AktualnościbioMérieuxIN

DU

STRY 15

lipiec2013

Cytometry jako część procesu produkcyjnego

Diagnostykaźródłem dobrego zdrowia

2

Spis treści

2 od wydawcy

3 Nowe wytyczne w zakresie wytwarzania i stosowania pożywek mikrobiologicznych

6 Czuła analiza w kilka minut

8 Oznaczanie liczby drożdży w wybranych fermentowanych produktach mleczarskich z wykorzystaniem systemu TEMPO® YM

11 bioMérieux wprowadza nowy test TEMPO® AC, do szybkiego liczenia ogólnej liczby drobnoustrojów w żywnosci

13 Enterotoksyny gronkowcowe – zagrożenie mikrobiologiczne i wykrywanie

od wydawcy

wydawca: bioMérieux Polska Sp. z o.o.

Osoba odpowiedzialna: Elżbieta Wójcik

Osoby biorące udział w przygotowaniu nr 15:Dorota Pawluch Artur GąsiorCzesław MitekJacek CharlińskiAneta Lesiuk (korekta)

Adres redakcji i wydawcy:bioMérieux Polska01-518 Warszawa, ul. Gen. Józefa Zajączka 9tel. (22) 569 85 00 • fax (22) 569 85 54www.biomerieux.pl

opracowanie graficzne i druk:Agencja Wydawnicza SOWAwww.agencja-sowa.com.pl

Szanowni Państwo!

Mam nadzieję ,że artykuły, które zamieściliśmy w numerze15. „Aktualności Industry”, spełnią Państwa oczekiwania.Bardzo prosimy o opinie, które będą dla nas wskazaniem,co powinniśmy zmienić w przyszłości i jakie tematy są dlaPaństwa ważne.

Przedstawiamy Państwu kolejne produkty firmy AESChemunex,które weszły do naszej oferty. Cytometry przepływowe prze-znaczone do badania jałowości lub liczenia drobnoustrojóww żywności, farmaceutykach i kosmetykach. Wykorzystaniecytomerów: BactiFlow ALS, D-Count i ChemScan RDI jakoczęść procesu produkcyjnego skraca czas oczekiwania nawyniki badań surowców i gotowych produktów do 24. go-dzin.Prezentujemy nowe wytyczne w zakresie wykorzystania i sto-sowania pożywek mikrobiologicznych. Mówimy na temat enterotoksyny gronkowcowej będącejprzyczyną wielu zatruć pokarmowych.W 15. numerze „Aktualności Industry” znajdziecie Państwoartykuł na temat wykorzystania systemu Tempo do oznacza-nia liczby drożdży w wybra-nych fermentowanychproduktach mleczarskich.

Szanowni Państwo,uprzejmie informujemy, żeod 01.06.2013 nie będądołączane do przesyłek cer-tyfikaty kontroli jakości w for-mie wydrukowanej.Certyfikaty kontroli jakościdla naszych produktów sądostępne w formie elektro-nicznej na stronie www.mybiomerieux.com.Aby uzyskać dostęp do da-nych biblioteki, należy się za-rejestrować na www.mybiomerieux.com: - na stronie głównej w prawym górnym rogu można wybrać

język polski, - kliknąć w „ZAŁÓŻ KONTO”.Po wypełnieniu wszystkich wymaganych pól, otrzymaciePaństwo wiadomość elektroniczną z potwierdzeniem loginui hasła.

Dorota Pawluch

Dyrektor ds. Marketingu i SprzedażyMikrobiologia Przemysłowa

3

Jakość pożywek mikrobiologicznych stosowanychw różnego rodzaju badaniach laboratoryjnych, a więci wiarygodność otrzymanego wyniku, uzależnionajest od wielu czynników, a w szczególności od jakościposzczególnych składników i substancji stosowanych,poprawności procedur przygotowania czy odpowied-niego procesu pakowania i przechowywania. Wy-twórca pożywek lub laboratorium je przygotowującemuszą zapewnić, że gotowa do użycia pożywka od-powiada pod względem cech fizycznych, chemicz-nych i biologicznych określonemu standardowi.Zatem wdrożony system jakości w laboratorium po-winien zapewniać otrzymanie odpowiednich cechwytworzonej i używanej w badaniach pożywki w za-kresie parametrów ogólnych i hodowlanych. Stądobecne dążenie w skali międzynarodowej do stan-daryzacji metod badań mikrobiologicznych. Chodzibowiem o opracowanie, a następnie zastosowaniew praktyce laboratoryjnej jednolitych metod badańmikrobiologicznych, odpowiednich dla różnego ro-dzaju matryc, dających powtarzalne oraz wiarygodnewyniki. W efekcie pozwoli to, aby były one porówny-walne w przypadku wykonywania badań tej samejpróbki w różnych laboratoriach niezależnie od miejscaczy kraju. W rezultacie powinno to pozwolić na wiary-godną, pełną i szybką identyfikację czynników zagro-żeń mikrobiologicznych występujących w żywności,paszach i wodzie oraz ułatwiać podejmowanie corazbardziej obiektywnych decyzji producenckich i admi-nistracyjnych przez organy kontrolne.

Standaryzacja metod wytwarzania, stosowania i kontroli jakości pożywek

Wyrazem dążenia do dalszej optymalizacji wytwarzaniai harmonizacji metod kontroli jakości stosowanych poży-wek jest ostatnio opracowany oraz poddany procedurzegłosowania projekt normy ISO/DIS 11133-1:2012 pt.: Mic-robiology of food, animal feed and water – Preparation,production, storage and performance testing of culturemedia. „Mikrobiologia żywności i pasz – Przygotowywanie,wytwarzanie, przechowywanie i kontrola jakości pożywek”.Głosowanie nad niniejszym projektem trwało do 2 stycz-

nia 2013 roku i zakończyło się przyjęciem projektu dopublikacji. Norma ISO/DIS 11133 zawiera ogólną termi-nologię odnoszącą się kontroli pożywek stosowanychw badaniach mikrobiologicznych żywności, pasz orazwszystkich rodzajów wody. Ponadto podaje w sposóbkompleksowy wytyczne systemu kontroli jakości i wymagańw procesie przygotowywania oraz stosowania pożywekw badaniach laboratoryjnych. Podobnie jak, w poprzed-nich wydaniach norm z tego zakresu, określono, że po-dane wymagania mają zastosowanie do kategorii pożywekwykorzystywanych w laboratoriach, które są przygotowy-wane i/lub używane podczas wykonywania analiz mikro-biologicznych, a mianowicie:– gotowych do użycia pożywek wytworzonych w celach

handlowych;– pożywek wymagających upłynnienia, uzupełnienia i roz-

lania;– pożywek przygotowanych z dostępnych na rynku su-

chych półproduktów; – pożywek przygotowanych z pojedynczych składników.

Dla celów niniejszej normy podano szereg ujednoliconychterminów i definicji związanych z wytwarzaniem i kontroląpożywek. Na podkreślenie zasługuje fakt, że w omawianejnormie podano szereg definicji dla różnych rodzajów po-żywek, począwszy od definicji ogólnej co to jest pożywka,poprzez pożywki klasyfikowane na podstawie składu, kon-systencji, sposobu użycia i przygotowania, a skończywszyna pożywce referencyjnej.

Terminologia pożywkarska

Omawiana norma w rozdziale 3 zawiera ogólną termino-logię odnoszącą się do systemu zapewnienia jakości przy-gotowywanych pożywek stosowanych w badaniachmikrobiologicznych produktów spożywczych, pasz i wody.

