REAKTIVASI R175H-p53 OLEH ADDUCT MQ-SISTEIN : …... · ABSTRAK Mutasi R175H pada p53 (R175H-p53) ... Dasar bagian Komputasi Kimia. 6. Bapak Ibu dosen dan seluruh staff jurusan Kimia

i

REAKTIVASI R175H-p53 OLEH ADDUCT MQ-SISTEIN : STUDI

SIMULASI DINAMIKA MOLEKULER

Disusun Oleh :

AGUSTINA MUKHAROMAH

M0307026

SKRIPSI

Diajukan untuk memenuhi sebagian

persyaratan mendapatkan gelar Sarjana Sains Kimia

JURUSAN KIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS SEBELAS MARET

SURAKARTA

2013

perpustakaan.uns.ac.id digilib.uns.ac.id

commit to user

ii


commit to user

PERNYATAAN

Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi saya yang berjudul

REAKTIVASI R175H-p53 OLEH ADDUCT MQ-SISTEIN : STUDI SIMULASI

DINAMIKA MOLEKULER

kesarjanaan di suatu perguruan tinggi, dan sepanjang pengetahuan saya juga belum

pernah ditulis atau dipublikasikan oleh orang lain, kecuali yang secara tertulis diacu

dalam naskah ini dan disebutkan dalam daftar pustaka.

Surakarta, 8 Januari 2013

AGUSTINA MUKHAROMAH

iii


commit to user

REAKTIVASI R175H-p53 OLEH ADDUCT MQ-SISTEIN :

STUDI SIMULASI DINAMIKA MOLEKULER

AGUSTINA MUKHAROMAH

Jurusan Kimia. Fakultas MIPA. Universitas Sebelas Maret.

ABSTRAK

Mutasi R175H pada p53 (R175H-p53) berkontribusi dalam perubahan konformasi protein p53. Perubahan tersebut mengakibatkan hilangnya fungsi p53 sebagai penekan tumor. Adduct Methylene Quinuclidinone-Cysteine (MQ-Sistein) diyakini dapat mereaktivasi R175H-p53. Restorasi konformasi R175H-p53 menyerupai wild type-p53 diperlukan untuk reaktivasi. Terdapat tujuh residu sistein pada domain inti p53 yang dapat dipilih untuk membentuk adduct tersebut. Laju pembentukan adduct bergantung pada lingkungannya. Sistein pada lokasi yang berbeda pada domain inti memberikan pengaruh interaksi yang berbeda, sehingga memungkinkan terjadinya perbedaan perubahan konformasi. Perubahan-perubahan tersebut dapat ditandai oleh perubahan pada konformasi backbone protein. Simulasi dinamika molekuler dari R175H-p53 yang mengandung satu adduct MQ-Sistein pada dua lokasi yang berbeda telah dilakukan untuk membedakan mekanisme restorasi konformasi mutan p53. Trajectory-trajectory hasil simulasi selama 100 ns menunjukkan peningkatan kestabilan dengan pembentukan adduct. Daerah DNA-binding distabilkan dengan terbentuknya helix pada loop 2. Adduct MQ-Sistein pada residu nomor 124 memberikan perubahan konformasi pada loop 2 dan 3 (L2 dan L3). Disisi lain, residu nomor 275 mengubah daerah L1, L2 dan L3. Oleh sebab itu, kami dapat menduga bahwa adduct MQ-Sistein menginduksi modifikasi lokal sehingga konformasi parsial R175H-p53 menyerupai wild type. Kata kunci : reaktivasi, R175H-p53, adduct MQ-Sistein, dinamika molekuler

iv


commit to user

R175H-p53 REACTIVATION BY MQ-CYSTEINE ADDUCT : A STUDY OF MOLECULAR DYNAMICS SIMULATION

AGUSTINA MUKHAROMAH

Department of Chemistry. Faculty of Mathematics and Natural Sciences.

Sebelas Maret University.

ABSTRACT R175H mutation of p53 (R175H-p53) contributes to conformational alterations in the p53 protein. The alterations result in the loss of p53 function as a tumor suppressor. Methylene quinuclidine-cysteine (MQ-cysteine) adduct is believed to able to reactivate the R175H-p53. Restoration of R175H-p53 conformational behavior resemble wild type p53 is needed for reactivation. There are seven cysteine residues in p53 core domain, which are eligible to form this adduct. The rate of the adduct formation were depending on its environment. Cysteine on different site of core domain provides different interaction effect, it allows different conformational alterations. The alterations may indicated by the alterations of protein backbone conformations. Molecular dynamics simulations of R175H-p53 containing MQ-Cysteine adduct in two different sites have been performed in order to determine the restoration mechanism of mutant p53. The simulations results of 100 ns trajectories show an increasing stability due to adduct formation. DNA binding region was stabilized as a helix formed on loop 2. MQ-Cysteine adduct on residue no. 124 introduced conformational alterations on loop 2 and 3 (L2 and L3). On the other hand residue no. 275 altered L1, L2 and L3. Thus we can surmise that MQ-Cysteine adduct induced local modification that resemble R175H-p53 partial conformational behavior of wild type. Keywords : reactivation, R175H-p53, MQ-Cysteine adduct, molecular dynamics

v


commit to user

MOTTO

Dan Allah mengeluarkanmu dari perut ibumu dalam keadaan tidak mengetahui

sesuatupun, dan Dia memberimu Pendengaran, Penglihatan dan Hati agar kamu

bersyukur

(Q.S. An Nahl : 78)

Sebaik-baik manusia adalah yang paling banyak memberi manfaat bagi manusia lainnya

(HR. Tirmidzi)

vi


commit to user

PERSEMBAHAN

Karya ini penulis persembahkan teruntuk:

vii


commit to user

KATA PENGANTAR

Alhamdulillah segala syukur kehadirat Allah SWT atas limpahan rahmat-Nya

bagi penulis sehingga skripsi ini dapat terselesaikan sebagai salah satu persyaratan

dalam memperoleh gelar sarjana sains Jurusan Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu

Pengetahuan Alam Universitas Sebelas Maret Surakarta. Keberkahan dan karunia-

Nya yang diberikan kepada penulis, sehingga penulis menyadari bahwa segala

sesuatu memiliki hikmah dan menjadi indah pada waktunya.

Dalam menyusun skripsi ini penulis menemui berbagai hambatan dan

permasalahan yang beragam. Namun, atas bimbingan, kritikan, saran, dan dorongan

semangat yang bermanfaat dari berbagai pihak, semua hambatan dan permasalahan

tersebut dapat penulis atasi dengan baik. Oleh karena itu, penulis ingin

menyampaikan terima kasih kepada pihak-pihak yang telah membantu penulis, yaitu

sebagai berikut.

1. Ir. Ari Handono Ramelan, M.Sc., Ph.D., selaku dekan Fakultas Matematika dan

Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Sebelas Maret Surakarta.

2. Dr. Eddy Heraldy, M.Si., selaku ketua Jurusan Kimia Fakultas Matematika dan

Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Sebelas Maret Surakarta.

3. Dr. rer. nat. Fajar R. Wibowo, M.Si., selaku dosen pembimbing I, yang dengan

penuh kesabaran membimbing penulis menyelesaikan skripsi ini, memberikan

banyak kesempatan, pengalaman dan inspirasi bagi penulis.

4. Prof. Drs. Sentot Budi Rahardjo, Ph.D., selaku pembimbing akademis yang

memberikan bimbingannya selama perkuliahan.

5. Edi Pramono, M.Si., selaku ketua laboratorium Kimia Dasar yang telah

memberikan akses bagi penulis melakukan penelitian di laboratorium Kimia

Dasar bagian Komputasi Kimia.

6. Bapak Ibu dosen dan seluruh staff jurusan Kimia yang telah memberikan fasilitas

dan pelayanan yang baik bagi penulis.

viii


commit to user

7. Ucapan terimakasih yang tak terhingga sepanjang masa teruntuk Bunda dan

ulis, kasih sayang,

dukungan moral, spiritual dan dalam segala hal.

8. Kakak-kakakku tersayang yang memberikan semangat untuk melangkah.

9. Teman- dan sahabat-sahabat HIMAMIA, terimakasih atas

kebersamaan dan kerja samanya.

10. Computational Chemistry Community, terimakasih atas persaudaraan yang tak

tergantikan dan semua pihak yang telah membantu penulis.

Semoga keikhlasannya diberikan tempat tersendiri oleh Allah SWT sebagai

amal baik. Penulis menyadari bahwa penelitian dan penyusunan skripsi yang penulis

lakukan masih jauh dari sempurna sehingga membutuhkan saran dan kritik yang

membangun dari para pembaca. Namun, lepas dari semua itu, semoga para pembaca

mendapatkan manfaat setelah membaca skripsi ini.

Surakarta , Januari 2013

Penulis

ix


commit to user

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL ........................................................................................... i

HALAMAN PERSETUJUAN ............................................................................ ii

HALAMAN PERNYATAAN ............................................................................ iii

HALAMAN ABSTRAK ..................................................................................... iv

HALAMAN ABSTRACT .................................................................................. v

HALAMAN MOTTO ......................................................................................... vi

HALAMAN PERSEMBAHAN ......................................................................... vii

KATA PENGANTAR ........................................................................................ viii

DAFTAR ISI ....................................................................................................... x

DAFTAR GAMBAR .......................................................................................... xiii

DAFTAR LAMPIRAN ....................................................................................... xv

BAB I PENDAHULUAN ................................................................................... 1

A. Latar Belakang .................................................................................... 1

B. Perumusan Masalah ............................................................................ 3

1. Identifikasi Masalah ........................................................................ 3

2. Batasan Masalah ............................................................................ 4

3. Rumusan Masalah .......................................................................... 4

C. Tujuan Penelitian ................................................................................ 4

D. Manfaat Penelitian .............................................................................. 5

BAB II LANDASAN TEORI ............................................................................. 6

A. Tinjauan Pustaka ................................................................................ 6

1. Kanker ............................................................................................ 6

2. Protein p53 ...................................................................................... 7

3. Struktur Protein .............................................................................. 8

4. Mutan R175H-p53 .......................................................................... 10

5. Reaktivasi p53 Termutasi ............................................................... 11

6. Pemodelan Molekuler ..................................................................... 12

7. Simulasi Dinamika Molekuler ........................................................ 13

a) Antechamber 15

x


commit to user

b) Parmchk 16

c) LEaP 16

d) Sander 16

e) Ptraj 16

(1)RMSD (Root Mean Square Deviation) ............................... 16

(2)B-factor ............................................................................... 17

(3)Entropi ................................................................................ 17

(4)Clustering Trajectory .......................................................... 18

B. Kerangka Pemikiran ............................................................................ 18

C. Hipotesis .............................................................................................. 20

BAB III METODOLOGI PENELITIAN ............................................................ 21

A. Metode Penelitian ................................................................................ 21

B. Waktu dan Tempat Penelitian ............................................................ 21

C. Alat dan Bahan yang Dibutuhkan ....................................................... 21

1. Alat ................................................................................................. 21

2. Bahan ............................................................................................. 21

D. Prosedur Penelitian ............................................................................ 21

1. Parameterisasi Adduct MQ-Sistein ................................................ 21

2. Pemilihan Makromolekul .............................................................. 22

3. Penentuan Koordinat Awal Sistem ................................................. 22

4. Minimisasi dan Penyeimbangan (Equilibrasi) Sistem .................... 22

5. Simulasi Sistem .............................................................................. 23

E. Teknik Pengumpulan dan Analisis Data ............................................. 23

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ............................................................. 24

A. Parameterisasi Adduct MQ-Sistein ................................................ 24

B. Pemilihan Posisi Sistein Target pada Makromolekul .................... 26

C. Reaktivasi R175H-p53 oleh Adduct MQ-Sistein ........................... 27

1. Stabilisasi R175H-p53 oleh Adduct MQ-Sistein ........................... 28

2. Perubahan Konformasi Parsial R175H-p53 oleh Adduct MQ-

Sistein ............................................................................................. 37

xi


commit to user

a)Perbedaan Konformasi Wild type-p53 dengan R175H-p53...... 38

b)Perubahan Konformasi R175H-p53 oleh Adduct pada Residu

Sistein-124 ................................................................................ 45

c)Perubahan Konformasi R175H-p53 oleh Adduct pada Residu

Sistein-275 ................................................................................ 51

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN .............................................................. 58

DAFTAR PUSTAKA ......................................................................................... 59

LAMPIRAN ........................................................................................................ 66

xii


commit to user

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Siklus perkembangan sel ............................................................... 7

Gambar 2. Empat tingkatan struktur protein ................................................... 9

Gambar 3. Struktur domain inti p53 ................................................................ 11

Gambar 4. Struktur adduct MQ-NAC dan adduct MQ-Sistein ....................... 12

Gambar 5. Tahapan pembentukan struktur adduct MQ-Sistein dari adduct MQ-

NAC ............................................................................................... 24

Gambar 6. Struktur adduct MQ-Sistein teroptimasi dengan keterangan kode

atom, tipe atom, dan muatan adduct MQ-Sistein yang diperoleh

dengan RESP ................................................................................. 25

Gambar 7. Hasil pemilihan lokasi sistein target pada mutan R175H .............. 26

Gambar 8. Grafik perbedaan RMSD sebagai fungsi waktu ............................ 28

Gambar 9. Grafik perbedaan B-factor semua atom sebagai fungsi nomor residu

dan grafik perbedaan B-factor atom backbone sebagai fungsi nomor

residu .............................................................................................. 30

Gambar 10. Grafik fluktuasi residu 113-123, 173-188, dan 237-250 ............... 32

Gambar 11. Resonansi elektronik ikatan peptida .............................................. 33

Gambar 12. Grafik perbedaan order parameter vektor NH sebagai fungsi nomor

residu .............................................................................................. 34

Gambar 13. Grafik order parameter sebagai fungsi residu pada range residu 113-

124, 172-190, dan 234-250 . ........................................................... 35

Gambar 14. Konformasi p53 antara wild type-p53 (pada dua populasi dominan

yang berdekatan) dengan R175H-p53 ........................................... 39

Gambar 15. Perbedaan jarak antar residu-residu daerah L1 wild type-p53 dengan

R175H-p53 ..................................................................................... 41


R175H-p53 ..................................................................................... 42


R175H-p53 ..................................................................................... 44

xiii


commit to user

Gambar 18. Perbedaan konformasi p53 antara wild type-p53 (sistem 3) pada

populasi dominan pertama dan populasi dominan ke-2 dengan

sistem 1 dan sistem 4 ..................................................................... 46

Gambar 19. Perubahan konformasi parsial R175H-p53 oleh adduct MQ-Sistein

sistem 1 pada daerah L1 ................................................................. 47



Gambar 21. Interaksi ikatan hidrogen antara Ser-183 dengan Glu-180 pada

sistem 1 .......................................................................................... 49




populasi dominan pertama dan populasi dominan ke-2 dengan

sistem 2 dan sistem 4 ..................................................................... 52





Gambar 26. Interaksi ikatan hidrogen antara residu Hie-178 dengan Arg-181 dan

Hin-179 dengan Ser-183 pada sistem 2 ......................................... 55



xiv


commit to user

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Diagram alir parameterisasi adduct MQ-Sistein ............................ 66

Lampiran 2. Diagram alir pemilihan makromolekul ............................................ 67

Lampiran 3. Diagram alir proses simulasi .......................................................... 68

Lampiran 4. Diagram alir analisis visualisasi konformasi ................................. 69

Lampiran 5. File prep adduct MQ-Sistein .......................................................... 70

Lampiran 6. Populasi 10 klaster dari empat sistem protein ............................... 71

xv


commit to user

1

BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang Masalah

Kanker merupakan suatu penyakit yang disebabkan oleh rusaknya

mekanisme pengaturan dasar prilaku sel, khususnya mekanisme pertumbuhan dan

diferensiasi sel yang diatur oleh gen, sehingga faktor genetik diduga kuat sebagai

pencetus utama terjadinya kanker (Maliya, 2004). Proses pengendalian untuk

menekan pertumbuhan kanker secara umum dilakukan dengan beberapa cara

antara lain: pencegahan terhadap agen penyebab kanker, peningkatan pertahanan

terhadap kanker, modifikasi gaya hidup dan pencegahan dengan bahan kimia

(Murray, 1998).

Pengendalian pertumbuhan sel tidak terlepas dari adanya gen penekan

tumor (tumor suppressor gen), salah satunya adalah p53. Deteksi DNA yang

mengalami kerusakan diatur oleh tumor suppressor p53. Jika terjadi kerusakan

DNA, maka signal p53 menghentikan pembelahan seluler dan memberikan waktu

bagi sel untuk memperbaikinya (Livingston et al., 1992; Kern et al., 1997).

