I. ECBU (examen cytobactériologique des urines)

Introduction :

L'examen cytobactériologique des urines, est un examen simple de biologie médicale, susceptible de procurer des éminents renseignements particulièrement utiles pour le diagnostic des maladies de l'arbre urinaire, et notamment des infections urinaires en étudiant l'urine d'un patient.

Le rôle du laboratoire est de prouver l'infection en identifiant la bactérie responsable, et d'évaluer l'importance de l'inflammation on déterminant la leucocyturie.

Objectif :

L’ECBU permet :• D’isoler, de dénombrer et d’identifier les bactéries responsables de l’infection urinaire et deréaliser un antibiogramme de la bactérie responsable• De dénombrer les leucocytes• De rechercher la présence de cylindres et de cristaux urinaires.

Matériels et méthode

1. Les matériels : Bec benzun. Tubes à essai. Boites de pétri. Pipette pasteur ou anse de platine. Bandelettes urinaires pour mesurer le pH des urines. Centrifugeuse. Microscope optique. Lame et mamelle. Des milieux de culture :

Gélose nutritive : permettre une numération des bactéries les plus fréquemment rencontrées, (les entérobactéries, les Pseudomonas , les Staphylocoques et les entérocoques ).gélose lactosée au bromocrésol pourpre (BCP) : pour l’isolement des bactéries peu exigeantes. milieu de Mac Conkey : qui permet d’inhiber les bactéries à Gram+ et le développement en nappe du Proteus .Une gélose au sang frais ou cuit : peut permettre d’isoler des Streptocoques ou des Haemophilus. Milieu Mueller Hinton : pour le test de l’antibiogramme

Compresseur des antibiotiques :

2. Méthode :L’ECBU s’effectue en plusieurs étapes et en plusieurs jours.2.1. Prélèvement :Il peut être réalisé au laboratoire ou à domicile. Dans ce dernier cas, le prélèvement doit être apporté sans délai au laboratoire.Pour éviter une contamination trop importante au cours du recueil de l’urine, le prélèvement doit être effectué dans des conditions précises :• Se laver les mains• Attendre minimum 3 h après la miction précédente (ou préférer la 1ère urine du matin)• Rejeter le premier jet d’urine• Recueillir le milieu de jet dans un flacon stérile (à demander au laboratoire)2.2. Examen macroscopique de l’urine :

2.2.1. Couleur et trouble :Homogénéiser l’urine par retournement ou par agitation mécanique et noter l’aspect limpide ou trouble et la présence d’une éventuelle hématurie.

2.2.2. Mesure du pHfait appel à des bandelettes revêtues de deux indicateurs colorés et dont le changement des couleurs allant de l’orange au bleu couvre une gamme de pH de 5,0 à 8,5. La réalisation de ce test s’effectue également sur urines fraîches.

2.3. Dénombrement des bactéries et des leucocytes urinaires :2.4. Examen du culot urinaire2.4.1. Préparation du culot urinaire :

Homogénéiser l’urine. Remplir les 3/4 d’un tube à centrifuger. Centrifuger 5 minutes à 2 000 tours/minute. Rejeter le surnageant dans le bac d’eau de Javel.

2.4.2. Examens microscopiques réalisés sur le culot urinaire À partir du sédiment urinaire, des frottis colorés (Gram, Ziehl) peuvent être

réalisés pour orienter le diagnostic. Cependant, c’est l’examen à l’état frais qui renseignera avec précision sur la

présence et la nature d’éléments cellulaires et cristallins. On prélève verticalement avec l’anse calibrée et par capillarité une goutte

d’urine que l’on ensemence par stries sur la boîte de gélose : Une strie centrale est ensemencée puis perpendiculairement réaliser un

isolement de haut en bas de la boite en desserrant légèrement les dernières stries.

2.5. Isolement Les bactéries responsables d’infections urinaires se développent bien sur les

milieux ordinaires. Dans la majorité des cas, l’urine est monomicrobienne (un seul type de

bactéries), il n’est donc pas nécessaire de choisir des milieux sélectifs ou même enrichis (sauf si suspicion d’un streptocoque : dans ce cas, isoler sur gélose au sang frais de cheval + acide nalidixique et colimycine (ANC))

Par contre, il est intéressant d’isoler sur des milieux lactosés avec indicateur de pH afin de déterminer les caractères lactose et ONPG hydrolase (BCP, CLED).