Wart podkreślenia jest fakt, że w prezentowanej normiepodano bardzo istotną z praktycznego punktu widzeniapraktycznego klasyfikację i definicje dotyczące drobnou-strojów testowych, a mianowicie co to jest: – organizm testowy (ang. test organism) – jest to drobnou-

strój ogólnie stosowany do kontroli przydatności pożywek;

prze

pisy

pra

wne

Nowe wytyczne w zakresie wytwarzania i stosowania pożywek mikrobiologicznychKrzysztof Kwiatek1, Dorota Pawluch2

1 Państwowy Instytut Weterynaryjny – Państwowy Instytut Badawczy, Puławy2 bioMérieux Polska Sp. z o.o

4

– szczep referencyjny – (ang. reference strain) - drob-noustrój otrzymany bezpośrednio z uznanej kolekcjiszczepów, która znajduje się na liście Światowej Fede-racji Kolekcji Szczepów (ang. World Federation of Cul-ture Collections) lub Europejskiej Organizacji KolekcjiSzczepów (ang. European Culture Collections Organi-sation), określony przynajmniej co do rodzaju i ga-tunku, skatalogowany i opisany pod względem cech,przy jednoczesnym wskazaniu preferowanego źródłapochodzenia, takiego jak żywność lub woda, jeżeli toma zastosowanie;

– szczep macierzysty (ang. reference stock) – szczepmacierzysty - zestaw odrębnych, identycznych szcze-pów, uzyskanych w laboratorium z pierwszego pasażuszczepu referencyjnego otrzymanego z laboratoriumlub też od dostawcy;

– kultura macierzysta (ang. stock culture) - pierwsza kul-tura otrzymana ze szczepu referencyjnego;

– kultura robocza (ang. working culture) – jest to kulturauzyskana ze szczepu referencyjnego lub szczepu ma-cierzystego lub materiału referencyjnego, certyfikowanalub nie certyfikowana.

Ponadto w omawianym dokumencie zdefiniowano, żemateriał referencyjny to materiał zawierający określonąliczbę możliwych do ożywienia drobnoustrojów, równo-miernie rozmieszczonych, o stabilnej liczbie. Certyfiko-wany materiał referencyjny to materiał, w którym liczbadrobnoustrojów jest potwierdzona odpowiednim certyfi-katem.

Pożywki gotowe do stosowania

W rozdziale 4 norma podaje wytyczne dotyczące zapew-nienia jakości pożywek w czasie ich przygotowania i sto-sowania. W pierwszej kolejności określono, że w systemiezapewnienia jakości zaleca się, aby wytwórca lub produ-cent pożywek udostępnił klientowi następujące dane:• nazwę pożywki, pojedyncze składniki i suplementy oraz

kody tych produktów;• kartę specyfikacji technicznej;• informacje o zasadach bezpieczeństwa i/lub zagroże-

niach, o ile jest to konieczne;• numer partii/serii;• docelowy odczyn pH kompletnej pożywki przed zasto-

sowaniem;• informacje dotyczące przechowywania i przydatności

do stosowania;• certyfikat kontroli jakości i nazwę użytych organizmów

testowych; • wyniki testów kontrolnych w zakresie przydatności po-

żywki z uwzględnieniem kryteriów ich akceptacji.

W procesie akceptacji produktów przy dostawie dla każdejpartii produktu (składnik lub pożywka) należy sprawdzić na-stępujące dane: znaki identyfikacyjne produktu, integralnośćopakowania, datę ważności produktu i dołączoną dokumen-tację. Ponadto należy zapisać datę otrzymania produktu.W trakcie przechowywania pożywek we wszystkich sytua-cjach postępować zgodnie z instrukcją producenta, dotyczącąwarunków przechowywania, daty ważności i stosowania.

Zarządzanie jakością, kontrola gotowych do użycia i suchych pożywek oraz suplementów

W przypadku stosowania gotowych, dostępnych w handlupożywek należy przestrzegać instrukcji producenta w za-kresie warunków przechowywania, przydatności do użyciai stosowania.Pożywki suche dostarczane są w szczelnie zamkniętychpojemnikach w postaci suchego proszku lub granulatu.Suplementy mające właściwości selektywne lub sub-stancje diagnostyczne dostarczane są w postaci zliofili-zowanej lub płynnej. Jednak zaleca się, aby zakupy byłyplanowane w sposób zapewniający obrót w magazyniezgodnie z zasadą „pierwsze przyszło – pierwsze wyszło(first in – first out)”. W ramach prowadzonej gospodarkimagazynowej pożywek należy sprawdzić szczelnośćopakowania, zapisać datę pierwszego otwarcia i ocenićwizualnie zawartość otwartego opakowania. Szczegól-nie po otwarciu nowego pojemnika jakość pożywki za-leży od warunków przechowywania. Na utratę jakościsuchej (odwodnionej) pożywki wskazuje zmiana kon-systencji sproszkowanej pożywki, jej jednorodności, wy-stępujące zbrylenia czy zmiana zabarwienia. Każdasucha pożywka, która wchłonęła wilgoć lub wykazujejakiekolwiek zmiany fizykochemiczne, powinna być wy-brakowana.

Ogólne zasady przygotowania pożywek w laboratorium

W rozdziale 4.3 omawianej normy stwierdzono, że wła-ściwe przygotowanie pożywki jest jednym z najważniej-szych etapów badania mikrobiologicznego i należyzwracać na to baczną uwagę. W szczególności należyzadbać o przestrzeganie zasad dobrej praktyki labora-toryjnej (GLP) oraz zaleceń producenta pożywki w za-kresie postępowania z suchymi pożywkami i innymiskładnikami, zwłaszcza tymi zawierającymi niebez-pieczne materiały, takie jak sole żółci czy inne selek-tywne czynniki.

Przygotowywanie suplementów stosowanych w procesie sporządzania pożywek

W normie podkreślono, że nie można stosować suple-mentów po upływie okresu trwałości określonym przezproducenta. W przypadku roztworów roboczych anty-biotyków należy zużyć je tego samego dnia. W pew-nych warunkach roztwory antybiotyków mogą byćprzechowywane w stanie zamrożenia, ale po rozmro-żeniu nie mogą być one ponownie zamrażane. Zalecasię, aby stopień potencjalnej utraty aktywności antybio-tyków w trakcie mrożenia był ustalony z producentemlub określony przez użytkownika. Wyprodukowane su-plementy zawierające substancje toksyczne, szczegól-nie antybiotyki, powinny być traktowane z ostrożnościąw celu uniknięcia pylenia się, co może powodowaćreakcje alergiczne u personelu laboratorium podczasprzygotowywania roztworów. Podczas przygotowywaniaroztworów należy zastosować wszelkie środki ostrożno-ści i postępować zgodnie z zaleceniami producenta.