Protein p53 akan menginduksi terjadinya apoptosis (bunuh diri sel terprogram)

ketika terjadi kegagalan pada proses perbaikan kerusakan DNA dan kerusakan sel

yang lain sebelum terjadinya replikasi (Alberts et al., 2002; Almog dan Rotter,,

1997). Sebagian besar perubahan genetik dalam tumor yang terjadi lebih dari 50%

kanker manusia disebabkan karena hilangnya fungsi p53 akibat protein yang

membawa mutasi p53 (Bykov et al., 2002a; Bykov et al., 2002b; Joerger et al.,

2006; Hollstein et al., 1991). Mutasi p53 terjadi sebagian besar pada domain inti

protein terutama daerah DNA-binding (Joerger dan Fersht, 2007; Olivier et al.,

2002; Hamroun et al hot spots

dengan kanker manusia yaitu R175H, G245S, R248Q, R249S, R273H, dan

R282W (Joerger dan Fersht, 2007; Friedler et al., 2002; Olivier et al., 2002;

Hainaut dan Hollstein, 2000).


commit to user

2

Mutan p53 yang terletak pada domain inti dengan mutasi R175H (mutasi

arginin menjadi histidin) mengakibatkan ketidakstabilan struktur p53 dalam

berinteraksi dengan DNA (Joerger dan Fersht, 2007; Cho et al., 1994). Stabilisasi

pada daerah domain inti menggunakan desain obat yang spesifik merupakan salah

satu cara terapi kanker yang dapat merestorasi fungsi p53 (Fahraeus et al., 1999;

Wiman, 1998; Harris, 1996). Fungsi p53 dapat dikembalikan dengan mengatur

konformasi mutan p53 sehingga menyerupai wild type-p53 (Bykov et al., 2005).

Modifikasi yang terdapat pada residu sistein mutan p53 diperkiran mampu

mengembalikan konformasi dan fungsi mutan p53 mendekati wild type-p53

sehingga dapat menginduksi apoptosis dalam sel yang mengekspresikan mutan

p53 (Wiman, 2010; Lambert, 2009). Modifikasi pada p53 melalui pembentukan

adduct dari satu atau beberapa residu sistein diperkirakan mampu mengembalikan

konformasi p53 mendekati wild type-p53 (Shen et al., 2001; Zache et al., 2008;

Shen, J., 2010). Terdapat 10 residu sistein yang terletak pada domain inti p53

(Lambert et al., 2009). Beberapa diantaranya diketahui memiliki reaktivitas

tertinggi dalam pembentukan adduct, yaitu pada nomor 124, 141, 135, 182, dan

277, sedangkan yang memiliki reaktivitas terendah terletak pada nomor 176 dan

275 (Joerger et al., 2010).

Lambert (2009) menyatakan bahwa salah satu produk dekomposisi

PRIMA-1 (p53 reactivation and induction of massive apoptosis-1) yaitu MQ

(Methylene Quinuclidinone) memiliki aktivitas menghambat pertumbuhan sel

tumor manusia yang membawa mutan p53. MQ memiliki gugus aktif berupa

ikatan rangkap yang mempunyai kecenderungan untuk membentuk adduct dengan

gugus tiol sistein melalui reaksi addisi. Lambert (2009) telah menggunakan N-

Asetil sistein (NAC) sebagai model untuk menunjukkan pembentukan adduct

melalui terbentuknya ikatan kovalen dengan gugus tiol sistein dalam NAC lebih

mungkin terjadi melalui MQ. Selain itu, pembentukan ikatan kovalen pada adduct

MQ-NAC lebih mudah terbentuk melalui addisi nukleofilik pada ikatan rangkap

MQ dibandingkan dengan adduct PRIMA-NAC (Nurmalitasari, 2012).

Identifikasi perubahan tiol sistein sebagai mekanisme untuk reaktivasi

mutan p53 akan memfasilitasi desain senyawa mutan p53 selektif yang lebih


commit to user

3

potensial dan akhirnya pengembangan obat yang benar untuk penanganan kanker

(Lambert et al., 2009). Penggunaan adduct MQ-Sistein diperkirakan mampu

mengembalikan konformasi mutan p53 mendekati wild type-p53, sehingga

identifikasi terhadap molekul kecil yang mampu mereaktivasi mutan p53 seperti

adduct MQ-Sistein membuka peluang untuk mengembangkan obat antikanker

yang lebih efisien.

B. Perumusan Masalah

1. Identifikasi Masalah

Mutan R175H-p53 kehilangan fungsi penekan tumor akibat perubahan

konformasi. Modifikasi pada p53 melalui pembentukan adduct dari satu atau

beberapa residu sistein diperkirakan dapat mereaktivasi fungsi p53 dengan cara

mengembalikan konformasi p53 mendekati wild type-p53.

Modifkasi sistein dapat dilakukan dengan pembentukan adduct melalui

terbentuknya ikatan kovalen antara gugus tiol sistein dalam N-Asetil Sistein

(NAC) dengan MQ. Pembentukan adduct MQ-NAC dapat dijadikan sebagai

analogi pembentukan adduct antara MQ dengan residu sistein pada p53 sehingga

membentuk adduct MQ-Sistein. Lokasi residu sitein pada p53 dapat terletak pada

suatu lekukan (cavity) yang dalam ataupun landai, ditengah-tengah makromolekul

yang jauh dari permukaan (surface area), maupun dipermukaan makromolekul.

Beberapa residu sistein diketahui memiliki reaktivitas tercepat dalam

pembentukan adduct yaitu terletak pada residu nomor 124, 141, 135, 182 dan 277,

sedangkan residu sistein yang memiliki reaktivitas paling lambat dalam

pembentukan adduct terletak pada residu nomor 176 dan 275. Banyak sistein p53

yang diketahui berpotensi dapat membentuk adduct, namun adduct mana yang

memiliki probabilitas terbesar dalam mereaktivasi p53 belum terungkap. Lokasi

sitein dan kecepatan pembentukan adduct yang berbeda diduga memberikan

perbedaan pengaruh interaksi yang memungkinkan terjadinya perbedaan

perubahan konformasi p53, sehingga pemilihan residu sistein menjadi penting

untuk dilakukan.

Modifikasi sistein melalui pembentukan adduct dapat dilakukan dengan


commit to user

4

pengujian secara in vitro, in vivo, maupun in silico. Pemodelan in silico melalui

eksperimen dengan menggunakan komputer memungkinkan untuk menghitung

sifat molekul yang kompleks dan hasil perhitungan tersebut berkorelasi dengan

eksperimen. Untuk dapat menghasilkan dinamika konformasi seperti real sistem,

maka perlu dilakukan pengaturan terhadap jumlah partikel (N), temperatur (T),

tekanan (P), volume (V), dan energi (E) pada sistem tersebut. Hasil pengaturan

tersebut berupa suatu ensambel yang merupakan koleksi dari keadaan sistem yang

mungkin memiliki keadaan mikroskopis berbeda namun memiliki keadaan

makroskopis sama. Beberapa ensambel yang sering digunakan dalam dinamika

molekuler adalah ensambel mikrokanonikal, ensambel kanonikal, ensambel

isobarik-isotermal, dan ensambel grand kanonikal. Penggunaan ensambel yang

tepat diperlukan untuk efektivitas hasil simulasi agar lebih sesuai dengan metode

eksperimen.

2. Batasan Masalah

1. Pemilihan residu sistein target berdasarkan pada lokasi sistein yang memiliki

probabilitas terbentuknya adduct dan kecepatan pembentukan adduct.

2. Ensambel untuk mengkondisikan molekul sistem yang dipakai adalah

ensambel isobarik-isotermal.

3. Rumusan Masalah

1. Apakah modifikasi adduct dari satu residu sistein dapat mereaktivasi R175H-

p53?

2. Bagaimanakah adduct MQ-Sistein dapat mereaktivasi R175H-p53?

C. Tujuan Penelitian

1. Mengetahui apakah modifikasi adduct dari satu residu sistein dapat

mereaktivasi R175H-p53.

2. Mengetahui bagaimana adduct MQ-Sistein dapat mereaktivasi R175H-p53.


commit to user

5

D. Manfaat Penelitian

Dengan membandingkan dinamika reaktivasi p53 termutasi di residu

sistein R175H oleh adduct MQ-Sistein pada posisi dan kecepatan pembentukan

adduct yang berbeda, maka secara umum dapat diketahui selektivitas adduct MQ-

Sistein dalam mereaktivasi p53 termutasi R175H. Hal ini juga diharapkan mampu

memberikan kontribusi dalam pengambangan ilmu kesehatan, terutama dibidang

pengobatan kanker.


commit to user

6

BAB II

LANDASAN TEORI

A. Tinjauan Pustaka

1. Kanker

Kanker merupakan penyakit sel yang berasal dari sel normal dalam tubuh

yang mengalami transformasi menjadi ganas. Proses keganasan ini di karenakan

terjadinya mutasi spontan atau induksi karsinogen (Franks dan Teich, 1998;

Maliya, 2004). Transformasi tersebut mengakibatkan rusaknya mekanisme

pengaturan dasar prilaku sel, khususnya mekanisme pertumbuhan dan diferensiasi

sel yang diatur oleh gen, sehingga faktor genetik diduga kuat sebagai pencetus

utama terjadinya kanker (Maliya, 2004). Akumulasi perubahan genetik pada sel

kanker berakibat terhadap regulasi siklus sel (Dharmayanti, 2003). Pembelahan,

proliferasi dan diferensiasi sel dikontrol secara ketat dalam kondisi normal, serta

terdapat keseimbangan antara proliferasi sel dengan kematian sel yang diregulasi

melalui siklus sel dengan cellular checkpoint (Hartwell dan Kastan, 1994).

Siklus sel merupakan proses replikasi sel yang melalui beberapa fase yaitu

fase G1 (gap 1), S (sintesa), G2 (gap 2), M (mitosis), dan diselingi fase istirahat

yaitu G0 (gap 0) (Rang et al., 2003; Enten dan Monson, 2005; MacDonald dan

Ford, 1997; De Vita, Helman dan Rosenberg, 1997). Checkpoint terjadi di antara

fase G1 dan fase S pada siklus sel, berlangsung kira-kira dua hingga tiga jam

sebelum DNA disintesa dalam fase S. Lintasan yang teraktifkan sebagai respon

kerusakan DNA merupakan sinyal bagi inaktivasi checkpoint, sehingga siklus sel

berhenti di fase G1. Apabila terjadi kerusakan DNA, siklus sel berhenti di fase G1

dan di fase G2. Pemberhentian di fase G1 berfungsi untuk mencegah DNA yang

rusak direplikasi dan pemberhentian di G2 memungkinkan sel untuk menghindari

pemisahan kromosom yang rusak. Setelah perbaikan DNA selesai, pembelahan

sel akan memasuki fase berikutnya. Ketidakmampuan kontrol checkpoint

menyebabkan inisiasi fase S atau M tetap berlangsung meskipun ada kerusakan

seluler dan ketidakstabilan genetik (De Vita, Helman dan Rosenberg, 1997).

6


commit to user

7

Proses checkpoint yang berlangsung dalam siklus perkembangan sel ditunjukkan

pada gambar 1.

Gambar 1. Siklus perkembangan sel. Proses checkpoint berlangsung selama fase G1 dan G2 (Ismono dan anggono, 2009).

2. Protein p53

Protein p53 berperan sebagai tumor-suppressor yang disandi oleh gen p53.

p53 merupakan faktor transkripsi dengan fungsi utama sebagai pengatur siklus sel

dan sering mengalami mutasi pada berbagai kasus tumor pada manusia (Leffel,

2000). Protein p53 selain berpengaruh terhadap kontrol siklus sel, juga berperan

pada perbaikan kerusakan DNA dan sintesis DNA, diferensiasi sel, serta apoptosis

(Benjamin dan Ananthaswamy, 2007). Protein p53 mengikat DNA dalam bentuk

yang spesifik untuk menjalankan fungsinya, sehingga memungkinkan p53

mengaktifkan transkripsi gen sasaran.

Kadar protein p53 wild type pada sel normal relatif sangat sedikit, bersifat

labil dan mempunyai waktu paruh pendek. Protein p53 wild type berperan

menghambat proliferasi sel, transkripsi sel, reparasi DNA, dan apoptosis.

Sebaliknya protein p53 mutant type (tipe mutan) berperan menghambat protein

p53 wild type sehingga proliferasi sel kehilangan hambatannya (Brock, 1993).

Protein p53 terdiri dari 3 mayor domain yaitu: N-terminal transaktivation,

DNA binding domain yang terletak dalam bagian tengah molekul, dan C-

oligomerization domain (Hollstein et al., 1991). Protein p53 secara spesifik terikat


commit to user

8

pada daerah DNA binding sequence (Kern et al.,1997) dan kebanyakan mutasi

terletak pada daerah DNA-binding tersebut (Joerger dan Fersht, 2007; Olivier et

al., 2002; Hamroun et al., 2006), sehingga secara langsung maupun tidak

langsung mempengaruhi interaksi p53 dengan DNA.

Pusat DNA binding domain merupakan domain inti yang berinteraksi

dengan DNA dan berawal dari residu 102 sampai residu 292. Domain inti p53

adalah bagian yang sangat dipertahankan. Substitusi pada domain inti akan

meningkatkan 98% mutasi perubahan (transforming mutation) pada p53, dan 40%

dari jumlah tersebut melibatkan hanya enam titik atau hot spot di dekat

permukaan ikatan DNA (Wong et al., 1999). Enam hot-spots mutasi yang sering

terkait dengan kanker manusia tersebut yaitu R175H, G245S, R248Q, R249S,

R273H, dan R282W (Joerger dan Fersht, 2007; Friedler et al., 2002; Olivier et al.,

2002; Hainaut dan Hollstein, 2000). Mutasi ini dapat dibedakan menjadi 2 kelas,

yaitu kontak dan struktural mutan. Kontak mutan terjadi pada residu yang kontak

langsung dengan DNA yaitu Arg-248 dan Arg-273. Mutasi pada dua residu

tersebut mengakibatkan lepaskan p53 dari ikatan DNA. Struktural mutan terjadi

pada residu yang menjaga stabilitas struktur dari domain inti yaitu Arg-175, Gly-

245, Arg-249, dan Arg-282 yang dapat merusak struktur permukaan p53 yang

binding dengan DNA (Joerger dan Fersht, 2007; Peng et al., 2003; Cho et al.,

1994).

1. Struktur Protein

Protein merupakan makromolekul yang paling melimpah di dalam sel dan

sangat bervariasi fungsinya. Dari sudut pandang kimia, protein adalah polimer

yang tersusun oleh 20 jenis residu asam amino (Pudjaatmaka, 1999) dan

semuanya memiliki struktur yang sama kecuali pada rantai sampingnya. Rantai

samping memberikan karakteristik tertentu pada suatu asam amino sehingga dapat

digunakan sebagai dasar dalam penggolongan asam amino (Nelson dan Cox,

2004; Berg, Tymoczko dan Stryer, 2002). Asam amino dapat bergabung dengan

asam amino lainnya melalui pembentukan ikatan amida atau ikatan peptida.

Ikatan tersebut terbentuk melalui ikatan kovalen antara gugus karboksil suatu

asam amino dengan gugus amino dari asam amino lainnya, yang diikuti oleh


commit to user

9

pelepasan atau eliminasi molekul air (H2O). Ikatan peptida ini menghubungkan

beberapa asam amino membentuk rangkaian polipeptida penyusun protein. Linus

Pauling dan Robert Corey (1930) dengan menggunakan difraksi sinar-X dari

kristalografi peptida menyatakan bahwa ikatan peptida bersifat rigid (kaku) dan

planar. Sifat rigid dan planar tersebut merupakan konsekuensi dari interaksi

resonansi amina atau kemampuan amida nitrogen untuk delokalisasi pasangan

elektron bebas (lone pair electron) ke karbonil (C=O) (Nelson dan Cox, 2004).

Struktur protein terdiri dari 4 tingkatan yaitu struktur primer, sekunder,

tersier dan kuaterner (Nelson dan Cox, 2004; Berg, Tymoczko dan Stryer, 2002).

Empat tingkatan struktur protein disajikan pada gambar 2. Struktur primer

merupakan struktur yang terbentuk dengan adanya ikatan peptida antara atom C

karbonil dengan atom N amino dari residu asam amino yang tersususn berurutan

membentuk rantai polipeptida (Berg, Tymoczko dan Stryer, 2002).

