinada; ii) equilibrar la resina hidrofbica con una

Quimotripsina


solucin salina a pH 3,0-5-0; iii) se ajusta la concentracin salina del material

crudo a purificar de 80 a 220/ g/dm3 y a pH 3,0-5,0; iv) clarificar por filtracin o

centrifugacin la solucin del material a ser purificado obtenido en la etapa I) antes

del sembrado de la columna; v) pasar la solucin del material a purificar hasta que

la columna se sature con los componentes de la mezcla; tripsina y quimotripsina;

vi) agregar en forma continua la solucin proteica desplazando de la resina la

tripsina por medio de la quimotripsina; vii) lavar la columna con una solucin en

condiciones salinas y de pH idnticas a las de la siembra; viii) descartar el material

que eluy de la columna durante la etapa de siembra y lavado; ix) eluir el material

retenido en la columna por medio del agregado de una solucin salina de 80-120

g/dm3 y a pH3,0-5,0; x) colectar y reservar el material eluido para la recuperacin

de la tripsina; xi) eluir el material retenido en la columna por medio del agregado

de agua acidulada a pH 3,0-5,0; xii) colectar y reservar el material eluido para la

recuperacin de la quimotripsina; xiii) A) si el material de origen estaba activado,

concentrar y secar ambas soluciones hasta llegar a un residuo en forma de polvo;

o B) si el material de origen no estaba previamente activado, concentrar ambas

soluciones por separado hasta una concentracin de slidos del orden de 20%;

activar hasta llegar a la actividad especfica buscada; acidular los lquidos

obtenidos a pH 3,0-3,5; dializar y secar hasta obtener cada una de las protenas al

estado de polvo.

Determinacin de quimotripsina en las heces fecales.

Tripsina y quimotripsina en las heces es un anlisis fecal que pueden observar

cantidades menores a lo normal en una muestra de materia fecal. La tripsina y la

quimotripsina (como lo hemos descrito) son sustancias secretadas desde el

pncreas durante la digestin normal y cuando este rgano no las produce en

cantidad suficiente puede existir un problema pancretico.

El test se conoce como Secretina-Ceruleina (CCK-Pz), un test directo de funcin

pancretica en la que se valora la capacidad secretora del pncreas exocrino. Los

pasos del mtodo son los siguientes:

Quimotripsina


Precisa intubar al paciente con una sonda de doble luz a estmago y

duodeno.

Administrar secretina-ceruleina (CCK-Pz) I.V.

Se recoge la secrecin pancretica.

Se determina en ella volumen, quimotripsina, lipasa y bicarbonatos.

Quimotripsina


USOS INDUSTRIALES

La importancia de las proteasas radica en su gran inclusin en el mercado al

constituir uno de los grupos ms importantes de las enzimas industriales debido a

que ocupan una posicin primaria en el campo comercial, (Kembhavi et al., 1993)

por lo que han adquirido especial relevancia, ya que pueden ser utilizadas en

procesos productivos como en la industria de los detergentes, de alimentos y del

cuero (Smith y Brekke, 1984), adicionalmente una variedad de proteasas

contienen importantes aplicaciones farmacuticas (la quimotripsina)

(Chandrasekaran y Dhar 1986; Vzquez et al., 2008).

En las industrias de produccin de alimentos ms del 60 % de las enzimas

utilizadas son proteasas por poseer aplicaciones ms prcticas y variadas ya que

ocasionalmente son combinadas con pptidasas, esto es con la finalidad de lograr

una hidrolisis ms completa.

Las proteasas son ampliamente utilizadas para la fabricacin de bebidas,

panificaciones, galletera, ablandadores de carne, sntesis del aspartame,

(Kembhavi et al., 1993) clarificacin de cerveza, (Snchez, 2004) fabricacin de

productos fermentados de soya y de pescado, saborizantes, as como en la

elaboracin de quesos, concentrados proteicos y produccin de hidrolizados

proteicos.

Adems de se aplica de manera importante en la industria farmacutica, ya que se

utiliza dichas enzimas para formular antitrombiticos, coadyuvantes digestivos,

antiinflamatorios, aceleradores de la coagulacin sangunea y para la activacin

del plasimingeno. Otros usos son el depilado de pieles en curtidura y la

recuperacin de la plata de las pelculas fotogrficas y radiogrficas ya utilizadas,

adems de emplearse enzimas proteolticas en la sntesis enzimtica de pptidos

y steres con actividad biolgica y formulacin de los llamados detergentes

biolgicos (Prado et al., 1999).