5

Zasady przechowywania i określania trwałościprzygotowanych pożywek

Okres trwałości pożywek mikrobiologicznych jest zróżni-cowany w zależności od rodzaju i warunków przechowy-wania. Określone warunki i okresy trwałości mogą byćzawarte w odpowiednich normach międzynarodowych ikrajowych. Pożywki należy przechowywać w warunkachzapobiegających wystąpieniu jakichkolwiek modyfikacji ichskładu, chroniąc przede wszystkim przed światłem, od-wodnieniem oraz – jeżeli to konieczne – przechowywaćw lodówce w temperaturze 5°C ± 3°C. Na ogół zalecasię, aby nie przechowywać płytek z rozlaną pożywką dłu-żej niż 2 do 4 tygodni, natomiast w przypadku pożywekrozlanych do butelek lub probówek okres ten wynosi od3 do 6 miesięcy, jeżeli nie jest to inaczej podane w od-powiednich normach. Na podstawie wyników laboratoryj-nych badań walidacyjnych trwałości czas przechowywaniapożywek może być wydłużony. Zaleca się, aby pożywki,do których zostały dodane niesta-bilne suplementy, były użyte wdniu ich przygotowania. Inneokresy mogą być stosowane wprzypadku istnienia zapisów wodpowiednich normach lub gdywykazano w laboratoryjnych ba-daniach walidacyjnych dłuższyokres trwałości. Zaleca się, abystałe pożywki zawierające che-micznie reaktywne i/lub niestabilne substancje nie byłyprzechowywane na zapas w magazynie przed upłynnie-niem. Zaleca się, aby dla każdej pożywki przeznaczonejdo przechowywania była ustalona zwalidowana data trwa-łości/przydatności. Obserwować należy również wszelkiezmiany zabarwienia pożywki, oznaki jej parowania/od-wodnienia lub wzrost drobnoustrojów. Partie pożywek wy-kazujące takie zmiany nie powinny być stosowane wbadaniach. Przed użyciem lub dalszą obróbką cieplną za-leca się wyrównanie temperatury pożywki z temperaturąotoczenia.W przypadku pożywek gotowych należy przestrzegać za-leceń producenta w zakresie przechowywania, okresutrwałości i stosowania.

Przygotowanie stałych pożywek agarowych na płytkach Petriego

Agar rozlewać na płytki w taki sposób, aby grubośćwarstwy pożywki wyniosła przynajmniej 3 mm (do pły-tek Petriego o średnicy 90 mm zazwyczaj wlewa sięod 18 do 20 ml agaru). Płytki przykryć wieczkami i po-zostawić do zestalenia na wypoziomowanej chłodnejpowierzchni. Jeżeli płytki są przechowywane lub inku-bowane dłużej niż 72 h lub w temperaturze powyżej40°C, rozlewać większą objętość pożywki. W czasie in-kubacji posiewów dochodzi nieuchronnie do utratywody z pożywki agarowej, co w pewnych sytuacjachmoże wpływać na wzrost drobnoustrojów. Ważnymelementem GLP jest to, aby natychmiast po przygoto-waniu zużyć pożywkę agarową lub zapewnić takie wa-runki przechowywania, które chronią ją przed zmianą

składu, tj. przechowywać w ciemności i/lub w chło-dziarce w temperaturze 5°C ± 3°C w szczelnych to-rebkach.

Kontrola jakości pożywek

Do parametrów jakościowych o charakterze hodowlanymstosowanych w prowadzonych w zakresie tzw. kontroliszczegółowej zaliczyć należy: jałowość, żyzność, selektyw-ność, specyficzność cech biochemicznych i fizjologicznychi cechy umożliwiające prowadzenie badań w kierunkuobecności substancji hamujących.Kontrola właściwości fizycznych pożywek w laboratoriumobejmuje następujące parametry: pomiar odczynu pH wtemperaturze 20-25°C, pomiar objętości rozlanej pożywkilub grubość warstwy agarowej, wygląd zewnętrzny, zabar-wienie, stopień ujednolicenia składu, ocenę przejrzystości,występowanie optycznych artefaktów, zbadanie siły żelu-jącej, konsystencji i wilgotności pożywek agarowych.

Dla oceny jakości pożywek i skład-ników pożywkarskich w zakresiezapewnienia warunków dowzrostu stosuje się ocenę ilo-ściową i ocenę jakościową. Dlametod ilościowych zaleca się,ażeby dodatkowo stosować spe-cjalną, referencyjną pożywkę.Przy prowadzeniu oceny jako-ściowej stosowanie pożywki refe-

rencyjnej pomaga w interpretacji wyniku. Wyrazem kompleksowego podejścia do kwestii zapew-nienia jakości wytwarzanych pożywek są dołączone ane-ksy do normy ISO/DIS 11133/2012, a mianowicie:1. Aneks A – Nazewnictwo składników pożywek w nor-

mach z zakresu badania żywności, pasz iwody.

2. Aneks B – Schemat przygotowywania szczepu macie-rzystego i kultury roboczej.

3. Aneks C – Schemat przepływowy metod jakościowychi ilościowych badania jakości pożywek.

4. Aneks D – Przykładowa karta do rejestrowania wyni-ków kontroli pożywek w laboratorium.

5. Aneks E – Drobnoustroje testowe do oceny pożywekpowszechnie stosowanych w mikrobiologiiżywności.

6. Aneks E – Drobnoustroje testowe do oceny pożywekpowszechnie stosowanych w mikrobiologiiwody.

7. Aneks F – Stosowanie kart kontrolnych do monitoro-wania oceny ilościowej stałych pożywek.

8. Aneks H – Zapewnienie jakości pożywek.

Reasumując można stwierdzić, że proponowane do wdro-żenia wytyczne stanowią dobrą podstawę do dalszegopostępu w zakresie doskonalenia systemu zapewnieniajakości stosowanych pożywek mikrobiologicznych i pod-noszenia poziomu wiarygodności wyniku badania labora-toryjnego.

Piśmiennictwo u Autora.

6

GETRÄNKEINDUSTRIE: Jakie były powody, dla którychEckes-granini zakupiło szybki system mikrobiologicznychanaliz w zapewnieniu jakości?

Elke Karches: Z powodu nowej strategii marketingowejoraz zmieniających się wymagań klientów na początku 2004roku zmieniono opakowania produktów Eckes-granini z tra-dycyjnych butelek na nowoczesne butelki PET. Podstawą tej zmiany jest nowa technologia napełnianiawymagająca aseptycznych warunków pracy. W przeciw-ieństwie do tradycyjnego, ciepłego napełniania, asep-tyczne, zimne napełnianie nie zabezpiecza przeciwzanieczyszczeniom przez oddziaływanie termiczne. Oznacza to, że każde zanieczyszczenie mikrobiologicznemoże powodować zepsucie produktu. Oprócz komple-ksowych badań kontrolnych w czasie produkcji, badaniamikrobiologiczne procesu produkcyjnego oraz wyrobówgotowych odgrywają kluczową rolę w ocenie higieny za-kładu produkcyjnego. Aby móc jak najszybciej wydawaćatesty dotyczące jałowości, zdecydowaliśmy się na wdro-żenie systemu szybkiej analizy mikrobiologicznej razemz instalacją linii PET.

GI: Dlaczego zdecydowaliście się na wdrożenie systemuD-Count firmy Chemunex?

Karches: Chcieliśmy aby szybkie metody badań spełniałynastępujące wymogi: – w pełni automatyczne badanie próbek,– wykrywanie możliwie niskich poziomów zanieczyszczeń,– wykrywanie wszystkich mikroorganzimów, które mogą

powodować zepsucie produktu,– pewność i odtwarzalność wyników.

Badania porównawcze różnych systemów dostępnych narynku wykazały, że D-Count jest najlepszym systememspełniającym nasze wymagania.

GI: Jak przebiegał proces wprowadzenia systemu szyb-kich analiz mikrobiologicznych? Jakie aspekty należy roz-ważyć przed i w trakcie instalacji?

Karches: W każdym przypadku metoda powinna być wa-lidowana w porównaniu z metodą stosowaną wcześniej.W tym celu wykonano pracę badawczą w Eckes-granini.Badane produkty kontaminowano różnymi drobnoustro-jami, następnie wykonano analizę polegającą na wykryciuwzrostu mikroorganizmów z zastosowaniem metod kla-sycznych oraz z użyciem cytometru. Ponieważ wykazanodobrą zgodność wyników, metoda mogła być wybranajako standardowa w badaniach.

now

e te

chno

logi

e

Czuła analiza w kilka minutZwolnienie napojów dzięki automatycznym cytometrom przepływowymObecnie w dobie szybkich analiz, bezpieczne i szybkie zwolnienie produktów staje się coraz bardziej znaczącymczynnikiem. Z uwagi na to, że klasyczna mikrobiologia ograniczona jest stopniem wzrostu mikroorganizmów na podłożachhodowlanych, mikrobiologiczne systemy szybkich analiz w ciągu ostatnich pięciu lat cieszyły się coraz większymzainteresowaniem. GETRÄNKEINDUSTRIE przeprowadziło wywiad z Elke Karches, liderką działu mikrobiologii wEckes-granini, w kontekście zastosowania automatycznych cytometrów przepływowych do zwalniania badanychwyrobów gotowych.