Gambar 2. Empat tingkatan struktur protein (Mandle, Jain dan Shirvastava, 2012).

Struktur sekunder merupakan struktur yang terbentuk dengan adanya

perubahan pada backbone polipeptida membentuk pola lipatan berulang (Nelson

dan Cox, 2004). Struktur sekunder protein terjadi karena ikatan hidrogen yang


commit to user

10

terbentuk antara C karbonil dengan NH amino pada backbone polipeptidanya.

Ikatan hidrogen dalam satu rantai polipeptida memungkinkan terbentuknya

konformasi spiral yang disebut dengan srtuktur -helix. Namun bila ikatan

hidrogen tersebut terjadi antara dua rantai polipeptida maka akan membentuk

rantai paralel dengan bentuk berkelok-kelok yang disebut -sheet

(Berg, Tymoczko dan Stryer, 2002).

Struktur tersier protein terbentuk karena terjadi pelipatan (folding) rantai

-helix maupun -sheet. Kemantapan struktur tersier disebabkan oleh ikatan

disulfida serta ikatan non kovalen yang menunjang terjadinya pelipatan. Pelipatan

struktur sekunder terjadi akibat interaksi antar gugus alkil (rantai samping)

polipeptida yaitu interaksi hidrofobik, interaksi ionik, ikatan hidrogen antar

peptida, ikatan hidrogen rantai samping, ikatan elektrostatik serta ikatan van der

walls sehingga membentuk struktur tiga dimensi (Nelson dan Cox, 2004;

Pudjaatmaka, 1999). Sedangkan struktur kuaterner merupakan polipeptida yang

sudah mempunyai struktur tersier yang saling berinteraksi dan bergabung menjadi

satu multimer (Pudjaatmaka, 1999).

Aktivitas fungsional protein terjadi setelah rantai polipeptida yang baru

disintesis mengalami proses pelipatan (Gething dan Sambrook, 1992). Urutan

asam amino suatu polipeptida akan menentukan pelipatan konformasi tiga

dimensi apa yang akan diambil oleh protein tersebut (Mandle, Jain dan

Shirvastava, 2012). Substitusi residu pada protein seperti terjadinya mutasi

menimbulkan konsekuensi fungsional yang sangat kompleks (Blagosklonny,

2000; Sigal dan Rotter, 2000) tergantung pada jenis mutasi yang terjadi.

2. Mutan R175H-p53

Mutasi R175H terjadi dari residu arginin menjadi histidin dan merupakan

salah satu hot spots mutasi yang sering terkait dengan kanker manusia (Joerger

dan Fersht, 2007; Friedler et al., 2002; Olivier et al., 2002; Hainaut dan Hollstein,

2000). Mutasi yang berlokasi pada daerah -sandwich seperti R175H

mengakibatkan ketidakstabilan struktur sekunder p53 dalam berinteraksi dengan

DNA (Joerger et al., 2005a, 2005b; Cho et al., 1994). Ketidakstabilan struktur p53


commit to user

11

tersebut disebabkan karena rusaknya ikatan hidrogen antara residu-residu loop 2

dan loop 3 dengan DNA (Joerger et al., 2006) yang menyebabkan perubahan

konformasi p53, sehingga mengakibatkan hilangnya fungsi p53 (Bullock, Henckel

dan Fersht, 2000; Kato et al., 2003). Gambar 3 menunjukkan posisi mutan

R175H-p53 pada struktur domain inti p53.

Gambar 3. Struktur domain inti p53. Posisi mutan R175H-p53 ditunjukkan dengan garis oval untuk kejelasan gambar (Joerger dan Fersht, 2010).

Kanker yang mengandung p53 termutasi cenderung resisten terhadap

kemoterapi yang telah umum dilakukan dibandingkan dengan yang mengandung

wild type-p53 (Bykov et al., 2002a). Stabilisasi pada daerah domain inti

menggunakan desain obat yang spesifik merupakan salah satu cara terapi kanker

yang dapat merestorasi fungsi p53 (Fahraeus et al., 1999; Wiman, 1998; Harris,

1996). Fungsi p53 dapat dikembalikan dengan mengatur konformasi mutan p53

sehingga menyerupai wild type-p53 (Bykov et al., 2005).

3. Reaktivasi p53 Termutasi

Proses pengembalian fungsi p53 melalui pengembalian konformer domain

inti p53 termutasi dengan molekul kecil telah dilakukan (Bykov et al., 2002a,

2002b). Adanya modifikasi kovalen pada satu atau beberapa residu sistein mutan

p53 diperkirakan mampu mengembalikan konformasi dan fungsi p53 mendekati

wild type sehingga dapat menginduksi apoptosis dalam sel yang mengekspresikan

mutan p53 (Lambert et al., 2009; Wiman, 2010). Terdapat 10 residu sistein yang


commit to user

12

terletak pada domain inti p53, namun belum diperoleh kesimpulan residu sistein

mana pada domain inti p53 yang dapat dimodifikasi oleh MQ dan produk

dekomposisi PRIMA-1 lainnya (Lambert et al., 2009). Analisis reaktivitas relatif

menggunakan spektrometri massa menemukan bahwa sistein yang memiliki

reaktivitas tertinggi dalam pembentukan adduct terletak pada nomor 124, 141,

135, 182, dan 277, sedangkan yang memiliki reaktivitas terendah terletak pada

nomor 176 dan 275 (Joerger et al., 2010). Modifikasi kovalen dari domain inti

p53 secara in vitro oleh MQ dan produk dekomposisi lain telah ditentukan

menggunakan MS. Percobaan presipitasi imun menggunakan radioaktif

mengindikasikan bahwa modifikasi kovalen mutan p53 oleh MQ dan atau produk

degradasi lain dari PRIMA-1 terjadi pada sel hidup (Bykov et al., 2002a).

Modifikasi pada p53 melalui pembentukan adduct dari satu atau beberapa

residu sistein diperkirakan mampu mengembalikan konformasi p53 mendekati

wild type (Shen et al., 2001; Zache et al., 2008; Shen, J., 2010). Lambert (2009)

telah menggunakan N-Acetyl Cysteine (NAC) sebagai model dalam pembentukan

adduct dengan MQ sehingga membentuk adduct MQ-NAC. MQ mempunyai

gugus aktif berupa ikatan rangkap yang cenderung berpartisipasi dalam reaksi

adisi nukleofilik (Lambert et al., 2009). Pembentukan adduct MQ-NAC dapat

dijadikan sebagai analogi pembentukan adduct antara MQ dengan residu sistein

pada p53 membentuk adduct MQ-Sistein. Struktur adduct MQ-NAC dan adduct

MQ-Sistein disajikan pada gambar 4.

Gambar 4. Struktur adduct MQ-NAC (kiri) dan adduct MQ-Sistein (kanan).

4. Pemodelan Molekuler

Pemodelan molekuler merupakan suatu teknik untuk merancang dan

menampilkan struktur dan sifat-sifat molekul tertentu yang dilakukan dengan

persamaan matematis menggunakan teknik kimia komputasional dan visualisasi


commit to user

13

grafis. Pemodelan molekuler berfungsi untuk memodelkan perilaku molekul

sehingga dapat digunakan untuk mempelajari sistem molekular suatu molekul

tertentu (Leach, 2001).

Tujuan dari pemodelan molekuler adalah menyediakan struktur geometri

tiga dimensi yang sesuai dengan parameter kondisi yang telah ditentukan

(Pranowo, 2004). Struktur tiga dimensi ligan dapat dimodelkan dengan teknik

pemodelan molekuler, sedangkan struktur tiga dimensi protein target dapat

ditentukan secara empiris dengan menggunakan teknik spektroskopi NMR dan

kristalografi sinar-X yang terdapat pada database protein data bank (PDB) dan

secara in silico dengan pemodelan homologi (Elmar et al., 2003).

Pemodelan in silico melalui eksperimen dengan menggunakan komputer

memungkinkan untuk menghitung sifat molekul yang kompleks dan hasil

perhitungan tersebut berkorelasi dengan eksperimen laboratorium (Pranowo,

2004). Teknik in silico memiliki beberapa keunggulan diantaranya kualitas data

eksperimen lebih baik, produktivitas kerja lebih tinggi, efisiensi biaya dan dapat

dilakukan tanpa menggunakan langsung senyawa sebenarnya (Helma, 2004).

Pembuatan model molekul harus memperhatikan adanya model interaksi

antar molekul yang menunjukkan adanya ikatan antar atom. Interaksi tersebut

dipengaruhi oleh suatu potensial yang dibentuk oleh medan gaya (force field) dari

partikel-partikel lain disekitarnya (Leach, 2001). Force fields diperoleh dengan

mengembangkan model melalui kombinasi antara bentuk ikatan (jarak ikatan,

sudut ikatan, sudut torsi, dll) dan tanpa ikatan (vander walls dan elektrostatik)

(Teodoro et al., 2001). Pada akhirnya force fields merupakan penjumlahan energi

total dari protein yang meliputi energi bonding-streching, bending, torsi, vander

walls dan elektrostatis menurut persamaan:

Etotal = Estreching + Ebending + Evdw + Eelektrostatis (2.6)

(Leach, 2001; Sanchez, 2004).

5. Simulasi Dinamika Molekuler

Metode simulasi komputer memudahkan kita untuk mempelajari

beberapa sistem dan memprediksikan sifat-sifatnya dengan penggunaan teknik


commit to user

14

yang mempertimbangkan replikasi yang kecil dari sistem makroskopik dengan

sejumlah atom atau molekul yang dapat diatur (Leach, 2001). Simulasi dinamika

molekuler (DM) memungkinkan kita untuk menyelidiki energi dan gaya yang

berkaitan dengan sejumlah ikatan, konfigurasi sterik mengenai protein, informasi

stabilitas dan perilaku protein serta mengamati sejumlah sifat-sifat fisik sistem

(Turner, 2004). Metode simulasi DM dikembangkan untuk mempelajari stabilitas

protein, perubahan konformasi, pelipatan protein, evaluasi struktur hasil

kristalografi sinar-X maupun NMR sampai perancangan obat (drug design),

se sperimen dengan teori

(Nurbaiti, 2009).

Terdapat beberapa parameter dalam simulasi DM yang berkaitan dengan

proses simulasi tersebut antara lain jari-jari cutoff, minimisasi energi, dan

ensambel. Jari-jari cutoff (Rc) merupakan nilai batas partikel agar masuk ke dalam

perhitungan gaya total atom (Nurbaiti, 2009). Minimisasi energi merupakan

proses perhitungan algoritma yang dikembangkan untuk mencari posisi geometri

atom yang paling sesuai dengan tingkat energi terendah. Secara umum terdapat

dua jenis metode minimisasi energi yang umum digunakan dalam simulasi DM,

yaitu: metode Steepest Descent dan metode Conjugate Gradient (Leach, 2001).

Metode Conjugate Gradient dapat mengatasi kekurangan metode Steepest

Descent dalam mengenali informasi bentuk kurva energi potensial permukaan

(Becker et al., 2001).

Parameter lainnya yang berkaitan erat dengan simulasi DM yaitu

pengaturan suatu ensambel yang dapat mewakili keadaan dari sistem yang

sebenarnya. Pengaturan dilakukan terhadap jumlah partikel (N), temperatur (T),

tekanan (P), volume (V), dan energi (E) pada sistem tersebut. Hasil pengaturan

tersebut berupa suatu ensambel yang merupakan koleksi dari keadaan sistem yang

mungkin memiliki keadaan mikroskopis berbeda namun memiliki keadaan

makroskopis sama (Leach, 2001). Beberapa ensambel yang sering digunakan

dalam dinamika molekul yaitu:

1) Ensambel mikrokanonikal

Ensambel mikrokanonikal memiliki karakteristik jumlah molekul,


commit to user

15

volume dan energi yang tetap (Leach, 2001). Ensambel ini diperoleh dari

sistem terisolasi, sehingga tidak terdapat interaksi antara sistem dengan

lingkungan. Hal ini menunjukkan bahwa energi tidak dapat keluar-masuk

sistem sehingga energi totalnya tetap (Sofyan, 2007).

2) Ensambel kanonikal

Ensambel mikrokanonikal memiliki karakteristik jumlah molekul,

volume dan temperatur yang tetap. Konsekuensi dari ensambel ini yaitu

dihasilkannya nilai minimum dari energi bebas Helmholtz (A) ketika

kesetimbangan (Leach, 2001).

3) Ensambel isobarik-isotermal

Sistem diisolasi dari perubahan jumlah molekul, tekanan dan

temperatur. Tekanan dan temperatur adalah sifat makroskopis yang mudah

dikendalikan dalam eksperimen. Kondisi ini lebih menyerupai kondisi yang

sering digunakan di dalam eksperimen laboratorium. Konsekuensi dari

ensambel ini yaitu dihasilkannya nilai minimum dari fungsi Gibbs (G) ketika

kesetimbangan (Leach, 2001).

4) Ensambel Grand kanonikal

Ensambel Grand kanonik memiliki karakteristik potensial kimia (µ),

volume dan temperatur tetap. Konsekuensi kondisi ini akan memberikan

harga tekanan maksimum dan harga volume yang minimum pada kondisi

setimbangnya (Leach, 2001; Witoelar, 2002).

Salah satu program yang umum digunakan dalam simulasi DM adalah

program AMBER10 (Assisted Model Building with Energy Refinement). Program

AMBER10 terdiri dari 60 program yang beberapa di antaranya dideskripsikan

sebagai berikut:

a) Antechamber

Antechamber merupakan program yang mengotomatisasi proses

pengembanngan deskriptor-deskriptor force field khususnya untuk molekul-

molekul organik. Antechamber dihidupkan dari masing-masing arsip PDB

(format PDB ) baru dengan format yang dapat dibaca dalam

LEaP untuk digunakan dalam pemodelan molekuler. Deskripsi force field


commit to user

16

yang dibuat dirancang untuk sesuai dengan force field Amber yang biasa.

b) Parmchk

Parmchk

sebagaimana suatu arsip force field

untuk parameter-parameter yang hilang.

c) LEaP

LEaP adalah suatu program berbasis X-windows yang disediakan

untuk pembuatan model dasar dan koordinat AMBER dan pembuatan arsip

input parameter atau topologi. Program tersebut meliputi editor molekuler

yang memungkinkan pembuatan residu dan memanipulasi molekul.

d) Sander (Simulated Annealing with NMR-derived Energy Restraints)

Sander adalah program utama yang digunakan untuk simulasi DM.

Program ini merelaksasi struktur dengan memindahkan atom-atom secara

iteratif menurunkan gradien energi sampai gradien rata-rata yang cukup

diperoleh. Simulasi DM akan membentuk konfigurasi sistem dengan

menggabungkan persamaan newtonian tentang gerak. DM akan melakukan

sampling ruang konfigurasional yang lebih banyak daripada minimisasi dan

memungkinkan struktur untuk melewati halangan energi potensial yang kecil.

Konfigurasi dapat disimpan pada interval tetap selama simulasi untuk analisis

lebih lanjut, dan perhitungan energi bebas dasar menggunakan integrasi

termodinamik dapat dilaksanakan.

e) Ptraj

Ptraj merupakan program yang digunakan untuk menganalisa

trajectory -trajectory DM, diantaranya untuk analisis:

(1) RMSD (Root Mean Square Deviation)

Pengukuran kesamaan struktur antara dua konformasi yang

digunakan untuk perbandingan kuantitatif suatu struktur dengan lainnya

(Becker, 2001). RMSD menyediakan informasi apakah konformasi telah

mencapai suatu keadaan yang stasioner. Deviasi masing-masing frame

terhadap frame pertama dalam trajectory dihitung. Harga ini sangat

berguna dalam mendekati sejauh mana struktur bergeser selama


commit to user

17

simulasi DM berjalan (Molinelli, 2004).

Dalam koordinat kartesian, jarak RMS antara konformasi i dan

konformasi j dari suatu molekul didefinisikan dengan persamaan

sebagai berikut :

dij = (2.7.1)

dimana N adalah jumlah atom, k adalah indeks atom, dan r(i)k, r(ij)k

adalah koordinat kartesian dari atom k dalam konformasi i dan j

(Becker, et al., 2001).

