Immunohistochemistry Staining CD4, Kolagen & P53 / Pengecatan imunohistokimia

  • View
    464

  • Download
    10

Embed Size (px)

DESCRIPTION

menjelaskan tentang Immunohistochemistry Staining CD4, Kolagen & P53, reagen kit, antibodi monoklonal, antibodi primer, antibodi sekunder.

Text of Immunohistochemistry Staining CD4, Kolagen & P53 / Pengecatan imunohistokimia

Evaluasi Antara

Immunohistochemistry StainingCD4, Kolagen & P53

AryaDOSENDOKTOR

1IHCDiambil dari kata immune proses yg menggunakan antibody dan histo menunjukkan jaringan secara mikroskopisAdanya antigen spesifik didapat antibodi(Ab) spesifik Ab primer dilabel atau sudah berlabel pengecatanAg bisa diamatiPada sel terdapat berbagai macam struktur protein yg AG spesifik baik tingkat selular maupun tingkat molekuler.Contoh protein spesifik selular : LCA, Vimentin, CD 20, CD 3Contoh protein spesifik molekuler: RE, RP, Her 2,p53, Bcl 2- Tahu jenis protein yg akan dideteksi- Tahu lokasi protein tersebut - Kalau pabrik sudah membuat Ab primernya- Kalau lab.PA punya kemampuan pem.IHCLabel ada 2 macam: fluorescent - enzym / peroksidase Label fluorescent tak perlu dicat lagiLabel enzim perlu cat chromogen : DAB , AEC Untuk mengukur dan mengidentifikasi karakteristik seluler spt proses proliferasi sel, apoptosis sel, mengetahui distribusi dan lokasi biomarker atau protein terekspresi pada jaringan tubuh2Prinsip Utama Imunohistokimia2

Metode imunohistokimia Merupakan metode Imunohistokimia tertua. Memanfaatkan metode reaksi antara antibodi primer yang telah diberi label enzim dengan antigen pada jaringan. Keunggulan metode ini cepat krn hanya menggunakan satu antibodin dan reaksi nonspesifik dapat diminimalisir. Kelemahan krn hanya menggunakan satu label antibodi amplifikasi sinyal/pewarnaan kurang memadai dan mulai kurang sensitif untuk permintaan diagnosa akhir2 iniDirectTerdapat beberapa metode yang digunakan diantaranya adalahTwo step indirectmethodPrinsip utama metode ini antibodi primer yang dikatkan dgn antigen, antibodi sekunder diikatkan pada antibodi primer dilanjutkan dengan larutan substrat kromogen.Metode ini lebih serbaguna dibanding metode direct lebih banyak jenis antibodi primer dr spesies yg sama yg dpt digunakan bersama dengan antibodi sekunder yg terkonjugasi, serta lbh sensitif krn beberapa antibodi sekunder dpt bereaksi terhadap beberapa epitop primer shg memperkuat hasil.Three step indirectmethod

Metode ini melanjutkan metode sebelumnya, antibodi tersier yg dikonjugasi enzim ditempelkan pd antibodi sekunder. Antibodi tersier ini harus spesifik terhadap antibodi sekunder. Kedua antibodi tsb juga harus dikonjugasikan pd enzim yg sama.Penambahan lapisan ketiga ini memperkuat hasil krn lbh banyak antibodi yg terikat, jg sangat membantu pada pewarnaan pada epitop (epitop mjd lbh banyak)ABC,LAB/LSAB,Avidin-Biotin-Complex (ABC) menggunakan afinitas terhadap molekul avidin- biotin oleh tiga enzim peroksidase. Situs pengikatan bbrp biotin dlm molekul avidin tetravalen bertujuan untuk amplifikasi dan merespon sinyal yang disampaikan oleh antigen target.Labelled avidin biotin (LAB), 4-8 kali lebih sensitif dr ABC. Avidin sekarang tlh tergantikan oleh streptavidin shg menjadi metode baru yaitu labelled streptavidin-biotin (LSAB) dan modifikasi lain dr ABC seperti CSA.