D-Count jest automatycznym cytometrem przepływowym przeznaczonym do laboratoriów o średniej i dużej przepustowości próbek.

7

Dużą zaletą takiego podejścia było to, że badania z uży-ciem nowego urządzenia wykonywane były przez osobę,która na co dzień nie jest związana z pracą w laborato-rium. Pozwoliło to na wysunięcie obiektywnych wnioskówz doświadczeń, które mogły być następnie przekazaneinnym użytkownikom. Testowana metoda była walido-wana, zanim dokonano instalacji linii PET. Dzięki temu po-czątkowe problemy mogły być rozwiązane na samympoczątku badań, jak również możliwe było sprawdzeniecytometru w rutynowej pracy.

GI: W jakich sektorach produkcji D-Count posiada największe zalety?

Karches: Obecnie zastosowanie wspomnianych testówjest ograniczone do badania wyrobów gotowych. W kon-tekście przyszłego rozwoju testujemy bardzo dużą liczbęaplikacji .

GI: W jaki sposób metoda jest stosowana i jak wpływaona na zwolnienie produktu?

Karches: Dzięki badaniom sprawdzającym, które zostałyopracowane w kontekście wspomnianej wcześniej pracynaukowej, wykazano że nawet wolno-rosnące drobnou-stroje mogą być wykryte. Próby są inkubowane w warun-kach tlenowych przez 72 godziny, następnie poddawanesą badaniom w D-Count i jeśli wyniki są ujemne, produktymogą być natychmiast zwolnione. W ten sposób naszafirma zyskuje około pięciu dni w porównaniu z tradycyjnąmetodą płytkową.

GI: Czy stosujecie Państwo równolegle klasyczną metodębadań na podłożach hodowlanych?

Karches: Na początku wykonywane były badania porów-nawcze na płytkach i równolegle z użyciem cytometru.Z powodu zgodności wyników oraz zwiększającej się pew-ności wyników uzyskiwanych w badaniach z użyciem cy-tometru mogliśmy zrezygnować z badań klasycznych.

GI: Czy widzi Pani zalety nowej metody tylko w zapew-nieniu jakości, czy są też zalety dla firmy jako całości?

Karches: Dzięki wynikom z szybkiej analizy mikrobiolo-gicznej możliwa była redukcja czasu kwarantanny, co przy-czyniło się do zwiększenia przestrzeni magazynowej,równocześnie zapewniając stały, krótki czas dostawy. Jed-nocześnie wyniki z analizy mikrobiologicznej, które mogąbyć traktowane jako czuły czujnik w czasie rzeczywistym,dostarczają informację odnośnie higieny procesu napeł-niania.

GI: Mrs. Karches, dziękuję bardzo za rozmowę.

BactiFlow, jest półautomatycznym, najlepszym rozwiązaniem dla ma-łych i średnich serii.

W pełni zautomatyzowany cytometr przepływowyOferowany przez firmę Chemunex system D-Count® przeznaczony do mi-krobiologicznego zwalniania napojów oraz wsadów owocowych, będąc wpełni zautomatyzowanym cytometrem przepływowym, zapewnia automa-tyczne przygotowanie próbki, prostotę obsługi, bardzo czułą analizę ilościowąw czasie kilku minut .Zasadniczo czas zwolnienia produktu jest zredukowanyo dwa do pięciu dni.

Cytometry przepływowe umożliwiają badania wszystkich produktów gazowa-nych – napojów zawierających wsady owocowe, jak również napojów alko-holowych – zasadniczo bez interferencji pochodzącej od produktu. Poza tymmetoda ta wykrywa również żywe mikroorganizmy, które nie wzrastają na od-powiednich podłożach hodowlanych (żywe, ale nie dające się hodować).

System automatycznie znakuje mikroorganizmy obecne w produkcie za po-mocą opatentowanego markera Fluorassure, który zapewnia wiarygodne roz-różnienie pomiędzy żywymi a martwymi komórkami.

Po wyznakowaniu mikroorganizmów próbka jest automatycznie wstrzykiwanado przepływu w świetle lasera w automatycznym cytometrze przepływowym.Tutaj wyznakowane mikroorganizmy przepływają jeden po drugim w strumie-niu światła lasera i są wykrywane przez czułe fotodetektory. Następnie wynikianalizy podawane są jako komórki na gram lub mililitr.

Obecnie w branży napojów w D-Count® stosowane są następujące aplikacje:

Zwolnienie po produkcji:

Wykrywanie drożdży i bakterii w napojach poddawanych filtracji 48 godzin

Wykrywanie drożdży w napojach poddawanych filtracji 22 godziny

Wykrywanie ogólnej liczby drobnoustrojów w napojach niepoddawanych filtracji 72 godziny

Wykrywanie ogólnej liczby drobnoustrojów w koncentratach 48 godzin

Badania jałowości w produktach UHT 48 godzin

Wykrywanie ogólnej liczby drobnoustrojów w wodzie 30 minut

Specyficzne wykrywanie Enterobacteriaceae w wodzie 10 minut

Specyficzne wykrywanie Alicylobacillus w wodzie i koncentratach 48 godzin

Wydajność automatycznego cytometru przepływowego pozwala na wykona-nie od 250 do 1000 analiz w ciągu jednej zmiany roboczej, zależnie od rodzajuaplikacji. System może być obsługiwany przez jedną osobę.

8

kont

rola

żyw

nośc

i

Wprowadzenie

Maślanki są chętnie spożywane przez konsumentów, a ichudział w segmencie produktów mleczarskich jest corazwiększy. W celu poprawy atrakcyjności producenci oferująmaślanki smakowe, zawierające aromaty i wsady owo-cowe lub czekoladowe. Produkty tego rodzaju z punktuwidzenia analizy mikrobiologicznej stanowią stosunkowotrudną matrycę. Typową, charakterystyczną mikrobiotęmlecznych napojów fermentowanych tworzą bakterie fer-mentacji mlekowej. Równocześnie mogą występowaćbakterie z grupy coli, a monitorowanie obecności tychostatnich stanowi cześć oceny czystości sanitarnej żywno-ści. Produkty te mogą także zawierać grzyby mikrosko-powe. Drożdże i pleśnie wprowadzane są głównie zwsadami owocowymi, a dodatki słodzące i czekoladowemogą być zanieczyszczone grzybami osmofilnymi lubosmotolerancyjnymi. Zarówno drożdże, jak i pleśnie, sta-

nowią niepożądane elementy tego układu mikroorganiz-mów, a ich obecność może ujawniać się nawet pod dłu-gim okresie przechowywania produktów w warunkachchłodniczych.Poziom drożdży i pleśni w produktach spożywczych jestjednym z kluczowych wskaźników jakości mikrobiologicz-nej QI (ang. Quality Indicators). Ze względu na znaczniedłuższy czas generacji grzybów w porównaniu do czasugeneracji bakterii, wykrycie ich obecności trwa od 3 do 5dni. Standardowe płytkowe metody analizy mikrobiolo-gicznej umożliwiają podanie osobno liczby drożdży i liczbypleśni, ale charakteryzują się dużą bezwładnością odczytu.W praktyce trwałość produktu zwykle determinowana jestrozwojem równocześnie obu tych grup drobnoustrojów itylko nieliczni odbiorcy wymagają ich rozróżnienia. Skró-cenie czasu analizy możliwe jest jedynie w przypadku mo-nitorowania metabolitów tworzonych podczas wzrostugrzybów mikroskopowych.