Dans le cas d’urine polymicrobienne associant un coque Gram + et un ou plusieurs bacilles Gram –, isoler sur un milieu sélectif lactosé (Drigalski, Mac Conkey).

2.6. Identification :Seules les colonies présentes en nombre significatif font l’objet d’une identification.Les bactéries peu représentées ont une signification de contaminant.La démarche d’identification est classique et repose sur l’examen macroscopique, les examens microscopiques, les tests enzymatiques et la détermination des caractères biochimiques.2.7. Antibiogramme :Un antibiogramme est obligatoirement réalisé si le dénombrement signe une infection urinaire et lorsqu’on possède des colonies isolées des bactéries responsables de l’infection.

Technique d’antibiogramme :

Résultats et discussion

1.Couleur :Normalement jaune.Rose à rouge : hématurieOrange-acajou : ictère (jaunisse)

2. Troubles : Indique à la Présence de leucocytes, de bactéries et éventuellement de pus

3. pH : Le pH normal de la première urine du matin est acide.

Un pH alcalin suggère une infection urinaire.

Rôle des germes uréasiques (Proteus, Klebsiella) métabolisant l'urée grâce à leur uréase et la transformant en une molécule de bicarbonate et une molécule d'ammoniac.

4. résultats d’observation microscopique ( entre lame et lamelle) : L’expression quantitative de la leucocyturie s’opère par examen du culot urinaire

entre lame et lamelle, à l’objectif 40 x (nombre de champs à parcourir dizaine / cinquantaine).

Nombre de leucocytes par champs microscopiques

Expression du résultat

0-5 Rares leucocytes (= valeur normale)5-10 Quelques leucocytes10-20 Leucocytes en quantité un peu supérieure à

la normalePlus de 20 leucocytes isolés et intacts Nombreux leucocytes intactsPaquets de plus de 20 leucocytes agglutinés et altérés

Nombreux leucocytes altérés et présence de pus

Paquets de plus de 50 leucocytes agglutinés et altérés

Pus abondant

Chez l’enfant : Garçon : 0-10 Fille : 0-50

Rares leucocytes (=valeurs normales)

L’expression quantitative des hématies se fait par le même procédé :

*Le pH normal des urines varie de 4,5 à 7,8 en fonction de l’alimentation et des modifications du pH sanguin.*En cas d’infection urinaire, en particulier à germes uréasiques, il existe une alcalinisation intempestive.

Nombre d’hématies par champs microscopiques

Expression du résultat

0-5 Rares hématies (= valeur normale)5-10 Hématies en quantité un peu supérieur à la

normale10-20 Hématies assez nombreusesSupérieur à 20 Nombreuses hématies

Description des éléments de l’urine sur une préparation à l’état frais :

L’examen de l’urine totale entre lame et lamelle (à x 40) permet de distinguer les éléments suivants :

1- Les leucocytes : ils se présentent comme des disques granuleux à l’intérieur desquels le noyau apparaît plus réfringent.La présence de leucocytes dans les urines signe l’existence d’une réaction inflammatoire. L’altération des leucocytes peut être liée à de mauvaises conditions de conservation du prélèvement avant son examen.

2- Les hématies : elles se présentent comme de petits disques de 7 mm de diamètre aux bords plus réfringents.

La présence d’hématies témoigne d’une lésion des muqueuses de l’appareil urinaire. Le passage des globules rouges dans les urines peut être considéré comme

pathologique. les hématies intactes ont une forte probabilité

de provenir de la vessie ou de l’urètre. Les hématies altérées viennent du rein.

L’hématurie s’observe : - dans les formes hémorragiques des néphrites. - dans le cas d’une atteinte glomérulaire. - dans les cystites hémorragiques tuberculeuses, gonococciques, germes banaux. - dans la tuberculose rénale. - l’hématurie peut être associée à d’autres affections d’étiologie non infectieuse : cancer, lithiase rénale, tumeurs de la vessie.

3- Les cellules épithéliales : Peuvent être observées dans les urines : des cellules rénales, urétérales vésicales et urétrales.