(2) B-factor

B-factor merupakan ukuran termal dari ketidaktentuan (luasan

densitas elektron) untuk struktur dan ditetapkan terhadap tiap-tiap atom

dan dapat dihitung untuk tiap-tiap residu asam amino. Pergerakan

termal paling besar biasanya ditemukan pada rantai samping dan loop

(Esposito, Tobi dan Madura, 2006). Kristalografik B-factor dapat

digunakan sebagai indikator mobilitas konformasional atau fleksibilitas

protein. Analisis distribusi B-factor telah digunakan lebih awal untuk

menganalisa karakteristik struktural dan fungsional protein (Kumar dan

Krishnaswamy, 2009). Tinggi rendahnya fluktuasi atomik suatu

molekul diwakili oleh tinggi rendahnya harga B-factor yang dihitung

sebagai rata- 2 untuk

menghasilkan perhitungan B-factor (Karjiban et al., 2009).

(3) Entropi

Entropi suatu sistem makroskopis yang berada dalam suatu

keadaan termodinamika tertentu merupakan hasil ukur dari berbagai

macam gerakan yang mungkin. Simulasi DM dapat menunjukkan

mekanisme gerak pada skala atom (Carl, Samuel dan Kristofer, 2009).

Pergerakan internal yang cepat dalam skala waktu fs sampai ns meliputi

gerak rotasi, vibrasi dan librasi dari ikatan kimia yang dapat

berhubungan dengan konformasi entropi backbone (Dhulesia,

Bodenhausen dan Abergel, 2008). Gerakan sudut masing-masing vektor


commit to user

18

ikatan dapat dipantau dari trajectory simulasi DM menggunakan order

parameter (S2) (MacRaild et al., 2007). Hubungan entropi backbone

dengan S2 merupakan estimasi entropi tiap residu dengan order

parameter. Hubungan tersebut dapat dilihat melal -

backbone hasil pengukuran S2 yang paling umum

digunakan adalah pada vektor NH. Vektor NH digunakan untuk

estimasi entropi atom backbone dengan persamaan sebagai berikut:

Sconf = kB )] (2.7.3)

untuk kB adalah konstanta Boltzmann (Stone et al., 2001). Skala order

parameter antara 0-1, dimana harga S2 yang mendekati 1 menunjukkan

vektor ikatan yang rigid, sedangkan ketika mendekati 0 berarti vektor

ikatan lebih fleksibel (Paul dan Andrew, 2010).

(4) Clustering Trajectory

Clustering merupakan teknik analisa data yang beragam untuk

mengidentifikasi subgrup yang homogen berdasarkan kemiripan model

atau pengukurannya ( Lipkowitz., 2002). Algoritma yang digunakan

untuk memisahkan data secara alami akan membagi data yang ada

menjadi bagian bagian tertentu (klaster) yang representatif, dimana

setiap klaster mempunyai konformasi, variasi dan ukuran yang berbeda

(Shao et al., 2007). Algoritma dalam clustering trajectory terbagi

menjadi dua kelas besar yaitu, kelompok Hierarchical dan kelompok

Nonhierarchical. Kelompok Hierarchical mampu menghasilkan

klaster- klaster yang berukuran berbeda tetapi tidak dapat menghasilkan

klaster yang mempunyai perbedaan diameter yang jauh seperti energi

lokal minimal yang berbeda sangat signifikan. Keuntungan dari

algoritma ini yaitu dapat mengklaster dalam waktu yang paling cepat

(Shao et al., 2007). Salah satu algoritma yang termasuk dalam

kelompok ini adalah Complate lingkage. Sedangkan kelompok

Nonhierarchical mengklaster data dengan cara menghasilkan suatu

klaster yang single yang merupakan hasil dari pengukuran seluruh data

(Lipkowitz et al., 2002).


commit to user

19

B. Kerangka Pemikiran

Mutan p53 yang terletak pada domain inti dengan mutasi hot spot R175H

(mutasi arginin menjadi histidin) mengakibatkan ketidakstabilan struktur p53

dalam berinteraksi dengan DNA. Hal ini menyebabkan hilangnya fungsi p53

sebagai penekan tumor. Fungsi p53 dapat dikembalikan dengan mengatur

konformasi dari mutan p53 sehingga menyerupai wild type-p53. Pengembalian

konformasi mutan p53 salah satunya dapat dilakukan dengan pembentukan adduct

terhadap residu sistein pada p53.

Modifikasi residu sistein yang dimodelkan dengan N-Acetyl Cysteine

(NAC) dapat membentuk adduct dengan Methylene Quinuclidinone (MQ) melalui

addisi nukleofilik. Adduct MQ-NAC dapat dijadiakan analogi pembentukan

adduct antara MQ dengan residu sistein pada p53. Pemilihan posisi residu sistein

yang tepat diperlukan untuk mengetahui selektivitas dan efektifitas adduct dalam

mengembalikan konformasi mutan p53. Beberapa residu sistein diketahui

memiliki aktivitas pembentukan adduct dengan kecepatan yang berbeda.

Pembentukan adduct paling cepat terjadi pada Cys-124, sedangkan yang paling

lambat terjadi pada Cys-275. Selain berdasarkan aktivitas pembentukan adduct,

pertimbangan lain yang dilakukan dalam pemilihan sistein target yaitu

berdasarkan posisi (lokasi) residu sistein. Posisi residu sistein yang memiliki

cavity cukup lebar lebih memungkinkan adduct MQ-Sistein untuk masuk dan

bertahan dibanding dengan residu sistein yang berada dipermukaan

makromolekul. Perbandingan pengaruh adduct MQ-Sistein pada posisi yang

berbeda terhadap konformasi total mutan p53 diharapkan mampu menunjukkan

probabilitas yang lebih tinggi dalam pengembalian konformasi mutan p53 agar

mendekati konformasi wild type-p53.

Perubahan konformasi protein akibat pengaruh adduct pada posisi yang

berbeda akan menunjukkan sejauh mana adduct tersebut dapat mengembalikan

konformasi mutan p53 mendekati wild type-p53. Hal tersebut akan menunjukkan

bahwa pengembalian konformasi mutan p53 cukup dengan satu adduct ataukah

diperlukan kombinasi lebih dari satu adduct untuk dapat mereaktivasi mutan p53.


commit to user

20

Simulasi dinamika molekuler dapat menghasilkan trajectory molekul-

molekul dalam jangka waktu terhingga. Trajectory tersebut berupa suatu

konfigurasi yang dapat diartikan sebagai koordinat dalam phase space. Menurut

Boltzman, suatu sistem akan pernah memiliki semua konfigurasi yang mungkin

terjadi dalam jangka waktu mendekati tak hingga sesuai dengan hipotesis ergodic.

Hal ini berarti, sistem tersebut akan pernah berada pada setiap koordinat dalam

phase space. Phase space yang berbeda dapat menghasilkan keadaan makroskopis

sama, sehingga konfigurasi-konfogurasi yang dihasilkan selama simulasi dapat

menunjukkan karakteristik sistem.

Analisis trajectory hasil simulasi dapat menunjukkan konformasi yang

mungkin terjadi selama simulasi berjalan. Konformasi dominan yang diperoleh

dengan teknik clustering pada mutan p53 yang mengandung adduct pada posisi

yang berbeda dapat digunakan untuk mengamati perbedaan karakteristik masing-

masing sistem. Konformasi yang dapat menunjukkan karakteristik mendekati wild

type-p53 dimungkinkan dapat merestorasi mutan p53.

C. Hipotesis

1. Adduct MQ-Sistein pada posisi yang berbeda berpengaruh terhadap perubahan

konformasi mutan p53, sehingga memungkinkan terjadinya reaktivasi R175H-

p53 dengan satu adduct.

2. Adduct MQ-Sistein mampu mereaktivasi R175H-p53 melalui pengembalian

konformasi menyerupai konformasi wild type-p53.


commit to user

21

BAB III

METODOLOGI PENELITIAN

A. Metode Penelitian

Metode yang digunakan dalam penelitian ini adalah metode eksperimental

laboratoris.

B. Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian dilakukan pada bulan Mei 2012 sampai Oktober 2012,

bertempat di Laboratorium Kimia Dasar bagian Komputasi Kimia jurusan Kimia

FMIPA UNS.

C. Alat dan Bahan yang Dibutuhkan

1. Alat

Seperangkat klaster komputer dengan spesifikasi : Master node dan 4 x

compute node @ 2 intel six-core Xeon X5650 CPU (12 core 2,7 GHz), 12 GB

DDR3 ECC RAM (1GB per core). Software yang digunakan, yaitu: AMBER10

(Case et al., 2008), Molden (Schaftenaa dan Noordik, 2000), GAUSSIAN03

(Frishch et al., 2003), Chimera (Pettersen et al., 2004), XMGRACE.

2. Bahan

Struktur p53 termutasi R175H (.pdb) yang diperoleh dari mutasi struktur

wild type-p53 (.pdb), struktur adduct MQ-NAC hasil optimasi program molden.

D. Prosedur Penelitian

1. Parameterisasi Adduct MQ-Sistein

Struktur adduct MQ-Sistein diperoleh dari modifikasi struktur adduct MQ-

NAC teroptimasi (Nurmalitasari, 2012), kemudian dilakukan penggantian gugus

asetil pada NAC dengan atom H. Selanjutnya dilakukan eliminasi atau pelepasan

H2O yaitu atom H pada gugus amina dan hidroksi (OH) pada gugus karboksilat

membentuk adduct MQ-Sistein. Eliminasi H2O dilakukan karena sistein yang

digunakan dikondisikan seperti residu sistein target yang berada diantara residu

lain dalam makromolekul. Populasi elektron dihitung dengan metode Mulliken.

Arsip log data ESP (Electrostatic Potensial) dikonversi menjadi format RESP

21


commit to user

22

(Restrain Electrostatic Potensial) menggunakan program Antechamber melalui 2

tahap. Tahap yang pertama yaitu membuat input file (resp.in, resp.qin) dan input

script (esp.sh) untuk penyesuaian muatan pada sistein target menghasilkan file

chg. Tahap kedua yaitu pengolahan arsip log data ESP menjadi file prep dengan

penyesuaian nama atom, tipe atom, dan muatan pada sistein berdasarkan file chg

yang telah diperoleh. Hasilnya berupa arsip prep dan arsip frcmod sebagai

template dan parameter adduct MQ-Sistein yang akan digunakan dalam proses

selanjutnya.

2. Pemilihan Makromolekul

Makromolekul diperoleh dari struktur wild type-p53 (.pdb) yang dimutasi

pada residu arginin menjadi histidin yang membentuk mutan R175H-p53. Mutan

tersebut kemudian disimulasi selama 100 ns dan dilakukan clustering. Struktur

representatif yang diambil dalam penelitian ini berdasarkan ascessibilitas solvent

analysis. Pemilihan makromolekul juga dilakukan berdasarkan keberadaan sistein

yang memiliki cavity yang cukup dalam dan lebar sehingga dimungkinkan adduct

dapat masuk pada posisi tersebut menggunakan surface analysis dengan program

Chimera.

3. Penentuan Koordinat Awal Sistem

Simulasi dilakukan terhadap R175H-p53 yang telah dilakukan penggantian

residu sistein target oleh adduct MQ-Sistein. Ion Cl- sebagai counterion

ditambahkan menggunakan modul XLEAP dalam AMBER10. Sistem kemudian

disolvasi dengan penambahan eksplisit solvent berupa model air TIP3PBOX yang

berupa sekumpulan molekul air yang berbentuk kotak yang melingkupi sistem

dengan jarak minimum antara sistem dan model istem tersebut

disimpan dalam format arsip pdb (urutan atom dan posisinya), arsip prmtop

(topologi sistem), dan arsip inpcrd (parameter sistem) yang nantinya akan

digunakan dalam proses minimisasi, penyeimbangan, dan simulasi.

4. Minimisasi dan Penyeimbangan (Equilibrasi) Sistem

Minimisasi dilakukan agar proses solvasi sempurna yaitu jarak model air

dekat dengan sistem. Tahap penyeimbangan (equilibrasi) diperlukan agar keadaan

awal simulasi tidak dominan mempengaruhi analisa dari simulasi. Minimisasi dan


commit to user

23

penyeimbangan sistem dilakukan dengan prosedur yang terbagi dalam 20 langkah.

Makromolekul dan posisi-posisi ion dijaga konstan dengan penahanan harmonik

(harmonic restraint) sebesar 1000 kcal mol-1 -2 pada langkah pertama sampai

langkah ke-5. Langkah pertama dilakukan minimisasi sistem tanpa melibatkan

atom hidrogen (H). Langkah ke-2 dilakukan minimisasi dengan melibatkan air

sebagai eksplisit solvent tanpa melibatkan atom H. Langkah ke-3 dilakukan

penyeimbangan dalam kondisi N,V,T tetap dengan pemanasan bertahap 100-300 oK selama 1 fs tanpa melibatkan atom H. Langkah ke-4 dilakukan penyeimbangan

dalam kondisi N,P,T tetap tanpa melibatkan atom H selama 2 fs. Langkah ke-5

kembali dilakukan penyeimbangan sistem dalam kondisi N,V,T tetap dengan

penurunan temperatur secara bertahap 300-100 oK selama 1 fs. Langkah ke-6

sampai dengan langkah ke-19 dilakukan minimisasi dengan penurunan penahanan

harmonik secara bertahap dari 1000 kcal mol-1 -2 sampai 0,5 kcal mol-1 -2.

Selanjutnya langkah ke-19 kembali dilakukan penyeimbangan dalam kondisi

N,V,T tetap tanpa adanya penahanan harmonik selama 2 fs. Langkah terakhir

dilakukan penyeimbangan dalam kondisi N,P,T tetap selama 2 fs. Langkah

terakhir tersebut menghasilkan ensambel isobarik-isotermal. Kondisi pada

ensambel tersebut lebih menyerupai kondisi yang sering digunakan di dalam

eksperimen laboratorium. Hal ini dilakukan karena tekanan dan temperatur

merupakan sifat makroskopis yang mudah dikendalikan dalam eksperimen.

5. Simulasi Sistem

Simulasi dijalankan pada temperatur konstan 300 oK, tekanan 1 atm,

SHAKE constraints

hidrogen), nonbonded cutoff 8 time step dan prosedur particle mesh Ewald

yang digunakan untuk menangani interaksi elektrostatik yang jangkauannya jauh

(long range electrostatic interactions) menggunakan protokol pmemd. Simulasi

dilakukan selama 100 ns, dimana informasi struktural dikumpulkan setiap 500 ps.

E. Teknik Pengumpulan dan Analisis Data

Data yang berupa trajektori hasil simulasi DM diolah dengan perangkat

analisis yang terdapat dalam program AMBER10 (ptraj) dan XMGRACE.

Sedangkan program CHIMERA digunakan untuk menampilkan data secara visual.


commit to user

24

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Parameterisasi Adduct MQ-Sistein

Parameterisasi adduct MQ-Sistein dilakukan untuk memperoleh template

adduct yang akan digunakan dalam penghitungan minimisasi, penyeimbangan

(equilibrasi), dan simulasi. Struktur adduct MQ-Sistein diperoleh dari modifikasi

struktur adduct MQ-NAC teroptimasi (Nurmalitasari, 2012) yang telah dilakukan

penggantian gugus asetil pada NAC dengan atom hidrogen, kemudian dilakukan

eliminasi H2O yaitu satu atom H pada gugus amino dan hidroksi (OH) pada gugus

karboksilat. Eliminasi H2O dilakukan karena sistein yang digunakan dikondisikan

seperti residu sistein target yang berada diantara residu-residu lain dalam

makromolekul. Modifikasi sistein tidak dilakukan pada N-terminal maupun C-

terminal protein untuk mempertahankan kondisi sistein target sehingga

penggantian hanya dilakukan pada atom H gugus tiol sistein dengan MQ

(Methylene Quinuclidinone). Tahapan pembentukan adduct MQ-Sistein dari

adduct MQ-NAC dengan program molden disajikan pada gambar 5.

Gambar 5. Tahapan pembentukan struktur adduct MQ-Sistein dari adduct MQ-

NAC.

Populasi dan distribusi elektron MQ yang menggantikan atom H pada

sistein diperoleh dengan metode Mulliken. Arsip log data ESP (Electrostatic

Potensial) yang dihasilkan kemudian dikonversi menjadi format RESP (Restrain

Electrostatic Potensial) menggunakan program Antechamber melalui 2 step. Step

yang pertama yaitu membuat file input dengan penyesuaian muatan pada sistein

target yang menghasilkan file chg. Step kedua yaitu pengolahan arsip log data

ESP menjadi file prep dengan penyesuaian nama atom, tipe atom, dan muatan

24


commit to user

25

pada sistein. Tipe atom yang digunakan untuk parameter asam amino maupun

protein adalah AMBER atom type sehingga penyesuaian tipe atom tersebut penting

dilakukan untuk perhitungan parameter lainnya seperti ikatan dan torsi dengan

program parmchk dalam AMBER10. Hasil parameterisasi struktur adduct MQ-

Sistein disajikan pada gambar 6.

