Rapid One Step Assay - MCS Diagnostics · Antibiotika • Arzneimittel, die gegen Bakterien und andere Mikroorganismen, nicht aber gegen Viren wirksam sind, indem sie sie entweder

Rapid One Step Assay

Charm ROSA Technologie

MCS Diagnostics BV Tel: +31 475 508260 Deutschland: 02163 953029 Voorveld 16 Fax: +31 475 508261 Deutschland: 02163 952399 NL-6071 RE Swalmen E-Mail: [email protected] Web: www.mcsdiagnostics.com

Antibiotika

• Arzneimittel, die gegen Bakterien und andere Mikroorganismen, nicht aber gegen Viren wirksam sind, indem sie sie entweder abtöten (bakterizide Antibiotika) oder in ihrem Wachstum hemmen (bakteriostatische Antibiotika).

Antibiotika

Penicillin: Ursprüglich ein metabolisches Produkt von Penicillium Schimmelpilze

Penicillin- Alexander Fleming 1928

Antibiotika

Antibiotikafamilien

Betalaktame Penicillin, Ampicillin, Cloxacillin Tetracycline Tetracyclin, Oxytetracyclin, Chlortetracyclin, Doxycyclin Macrolide Erythromycin, Lincomycin, Spiramycin Aminoglykoside Streptomycin, dihydrostreptomycin, Gentamicin Sulfonamide Sulfamethazin Amphenicole Chloramphenicol Gyrasehemmer Enrofloxacin

Antibiotika

Entwicklungszeitraum

Antibiotika

Betalaktame

Gemeinsames Kennzeichen ist der Betalaktamring

Antibiotika

Peptidoglycan

Betalaktam

Peptidoglycan Synthese unterbrochen

Zelle lysiert

Antibiotika

Antibiotikafamilien

Penicillinase (b Lactamase)

• Spaltet den Betalaktam Ring • Antibiotikum wird unwirksam

Antibiotika Penicillin

Antibiotika Penicillin

Die Gefahr Resistenzentwicklung

• Erhöhte Minimale HemmKonzentrationen • Multi-Resistenz Methicillin, Vancomycin • Antibiotikafamilien Resistenz • Infektionen schwer zu bekämpfen • Hohe Kosten

Resistenzbestimmung

Agardiffusion

Mikrodilution

Antibiotika


• Streifentechnologie • Keine Probenvorbereitung • Antibiotikanachweis nach internationalen Höchstmengen • Aflatoxin M1 Nachweis 50ppt • Mykotoxine DON, Zearalenone, Fumonisin, Aflatoxin B1 etc.


Testprinzip

Testlinie

Probekammer

Rezeptor

Kontrollinie Kompetitive Rezeptortests

Antibiotika in der Probe und Antibiotika im Rezeptorgemisch konkurrieren um die Bindungs-stellen des Rezeptors

Milchprobe mit Antibiotikum

T C

Milchprobe OHNE Antibiotikum T C

Antibiotikum

Colloidales Gold

Rezeptor

Testlinie Kontrollinie


T C


Milchprobe OHNE Antibiotikum T C

Antibiotikum bindet am Rezeptor

Bindungsstellen Rezeptor nicht besetzt


T C

T C

Lateral flow


Milchprobe OHNE Antibiotikum


T C

T C



Lateral flow


T C

T C



Lateral flow


T C

T C



Lateral flow


T C

T C



Rezeptor bindet an Testlinie


T C

T C

Rest Rezeptor bindet an Kontrollinie




T C

Kann der Charm Test falsch negativ werden?

Nein … Keine Bindung am Rezeptor Test Positiv….


•

Schnelltests zum Nachweis von Antibiotika und Aflatoxin M1

Untersuchungszeit 1 – 8 Minuten

Internationale Nachweisgrenzen EU MRL, USA SL, KIWI, Russland etc.