3- Les cylindres :

Une cylindrurie n’a pas une grande signification. On peut l’observer chez des individus normaux lorsque l’urine est très concentrée ou très acide, ou encore après un effort musculaire très intense.

5- Les cristaux urinaires Les cristaux observés peuvent correspondre à un constituant normal de l’urine ou bien à un métabolite anormal dont elle est physiologiquement dépourvue. Certains cristaux sont retrouvés exclusivement dans une urine acide et d’autres dans une urine alcaline.

PH alcalin pH acide

Phosphates amorphes Urates amorphes

Triple phosphates Acide urique

Biurate d’ammonium Oxalates de calcium

Phosphate de calcium Cystine

Carbonate de calcium

5. résultats d’observation macroscopique des colonies :

Interprétations : selon la bactériurie et la leucocyturie :

• Leucocyturie ≤104/ml et la bactériurie ≤103 UFC/ml : absence d’infection urinaire.• Leucocytaire ≥104/ml et la bactériurie ≥105 UFC/ml, avec un seul type de bactérie, il s’agit d’une infection urinaire certaine.• Leucocyturie ≥104/ml et la bactériurie ≥105 UFC/ml avec deux types de bactéries chez la femme est un examen direct qui retrouve de nombreuses cellules épithéliales, il s’agit de deux probables possibilités : - Infection génitale. - Infection urinaire mais contaminée • Leucocyturie ≤104/ml et la bactériurie ≥105 UFC/ml, avec un seul type de bactérie, c’est une infection urinaire dans les cas suivants :- Femme enceinte : confirmer par un deuxième ECBU. - Immunodéprimé - diabétique - Nourrisson - Personne âgéeUne bactériurie sans leucocyturie peut être également observée lorsque le prélèvement est gardé trop longtemps à +4°C ou lorsque les urines sont hypertonique ou trop alcalines. Ces conditions contribuent à détruire les leucocytes.

selon les germes:L’identification de la bactérie mérite aussi une interprétation lorsque le germe n’appartient pas à une espèce courante de l’infection urinaire, en sachant que toute bactérie peut être responsable d’une infection et aussi peut être un contaminant. Escherichia coli, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae, et Staphylococcus

saprophyticus (chez la femme) sont des germes dont le rôle est bien établi dans l’infection urinaire

Les Staphylocoques coagulase négative sont en nette augmentation dans les infections urinaires, mais ils ne peuvent être incriminés que s’ils sont retrouvés dans un deuxième prélèvement surtout en l’absence de leucocyturie, car ce sont des bactéries de la flore cutanée. Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus meticillino-résistant sont

incriminés avec une numération ≥ 104UFC/ml dans les cas suivants : - Malade hospitalisé - Prise d’antibiotiques à large spectre - Intervention sur l’arbre urinaire Streptococcus agalactiae, retrouvé chez la femme enceinte. Enterobacter sp, Serratia sp., Citrobacter sp et Proteus indole positif sont des

bactéries responsables surtout d’infections urinaires nosocomiales.

6. Résultats d’antibiogramme :- la bactérie est sensible à ATB quand la CMI est inférieure à la concentration critique inférieure (dose minimale d'ATB qu'un malade peut recevoir sans dangers et qui fait effet sur la souche bactérienne). ceci signifie qu'il suffit d'une faible concentration d'antibiotique pour tuer les bactéries .

- la bactérie est résistante à l'antibiotique quand la CMI est supérieure à la concentration critique supérieure (dose maximale d'antibiotique qu'un malade peut recevoir sans dangers et qui fait effet sur la souche bactérienne.).la dose nécessaire pour tuer les bactéries est bien trop élevée pour être supportée chez l'homme sans effets secondaires importants. Cet antibiotique ne peut pas être utilisé pour traiter une infection.

- la bactérie est intermédiaire à l'antibiotique quand la CMI est comprise entre les deux concentrations critiques. Il ne faut pas utiliser cet antibiotique.

II. Coproculture (examen des selles)

Introduction :

Le tube digestif de l'être humain contient une importante flore microbienne commensale, bien que dans certains cas, il y ait la présence d'autres bactéries réputées par leur pouvoir pathogène.

Cet examen est demandé en cas de diarrhée, il peut aussi être réalisé dans un bilan d'une intoxication alimentaire. Le délai d'exécution est de 1 à 3 jours avec un test d'antibiogramme.