Kode atom

Tipe atom

Muatan atom

Kode atom

Tipe atom

Muatan atom

C3 CT -0.032 C6 CT -0.061 H3 HC 0.020 H8 H1 0.330 H4 HC 0.034 C8 CT -0.232 C2 CT -0.013 H14 H1 0.049 H5 H1 0.105 H15 H1 0.275 H6 H1 0.063 SG SH -0.249 N1 NT -0.530 CB CT 0.003 C1 CT -0.026 HB2 H1 0.111 H9 H1 0.070 HB3 H1 0.111 H10 H1 0.104 CA CT -0.245 C5 CT -0.138 N N -0.415 H1 HC 0.051 H H 0.271 H2 HC 0.059 HA H1 0.252 C4 CT 0.146 C C 0.597 H7 HC 0.001 O O -0.567 C7 C 0.310 O1 O -0.457

Gambar 6. Struktur adduct MQ-Sistein teroptimasi dengan keterangan kode

atom, tipe atom, dan muatan adduct MQ-Sistein yang diperoleh

dengan RESP.


commit to user

26

B. Pemilihan Posisi Sistein Target pada Makromolekul

Makromolekul diperoleh dari struktur wild type-p53 yang dimutasi pada

arginin-175 menjadi histidin menghasilkan mutan R175H-p53. Mutan R175H-p53

disimulasi selama 100 ns dan dilakukan clustering. Dalam penelitian ini struktur

representatif makromolekul yang diambil berdasarkan accessibilitas solvent

analysis. Analisis reaktivitas relatif residu sistein pada p53 dengan spektrometri

massa menemukan bahwa residu sistein (Cys) yang memiliki reaktivitas tertinggi

dalam pembentukan adduct secara berurutan diantaranya terletak pada posisi Cys-

124, Cys-141, Cys-135, Cys-182, dan Cys-277, sedangkan sistein yang memiliki

reaktivitas rendah terletak pada posisi Cys-176 dan Cys-275 (Joerger et al., 2010).

Pemilihan sistein target juga dilakukan berdasarkan lokasi residu sistein pada

makromolekul menggunakan surface analysis dengan program Chimera. Residu

sistein yang berada pada cavity (lekukan) yang cukup dalam dan lebar

memungkinkan adduct dapat masuk dan stabil pada posisi tersebut. Hasil

pemilihan lokasi sistein target pada mutan R175H-p53 disajikan pada gambar 7.

Gambar 7. Hasil pemilihan lokasi sistein target pada mutan R175H-p53 digambarkan dengan surface berwarna kuning. Posisi sistein target yang digambarkan dalam bentuk pita pada Cys-124 (A) dan Cys-275 (B). Lokasi Cys-124 yang berada pada cavity (C) dan lokasi Cys-275 yang berada pada permukaan mutan R175H (D).


commit to user

27

Hasil pemilihan residu sistein yaitu Cys-124 yang memiliki reaktifitas

tercepat dengan posisi residu sistein berada pada cavity yang cukup dalam dan

Cys-275 yang memiliki reaktifitas paling lambat dengan posisi residu sistein

berada pada permukaan mutan R175H-p53. Masing-masing posisi Cys-124 dan

Cys-275 digantikan dengan adduct MQ-Sistein sebagai template yang akan

digunakan untuk proses simulasi.

Sistein pada nomor residu 124, 141, 135, dan 275 terletak pada -sheet

yang cenderung lebih rigid dibandingkan sistein pada nomor residu 182 dan 277

yang terletak pada loop makromolekul. Berdasarkan surface analysis

menggunakan Chimera, sistein pada nomor residu 141 dan 135 berada jauh dari

permukaan makromolekul, sehingga sulit dilakukan modifikasi pada posisi

tersebut dan menimbulkan banyaknya benturan dengan residu-residu lain

disekitarnya. Modifikasi pada Cys-124 yang berada pada cavity memungkinkan

mengubah struktur lokal yang dapat memberikan perubahan konformasi mutan,

sedangkan modifikasi pada Cys-275 yang berada pada daerah DNA-binding juga

dimungkinkan memberikan perubahan konformasi makromolekul mutan R175H-

p53.

Dua protein mutan R175H-p53 dengan masing-masing lokasi sistein target

(Cys-124 dan Cys-275) yang telah dimodifikasi oleh adduct MQ-Sistein

terparameterisasi, selanjutnya dilakukan proses minimisasi, penyeimbangan

(equilibrasi) dan simulasi.

C. Reaktivasi R175H-p53 oleh Adduct MQ-Sistein

Hasil minimisasi dan penyeimbangan dari dua protein mutan R175H-p53

yang telah dimodifikasi pada masing-masing sistein target dengan adduct MQ-

Sistein kemudian disimulasikan selama 100 ns. Dua sistem tersebut adalah sistem

1 yaitu mutan R175H-p53 dengan penggantian residu sistein (Cys-124) oleh

adduct MQ-Sistein dan sistem 2 yaitu mutan R175H-p53 dengan penggantian

residu sistein (Cys-275) oleh adduct MQ-Sistein. Dua sistem pembanding adalah

sistem 3 yaitu wild type-p53 dan sistem 4 yaitu mutan p53 (R175H) yang telah

disimulasikan selama 100 ns. Hasil simulasi berupa suatu trajectory yang


commit to user

28

menspesifikkan bagaimana posisi dan kecepatan partikel di dalam sistem

bervariasi sesuai waktu. Hasil simulasi kemudian diolah dengan program analisis

yaitu ptraj.

1. Stabilisasi R175H-p53 oleh Adduct MQ-Sistein

Analisis yang dapat menunjukkan karakter umum dari sistem yang

disimulasikan yaitu analisis RMSD (root mean square deviation). Posisi sistem

tiap waktu dibandingkan posisi awal sistem dalam rentang waktu tertentu

menunjukkan kestabilan sistem secara umum dengan perubahan jarak yang terjadi

pada masing-masing sistem selama simulasi. Grafik RMSD keempat sistem

ditampilkan pada gambar 8.

Gambar 8. Grafik perbedaan RMSD sebagai fungsi waktu. Sistem 1, 2, 3 dan 4

berturut-turut ditunjukkan dengan warna hijau, biru, hitam dan merah.

Grafik RMSD diatas memperlihatkan bahwa keempat sistem bergeser dari

posisi awal dan mengalami penyeimbangan sistem setelah simulasi berjalan 12,5

ns. Keempat sistem sama-sama bergeser sejauh ± 1 Å dari posisi awalnya dan

terus bergeser naik menjauhi posisi awal dan stabil pada jarak ± 3 Å saat simulasi

berjalan 12,5 ns. Sistem 3 terlihat mengalami perubahan posisi dari awal simulasi


commit to user

29

hingga simulasi berakhir. Perubahan tersebut mengindikasikan bahwa sistem 3

berada pada konformasi yang berbeda selama simulasi 100 ns. Sistem 4 yang

merupakan mutan R175H-p53 meskipun terlihat lebih stabil dibandingkan dengan

sistem 3, namun sistem 4 diketahui kehilangan fungsi supresi tumor akibat

perubahan konformasi yang dapat berpengaruh pada keseluruhan sistem protein.

Hasil cukup mengejutkan terlihat pada grafik RMSD yang menunjukkan selama

simulasi berlangsung sistem 1 dan 2 relatif stabil dibandingkan sistem 3. Sistem 1

yang merupakan mutan R175H-p53 dengan penggantian residu sistein (Cys-124)

oleh adduct MQ-Sistein relatif stabil sampai simulasi berakhir. Sistem 2 yang

merupakan mutan R175H-p53 dengan penggantian residu sistein (Cys-275) oleh

adduct MQ-Sistein memiliki kestabilan yang paling tinggi dibandingkan tiga

sistem lainnya. Adanya penggantian residu sistein pada mutan oleh adduct

ternyata memberikan perubahan dinamika selama simulasi berlangsung.

Pergeseran posisi yang telah ditunjukkan pada grafik RMSD berkaitan

dengan fluktuasi atomik rata-rata sistem. Analisis B-factor dapat menggambarkan

fluktuasi atomik rata-rata sistem yang disimulasikan. Harga B-factor sebagai

fungsi nomor residu dapat menunjukkan residu-residu mana saja yang mengalami

fluktuasi, sehingga terhadap residu-residu tersebut akan dapat dilihat perubahan

posisi konformasinya selama simulasi berlangsung. Harga B-factor untuk semua

atom dari keempat sistem ditampilkan pada gambar 9A dan harga B-factor untuk

atom backbone keempat sistem ditampilkan pada gambar 9B.

Grafik B-factor untuk semua atom keempat sistem memperlihatkan pada

awal dan akhir residu yang merupakan ujung-ujung protein memiliki harga B-

factor yang sangat tinggi. Hal ini dikarenakan residu pada ujung-ujung protein

sangat fleksibel sehingga sangat fluktuatif. Perbedaan fluktuasi keempat sistem

terlihat cukup jelas pada beberapa bagian residu, diantaranya pada range residu

113-123, 173-193, dan 233-253.

Adduct MQ-Sistein yang ada pada sistem 1 dan 2 menunjukkan sebagian

fluktuasi atomik rata-rata berkurang terhadap sistem 3 dan 4. Untuk memperjelas

perubahan yang terjadi pada B-factor total keempat sistem maka dilakukan

analisis B-factor untuk atom backbone. Analisis B-factor atom backnone


commit to user

30

menunjukkan lebih jelas residu mana saja yang mengalami perubahan kestabilan

konformasi protein selama simulasi berlangsung. Pada gambar 9B, fluktuasi untuk

atom backbone tiap residu menunjukkan perubahan cukup signifikan pada

beberapa residu sama seperti fluktuasi yang terjadi pada grafik B-factor atom

total.

Gambar 9. Grafik perbedaan B-factor semua atom sebagai fungsi nomor residu

(A) dan grafik perbedaan B-factor atom backbone sebagai fungsi

nomor residu (B). Sistem 1, 2, 3 dan 4 berturut-turut ditunjukkan

dengan warna hijau, biru, hitam dan merah.


commit to user

31

Fluktuasi B-factor semua atom terlihat overlapping dan lebih tinggi

dibandingkan dengan fluktuasi yang terjadi pada B-factor atom backbone. Hal ini

dimungkinkan karena fluktuasi yang terjadi pada B-factor semua atom

dipengaruhi oleh fluktuasi sudut dihedral (yaitu sudut yang terbentuk oleh 4 atom)

yang melibatkan keseluruhan atom, sehingga menyulitkan untuk melihat

perbedaan kestabilan pada masing-masing sistem. Fluktuasi B-factor atom

backbone dapat menunjukkan perbedaan kestabilan lebih jelas yang ditunjukkan

dengan besarnya delta fluktuasi antara keempat sistem. Secara kualitatif, fluktuasi

B-factor atom backbone menunjukkan bahwa konformasi keempat sistem

mengalami perbedaan konformasi parsial karena perbedaan dinamika backbone

masing-masing sistem.

Gambar 10 menunjukkan fluktuasi ketiga range residu pada B-factor atom

backbone. Gambar 10A menunjukkan perbedaan fluktuasi keempat sistem yang

terjadi pada residu 113 sampai 123. Residu 113-123 merupakan residu-residu

yang berperan penting dalam DNA-binding. Fluktuasi sistem 3 (wild type-p53)

terlihat paling tinggi dibandingkan tiga sistem lainnya, hal ini dimungkinkan pada

range residu tersebut sistem 3 berada pada konformasi dominan yang berbeda.

Fluktuasi sistem 1 terlihat paling rendah sedangkan sistem 2 menunjukkan

fluktuasi yang mendekati sistem 3. Hal ini menunjukkan bahwa sistem 2 yang

merupakan kompleks mutan R175H-p53 dengan penggantian residu sistein (Cys-

275) oleh adduct MQ-Sistein mampu memberikan perubahan konformasi parsial

mendekati konformasi wild type-p53 pada daerah tersebut.

Gambar 10B menunjukkan perbedaan fluktuasi keempat sistem yang

terjadi pada residu 173-188. Residu yang berada pada range 173-188 merupakan

residu-residu yang berperan penting dalam stabilitas permukaan p53 DNA-binding

namun tidak secara langsung kontak dengan DNA. Fluktuasi tertinggi terjadi pada

sistem 3 mencapai harga ± 600 Å, sementara sistem 4 fluktuasi tertinggi ± 300 Å.

Tingginya fluktuasi sistem 3 menunjukkan bahwa pada range tersebut sistem 3

lebih fleksibel, hal ini dimungkinkan terdapat lebih dari satu konformasi dominan

yang terjadi selama simulasi berlangsung. Sistem 1 dan 2 terlihat memiliki harga

B-factor yang lebih rendah dibandingkan sistem 4, hal ini menunjukkan bahwa


commit to user

32

dengan adanya penggantian residu sistein oleh adduct MQ-Sistein pada sistem 1

dan 2 mampu menstabilkan residu-residu pada kisaran nomor residu 173-188.

Gambar 10. Grafik fluktuasi residu 113-123 (A), 173-188 (B), dan 237-250 (C).

Gambar 10C menunjukkan perbedaan fluktuasi keempat sistem yang

terjadi pada residu 237-250. Residu yang berada pada range tersebut merupakan

residu-residu yang berperan penting dalam DNA-binding. Sistem 2 pada residu

237-250 dan sistem 1 pada residu 243-250 terlihat lebih stabil dibandingkan

sistem 3 dan 4 karena memiliki harga B-factor paling rendah. Sistem 1 mengalami

sedikit fluktuasi yang terjadi pada residu 237-242, namun fluktuasi ini tidak

menunjukkan perubahan konformasi parsial yang mendekati konformasi wild

type-p53.

Adduct MQ-Sistein yang ada pada sistem 1 mempengaruhi sebagian

fluktuasi R175H-p53 yang terlihat berkurang cukup signifikan. Keberadaan

adduct MQ-Sistein pada sistem 2 juga menunjukkan perubahan fluktuasi terhadap

R175H-p53 pada residu nomor 173-188 dan 237-250. Menariknya, residu-residu

yang mengalami perubahan fluktuasi pada B-factor merupakan residu-residu yang

A B

C


commit to user

33

berperan dalam DNA-binding maupun stabilisasi permukaan p53 DNA-binding

meskipun tidak secara langsung kontak dengan DNA.

Perubahan signifikan yang ditunjukkan pada analisis B-factor ternyata

bukan hanya karena pengaruh rantai samping akan tetapi lebih pada pengaruh

backbone yang dapat menunjukkan perubahan konformasi makromolekul seperti

dalam bentuk loop, helix, maupun -sheet. Perbandingan harga B-factor untuk

atom backbone keempat sistem cukup menunjukkan adanya perubahan pada

kestabilan protein terutama pada ketiga range residu tersebut. Adduct MQ-Sistein

yang ada pada sistem 1 dan 2 mempengaruhi terjadinya perubahan konformasi

dan kestabilan pada residu-residu lain protein p53 termasuk residu-residu yang

berperan dalam DNA-binding.

Pendekatan lain yang dilakukan untuk mengetahui perubahan konformasi

dan kestabilan mutan R175H-p53 oleh adanya adduct MQ-Sistein yaitu dengan

- backbone vektor NH. Atom N

pada vektor NH yang berikatan dengan atom C karbonil asam amino yang lain

merupakan ikatan peptida yang memiliki ciri unik yakni bersifat rigid dan planar.

Sifat rigid dan planar ikatan peptida merupakan konsekuensi dari interaksi

resonansi dari amina atau kemampuan amida nitrogen untuk delokalisasi pasangan

elektron bebas (lone pair electron) ke karbonil (C=O). Hal ini mengindikasikan

bahwa atom backbone vektor NH lebih stabil karena adanya resonansi elektronik

dibandingkan atom backbone. Resonansi elektronik yang terjadi pada ikatan

peptida ditunjukkan pada gambar 11.

C

O

N

H

C

O-

N+

H

Gambar 11. Resonansi elektronik ikatan peptida.