Mehrere Gerätekonfigurationen EZ Reader, ROSA Reader


http://www.google.nl/url?sa=i&source=images&cd=&cad=rja&docid=qmD3zNqENrKwmM&tbnid=pbEmHyvxr6QG-M:&ved=0CAgQjRwwAA&url=http://www.kunst-enzo.nl/nieuwtjes2007.htm&ei=la8xUt6tOqnE0QWZjYGACQ&psig=AFQjCNHbwJLfvjj03n9aNfX3dM6ScndGVA&ust=1379074326005834�

1. Betalaktame – klassische und synthetische Antibiotika 2. Tetracycline – Tetracyclin, Oxytetracyclin, Chlortetracyclin, Doxycyclin 3. Aminoglykoside – Streptomycin, dihydrostreptomycin, Gentamicin 4. Makrolide 5. Sulfonamide – Sulfamethazin 6. Chloramphenicol 7. Sonstige Antibiotika – Enrofloxacin

Nachweispriorität der Antibiotikafamilien


Penicillin G Klassisches Betalaktam Amoxicillin Klassisches Betalaktam Ampicillin Klassisches Betalaktam Cefacetril Synthetisches Betalaktam Cephalonium Synthetisches Betalaktam Cefazolin Synthetisches Betalaktam Cefoperazon Synthetisches Betalaktam Cefquinom Synthetisches Betalaktam Ceftiofur und Metaboliten Synthetisches Betalaktam Cephapirin Synthetisches Betalaktam Cloxacillin Klassisches Betalaktam Dicloxacillin Klassisches Betalaktam Oxacillin Klassisches Betalaktam

Familie der Betalaktame


Rezeptor Technologie – Extrakt aus Bakterienzellwand PBP PBP = Penicillin Binding Protein

Betalaktame zerstören die Zellwand von Mikroorganismen Alle Betalaktame besitzen einen Betalaktam Ring

Vorteile Rezeptortechnologie: Alle Betalaktame werden in nur einem Untersuchungsvorgang

nachgewiesen! Schnelle, spezifische Reaktion

Charm ROSA Betalaktam Tests


Maximal zulässige Konzentration eines Antibiotikums

Betalaktam Codex/EU MRL Nachweisgrenze Amoxicillin 4 3 – 4 Ampicillin 4 3 – 4 Cefacetril 125 30 – 40 Cephalonium 20 8 – 12 Cefazolin 50 40 – 50 Cefoperazon 50 3 – 5 Cefquinom 20 20 – 30

Ceftiofur und Metaboliten* 100 60 – 100

Cephapirin 60 15 – 20 Cloxacillin 30 15 – 20 Dicloxacillin 30 10 – 15 Oxacillin 30 10 – 20 Penicillin G 4 2 – 3

* metabolisiert sofort

(M)aximum (R)esidue (L)imit


Warum sollen Höchstmengen nicht überschritten werden?

Resistenz klassische Betalaktame

Resistenz synt. Betalaktame 2. Generation

Resistenz synt. Betalaktame 3. Generation

z.B. Penicillin, Ampicillin, Cloxacillin

z.B. Cephapirin, Cefazolin

Resistenz Methicillin

z.B. Cefotaxim

MRSA, ESBL


Charm ROSA Tetracycline

Nach Betalaktamen die Nummer 2 in der Antibiotikastatistik Starke Resistenzentwicklung Resistenzproblem vorallem in Süd-Europa Erhöhte M(inimale) (H)emm (K)onzentrationen bzw. Resistenz der

isolierten Mikroorganismen gegen Tetracycline


Anforderungen für Export nach Russland

Betalaktame EU MRL = Rusland MRL Tetracycline Maximal 10ppb Gesamt-Tetracycline Streptomycin < 100 ppb Chloramphenicol < 0.1 ppb


Russland Export Tetracycline

2 Minutentest 3 Linien Kontrolle, Betalaktame und Tetracycline

EU MRL (ppb) RF (ppb) Nachweisgrenze

(ppb) Chlortetracyclin 100 10 6 – 10

Doxycyclin 100 10 6 – 10

Oxytetracyclin 100 10 6 – 10

Tetracycline 100 10 6 – 10


Russland Export Streptomycin

8 Minutentest 2 Linien Kontrolle und Testlinie

EU MRL (ppb) RF (ppb) Nachweisgrenze

(ppb) Streptomycin 200 500 50


8 Minutentest 2 Linien Kontrolle und Testlinie

EU MRL (ppb) RF (ppb) MRPL * (ppb)

Chloramphenicol < 0.1 10 < 0.3

* MRPL: Minimum Required Performance Limit

Russland Export Chloramphenicol


Monatlich mindestens zwei Untersuchungen zur Feststellung von Hemmstoffen nach den Bestimmungen der Amtlichen Sammlung von Untersuchungsverfahren nach § 64 Abs. 1 des Lebensmittel- und Futtermittelgesetzbuches.