Quimotripsina


CONCLUSIONES

Las enzimas son catalizadores biolgicos que aumentan las velocidades de los

procesos bioqumicos mientras se mantienen inalteradas. La mayora, aunque no

todas, las enzimas son protenas. En la catlisis enzimtica, uno o ms sustratos

se unen al lugar activo de una enzima, para formar el complejo enzima-sustrato;

tras ello se liberan los productos.

El cuerpo humano es considerando la mquina perfecta pues las millones de

reacciones que ocurren en el organismo da a da, las funciones que realizan

todos los rganos, todo ello y mucho ms se encuentra estrictamente operado,

regulado y finalizado. Aunque el cerebro sea el rgano que coordine el cuerpo

humano y sus funciones, las enzimas forman parte de la dinmica de la vida, son

parte fundamental de la catlisis y control de las reacciones bioqumicas y la falta

de una sola de ellas podra traer consecuencias fatales.

La quimotripsina es una enzima digestiva que se encuentra bien estudiada y

gracias a ello, se han realizado grandes logros en la industria alimentaria y

farmacutica; sin embargo, tuvieron que pasar ms de 50 aos para encontrar

cmo es su estructura, mecanismo, etc. y por esto, se debe dar ms impulso e

inters en la investigacin del funcionamiento biolgico y bioqumico del cuerpo

humano pues an falta mucho por descubrir, muchas preguntas que resolver y

ms soluciones mdicas qu proponer.

Quimotripsina


BIBLIOGRAFA

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Pginas: 415, 446-448.

Lehninger, L. A. Bioqumica. Ediciones Omega. Decimoquinta reimpresin.

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Mathews, K. C. y colaboradores. Bioqumica. Editorial Pearson. Tercera

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http://www.postgradoeinvestigacion.uadec.mx/CienciaCierta/CC27/6.html.

Fecha de consulta: 4 de mayo del 2013.

REFERENCIAS

1 Las enzimas proteolticas (comnmente llamadas proteasas) pertenecen al

grupo de las hidrolasas (Guadix et al., 2000) ya que degradan las cadenas

polipeptdicas de las protenas-sustrato (Carrera, 2003), hidrolizando los enlaces

peptdicos con diferentes grados de intensidad y de selectividad. Un enlace

peptdico es la unin que se realiza entre el grupo cido de un aminocido con el

grupo amino de otro, con la consecuente eliminacin de una molcula de agua

(Guadix et al., 2000).

Quimotripsina


2 La Enzyme Commission (EC) del Nomenclature Committee of the International

Union of Biochemistry and Molecular Biology (NC-IUBMB, 1992) recomienda el

trmino general peptidasas para todas las enzimas que hidrolizan enlaces

peptdicos. Esta recomendacin es adoptada por Barret et al. (1998) en un tratado

actual sobre el tema. Aunque en algunos textos siguen denominndolas

proteasas.

3 Los puentes intercatenarios estabilizan la estructura cuaternaria, es decir,

cuando existe una protena conformada por ms de una cadena polipeptdica (la

hemoglobina, por ejemplo), son los puentes que se dan entre aminocidos de las

distintas cadenas. Intercatenarios es entre cadenas distintas.

4 Dado que la activacin de la tripsina puede ser autocataltica, la presencia de

una sola molcula activa de tripsina podra poner en marcha toda la cadena de

manera prematura [ ] Las enzimas activas inician entonces una digestin del

propio tejido pancretico. El trastorno, denominado pancreatitis aguda, es

extremadamente doloroso y a veces resulta mortal.

5 La reactividad especial de la Ser 195 se atribuye a la proximidad de la His 57 y

del Asp 102. El anillo imidazol de la His 57 se encuentra entre el grupo carboxilo

del Asp 102 y el grupo CH2OH de la Ser 195. El grupo carboxilo del Asp 102

polariza a la His 57, permitindolo de esta manera actuar como una base general

(es decir, se fomenta la abstraccin de un protn por el grupo imidazol).

Documents

QUIMOTRIPSINA (ISIS, PAULINA, THALIA, CYNTHIA JAZMÍN)