Oznaczanie liczby drożdży w wybranych fermentowanych produktach mleczarskich z wykorzystaniem systemu TEMPO® YMAlina Kunicka-Styczyńska1, Jacek Charliński21 Instytut Technologii Fermentacji i Mikrobiologii Politechniki Łódzkiej2 bioMérieux, Polska

9

Test YM systemu TEMPO® stanowi alternatywę dla metodkonwencjonalnych. Test ten jest zgodny ze standardemISO 21527 oraz BAM (Rozdział 1 Bacteriological Analyti-cal Manual) [4] i zapewnia wiarygodność porównywalnąz tymi metodami referencyjnymi. Zaletą testu jest nie tylkołatwość wykonania bez konieczności prowadzenia od-dzielnych wysiewów dla określenia liczby drożdży i pleśniosmotolerancyjnych, ale również zapewnienie wiarygod-nego odczytu już po 72 godzinach inkubacji. Zasada testuopiera się na odczycie sygnału fluorescencyjnego gene-rowanego w obecności metabolitów grzybów przy brakuinterferencji enzymów zawartych w produkcie oraz nieza-leżnie od pH badanej matrycy. Według zaleceń produ-centa test YM może być wykorzystywany w badaniachszerokiej gamy produktów, w tym produktów mleczarskichnie zawierających mikroorganizmów wprowadzanych jakoelement procesu technologicznego. Ponieważ maślankinie spełniają tego założenia, konieczna jest modyfikacjaprocedury przygotowania próbki przed jej wprowadze-niem do karty systemu TEMPO®.Celem prezentowanych badań była modyfikacja protokołuprzygotowania próbek dla zapewnienia wiarygodnegooznaczenia liczby drożdży w maślankach. W badaniach,oprócz maślanki niezawierającej dodatków, badano mat-ryce zawierające wsad owocowy lub czekoladowy. Dla wy-eliminowania wpływu bakterii mlekowych podczasprzygotowania próbek wprowadzano roztwór dezoksycho-lanu sodu lub nadtlenku wodoru.

Materiał i metody badań

Matryce żywności. W badaniach wykorzystano konfek-cjonowane, pochodzące z handlu detalicznego maślankiw trzech asortymentach: bez dodatków smakowych, z do-datkiem wsadu owocowego oraz z dodatkiem wsadu cze-koladowego. Wszystkie matryce kontaminowano poprzezwprowadzenie drożdży Candida kefyr, pochodzących zKolekcji Czystych Kultur Instytutu Technologii Fermentacjii Mikrobiologii Politechniki Łódzkiej ŁOCK 105.Pożywki. Do oznaczenia liczby drożdży metodą płytkowąstosowano pożywkę YGC (bioMérieux).Płyny do rozcieńczeń. Zawiesiny drożdży oraz rozcień-

czenia próbek wykonywano w buforowanej wodzie pep-tonowej (bioMeriéux).Odczynniki. Bezpośrednio przed oznaczeniem do próbekdodawano 800 µL 3% roztworu nadtlenku wodoru(H2O2) lub 2 ml roztworu dezoksycholanu sodu. Roztwórdezoksycholanu sodu przygotowano przez rozpuszczenie2,5 g związku (Sigma) w 100 ml sterylnej wody destylo-wanej.Metody badań. Oznaczenia liczby drożdży prowadzonorównolegle metodą płytkową oraz z wykorzystaniem sys-temu TEMPO® YM.

Wyniki i dyskusja

Oznaczenia poziomu mikroorganizmów saprofitycznych,w tym również drożdży i pleśni, dla wielu producentówmlecznych produktów fermentowanych stanowi jeden zkluczowych parametrów oceny nie tylko bezpieczeństwaproduktu, ale również jego trwałości. Drożdże stanowiąpotencjalne zagrożenie dla trwałości maślanek, a produ-cenci są zainteresowani wczesnym wykryciem ich obec-ności w gotowym produkcie. Proponowane przez nasmodyfikacje protokołu oznaczenia liczby drożdży z wyko-rzystaniem testu TEMPO® YM mają na celu ułatwieniemonitorowania czystości mikrobiologicznej maślanek. Po-mimo, że pożywka przeznaczona do wykrywania grzybówzawiera składniki hamujące rozwój bakterii, nie możnawykluczyć wpływu bakterii mlekowych wprowadzanychjako kultury starterowe i namnożonych podczas produkcjimaślanek. W celu wzmocnienia efektu inhibicji bakteriiwnoszonych z matrycą żywności przed napełnieniemkarty do zawiesiny podstawowej dodawano roztwór dez-oksycholanu sodu (Rysunek 1) lub nadtlenku wodoru(Rysunek 2) i inkubowano odpowiednio przez 5 lub 10minut. Równolegle, oznaczenia liczby drożdży prowa-dzono metodą płytkową. Odniesienie stanowiła próbkamaślanki bez dodatku dezoksycholanu sodu i nadtlenkuwodoru. Dla sprawdzenia ewentualnego wpływu dodat-ków smakowych na wiarygodność oznaczenia do badańwykorzystano oprócz maślanki bez dodatków maślankizawierające wsad owocowy i wsad czekoladowy. Ponie-waż w produktach handlowych, w 1 g, stwierdzano obec-

Rysunek 1. Procedura oznaczania liczby drożdży w maślancez wykorzystaniem systemu TEMPO® YM z dodatkiem dezoksy-cholanu sodu.

10 g próbki żywności + 90 ml wody peptonowej

+ 2ml roztworu dezoksycholanu sodu (25g/l)

inkubacja 5 minut

0,1 ml lub 1 ml do pożywki TEMPO® YM

napełnienie karty TEMPO® YM, inkubacja 28°C, 72 h

Rysunek 2. Procedura oznaczania liczby drożdży w maślancez wykorzystaniem systemu TEMPO® YM z dodatkiem nad-tlenku wodoru.

10 g próbki żywności + 90 ml wody peptonowej

+ 800 µL roztworu nadtlenku wodoru (3%)

inkubacja 10 minut

0,1 ml lub 1 ml do pożywki TEMPO® YM

napełnienie karty TEMPO® YM, inkubacja 28°C, 72 h

10

ność pojedynczych komórek drożdży, zatem wszyst-kie próbki dodatkowo zanieczyszczano drożdżamiCandida kefyr. Badania przeprowadzono dla maśla-nek niezanieczyszczanych, gdzie w 1 g produktuznajdowano do 10 komórek drożdży oraz zanie-czyszczanych drożdżami do poziomów 102 komó-rek/g oraz 103 komórek/g. Zgodność wynikówpomiędzy metodą płytkową oraz metodą TEMPO®