Festgelegt vom Bundesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit

Rückstandshöchstgehalte werden in der EU in einem Gemeinschaftsverfahren festgesetzt EU MRL

Antibiotikanachweis Milchgüteverordnung


Mikrobiologische Screeningtest

BR Test – Brilliantschwarz Reduktionstest Delvo Test – Vergleichbar mit BR Test Copan – Vergleichbar mit BR Test Charm Sciences Blue Yellow - Verbesserte Empfindlichkeit

Sporen von Bacillus Stearothermophilus Briljant Schwarz Redox Indikator

Alle Tests funktionieren nach dem gleichen Prinzip!


Charm ROSA Test vs Mikrob. Screeningtests

Charm ROSA Test ist auf immunologischer Basis - Antigen ( Antibiotikum ) / Rezeptor Reaktion

- z.B. Betalaktame und Tetracycline - Antigen ( Antibiotikum ) / Antikörper Reaktion - Chloramphenicol

Screeningtests sind auf mikrobiologischer Basis

Meistverbreitete Tests BR/Delvo


Nachweis von Hemmstoffen in Sammelmilch; Agar-Diffusions-Verfahren ( z.B. Antibiotika, Immunglobuline, Lysozym ) (Brillantschwarz - Reduktionstest) § 35 LMBG 01.00-5

Begriffsdefinition:

Eine Probe enthält Hemmstoffe, wenn sie nach dem festgelegten Verfahren das Wachstum des Testkeims und somit die Reduktion des dem Medium zugesetzten blauen Redoxindikators mindestens in gleicher Weise hemmt wie die Kontrolle mit 4 µg/kg Benzylpenicillin.

Milchgüteverordnung

Problem: Unterschiedliche MHK-Werte 4ppb Penicillin

200ppb Cefquinom ( MRL 20ppb )



Wachstum Indikator nach gelb Hemmstoffe nicht nachweisbar

Kein Wachstum Indikator ändert nicht Hemmstoffe nachweisbar

Ergebnis mikrobiologische Screeningtests

Positive Ergebnisse mikrob. Screening Tests u.a. durch:

Antibiotika Immunologische Faktoren Erhöhte somatische Zellzahl Fettgehalt > 6% Interferenz durch natürliche Hemmstoffe

Lysozym Lactoferrin

Positive Ergebnisse nicht nur durch Antibiotika!


Betalaktam EU/ Codex MRL (ppb) Charm ROSA ( ppb ) BR ( ppb ) Amoxicillin 4 3 – 4 2 – 3 Ampicillin 4 3 – 4 2 – 3 Cefacetril 125 8 – 18 N.D. Cefalexin 100 30 – 60 200 – 300 Cephalonium 20 3 – 5 10 – 20 Cefazolin 50 12 – 20 10 – 25 Cefoperazon 50 5 – 9 25 –50 Cefquinom 20 15 – 20 100 – 200 Ceftiofur und Metaboliten 100 / 100 10 – 20 50 – 100 * Cefuroxim 50 3 – 5 200 – 300 Cephapirin 60 6 – 10 4 – 5 Cloxacillin 30 25 – 30 20 – 30 Dicloxacillin 30 20 – 30 10 – 20 Oxacillin 30 25 – 40 10 – 20 Nafcillin 30 30 – 50 10 – 15 Penicillin G 4 2 - 3 2 - 3

* Keine Metaboliten ( Reybroeck ILVO)

Nachweisgrenzen Charm ROSA und BR Test


Falsch negative Ergebnisse mikrob. Screening Tests u.a. durch:

Nachweisgrenze für Antibiotika nicht ausreichend Synthetische Betalaktame u.a. Ceftiofur Metaboliten Cefquinom Cefalexin Cefuroxim


Falsch positive oder falsch negative Charm ROSA Ergebnisse?

Falsch negative Ergebnisse nicht möglich wenn Antibiotikakonzentration >= Grenzwert ( limit of detection )

Falsch positive Ergebnisse können auftreten: Streifen ohne Deckel gelagert – Luftfeuchtigkeit! Erhöhter Fettgehalt > 7%


Übereinstimmung von Hemmstoff positiven Milchproben

Allgemein gute Übereinstimmung circa 97%

Abweichung kann auftreten bei: Synthetische Betalaktam Antibiotika Nicht-Betalaktam Antibiotika Sonstige Hemmstoffe


Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit


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