Objectif :

· Rechercher et isoler les bactéries responsables de diarrhées.

· Identifier ces bactéries en donnant l'antibiogramme.

La démarche diagnostique:

1- Prélèvement des selles   :

a- Chez l'adulte et l'enfant : un peu de selles suffit dans un flacon hermétique.b- Chez le nourrisson : un écouvillonnage récital suffit. - Un échantillon muco-purulent ou sanglant est choisi lorsqu'il en existe. - le choix du flacon idem que l’ECBU.

2- Technique   : Premier jour : Examen macroscopique :

Il est important de noter l'aspect macroscopique des selles, car il nous aidera à choisir les milieux de culture.

Les selles peuvent être liquides, molles ou solides. Elles peuvent être aussi hémorragiques.

Examen microscopique :

Si les selles sont solides ou molles, nous devons préparer une suspension. L'état frais permet d'observer la morphologie des bactéries, leur mobilité ainsi de

déceler la présence des leucocytes et d'hématies. Il est possible de révéler des parasites.

L'examen des selles après coloration permet d'étudier l'équilibre de la flore (concernant le Gram, la morphologie).

Si les selles sont liquides, l'examen microscopique est important pour orienter les cultures : La présence des leucocytes montre que la diarrhée est á germes invasifs

(provoquent la lésion des tissus), les germes caractéristiques sont : Salmonella sp, Shigella sp, Campylobacter sp.

En cas d'absence des leucocytes, la diarrhée est du aux germes enterotoxigéniques, les germes caractérisant ce cas sont : Vibrio cholerae, Aeromonas sp.

Mise en culture :

Les germes recherchés systématiquement :

Salmonelles et Shigelles: Concernant les Salmonelles, un milieu d'enrichissement est indispensable tel que :

bouillon au sélénite - milieu Leifson ou Muller Kauffmann avec 0.5ml de selle, puis incubation á 37°C.

Il n'existe pas un milieu d'enrichissement pour les Shigelles. Il est important de repiquer le milieu d'enrichissement des Salmonelles sur gélose

sélective après 3-6h maximum d'incubation afin d'éviter la multiplication des bactéries commensales mal inhibées au-delà de ce temps.

Les milieux sélectifs les plus utilisés pour l'isolement de Salmonelles et de Shigelles sont : gélose SS, gélose Hektoen.

L'incubation se fait pendant 24h à 37°C. E .coli:

Recherchée systématiquement chez l'enfant moins de trois ans.

Autres germes :

Levures :Leur présence se révèle lors de l'observation microscopique à l'état frais.Dans ce cas, on utilise le milieu Sabouraud + chloramphénicol.

Staphylococcus aureus :Recherchée en cas de toxi-infection alimentaire, le milieu utilisé Chapman. Vibrio cholerae :Recherchée directement sur milieu sélectif(GNAB) et après enrichissement par EPA, puis repiquage après 3heures sur GNAB et sur EPA, puis repiquage de ce dernier dans GNAB. Incubation 37°C/24h.

Deuxième jour :Repérage des colonies :Caractérisation et identification biochimiques des colonies suspectes.1- Les colonies suspectes de Salmonelles et de Shigelles sur gélose Hektoen sont transparentes, vertes, elles sont lac, H2S + ou -.- On réalise un test d'oxydase instantané, afin d'éliminer les Pseudomonas qui sont oxy +- Réaliser un test d'uréase- Après incubation, ajouter le réactif de KOWACS- Ensemencer sur milieu Kliger Hajna incubation 24h/37°C.- Pour les colonies saumons, on élimine les Proteus par le test d'uréase sur milieu urée indole, Proteus est uréase+ (le milieu devient rouge en 2heures)a- Urease + :Proteus.b- Urease : ajouter le réactif de Kowacs indole + Possibilité d'avoir E.coli.2- Les tests effectués pour E.coli sont : lactose, acétoïne, citrate, H2S, gaz.3- Les Staphylocoques pathogènes forment des colonies pigmentées, entourées d'une auréole jaune due à la fermentation du mannitol.Les tests effectués sont : cat(+), coagulase(+).4- Pour l'identification des Vibrio cholerae, qui se présentent en colonies transparentes bleutées, on effectue un test d'oxydase (oxy+), catalase (cat+), urée indole, TDA

L'antibiogramme :L'antibiogramme est impératif pour Salmonella, Shigella, E. coli et pour V. cholerae.