podano jako różnice liczby drożdży w jednostkachlogarytmicznych.Wyniki badań zostały zamieszczone w Tabeli 1 a oce-na zgodności metod w Tabeli 2. Dla próbek nieza-nieczyszczonych stwierdzono pełną zgodnośćwyników, niezależnie od stosowanego protokołubadań. Wprowadzenie 3% roztworu nadtlenkuwodoru do próbki skutkowało niedoszacowaniemliczby oznaczonych drożdży. Równocześnie wynikiuzyskane metodą TEMPO® oraz metodą płytkowąróżniły się od 0,4 do 2 jednostek logarytmicznychprzy zanieczyszczeniu próbek drożdżami do poziomu102 komórek w 1 g. Dziesięciokrotne zwiększeniepoziomu zanieczyszczenia powodowało wzrost rozrzutuwyników do 3,18 jednostek logarytmicznych.Dodatek dezoksycholanu sodu nie zakłócał odczytu sys-temu TEMPO® YM, a oznaczona liczba drożdży w porów-naniu z metodą płytkową różniła się od 0,04 do 0,45jednostki logarytmicznej i nie zależała od poziomu zanie-czyszczenia drożdżami (Tabela 2). Biorąc pod uwagę, żew analizie mikrobiologicznej wyniki liczebności populacjidrobnoustrojów różniące się poniżej 0,5 jednostki loga-rytmicznej uznawane są jako zgodne, proponowany pro-tokół oznaczenia jest prawidłowy. Ponadto, dodanyzwiązek nie wpływał na żywotność populacji drożdży za-nieczyszczających maślanki.Przy zastosowaniu obu protokołów badań nie stwierdzonointerferencji dodatków smakowych maślanek i sygnałufluorescencyjnego systemu TEMPO®. Zatem wprowadze-nie wsadu owocowego lub czekoladowego nie miałowpływu na wiarygodność oznaczenia liczby drożdży tes-tem TEMPO® YM.

Przeprowadzone badania jednoznacznie wskazują na pra-widłowość oznaczenia liczby drożdży zanieczyszczającychmaślanki za pomocą systemu TEMPO®, z zastosowaniemprotokołu obejmującego wstępną inkubację roztworupodstawowego produktu z dodatkiem dezoksycholanusodu.

Podsumowanie

System TEMPO® umożliwia monitorowanie wskaźnikówkontroli jakości mikrobiologicznej żywności w warunkachprzemysłowych i przeznaczony jest do badania większo-ści produktów spożywczych. Odczyt systemu może byćjednak zakłócony obecnością tzw. mikroorganizmówtechnologicznych, stanowiących integralny element pro-duktu, tak jak w przypadku mlecznych napojów fermen-towanych. Wprowadzenie procedury uwzględniającejinkubację rozcieńczenia podstawowego próbki wraz zroztworem dezoksycholanu sodu pozwala na rozszerze-nie wykorzystania systemu TEMPO® do oznaczania

liczby drożdży zanie-czyszczających maślanki.Obecność dezoksycho-lanu sodu nie wpływa nażywotność i aktywnośćmetaboliczną drożdży, arównocześnie elimino-wana jest interferencjabakterii mlekowych znaj-dujących się w produk-cie. Przeprowadzonebadania wskazują namożliwość zastosowaniatakiej procedury równieżdo badania maślanek zwsadem owocowymoraz czekoladowym.

Pismiennictwo u Autorów

Tabela 1. Porównanie metod oznaczenia obecności drożdży Candida kefyr w maślankach.

Tabela 2. Różnice w odczycie liczby drożdży Candida kefyr w maślan-kach w oznaczeniach metodą TEMPO® YM i metodą płytkową.

Maślanka Liczba komórek* [CFU/g]

Próbka Próbka Próbkabezpośrednia + H2O2 + dezoksycholan sodu

Rodzaj Poziom YGC TEMPO® YM YGC TEMPO® YM YGCzanieczyszczenia**

Bez dodatków 0 0 <10 0 <10 0102 1,9×102 10 0 1,3×102 1,9×102

103 4,5×103 1,5×103 1,0×102 2,9×103 4,5×103

Z wsadem 0 1 <10 1 <10 4owocowym 102 1,0×102 <10 0 1,4×102 1,0×102

103 4,1×103 3,2×103 30 5,1×103 4,1×103

Z wsadem 0 4 <10 4 <10 4czekoladowym 102 80 43 1 55 80

103 5,0×103 1,0×102 0 5,5×103 5,0×103

Oznaczenia: * wynik podano jako średnią arytmetyczną 4 powtórzeń** zanieczyszczenie drożdżami Candida kefyr

Maślanka Protokół oznaczenia

Rodzaj poziom z nadtlenkiem z dezoksycholanem zanieczyszczenia* wodoru sodu

Bez dodatków 0 ± 0 log ± 0 log102 ± 0,40÷1,04 log ± 0,10÷0,25 log103 ± 0,65÷1,10 log ± 0,20÷0,43 log

Z wsadem 0 ± 0 log ± 0 logowocowym 102 ± 2,00 log ± 0÷0,06 log

103 ± 1,50÷1,87 log ± 0,04÷0,10 log

Z wsadem 0 ± 0 log ± 0 logczekoladowym 102 ± 0,40÷0,90 log ± 0÷0,29 log

103 ± 2,70÷3,18 log ± 0,03÷0,19 log

Oznaczenia: * zanieczyszczenie drożdżami Candida kefyr

11

Marcy l’Etoile, France – Kwiecień 17, 2013 – bioMérieux,światowy lider w diagnostyce in vitro, wprowadzaTEMPO® AC, nowy automatyczny test, który umożliwialiczenie ogólnej liczby drobnoustrojów w żywnościi próbkach środowiskowych w ciągu 24. godzin. Dziękiw pełni automatycznemu odczytowi, nowy test TEMPOpozwoli laboratoriom sektora rolno-spożywczego zaosz-czędzić czas oraz szybciej uwolnić ich produkty. TestTEMPO AC został już zwalidowany przez AOAC RI (Re-search Institute).

Innowacyjność testu TEMPO AC

Nowy test TEMPO AC umożliwia liczenie ogólnej liczbydrobnoustrojów w ciągu jedynie 24. godzin. Dzięki ta-kiemu rozwiązaniu laboratoria mogą znacznie szybciejudzielić informacji swoim klientom, szybciej zaplanowaćdziałania korekcyjne w przypadku wyników poza zakresemspecyfikacji oraz znacznie skrócić czas uwolnienia pro-duktu na rynek, gdzie pozytywne uwolnienie jest wymo-giem.

“Automatyczny system TEMPO spełnia potrzeby naszychklientów w branży spożywczej zapewniając zmniejszeniekosztów przez redukcję czasu analizy oraz robocizny wporównaniu z metodami tradycyjnymi,” twierdzi Jean-Marc Durano, Wiceprezes, Mikrobiologii Przemysłowej.„Nowy test TEMPO obrazuje zobowiązanie bioMérieux,aby ciągle proponować rozwiązania, które wpływają napoprawę bezpieczeństwa żywności.”

W pełni zautomatyzowany system TEMPO, oparty na tra-dycyjnej metodzie NPL (Najbardziej PrawdopodobnaLiczba), zapewnia optymalną wygodę dla użytkownika, re-dukcję czasu analizy oraz efektywne skrócenie czasu uzys-kania dokładnych wyników. TEMPO AC (liczba mikroflorytlenowej) jest dopełnieniem systemu TEMPO, zapewnia-jąc spełnienie potrzeb w badaniach najczęstszych wskaź-ników jakości: TEMPO EC (Escherichia coli), TEMPO TC(Ogólna Liczba Coliform), TEMPO CC (Liczba Coliform),TEMPO STA (Staphylococcus), TEMPO EB (Enterobacte-riaceae), TEMPO YM (Drożdże i Pleśnie) i TEMPO LAB(Bakterie Mlekowe).

TEMPO uzyskał już walidację AC AOAC RI do badaniaszerokiej gamy produktów żywnościowych, karmy dlazwierząt domowych i próbek środowiskowych.