Vektor NH digunakan untuk menunjukkan order parameter yang dapat

digunakan untuk estimasi entropi atom backbone. Entropi backbone vektor NH

yang ditunjukkan melalui harga order parameter (S2) dapat memberikan kontribusi


commit to user

34

untuk variasi stabilitas domain mutan dan dampaknya tidak hanya terlokasikan

pada tempat mutasi maupun pada posisi adduct saja, melainkan menyebar ke

lingkungan sekitar terjadinya mutasi. Dampak tersebut dapat dijelaskan secara

umum dengan kecenderungan struktur -sheet, dimana residu-residu -sheet

umumnya lebih rigid dibandingkan yang lain pada daerah inti p53. Besarnya order

parameter (S2) atom backbone vektor NH tiap residu dari keempat sistem

disajikan pada gambar 12.

Gambar 12. Grafik perbedaan order parameter vektor NH sebagai fungsi nomor

residu. Sistem 1, 2, 3 dan 4 berturut-turut ditunjukkan dengan warna

hijau, biru, hitam dan merah.

Perubahan harga order parameter terjadi pada beberapa residu, antara lain

residu nomor 113-124, 154, 165, 172-190, 200, dan 234-250. Residu Gln-165

sistem 1 memiliki harga order parameter paling rendah yang berarti bahwa sistem

1 pada residu tersebut lebih fleksibel dibandingkan tiga sistem lainnya. Harga

order parameter residu nomor Gly-154 dan Asp-200 sistem 2 terlihat lebih kecil

dibandingkan sistem 4 dan cenderung mendekati harga order parameter sistem 3.

Hal ini menunjukkan bahwa sistem 2 pada residu tersebut memiliki fleksibilitas


commit to user

35

yang hampir sama dengan wild type-p53 dan dimungkinkan memiliki konformasi

yang sama dengan wild type-p53. Perubahan harga order parameter yang terjadi

pada residu Gln-165, Gly-154, dan Asp-200 tidak cukup memberikan pengaruh

pada perbaikan mutan p53 oleh penambahan adduct mengingat pada ketiga residu

tersebut tidak berperan untuk binding dengan DNA maupun stabilitas residu-

residu yang berperan dalam DNA-binding.

Perubahan harga order parameter lainnya terjadi pada beberapa range

residu, yaitu 113-124, 172-190, dan 234-250. Perbedaan fleksibilitas residu-residu

yang terjadi pada analisis entropi ketiga range residu tersebut disajikan pada

gambar 13.

Gambar 13. Grafik order parameter sebagai fungsi nomor residu. Residu 113-124

(A), 172-190 (B), dan 234-250 (C).

Gambar 13A memperlihatkan bahwa sistem 2 pada residu 113-124

memiliki harga order parameter mendekati sistem 3. Sedangkan sistem 1 memiliki

order parameter yang lebih besar dibandingkan ketiga sistem yang lain. Secara

kualitatif ini menunjukkan bahwa sistem 2 pada range residu tersebut merupakan

sistem yang lebih stabil dengan fleksibilitas backbone (entropi) lebih besar


commit to user

36

dibandingkan sistem 1 yang memiliki backbone paling rigid. Analisi atom

backbone vektor NH pada residu 113-124 memperkuat dugaan bahwa sistem 2

mampu mengembalikan konformasi R175H-p53 mendekati wild type-p53

dibandingkan sistem 1 mengingat pentingnya residu 113-123 merupakan residu-

residu yang berperan penting dalam DNA-binding.

Gambar 13B menunjukkan sistem 1 dan 2 memliki order parameter yang

lebih besar dibandingkan sistem 3 dan 4. Beberapa residu yang diketahui berperan

penting dalam stabilitas permukaan p53 DNA-binding berada pada range residu

172-190. Adanya modifikasi mutan oleh adduct MQ-Sistein pada sistem 1 dan 2

menjadikan dua sistem tersebut pada range residu 172-190 lebih rigid

dibandingkan R175H-p53 maupun wild type-p53. Hal ini dikarenakan terjadinya

perubahan entropi mutan yang ditunjukkan dengan perubahan harga order

parameternya.

Gambar 13C juga menunjukkan perubahan fleksibilitas backbone vektor

NH pada range residu 234-250. Sistem 1 pada range residu 244-249 dan sistem 2

pada range residu 238-250 cenderung lebih rigid dibandingkan sistem 4. Residu

Arg-248 yang merupakan salah satu residu yang dapat kontak dengan DNA,

terlihat lebih tidak teratur pada sistem 4 dibandingkan sistem 3 yang ditunjukkan

dengan harga order parameternya yang lebih kecil. Hal tersebut menunjukkan

bahwa kebolehjadian residu Arg-248 pada sistem 4 untuk berikatan dengan DNA

semakin kecil. Penambahan adduct pada sistem 1 dan 2 ternyata menunjukkan

residu Arg-248 kembali lebih teratur seperti sistem 3 selama simulasi 100 ns.

Secara kualitatif, perubahan nilai ini menunjukkan hanya sebagian

konformasi pada residu-residu sistem 1 dan 2 yang dapat mendekati konformasi

wild type-p53 dan hanya sebagian konformasi R175H-p53 yang mampu

distabilkan dengan adanya adduct MQ-Sistein pada kedua sistem tersebut.

Perubahan harga order parameter mengindikasikan adanya perubahan dari

backbone yang fleksibel menjadi backbone yang lebih rigid maupun perubahan

dari backbone yang rigid menjadi backbone yang lebih fleksibel. Adduct MQ-

Sistein yang terdapat pada sistem 1 dan 2 mampu memberikan pengaruh


commit to user

37

perubahan konformasi parsial dari R175H-p53 sehingga dapat mendekati

konformasi wild type-p53.

Stabilisasi mutan R175H-p53 oleh adduct MQ-Sistein juga ditunjukkan

dengan penurunan total entropinya. Total entropi wild type-p53 (sistem 3) sebesar

2089,8 kal mol-1 K-1 sedangkan total entropi mutan R175H-p53 (sistem 4) sebesar

2138,3 kal mol-1 K-1. Modifikasi residu sistein mutan R175H-p53 oleh adduct

mampu menunjukkan penurunan total entropinya menjadi 1956,9 kal mol-1 K-1

(sistem 1) dan 2030,6 kal mol-1 K-1 (sistem 2).

Perubahan fluktuasi B-factor dan fleksibilitas entropi pada sistem 1 dan 2

pada beberapa residu maupun besarnya total entropi mampu menunjukkan

perubahan kestabilan R175H-p53 dengan adanya adduct MQ-Sistein. Perubahan

kestabilan yang terjadi memberikan pengaruh pada beberapa daerah penting

domain inti p53. Perubahan ini dapat dilihat melalui konformasi-konformasi

parsial keempat sistem, terutama pada ketiga daerah residu yang mengalami

perubahan kestabilan.

2. Perubahan Konformasi Parsial R175H-p53 oleh Adduct MQ-Sistein

Perbedaan kestabilan pada R175H-p53 yang mengandung adduct MQ-

Sistein pada posisi yang berbeda menunjukkan adanya perubahan konformasi

parsial yang terjadi pada R175H-p53 karena pengaruh penambahan adduct

tersebut. Dalam penelitian ini, trajectory hasil simulasi selama 100 ns

menghasilkan 2000 frame/ns. Keseluruhan frame tersebut dievaluasi sehingga

diperoleh 1000 konformasi struktur untuk dikelompokkan (clustering).

Pengelompokan berbagai konfigurasi molekuler dari trajectory hasil

simulasi DM dilakukan berdasarkan struktur-struktur yang memiliki kemiripan

secara konformasinya. Struktur representatif dapat menampilkan struktur yang

dapat mewakili seluruh konformasi yang terdapat dalam trajectory. Teknik

pengelompokan trajectory dilakukan berdasarkan algoritma yang digunakan.

Salah satu algoritma pengelompokan trajectory yaitu algoritma complete-linkage.

Kelebihan algoritma ini adalah struktur yang memiliki jarak kurang dari jarak

antara dua klaster akan tergabung menjadi satu klaster, sehingga setiap klaster


commit to user

38

yang dihasilkan dapat mewakili sejumlah data yang tersimpan. Hasil klaster dari

1000 konformasi struktur diperoleh 10 kelompok pada masing- masing sistem.

Konformasi representatif yang dipakai untuk menunjukkan perubahan

konformasi R175H-p53 karena penambahan adduct pada penelitian ini adalah

konformasi representatif yang dominan dari hasil clustering. Struktur representatif

yang digunakan pada sistem 1 merupakan konformasi struktur dengan populasi

paling dominan sebesar 33% terhadap keseluruhan konformasi struktur sistem

tersebut. Konformasi struktur paling dominan pada sistem 2 yang digunakan

untuk menunjukkan perubahan konformasi parsial R175H karena penambahan

adduct memiliki prosentase sebesar 20%. Konformasi struktur sistem 3 hasil

clustering memiliki dua kelompok konformasi struktur dengan populasi dominan

yang berdekatan yaitu sebesar 27,2% pada kelompok 3 dan 21,7% pada kelompok

2. Dua kelompok konformasi struktur tersebut menunjukkan struktur pada dua

konformasi tersebut relatif banyak ditemukan selama simulasi berlangsung.

Menariknya, dua kelompok tersebut menunjukkan beberapa perbedaan

konformasi parsial pada wild type-p53. Sedangkan konformasi struktur yang

digunakan pada sistem 4 memiliki populasi paling dominan sebesar 24,1%

terhadap keseluruhan konformasi struktur sistem 4. Konformasi representatif

dominan yang digunakan diharapkan dapat mewakili seluruh konformasi yang

terdapat dalam trajectory pada masing-masing sistem.

a) Perbedaan Konformasi Wild type-p53 dengan R175H-p53

Protein p53 yang termutasi pada bagian hot spots 175, dimana residu

arginin berubah menjadi histidin berada diantara dua loop (L2 dan L3) yang

mengakibatkan rusaknya ikatan hidrogen antara L2 dan L3, sehingga

menyebabkan ketidakstabilan ikatan antara p53 dengan DNA. Ketidakstabilan

tersebut dimungkinkan karena berubahnya konformasi parsial pada daerah loop

tersebut. Beberapa daerah residu dari konformasi wild type-p53 diketahui dapat

berinteraksi dengan DNA. Mutasi R175H mengakibatkan terjadinya perubahan

kestabilan residu-residu permukaan p53 yang berinteraksi dengan DNA.

Perubahan kestabilan tersebut berdampak pada perubahan struktural p53 sehingga


commit to user

39

terjadi perbedaan konformasi antara wild type-p53 dengan R175H-p53. Perbedaan

konformasi antara wild type-p53 (pada dua populasi dominan yang berdekatan)

dengan R175H-p53 disajikan pada gambar 14.

Gambar 14. Perbedaan konformasi p53 antara wild type-p53 (pada dua populasi dominan yang berdekatan) dengan R175H-p53. Overlay konformasi protein digambarkan dalam bentuk pita, sedangkan residu yang mengalami mutasi (Arg-175 menjadi His-175) digambarkan dalam bentuk stick. Wild type-p53 (sistem 3) dengan populasi sebesar 27,2% dan 21,7% ditunjukkan berturut dengan warna abu-abu dan orange, sedangkan mutan R175H-p53 (sistem 4) ditunjukkan dengan warna merah muda. Garis oval pada loop 2 ditampilkan untuk mendukung kejelasan gambar.

Perbedaan cukup jelas antara konformasi parsial wild type-p53 pada

populasi konformasi struktur sebesar 27,2% dengan 21,7% diantaranya terlihat

pada bagian loop 2 (residu 179-181 dan 195-198) dan strand S7 (residu 235-236).

Daerah L2 (nomor 179-181 dan 195-198) sistem 3 pada populasi dominan

pertama menunjukkan konformasi kedua range residu tersebut dalam bentuk loop,

sedangkan pada populasi dominan ke-2 menunjukkan konformasi dalam bentuk -


commit to user

40

sheet (residu 179-181) dan bentuk helix (residu 195-198). Perbedaan konformasi

parsial sistem 3 pada populasi dominan yang berbeda juga ditunjukkan pada

daerah strand S7 (residu 235-236). Populasi dominan pertama residu 235-236

berada pada bentuk loop sedangkan pada populasi dominan ke-2 berbentuk -

sheet. Meskipun terdapat perbedaan konformasi parsial pada sistem 3, namun

besarnya populasi yang tidak jauh berbeda pada dua kelompok tersebut

menunjukkan bahwa struktur pada konformasi tersebut banyak terjadi selama

simulasi berlangsung. Hal ini menunjukkan bahwa sistem 3 yang merupakan wild

type-p53 memiliki probabilitas berada pada dua konformasi tersebut.

Akibat mutasi yang terjadi pada nomor residu 175 ternyata memberikan

perubahan konformasi parsial pada protein p53. Perbedaan konformasi antara

sistem 3 dengan sistem 4 diantaranya ditunjukkan pada daerah loop (L1, L2, dan

L3), -sheet (strand S5), dan loop (turn S3-S4 dan S6-S7). Daerah loop (L1 dan

L3) merupakan daerah residu yang berperan penting dalam DNA-binding,

sedangkan L2 merupakan daerah residu yang berperan dalam stabilisasi

permukaan p53 DNA-binding. Perbedaan daerah L1 antara sistem 3 dengan

sistem 4 ditunjukkan dengan perbedaan lengkungan loop seperti terlihat pada

gambar 14. Daerah L2 sistem 4 pada residu 179-181 berada dalam bentuk loop

seperti yang terjadi pada sistem 3 dominasi populasi pertama, namun pada residu

195-198 sistem 4 berada dalam bentuk -sheet mengikuti sistem 3 dominasi

populasi ke-2. Perbedaan lainnya ditunjukkan pada daerah strand S5 (residu

nomor 204-207) sistem 3 yang berbentuk -sheet sedangkan pada sistem 4

berbentuk loop. Residu-residu pada daerah strand S5 diketahui tidak berinterkasi

secara langsung dengan DNA dikarenakan lokasinya yang cukup jauh dengan

DNA. Perbedaan konformasi parsial antara wild type-p53 dengan R175H-p53 juga

ditunjukkan dengan perbedaan lengkungan loop (turn S3-S4 dan S6-S7). Namun,

residu-residu yang berada pada daerah loop (turn S3-S4 dan S6-S7) tidak

memiliki peranan penting dalam berinteraksi dengan DNA karena posisinya yang

jauh dengan DNA sehingga tidak memungkinkan untuk berinteraksi secara

langsung dengan DNA.


commit to user

41

Perbedaan konformasi antara sistem 3 dengan sistem 4 terjadi akibat

mutasi Arg-175 yang memiliki rantai samping cukup panjang menjadi histidin

dengan rantai samping lebih pendek dan tertekuk, sehingga mengakibatkan

lingkungan disekitar tempat mutasi mengalami perubahan interaksi dengan residu

nomor 175. Perubahan tersebut dapat dilihat dari berubahnya jarak interaksi

residu-residu disekitar tempat mutasi yang mengindikasikan menjadi penyebab

berubahnya konformasi parsial makromolekul terutama daerah loop (L1, L2, dan

L3) yang cenderung fleksibel.

Residu nomor 114-124 berada pada daerah L1 yang berperan penting

dalam DNA-binding. Akibat mutasi R175H, daerah L1 mengalami perubahan

konformasi yang ditunjukkan dengan perubahan jarak interaksi yang terjadi pada

lingkungan L1. Daerah L1 pada gambar 15 terlihat bahwa lengkungan L1 sistem 4

jauh berbeda dengan lengkungan L1 sistem 3 pada populasi dominan pertama,

namun jika dibandingkan dengan lengkungan L1 sistem 3 pada populasi dominan

ke-2 perubahan yang tampak tidak jauh berbeda. Perbedaan lengkungan L1 dan

perbedaan jarak antar residu-residu daerah L1 disajikan pada gambar 15.


R175H-p53. Wild type-p53 (sistem 3) pada populasi dominan

pertama, sistem 3 pada populasi dominan ke-2 dan mutan R175H-

p53 (sistem 4) ditunjukkan berturut-turut dengan warna abu-abu,

orange dan merah muda.