Troisième jour :Lecture des résultats d'identification biochimique et de l'antibiogramme.Salmonella, Shigella :

Tests Lac H2S Uréase IndoleHajna Kligler

glucose gaz LDC

Salmonella - +/- - - + + +

Shigella - - - - + - -

- Les Salmonelles sont sensibles à l'amoxicilline.- Les Shigelles sont sensibles à la céphalosporine.-E.coli : oxy, Lac+, indole+, acétoïne, citrate, H2S, gaz+, uréase.-Staphylococcus aureus: cat+, coagulase+, mannitol+.-Vibrio cholerae: oxy+, cat+, urée, indole+, TDA.- Les Vibrio sont sensibles aux sulfamides et aux tétracyclines.

Donc, un résultat normal se traduit par l'absence de bactéries entéropathogenes, il y a seulement la présence de la flore commensale dont on retrouve 10% d'Entérobactéries surtout les Colibacilles.

En cas de pathologie, il y ait la présence d'Entérobactéries pathogènes.

Parasitologie des selles :

la parasitologie des selles met en évidence les parasites qui colonisent le tube digestif de l'homme.Cet examen est prescrit pour toute personne présentant des douleurs abdominales, diarrhées, fièvres. Il est demandé également pour des personnes ayant des troubles digestifs.But d'examen :Il permet d'affirmer l'existence d'une parasitose intestinale.Prélèvement :Avant le prélèvement, éviter les aliments riches en fibres, et certains médicaments .Les selles recueillies dans un pot stérile devront être rapidement transmises au laboratoire.Déroulement d'examen :1- Examen macroscopique   : Cet examen permet de noter la couleur, la consistance, la présence du sang, de mucus, ainsi la présence de parasites visibles á l'oeil nu.

2- Examen microscopique   : Met en évidence les kystes et les formes végétatives de protozoaires ainsi que les oeufs et les larves d'helminthes.Il comprend deux étapes :

  a- Examen direct :Se fait à l'état frais entre lame et lamelle et s'effectue sur des selles fraîches liquides ou en suspension (selle solide), il permet de rechercher le maximum de protozoaires et de kystes. b- Examen après concentration :Permet la recherche des œufs et des kystes qui sont en petites quantités invisibles par l'examen direct.Résultats : Résultats normaux :Absence de parasites dans les selles. Résultats anormaux :La présence de parasites.Tab   :  Principaux parasites des selles chez l'homme

Protozoaires Sporozoaires (coccidies)Infusoires (Balantidium coli)Flagellés(Giardia)Rhizopodes (amibes)

Helminthes=Nématodes(vers ronds)

Ascaris lombricoïdesTrichuris trichiura (trichocéphale)Enterobius vermicularis (oxyure)Strongyloides stercoralis (anguillule intestinale)

Plathelminthes (vers plats) Distomatoses (douves)Schistosoma (bilharzies)Cestodes(Taenia)

Prélèvement sanguin

Après préparation de la salle et du matériel de prélèvement :

1- choix de la veine :

Poser un garrot légèrement serré au-dessus du pli du coude

Recherche de la meilleure veine.

2- Antisepsie :

Passer sur la zone choisie un antiseptique le plus souvent de l'alcool sans repasser sur la zone déjà traitée

3- Introduction de l'aiguille :

Positionner l'aiguille  . Piquer, en tirant vers le bas, la peau sous le point

de piqûre, puis aspirer.

4- Retrait de l'aiguille :

Positionner au niveau du point de piqûre un coton propre et enlever l’aiguille.

5- Remplissage des tubes :

Remplir le tube jusqu'au trait indique sur celui-ci et l'agiter.

Eliminer les aiguilles Il faut identifier les tubes pour ne pas confondre les

résultats.

Les tests effectués :

1- Glycémie :

Cet examen est demandé pour la surveillance de l'évolution du taux de glucose. Il est basé sur une méthode enzymatique colorimétrique. Pour la mise en évidence du taux de glucose, on a besoin de 3 tubes :

Le 1er du blanc contenant 1 cc du réactif de travail Le 2eme d'étalon contient 1ml du R de travail +0.1 ml R3 Celui d'ech, contient 1ml de R de travail +0.1ml du sérum

Il faut agiter les tubes et attendre 30mn pour mesurer la D.O á 505 nm. D.O Calculer le taux du glucose (G = g/l).