Więcej informacji uzyskacie Państwo na stronie: www.biomerieux-industry.com/tempo

Ogólna mikroflora tlenowa

Analiza ilościowa ogólnej, tlenowej mikroflory stanowi25% dziennych analiz w laboratoriach mikrobiologicz-nych. Pozwala ona na ogólną oceną zanieczyszczenia pro-duktu i dlatego stanowi handlowy i higieniczny wskaźnikjakości. Tradycyjna metoda, w której stosuje się płytki PCAjest pracochłonna, czasochłonna, wyniki uzyskuje się po48 godzinach według BAM oraz po 72 godzinach wedługISO. To powoduje, że metoda ta powoduje wysokie ob-ciążenie pracą w laboratorium.

now

ość

w o

ferc

ie

bioMérieux wprowadza nowy test TEMPO AC® do szybkiego liczenia ogólnej liczby drobnoustrojów w żywności

12

TEMPO AC

ISO 16140 VALIDATION

# BIO 12/35-05/13

End of validity. 23-May_2017

NEWbioMérieux z przyjemnością zawiadamia, że nowy test

TEMPO® AC uzyskał walidacjęISO 16140

do liczenia tlenowej mezofilnej mikroflory

w żywości i próbach środowiskowych

n TEMPO® AC pozwala na liczenie tlenowej mikroflory w cza-sie 24-48 godzin

n Wyniki w ciągu 24 godzin dla specyficznych matryc(surowe mięso, drób, wycinki z tusz, owoce, warzywa,żywność gotowa do spożycia)

n Szerki zakres badanych matryc (żywność, karma dla zwierzątdomowych, próbki środowiskowe)

n Bardzo dobra zgodność wyników z ISO 4833

TEMPO® zapewnia

iii optymalizację zarządzania personelem

iii zmniejszenie pracochłonnościiii uzyskanie dokładnych wyników w krótszym czasie

iii efektywniejsze śledzenie zmian próbki

13

Enterotoksyczne szczepy gronkowców są jedną znajczęstszych przyczyn zatruć pokarmowych u ludzi.Zdolność do wytwarzania enterotoksyn mają głów-nie koagulazo-dodatnie izolaty należące do rodzajuStaphylococcus, przede wszystkim S. aureus. Dotych-czas poznano ponad 20 rodzajów enterotoksyn gron-kowcowych. Największe znaczenie w patogenezieintoksykacji pokarmowych u ludzi ma enterotoksynaA (SEA – Staphylococcal Enterotoxin A), która jest od-powiedzialna za wystąpienie ponad 75% przypadkówgronkowcowych zatruć pokarmowych (SFP – Staphy-lococcal Food Poisoning). W dalszej kolejności istotnąrolę odgrywają również enterotoksyny B (SEB), C (SEC)i D (SED). Ilość enterotoksyny niezbędna do wywoła-nia objawów chorobowych zależy od indywidualnejwrażliwości osobniczej, spożytej ilości oraz ogólnegostanu zdrowia osoby zakażonej. Przyjmuje się, żedawka wywołująca objawy zatrucia wynosi od 20 do100 ng. Intoksykacje na tle gronkowcowym charakte-ryzują się krótkim okresem inkubacji wynoszącym jużod 30 minut do około 8 godzin. Dominującymi obja-wami klinicznymi są: ból głowy, nudności i gwałtownewymioty, którym towarzyszą bóle brzucha i biegunka.Objawy działania enterotoksyn zwykle samoistnieustępują po kilku lub kilkunastu godzinach. Najcięższyprzebieg SFP obserwuje się u małych dzieci, osóbstarszych lub przyjmujących leki immunosupresyjne.Enterotoksyny gronkowcowe, w przeciwieństwie dobakterii S. aureus, są oporne na wysoką temperaturęjak też na enzymy proteolityczne, odwodnienie, pro-mieniowanie gamma oraz szeroki zakres pH. Dziękitym cechom nie są dezaktywowane podczas termicz-nej obróbki żywności i pozostają aktywne, podczasgdy bakterie S. aureus są niszczone.

Organem zajmującym się oceną ryzyka w zakresie bez-pieczeństwa żywności i pasz w Unii Europejskiej (UE) jestEuropejski Urząd ds. Bezpieczeństwa Żywności (EFSA).Od 2005 r. publikuje on corocznie raporty dotyczące wy-stępowania chorób odzwierzęcych (zoonoz) u ludzi orazich czynników etiologicznych. Opublikowany w bieżącymroku Raport EFSA obejmuje epidemie zatruć pokarmo-wych na tle toksyn bakteryjnych występujących na terenieUE w 2011 r. Według zawartych tam informacji, pocho-dzących z 25 krajów UE, toksyny bakteryjne były odpo-wiedzialne za 730 spośród 5648 zgłoszonych epidemii

zatruć pokarmowych (12,9%), co stawia je na drugimmiejscu po epidemiach wywołanych przez Salmonella(26,6%). Dalej wysoki odsetek stanowiły zachorowaniaepidemiczne wywołane przez Campylobacter (10,6%)i wirusy (9,3%). Wśród toksyn bakteryjnych, enteroto-ksyny gronkowcowe, obok toksyn Bacillus i Clostridium,były odpowiedzialne za 345 spośród zidentyfikowanychepidemii zatruć pokarmowych (47,3%). Masowe zatruciana tym tle stanowiły 6,1% wszystkich epidemii zatruć po-karmowych. Liczba zachorowań wzrosła o 25,9% w po-równaniu z 2010 r., kiedy odnotowano 274 epidemie.Wśród odnotowanych epidemii 35 z nich (10,1%) pod-dano szczegółowej weryfikacji i stwierdzono 394 przypad-ków gronkowcowych zatruć pokarmowych, z czego27,9% było hospitalizowanych. Nie odnotowano nato-miast zgonów. Najwyższy odsetek epidemii wywołany byłspożyciem żywności mieszanej zanieczyszczonej entero-toksynami gronkowcowymi. Drugą kategorią żywności po-wodującą zatrucia pokarmowe na tym tle były wyrobypiekarnicze (Tabela 1).Z danych Narodowego Instytutu Zdrowia Publicznego -Państwowego Zakładu Higieny wynika, że w Polscemożna zaobserwować tendencję spadkową zarówno coliczby bakteryjnych zatruć pokarmowych, jak również wstosunku do intoksykacji gronkowcowych. Największąliczbę przypadków zatruć pokarmowych wywołanychprzez enterotoksyny gronkowcowe w latach 2005 – 2012odnotowano w 2005 r. i wynosiła ona 658 przypadków.

kont

rola

zyw

nośc

i

Enterotoksyny gronkowcowe – zagrożenie mikrobiologiczne i wykrywanieJolanta G. Rola, Weronika Korpysa-Dzirba

Rodzaje produktów Udział w wywoływaniu

SFP (%)

Produkty mieszane 40,0

Produkty piekarnicze 11,4

Sery 8,6

Inne produkty, mieszane, mięso drobiowe 8,6i produkty pochodne

Produkty mleczne za wyjątkiem serów 5,7

Inne produkty np. mięso brojlerów (Gallus 25,7gallus i produkty pochodne, mięso i produktypochodne, jaja, orzechy, migdały, warzywa i soki)

Tabela 1. Produkty związane z gronkowcowymi zatruciamipokarmowymi (N=35) – wg. raportu EFSA za 2011.