Pengukuran jarak antar residu daerah L1 dilakukan antara atom C (CB)

yang terikat pada backbone satu residu dengan residu yang lain. Hal tersebut


commit to user

42

dilakukan karena apabila backbone mengalami perubahan posisi (lengkungan

loop) maka atom C (CB) juga akan mengalami perubahan posisi. Jarak antara

residu Leu-114 dengan Thr-123 pada sistem 3 adalah 9,7 Å (populasi dominan

pertama) dan 10,0 Å (populasi dominan ke-2), sedangkan pada sistem 4 sejauh

10,7 Å. Perbedaan jarak terjadi antara residu Hie-115 dengan Val-122. Jarak

antara residu Hie-115 dengan Val-122 pada sistem 3 sejauh 11,4 Å (populasi

dominan pertama) dan 12,2 Å (populasi dominan ke-2) kemudian berubah

menjadi 10,1 Å pada sistem 4. Jarak residu Ser-116 dengan Val-122 juga

mengalami perubahan signifikan, dimana pada sistem 3 sejauh 11,8 Å (populasi

dominan pertama) dan 8,6 Å (populasi dominan ke-2) kemudian berubah pada

sistem 4 menjadi 4,8 Å. Residu Val-122 merupakan salah satu residu yang dapat

berinteraksi (kontak) secara langsung dengan DNA. Perubahan jarak yang terjadi

pada residu Val-122 dengan beberapa residu dilingkungannya dari posisi yang

renggang menjadi cenderung rapat mengindikasikan hilangnya kontak residu

tersebut dengan DNA. Perbedaan jarak juga terjadi antara residu Thr-118 dengan

Ser-121. Pada sistem 3 sejauh 10,1 Å (populasi dominan ke-2) kemudian berubah

menjadi 9,7 Å pada sistem 4, namun tidak mengalami perubahan jika

dibandingkan dengan sistem 3 pada populasi dominan pertama.

Perbedaan konformasi antara sistem 3 dengan sistem 4 juga terjadi pada

residu nomor 174-192 yang berada pada daerah L2. Perbedaan konformasi parsial

sistem 3 akibat mutasi ditunjukkan dengan perbedaan jarak antar residu yang

terjadi di lingkungan L2. Perbedaan jarak antar residu-residu daerah L2 disajikan

pada gambar 16.



commit to user

43

R175H-p53.

Perbedaan jarak antar residu pada daerah L2 yang disajikan gambar 16

dapat menunjukkan terjadinya perubahan konformasi sistem 3 akibat mutasi yang

terjadi pada daerah L2 memberikan pengaruh pada lingkungan disekitar tempat

mutasi. Jarak backbone antara residu Arg-175 dengan Hie-178 sistem 3 sejauh 9,1

Å (populasi dominan pertama) dan 9,4 Å (populasi dominan ke-2). Setelah terjadi

mutasi pada residu Arg-175 menjadi His-175, jarak backbone antara residu His-

175 dengan Hie-178 mendekat menjadi 8,7 Å. Perbedaan lainnya terjadi pada

residu Hin-179 dan Glu-180, dimana jarak antara residu Hin-179 terhadap Arg-

175 pada sistem 3 sejauh 4,8 Å (populasi dominan pertama) dan 5,2 Å (populasi

dominan ke-2), sedangkan terhadap His-175 pada sistem 4 sejauh 4,2 Å. Jarak

antara residu Glu-180 dengan Arg-175 pada sistem 3 adalah 4,0 Å (populasi

dominan pertama) dan 4,6 Å (populasi dominan ke-2) kemudian menjadi 4,5 Å

pada sistem 4. Perbedaan jarak juga terjadi antara residu Arg-175 dengan Leu-188

sistem 3 sejauh 17,0 Å (populasi dominan pertama) dan 16,2 Å (populasi dominan

ke-2), sedangkan sistem 4 sejauh 18,1 Å.

Perbedaan jarak antar residu-residu tersebut dimungkinkan karena

perubahan residu Arg-175 yang memiliki rantai samping cukup panjang sehingga

membutuhkan space (ruang) gerak yang cukup luas menjadi histidin dengan rantai

samping yang lebih pendek. Akibat mutasi residu Arg-175 menjadi His-175 yang

memiliki rantai samping cenderung lebih pendek dan tertekuk sehingga

dimungkinkan mengubah kondisi ruang gerak rantai samping His-175 menjadi

lebih rapat agar dapat berinteraksi dengan residu-residu disekitarnya. Perubahan

jarak interaksi residu mutasi dengan residu disekitarnya mengakibatkan L2

cenderung lebih merapat. Hal ini ditunjukkan dengan perubahan jarak yang cukup

signifikan antara residu Ser-183 terhadap Arg-175 sistem 3 sejauh 12,5 Å

(populasi dominan pertama) dan 12,7 Å (populasi dominan ke-2) kemudian

berubah terhadap His-175 sistem 4 menjadi 9,8 Å. Perubahan jarak residu mutasi

terhadap residu-residu daerah L2 juga terjadi antara Arg-175 dengan Gln-192

sistem 3 sejauh 7,5 Å (populasi dominan pertama) dan 8,0 Å (populasi dominan

ke-2) kemudian menjadi 8,4 Å pada His-175 dengan Gln-192 sistem 4. Residu


commit to user

44

Arg-174 pada sistem 3 memiliki jarak dengan Hie-178 sejauh 12,0 Å (populasi

dominan pertama) dan 11,1 Å (populasi dominan ke-2) kemudian menjadi 12,3 Å

pada sistem 4.

Residu protein pada nomor 174-192 merupakan residu-residu yang

berperan penting dalam menjaga stabilitas residu-residu permukaan p53 yang

berikatan dengan DNA. Akibat mutasi yang terjadi pada daerah residu tersebut

mengakibatkan perubahan konformasi protein tidak hanya pada daerah terjadinya

mutasi namun juga menyebar ke daerah lain seperti L1 dan L2. Perubahan

konformasi inilah yang menjadikan sistem 4 kehilangan fungsi supresi tumor.

Perbedaan konformasi parsial antara sistem 3 dengan sistem 4 akibat

mutasi R175H juga terjadi pada daerah L3, dimana residu pada nomor 236-246

berlokasi di daerah tersebut. Residu pada range tersebut merupakan loop yang

diketahui mempunyai kontribusi dalam DNA-binding. Perbedaan jarak antar

residu-residu daerah L3 disajikan pada gambar 17.


R175H-p53.

Jarak antara residu Tyr-236 dengan Met-246 pada sistem 3 adalah 12,0 Å

(populasi dominan pertama) dan 11,9 Å (populasi dominan ke-2), sedangkan pada

sistem 4 sejauh 10,4 Å. Perbedaan jarak juga terjadi antara residu Met-237 dengan

Met-246, dimana jarak dua residu tersebut pada sistem 3 sejauh 10,8 Å (populasi

dominan pertama) dan 11,8 Å (populasi dominan ke-2), sedangkan pada sistem 4

sejauh 11,7 Å. Perbedaan jarak lainnya terjadi pada residu Ser-241 dengan Met-

246 yaitu sejauh 10,1 Å (populasi dominan pertama) dan sejauh 7,9 Å (populasi

dominan ke-2), sedangkan sistem 4 sejauh 6,9 Å. Perubahan cukup signifikan

terjadi antara residu Ser-241 dengan Gly-245, pada sistem 3 berjarak 11,5 Å


commit to user

45

(populasi dominan pertama) dan 10,5 Å (populasi dominan ke-2) menjadi 8,0 Å

pada sistem 4. Pengukuran jarak antar residu Ser-241 dengan Gly-245 dilakukan

pada atom C (CA), hal ini disebabkan rantai samping glisin hanya terdiri dari

sebuah atom hidrogen. Perubahan-perubahan jarak antar residu tersebut

diharapkan mampu menunjukkan perbedaan konformasi parsial daerah L3 antara

sistem 3 dengan sistem 4.

Mutasi residu Arg-175 menjadi His-175 yang berada pada daerah L2 p53

ternyata mengakibatkan terjadinya ketidakstabilan struktur p53 dalam berinteraksi

dengan DNA. Ketidakstabilan tersebut terjadi dikarenakan struktur pada daerah

mutasi ini berubah. Perubahan konformasi parsial telah ditunjukkan oleh

perubahan-perubahan jarak interaksi antar residu di daerah sekitar mutasi maupun

daerah lain (L1 dan L3). Perubahan konformasi parsial inilah yang mengakibatkan

hilangnya kontak protein dengan DNA, sehingga mutan R175H kehilangan fungsi

supresi tumor.

b) Perubahan Konformasi R175H-p53 oleh Adduct pada Residu Sistein-124

Penggantian residu sistein-124 pada konformasi R175H-p53 oleh adduct

MQ-Sistein mampu memberikan perubahan konformasi parsial mutan tersebut.

Perubahan konformasi parsial R175H-p53 dimungkinkan karena penggantian

residu sistein-124 dengan rantai samping yang pendek menjadi adduct MQ-

Sistein dengan rantai samping yang lebih panjang. Adduct MQ-Sistein

dimungkinkan mendesak lingkungan disekitarnya (daerah L1) yang secara tidak

langsung mengubah posisi rantai samping residu histidin pada tempat mutasi.

Perubahan posisi rantai samping residu histidin mengakibatkan terjadinya

perubahan konformasi parsial makromolekul terutama pada daerah loop yang

cenderung fleksibel. Perubahan konformasi parsial yang cukup menarik yaitu

lingkungan disekitar daerah mutasi, dimana pada daerah L2 terjadi perubahan

konformasi dari loop pada sistem 4 menjadi helix setelah penambahan adduct.

Perubahan konformasi R175H-p53 oleh adduct pada residu sistein-124 disajikan

pada gambar 18.


commit to user

46


populasi dominan pertama (kiri) dan populasi dominan ke-2 (kanan)

dengan sistem 1 dan sistem 4. Overlay konformasi p53 digambarkan

dalam bentuk pita, sedangkan residu yang mengalami mutasi

(arginin menjadi histidin) digambarkan dalam bentuk stick. Wild

type-p53 (sistem 3) dengan populasi dominan pertama, sistem 3

dengan populasi dominan ke-2, sistem 1, dan sistem 4 ditunjukkan

berturut-turut dengan warna abu-abu, orange, hijau, dan merah

muda.

Perubahan konformasi yang terjadi pada daerah loop tersebut sesuai

dengan analisis sebelumnya yang ditunjukkan oleh perubahan harga order

parameter sistem 4 yang fleksibel menjadi rigid dengan penambahan adduct.

Daerah L2 yang mengalami perubahan konformasi menjadi helix terjadi pada

range residu nomor 180-182. Terbentuknya konformasi helix juga terjadi pada

sistem 3 dengan populasi dominan ke-2. Hal ini menunjukkan bahwa konformasi

parsial pada daerah tersebut dapat mendekati konformasi dari wild type-p53.

Terbentukknya konformasi helix pada sistem 1 dimungkinkan akibat dari

perubahan interaksi yang terjadi pada daerah L2 dengan residu histidin yang


commit to user

47

mengalami perubahan posisi rantai samping dan perubahan konformasi backbone

L2 karena adanya penambahan adduct.

Perubahan konformasi parsial R175H-p53 oleh adduct MQ-Sistein pada

daerah L1 ditunjukkan dengan perubahan jarak antar residu di daerah tersebut.

Gambar 19 menunjukkan perubahan konformasi parsial R175H-p53 oleh adduct

MQ-Sistein pada daerah L1 yang ditunjukkan dengan perubahan jarak antar residu

di daerah tersebut. Jarak antar residu-residu daerah L1 sistem 1 diantaranya pada

residu Leu-114 dengan Thr-123 sejauh 12,3 Å, residu Hie-115 dengan Val-122

sejauh 10,1 Å, residu Ser-116 dengan Val-122 sejauh 4,6 Å, dan residu Thr-118

dengan Ser-121 sejauh 9,8 Å. Dari keempat perubahan jarak yang terjadi pada

daerah L1 sistem 1 hanya residu antara Thr-118 dengan Ser-121 yang memiliki

jarak antar residu paling mendekati wild type-p53, mengingat jarak antara residu

Thr-118 dengan Ser-121 wild type-p53 sejauh 9,7 Å. Hal ini cukup penting karena

residu Thr-118 dan Ser-121 merupakan residu-residu yang dapat berinteraksi

(kontak) secara langsung dengan DNA.


sistem 1 pada daerah L1. Konformasi parsial L1 digambarkan

dalam bentuk pita, sedangkan rantai samping residu-residu daerah

L1 digambarkan dalam bentuk stick. Konformasi parsial R175H-

p53 (sistem 4) dan R175H-p53 yang mengandung adduct MQ-

Sistein (sistem 1) ditunjukkan berturut-turut dengan warna merah

muda dan hijau.


commit to user

48

Perubahan konformasi parsial R175H-p53 oleh adduct MQ-Sistein juga

terjadi pada daerah L2. Perubahan konformasi parsial tersebut terlihat dari

berubahnya jarak antar residu-residu daerah L2. Penambahan adduct MQ-Sistein

ternyata mampu memberikan pengaruh perubahan di lingkungan sekitar tempat

mutasi. Menariknya, backbone residu Glu-180, Arg-181, dan Cys-182 pada

R175H-p53 yang berbentuk loop berubah menjadi helix dengan penambahan

adduct MQ-Sistein. Konformasi helix ini juga terjadi pada sistem 3 dengan

dominasi populasi ke-2 hasil clustering. Hal ini menunjukkan bahwa adanya

penambahan adduct pada R175H-p53 mampu memberikan perubahan konformasi

parsial mendekati konformasi wild type-p53. Perubahan konformasi pada R175H-

p53 karena penambahan adduct juga ditunjukkan dengan perubahan jarak antar

residu yang terjadi di daerah L2. Perubahan jarak antar residu-residu daerah L2

ditunjukkan pada gambar 20.


sistem 1 pada daerah L2. Konformasi parsial L2 digambarkan dalam

bentuk pita, sedangkan rantai samping residu-residu daerah L2

digambarkan dalam bentuk stick. Konformasi parsial R175H-p53 dan

R175H-p53 yang mengandung adduct MQ-Sistein ditunjukkan

berturut-turut dengan warna merah muda dan hijau.

Perubahan jarak backbone residu-residu dilingkungan tempat mutasi

R175H-p53 karena adanya adduct diantaranya terjadi pada residu His-175 dengan

Hie-178 sejauh 8,7 Å menjadi 9,0 Å, residu His-175 dengan Hin-179 dari 4,2 Å


commit to user

49

menjadi 6,3 Å, residu His-175 dengan Glu-180 dari 4,5 Å menjadi 5,2 Å, residu

His-175 dengan Ser-183 dari 9,8 Å menjadi 5,4 Å, residu His-175 dengan Leu-

188 dari 18,0 Å menjadi 16,6 Å, dan residu Arg-174 dengan Hie-178 dari 12,3 Å

menjadi 12,6 Å. Dari beberapa perubahan tersebut terdapat dua jarak antar residu

daerah L2 yang mampu mendekati jarak antar residu yang terjadi pada wild type-

p53, yaitu jarak backbone antara residu His-175 dengan Hie-178 pada sistem 1

sejauh 9,0 Å sedang pada sistem 3 sejauh 9,0 Å dan jarak backbone antara residu

His-175 dengan Leu-188 pada sistem 1 sejauh 16,6 Å sedang pada sistem 3 sejauh

17,0 Å.

Perubahan konformasi backbone histidin dimungkinkan mempengaruhi

residu-residu yang berada disekitarnya. Konformasi backbone seperti spiral yang

terbentuk pada sistem 1 mungkin disebabkan karena terjadinya ikatan hidrogen

antara atom H pada gugus NH residu Ser-183 dengan atom O pada gugus CO

residu Glu-180. Jarak ikatan hidrogen yang terjadi pada dua residu tersebut adalah

2,3 Å. Ikatan ini memungkinkan terjadinya tarikan atom backbone antara dua

residu tersebut sehingga dapat mengubah konformasinya menjadi helix. Interaksi

antara residu Ser-183 dengan Glu-180 sistem 1 disajikan pada gambar 21.

Gambar 21. Interaksi ikatan hidrogen antara Ser-183 dengan Glu-180 pada sistem

1. Rantai samping tiap residu ditampilkan dengan stick. Atom C, H,

O, N, S ditunjukkan berturut-turut dengan warna hijau, putih, merah,

biru, dan kuning.

Perubahan karena adanya penambahan adduct pada sistem 1 juga terjadi

pada daerah L3. Perubahan tersebut juga ditunjukkan oleh berubahnya jarak antar

residu yang berada di lengkungan L3. Perubahan konformasi parsial R175H-p53

oleh adduct MQ-Sistein pada daerah L3 juga ditunjukkan dengan perubahan jarak


commit to user

50

antar residu di daerah tersebut. Perubahan jarak tersebut disajikan pada gambar

22.


sistem 1 pada daerah L3. Konformasi parsial R175H-p53 dan R175H-

p53 yang mengandung adduct MQ-Sistein ditunjukkan berturut-turut

dengan warna merah muda dan hijau.