Valeurs normales : 0.70 -1.05 g/l

2- Créatinine :

Le dosage de la créatinine est prescrit pour le diagnostic d'une altération de la fonction rénale et pour la surveillance des sujets insuffisants rénaux.

C'est une méthode colorimétrique cinétique. Pour le dosage, on a besoin de 2 tubes un du standard et l'autre pour l'ech, le zéro du

spectrophotomètre est ajusté par l'air. Ici, nous devons prendre 2 valeurs de D.O (la 1ere après 30S et la 2eme après 1mn á

une longueur d'onde de 492nm.

D.O ech Créa = 20 mg/l.

D.O etalon créa: 7 -14 mg/l

3- Acide urique :

Ce test est prescrit pour la surveillance des insuffisants rénaux. Le dosage de l'A.U est basé sur des réactions enzymatiques (colorimétriques) La valeur de D.O est prise pour l'ech et l'étalon après le réglage par le blanc à une

longueur d'onde de 510nm.

D.O ech A.U = 60 mg/l.

D.O étalon Hommes : 34 - 70 mg/l

Femmes : 25 - 60 mg/l

4- Cholestérol total :

Puisqu'il fait partie des lipides, il est prescrit dans un bilan lipidique. Concernant la technique, semblable à celle de la glycémie. La D.O est prise à 500nm

D.O ech  CHO = 2 g/l.

D.O étalon cho< 2.2 g/l

5- Triglycérides :

Cet examen est prescrit pour le diagnostic des hyperlipidémies, ainsi dans un bilan lipidique.

Le principe du dosage est colorimétrique. Un taux très élevé en T.G est remarqué sur le sérum (celui-ci est trouble même après

la centrifugation). Les D.O de l'étalon et d'ech sont notées, après le réglage du zéro par le blanc.

D.O ech T.G = 2 g/l.

D.O étalon T.G=0.35 - 1.35 g/l

6- Vitesse de sédimentation (VS) :

La VS est la mesure de la chute des hématies en mm/h sur un ech de sang. Pour la prise de VS, on utilise un tube au citrate (anticoagulant). Cet examen est prescrit pour le dépistage des maladies infectieuses. Pour la mesure, on utilise des pipettes Westergreen et on note 2 valeurs (la 1ere après

1h et la 2emeaprès 1h de la 1ere prise).

Valeurs normales : Hommes : 3 - 15 mm

Femmes : 7 - 20 mm

7- Groupe sanguin (groupage) :

Les 4 groupes sanguins (A, B, AB, O) sont déterminés par la présence ou l'absence de 2 protéines agglutinogènes se trouvent à la surface des hématies et jouant le rôle des Ag : protéine A et protéine B.

La méthode consiste à poser 3 gouttes de sang sur une lame, on ajoute une goutte de chaque sérum (anti A, anti B, anti Rh), sans toucher le sang.

Avec un bâtonnet en plastique, on mélange la goutte du sang et celle du sérum. Après 30S environ, bouger la lame d'un mouvement circulaire et noter le résultat.

Tab : résultats possibles du groupe sanguin

A A + B B + AB AB + O O +

antiA

antiB

antiRh

 Agglutination   aucun changement

Conclusion

- Durant notre stage, nous avons remarqué que le personnel du laboratoire néglige les conditions d'asepsie tels que les gants, le masque..., alors qu'ils nous les conseillent

- Du coté bactériologique (ECBU, Coproculture), ces laborantins se basent sur l'étude cytologique et délaissent la culture et l'identification bactérienne dans son aspect particulier c.-à-d. le suivi des étapes.

- Concernant le dénombrement des leucocytes, ils utilisent une méthode semi quantitative c.-à-d. non précise (- / + / ++).

- La recherche des parasites est limitée á l'examen microscopique direct.

-D'une façon générale, le stage a été bénéfique puisque nous avons pu voir de près le déroulement des tests et certain temps de manipuler.

-Un stage plus long serait meilleur pour nous afin d'en savoir d'avantages.