Przez kolejne 4 lata liczba ta zmniejszała się, a w 2009 r.stwierdzono 146 przypadków zachorowań. W latach2010 – 2011 liczba gronkowcowych zatruć pokarmo-wych wzrosła odpowiednio do 217 przypadków w 2010roku i 283 w roku 2011. Wstępne dane za 2012 r.wskazują na odnotowanie 147 przypadków zachoro-wań. Największą ich liczbę stwierdza się w miesiącachletnich – w drugim, a szczególnie w III kwartale roku.Metody wykrywania enterotoksyn gronkowcowych możnapodzielić na 3 grupy: próby biologiczne, techniki biologiimolekularnej oraz testy immunologiczne. Próby biolo-giczne, ze względu na ograniczenia natury etycznej orazniską czułość, nie są obecnie wykorzystywane do charak-terystyki gronkowcowych zatruć pokarmowych. Metodybiologii molekularnej zwykle opierają się na wykorzystaniutechniki PCR i umożliwiają wykrycie genów kodujących SEw szczepach wyizolowanych z zanieczyszczonej żywności.Najczęściej jednak do wykrywania SE w żywności stosujesię techniki immunologiczne, np. ELISA, ELFA (enzyme-linked fluorescent assay), RPLA (reverse passive latex ag-glutination). Komercyjne testy ELISA i ELFA umożliwiająwykrycie pięciu odmian enterotoksyn: SEA – SEE, a wprzypadku RPLA jedynie czterech: SEA – SED. Zgodnie z obowiązującymi kryteriami mikrobiologicznymi,

zapisanymi w Rozporządzeniu Komisji (WE) Nr 2073/2005z dnia 15 listopada 2005 r. w produktach takich jak sery,mleko w proszku i serwatka w proszku, w przypadku gdyspodziewana liczba S. aureus w czasie procesu produkcjibędzie wyższa niż 105 jtk/g, istnieje obowiązek przeprowa-dzenia badań w kierunku obecności enterotoksyn gronkow-cowych. W rozporządzeniu tym metodą wskazaną jako referen-cyjna w zakresie wykrywania enterotoksyn gronkowco-wych jest Europejska Metoda Skriningowa (ESM –European Screening Method). Aktualnie obowiązujewersja 5. metody z września 2010 r. (Schemat 1).W 2010 roku Laboratorium Referencyjne Unii Europejskiejds. gronkowców koagulazo-dodatnich w tym S. aureus(EU-RL CPS – European Screening Method) przeprowa-dziło walidację wewnątrzlaboratoryjną metody ESM wy-krywania enterotoksyn gronkowcowych w żywnościprowadząc badania z zastosowaniem testu Vidas SET 2(metoda odniesienia) i testu Ridascreen SET Total (me-toda alternatywna). Uzyskano satysfakcjonujące wynikioceny.W celu potwierdzenia przydatności obu testów do detekcjienterotoksyn w 2011 roku przeprowadzono porównaniamiędzylaboratoryjne. W porównaniach dotyczących wy-

Tabela 2. Czułość, specyficzność i dokładność europejskiej metody skriningowej – wykrywanie w mleku i produktach mlecz-nych wg. raportu, EU-RL CPS z 2011 r.

Badania międzylaboratoryjne

Poziom zanieczyszczenia DC + Ridascreen SET Total DC + Vidas SET2

0 ng/g Specyficzność SP=99% Specyficzność SP=99%

0,04 ng/g Czułość SE=52% Czułość SE=99%

0,26 ng/g Czułość SE=99% Czułość SE=99%

Względna dokładność AC relative =84%

Badania wewnątrzlaboratoryjne

Dokładność AC=97%

Względna specyficzność SP relative =97%

Względna czułość SE relative =97%

DC – dializa/koncentracja

14

Tabela 3. Czułość, specyficzność i dokładność europejskiej metody skriningowej – wykrywanie w żywności innej niż mlekoi produkty mleczne wg. raportu, EU-RL CPS z 2011 r.

Badania międzylaboratoryjne

Poziom zanieczyszczenia DC + Ridascreen SET Total DC + Vidas SET2

Poziom zerowy Specyficzność SP=96% Specyficzność SP=100%

Poziom niski 0,5 ng/g Czułość SE=93% Czułość SE=100%

Poziom wysoki 1,25ng/g Czułość SE=100% Czułość SE=100%

Badania wewnątrzlaboratoryjne

DC + Ridascreen SET Total DC + Vidas SET2

Dokładność AC=91% Dokładność AC=96%

Względna specyficzność SP relative =89% Względna specyficzność SP relative =96%

Względna czułość SE relative =97% Względna czułość SE relative =97%

DC – dializa/koncentracja

15

krywania enterotoksyn w mleku i produktach mlecznychuczestniczyło 13 laboratoriów. Każdy z uczestników ana-lizował 24 próbki sera z surowego mleka krowiego, natu-ralnie zanieczyszczonego enterotoksyną gronkowcowątypu D (8 próbek na każdym z 3 poziomów zanieczysz-czenia). Stężenie enterotoksyny określone własną metodąpotwierdzającą wynosiło odpowiednio 0 ng/g, 0,04 ng/gi 0,26 ng/g. Walidację metody przeprowadzono zgodniez normą EN ISO 16140 określając jej czułość, specyficz-ność i dokładność. Względna dokładność wyników uzys-kanych metodą Ridascreen SET Total na niskim poziomiezanieczyszczenia wyniosła jedynie 52%. Ze względu naniezadowalające wyniki porównań ta metoda detekcji niejest aktualnie zalecana przez Europejskie Laboratorium

Referencyjne do wykrywania enterotoksyn gronkowco-wych w mleku i produktach mlecznych. W badaniach międzylaboratoryjnych obejmujących żyw-ność inną niż mleko i produkty mleczne uczestniczyło13 laboratoriów. Analogicznie badania przeprowadzonona 24 próbkach gotowanej szynki zanieczyszczonychenterotoksyną gronkowcową typu E (8 próbek na każ-dym z 3 poziomów zanieczyszczenia – 0 ng/g, 0,5 ng/gi 1,25 ng/g). W przypadku obu testów wyniki porównańbyły zadowalające. Czułość, specyficzność i dokładnośćprzekraczała 90%. W oparciu o uzyskane wyniki badańEU-RL CPS wydało pozytywną opinię na temat ich zasto-sowania do detekcji enterotoksyn gronkowcowych w żyw-ności innej niż mleko i produkty mleczne metodą ESM.

Schemat 1.Wykrywanie enterotoksyn gronkowcowych w produktach żywnościowych – etapy postępowania (12)

Rozdrobnić próbkę lub jej reprezentatywną część i odważyć 25 g ± 0,1 g do zlewki. W przypadku produktóww proszku odważyć 12,5 g próbki oraz 12,5 g wody lub postępować zgodnie z instrukcją producenta.

Dodać do próbki 40 ml wody destylowanej lub dejonizowanej o temp. 380C ± 2,00C, zhomogenizować próbkę i wytrząsać w temp. pokojowej przez co najmniej 30 minut.

W przypadku produktów płynnych pominąć ten etap.

Zakwasić próbkę przy użyciu HCl do poziomu pH 3,5 – 4,0. Odwirować próbkę przy 3130 g przez 15 minut w temp. 40C lub w temp. pokojowej.

Zneutralizować próbkę przy użyciu NaOH do poziomu 7,4 – 7,6. Odwirować próbkę przy 3130 g przez 15 minut w temp. 40C lub w temp. pokojowej.

Przenieść otrzymaną fazę wodną do membrany dializacyjnej, a następnie ułożyć membranę na tacy zawierającej 30% roztwór glikolu polietylenowego. Zagęszczanie próbki przeprowadzać

w temperaturze 50C ± 30C przez noc.

Odzyskać zagęszczony ekstrakt używając do tego celu roztworu PBS dla produktów mlecznych lub wody dejonizowanej dla innych produktów. Masa otrzymanego zagęszczonego ekstraktu

powinna wynosić 5,0 – 5,8 g.

Detekcja przy użyciu testu VIDAS SET 2 Detekcja przy użyciu testu Ridascreen SET Total

BIOMERIEUXPERFORMANCE

SOLUTIONS

Automatyczne monitorowaniei kontrola temperaturyoraz innych parametrów fizycznych