Perubahan jarak antar residu-residu daerah L3 dari R175H-p53 menjadi

R175H-p53 yang mengandung adduct MQ-Sistein diantaranya pada residu Tyr-

236 dengan Met-246 dari 10,4 Å menjadi 8,9 Å, residu Met-237 dengan Met-246

dari 11,7 Å menjadi 10,9 Å, dan residu Ser-241 dengan Met-246 dari 6,9 Å

menjadi 9,8 Å. Residu Ser-241 dengan Gly-245 dari 8,0 Å menjadi 10,0 Å. Dari

perubahan-perubahan jarak tersebut, residu antara Met-237 dengan Met-246

memiliki jarak yang tidak jauh berbeda dengan sistem 3, mengingat jarak antara

residu tersebut pada sistem 3 sejauh 10,8 Å. Jarak antar residu yang mampu

mendekati sistem 3 juga terjadi pada residu Ser-241 dengan Met-246, hal ini

disebabkan jarak pada residu Ser-241 dengan Met-246 sistem 3 sejauh 10,1 Å.

Jarak antara residu Ser-241 dengan Gly-245 juga mampu mendekati jarak yang

terjadi pada sistem 3.

Beberapa perubahan konformasi mutan R175H-p53 yang mengandung

adduct ternyata mampu mendekati konformasi wild type-p53. Perubahan tersebut

ditunjukkan oleh berubahnya sebagian konformasi backbone maupun berubahnya

jarak antar residu yang terjadi pada mutan R175H-p53 yang mengandung adduct.

Hal ini memperkuat dugaan bahwa penggantian oleh adduct MQ-Sistein pada


commit to user

51

posisi Cys-124 dapat memberikan pengaruh perubahan konformasi parsial

mendekati wild type-p53.

c) Perubahan Konformasi R175H-p53 oleh Adduct pada Residu Sistein-275

Perubahan konformasi R175H-p53 oleh adduct MQ-Sistein pada residu

nomor 275 mampu memberikan perubahan konformasi parsial dari makromolekul

seperti yang terjadi pada sistem 1. Adanya adduct MQ-Sistein secara tidak

langsung memberikan pengaruh pada posisi backbone residu mutasi (histidin)

maupun residu-residu lain terutama pada daerah loop yang cenderung lebih

fleksibel dibandingkan bagian lain pada makromolekul. Pengaruh perubahan

posisi backbone residu mutasi (histidin) terhadap lingkungan disekitarnya

diperkirakan karena terjadi perubahan interaksi di daerah sekitar residu mutasi,

terlebih pada daerah L2, akibatnya terjadi perubahan konformasi L2 pada sistem 4

dari loop menjadi helix setelah penambahan adduct. Perubahan konformasi mutan

oleh adduct pada residu sistein-275 disajikan pada gambar 23.

Gambar 23 memperlihatkan terjadinya perubahan konformasi parsial

akibat adanya adduct pada residu nomor 275. Sama halnya yang terjadi pada

sistem 1, sistem 2 yang merupakan R175H-p53 dengan penambahan adduct pada

residu 275 juga memberikan perubahan konformasi parsial pada beberapa daerah

terutama daerah loop. Penambahan adduct diperkirakan juga mengakibatkan

perubahan posisi backbone residu mutasi (histidin) yang terletak diantara L2 dan

L3. Akibat perubahan posisi rantai samping residu histidin, residu-residu yang

berada di lingkungan residu histidin juga berubah.

Menariknya, residu-residu yang berada disekitar lingkungan residu histidin

terutama pada daerah L2 mengalami perubahan cukup signifikan sama seperti

yang terjadi pada kompleks mutan R175H yang mengandung adduct MQ-Sistein

pada residu nomor 124. Perubahan konformasi parsial terjadi pada range residu

177-183 dari konformasi loop berubah menjadi helix karena adanya pengaruh

secara tidak langsung oleh penambahan adduct. Helix yang ada pada daerah L2

juga terjadi pada sistem 3 dengan populasi dominan ke-2. Probabilitas

terbentuknya helix ternyata dapat mengalami peningkatan ketika ditambahkan


commit to user

52

adduct pada residu 275. Perubahan konformasi ini sesuai dengan analisis

kestabilan yang ditunjukkan sebelumnya dengan harga B-factor atom backbone

maupun analisis entropi atom backbone vektor NH yang menunjukkan bahwa

daerah L2 mutan R175H cenderung fleksibel kemudian berubah menjadi lebih

rigid karena perubahan konformasinya menjadi helix yang disebabkan adanya

pengaruh adduct.


populasi dominan pertama (kiri) dan populasi dominan ke-2

(kanan) dengan sistem 2 dan sistem 4. Overlay konformasi p53

digambarkan dalam bentuk pita, sedangkan residu yang mengalami

mutasi (arginin menjadi histidin) digambarkan dalam bentuk stick.

Wild type-p53 (sistem 3) dengan populasi dominan pertama, sistem

3 dengan populasi dominan ke-2, sistem 2, dan sistem 4

ditunjukkan berturut-turut dengan warna abu-abu, orange, biru, dan

merah muda.

Perubahan konformasi parsial R175H-p53 oleh adduct MQ-Sistein pada

residu nomor 275 terjadi pada daerah L1 yang ditunjukkan dengan perubahan

jarak antar residu di daerah tersebut. Jarak antar residu-residu daerah L1 R175H-

p53 yang mengandung adduct MQ-Sistein diantaranya pada residu Leu-114

dengan Thr-123 sejauh 10,0 Å, residu Hie-115 dengan Val-122 sejauh 9,8 Å,


commit to user

53

residu Ser-116 dengan Val-122 sejauh 5,1 Å, dan residu Thr-118 dengan Ser-121

sejauh 10,0 Å. Beberapa perubahan jarak tersebut hanya residu antara Leu-114

dengan Thr-123 yang memiliki jarak paling mendekati wild type-p53, mengingat

jarak antara residu tersebut pada wild type-p53 sejauh 9,7 Å. Hal ini cukup

penting karena residu Thr-118 dan Ser-121 merupakan residu-residu yang dapat

berinteraksi (kontak) secara langsung dengan DNA. Perubahan konformasi parsial

R175H-p53 oleh adduct MQ-Sistein pada daerah L1 yang ditunjukkan dengan

perubahan jarak antar residu di daerah tersebut disajikan pada gambar 24.





p53 dan R175H-p53 yang mengandung adduct MQ-Sistein

ditunjukkan berturut-turut dengan warna merah muda dan biru.


terjadi pada daerah L2. Adduct MQ-Sistein yang berada pada residu Cys-275

ternyata mampu memberikan pengaruh perubahan di lingkungan sekitar tempat

mutasi. Backbone residu Glu-180, Arg-181, dan Cys-182 pada R175H-p53 yang

berbentuk loop berubah menjadi helix dengan penambahan adduct MQ-Sistein.

Konformasi helix ini juga terjadi pada sistem 3 dominasi populasi kedua hasil

clustering. Hal ini menunjukkan bahwa adanya penambahan adduct pada R175H-

p53 mampu meningkatkan probabilitas terbentuknya helix. Perubahan konformasi

lainnya pada R175H-p53 karena penambahan adduct juga ditunjukkan dengan


commit to user

54

perubahan jarak antar residu yang terjadi di daerah L2. Perubahan jarak antar

residu-residu daerah L2 ditunjukkan pada gambar 25.


sistem 2 pada daerah L2. Konformasi parsial R175H-p53 dan

R175H-p53 yang mengandung adduct MQ-Sistein ditunjukkan

berturut-turut dengan warna merah muda dan biru.

Perubahan jarak backbone residu-residu dilingkungan tempat mutasi yang

berada pada daerah L2 R175H-p53 karena adanya adduct MQ-Sistein diantaranya

terjadi pada residu His-175 dengan Hie-178 sejauh 8,7 Å menjadi 9,2 Å, residu

His-175 dengan Hin-179 dari 4,2 Å menjadi 6,4 Å, residu His-175 dengan Glu-

180 dari 4,5 Å menjadi 4,1 Å, residu His-175 dengan Ser-183 dari 9,8 Å menjadi

6,8 Å, residu His-175 dengan Leu-188 dari 18,0 Å menjadi 17,2 Å, dan residu

Arg-174 dengan Hie-178 dari 12,3 Å menjadi 12,1 Å. Dari perubahan-perubahan

jarak antar residu daerah L2 tersebut terdapat tiga perubahan jarak antar residu

daerah L2 pada sistem 2 yang mampu mendekati jarak antar residu yang terjadi

pada wild type-p53. Jarak backbone antara residu His-175 dengan Hie-178 pada

sistem 2 sejauh 9, 2 Å mampu mendekati jarak backbone antara residu His-175

dengan Hie-178 pada wild type-p53 yang memilik jarak sejauh 9,0 Å. Jarak

backbone antara residu His-175 dengan Glu-180 pada sistem 2 sejauh 4,1 Å

mampu mendekati jarak backbone antara wild type-p53 yang memilik jarak sejauh

4,0 Å. Hal serupa juga terjadi pada jarak backbone antara residu His-175 dengan

Leu-188 pada sistem 2 sejauh 17,2 Å sedang pada sistem 3 sejauh 17,0 Å. Jarak


commit to user

55

backbone antara residu residu Arg-174 dengan Hie-178 pada sistem 2 sejauh 12,1

Å mampu mendekati jarak backbone residu tersebut pada wild type-p53 yang

memilik jarak sejauh 12,0 Å.

Perubahan konformasi L2 menjadi helix dimungkinkan juga terjadi akibat

adanya ikatan hidrogen yang terbentuk antara atom O pada gugus CO residu Hie-

178 dengan atom H pada gugus NH residu Arg-181 dengan panjang ikatan 2,6 Å.

Ikatan hidogen lainnya dimungkinkan terjadi antara atom O gugus CO residu Hin-

179 dengan aton N gugus NH residu Ser-183. Jarak ikatan hidrogen yang terjadi

pada dua residu tersebut adalah 2,6 Å. Struktur helix terbentuk oleh backbone

ikatan peptida yang membentuk spiral. Bentuk spiral tersebut dimungkinkan

akibat tarikan ikatan hidrogen yang terjadi antara backbone residu Hie-178

dengan residu Arg-181 dan residu Hin-179 dengan Ser-183. Interaksi ikatan

hidrogen pada backbone helix yang berada di daerah L2 sistem 2 disajikan pada

gambar 26.

Gambar 26. Interaksi ikatan hidrogen antara residu Hie-178 dengan Arg-181 (A)

dan Hin-179 dengan Ser-183 (B) pada sistem 2. Konformasi

backbone helix digambarkan dalam bentuk flat, sedangkan rantai

samping tiap residu ditampilkan dalam bentuk stick. Atom C, H, O

ditunjukkan berturut dengan warna biru, putih, dan merah.


terjadi pada daerah L3 yang ditunjukkan dengan perubahan jarak antar residu di

daerah tersebut. Perubahan jarak antar residu-residu daerah L3 dari R175H-p53

menjadi R175H-p53 yang mengandung adduct MQ-Sistein diantaranya pada

residu Tyr-236 dengan Met-246 dari 10,4 Å menjadi 11,7 Å, residu Met-237

dengan Met-246 dari 11,7 Å menjadi 10,8 Å, residu Ser-241 dengan Met-246 dari


commit to user

56

6,9 Å menjadi 10,0 Å, dan residu Ser-241 dengan Gly-245 dari 8,0 Å menjadi

10,0 Å. Perubahan jarak antar residu-residu daerah L3 dari R175H-p53 menjadi

R175H-p53 yang mengandung adduct MQ-Sistein pada residu nomor 275

disajikan pada gambar 27.





p53 dan R175H-p53 yang mengandung adduct MQ-Sistein

ditunjukkan berturut-turut dengan warna merah muda dan biru.

Dari keempat perubahan jarak tersebut menunjukkan bahwa seluruh jarak

antar residu daerah L3 mampu mendekati jarak antar residu backbone yang terjadi

pada residu-residu milik wild type-p53. Jarak antar residu pada backbone antara

residu Tyr-236 dengan Met-246 sejauh 11,7 Å, sedang pada wild type-p53 sejauh

12,0 Å (populasi dominan pertama) dan 11,9 Å (populasi dominan kedua). Jarak

antar residu pada backbone antara residu Met-237 dengan Met-246 pada sistem 2

sama dengan sistem 3 yaitu sejauh 10,8 Å. Jarak antar residu yang mampu

mendekati wild type-p53 juga terjadi pada residu Ser-241 dengan Met-246,

mengingat jarak residu Ser-241 dengan Met-246 pada wild type-p53 sejauh 10,1

Å. Jarak antara residu Ser-241 dengan Gly-245 juga mampu mendekati jarak yang

terjadi pada sistem 3, mengingat jarak antar residu tersebut pada sistem 3 sejauh

10,5 Å.


commit to user

57

Penambahan adduct MQ-Sistein yang terdapat pada sistem 1 dan 2

ternyata mampu meningkatkan kestabilan R175H-p53 selama simulasi

berlangsung. Adduct MQ-Sistein yang terdapat pada sistem 1 dan 2 ternyata juga

memberikan perubahan konformasi parsial dari R175H-p53 yang dapat mendekati

konformasi wild type-p53, terutama daerah L1, L2, dan L3 yang merupakan

daerah penting untuk DNA-binding maupun stabilisasi residu-residu permukaan

p53 yang binding dengan DNA. R175H-p53 dengan modifikasi pada sistein-124

(sistem 1) yang diketahui memiliki reaksi pembentukan adduct paling cepat

terlihat memberikan perbaikan konformasi parsial mendekati wild type-p53 pada

daerah L2 dan L3. Daerah L2 sistem 1 terdapat konformasi parsial berupa helix

seperti yang ditemukan dalam wild type-p53 pada populasi dominan ke-2,

sedangkan pada daerah L3 terdapat beberapa residu yang memiliki jarak interaksi

yang mendekati wild type-p53. Penambahan adduct pada sistein-275 (sistem 2)

yang diketahui memiliki reaksi pembentukan adduct paling lambat secara

mengejutkan memperlihatkan perbaikan konformasi parsial yang dapat mendekati

wild type-p53 pada daerah L1, L2 dan L3. Beberapa residu daerah L1 dan L3

sistem 2 yang berperan penting dalam DNA-binding menunjukkan jarak antar

residu yang mendekati jarak antar residu pada wild type-p53. Daerah L2 diketahui

merupakan daerah stabilisasi residu-residu permukaan p53 yang berperan dalam

DNA-binding. Adanya adduct pada sistem 2 ternyata mampu meningkatkan

probabilitas terbentuknya helix. Hal ini cukup menarik karena dengan

terbentuknya helix menunjukkan peningkatan kestabilan daerah tersebut.

Modifikasi oleh adduct MQ-Sistein yang dilakukan pada residu sitein

R175H-p53 dengan perbedaan kecepatan reaksi pembentukan adduct dan

perbedaan lokasi memberikan pengaruh yang berbeda terhadap konformasi mutan

p53. Pengaruh penambahan adduct ternyata mampu menginduksi modifikasi lokal

sehingga sebagian konformasinya dapat menyerupai wild type-p53. Perubahan

konformasi parsial yang terjadi pada L1, L2, dan L3 menunjukkan bahwa

sebagian konformasi mutan p53 mampu distabilkan dan mampu mendekati

konformasi wild type-p53 dengan penambahan adduct MQ-Sistein.


commit to user

58

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan

1. Reaktivasi R175H-p53 oleh adduct MQ-Sistein membutuhkan lebih dari

satu adduct.

2. Adduct MQ-Sistein pada posisi 124 dan 275 mampu mengembalikan

konformasi mendekati konformasi wild type-p53 secara parsial. Adduct

MQ-Sistein pada posisi 124 memberikan perubahan konformasi daerah L2

dan L3, sedangkan pada posisi 275 memberikan perubahan konformasi

daerah L1, L2 dan L3.

B. Saran

Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut dengan memodifikasi lebih dari

satu adduct yang bersifat kooperatif dan memiliki kecepatan pembentukan adduct

yang tidak berbeda signifikan dalam merestorasi konformasi p53 termutasi,

dimana satu adduct memberikan pengaruh yang berbeda dengan adduct lain

sehingga dimungkinkan saling melengkapi.

58


commit to user

Documents

REAKTIVASI R175H-p53 OLEH ADDUCT MQ-SISTEIN : …... · ABSTRAK Mutasi R175H pada p53 (R175H-p53) ... Dasar bagian Komputasi Kimia. 6. Bapak Ibu dosen dan seluruh staff jurusan Kimia