ABC Protocol

FixationFiksasi sangat penting dalam menentukan outcome reaksi antigen-antibodiManfaat fiksasi :Menjaga keutuhan komponen sel (protein struktural dan soluble)Mencegah autolisis dan perubahan penyusun sel (antigen dan enzim)Stabilisasi material sel dari akibat prosedur tindakanFasilitasi pengecatan konvensional dan imunostainingAda dua macam cara fiksasiFiksasi cross linking (non koagulasi)Coagulating fixatives

Cross-linking FixationGold standard : formaldehidMekanisme dasar fiksasi : pembentukan addition product antara formalin dan grup amino reaktif yg tak bermuatan (-NH atau NH2) membentuk cross-linkJika terdapat hidrogen reaktif kedua maka akan terbentuk methylene bridge

Antigen retrievalAR bertujuan untuk optimalisasi imunoreaksiTahap fiksasi akan mengubah struktur tersier protein (antigen) sehingga sulit bereaksi dengan antibodiMetode untuk memulihkan perubahan akibat fiksasiAR terutama diperlukan pada jaringan yang difiksasi dengan cross-link fixativeTanpa AR, Ab poliklonal lebih mudah deteksi Ag dibanding Ab monoklonalProsedur AR yang paling banyak dipakaiMetode enzimatikMetode heat-based retrievalCara lain : inkubasi slide dalam larutan alkali kuat, urea, larutan asam, borohidrid, larutan sukrosaA.R enzimatikHuang et al mengenalkan metode protease-induced epitope retrieval (PIER)Enzim yang dipakai : tripsin, proteinase K, pronase, ficin, pepsinEfek dipengaruhi : konsentrasi dan tipe enzim, parameter inkubasi (waktu, suhu, pH), dan durasi fiksasiWaktu digesti enzimatik berbanding terbalik dengan lama fiksasiKelemahan metode PIERRendahnya jumlah antigenPerubahan morfologi jaringanDestruksi epitopA.R heat-basedHeat-induced epitope retrieval (HIER) dikenalkan oleh Shi et alKonsep : reaksi kimia antara protein dan formalin dapat dipulihkan/dibalik dengan pemanasan atau hidrolisis dengan alkali kuatPemanasan dapat membuka epitop melalui hidrolisis cross-link metilenPemanasan suhu tinggi (100C) dengan durasi singkat (10 menit) akan mendapat hasil yang lebih baik dibanding pemanasan suhu rendah dengan waktu yang lama

Imunohistokimia CD4BACKGROUND:Setelah diketahui bahwa limfosit dapat dibagi menjadi sel B dan sel T, diketahui jg bhw sel T berfungsi sebagai helper, supresor dan sel sitotoksik. Molekul CD4 mrp glikoprotein nonpolimorfik anggota superfamili gen Ig yg berekspresi pada permukaan membran subpopulasi sel T. Molekul CD4 bertindak sebagai ko-reseptor dan berikatan dengan region nonpolimorfik molekul MHC kelas II. SOURCES/CLONES:Ancell (QS4120), Becton Dickinson (Leu3), Biodesign (13B8.2, BL4), Biogenesis (T138A), Biotest (T4, TT1), Coulter (T4), Cymbus Bioscience (MEM115), Dako (MT310), GenTrak, Immunotech (BL4,13B8.2), Oncogene (VIT4), Sanbio (BL-TH4), MEM115), Seralab, Serotec (B-A1, B-F5, B-B14,13B8.2) and Pharmingen (RM-4-4, RM-4-5) Imunohistokimia CD4APPLICATION:Antibodi CD4 berguna utk identifikasi Thelper/sel inducer, memeriksa limfosit reaktif (karena terdapat pada 45% limfosit darah perifer), kelainan limfoproliferatif dan monosit. Juga terdapat pada 80% thymocyt. Walaupun juga diekspresikan pada monosit/makrofag, sel langerhans dan sel dendritik lainnya, Cd4 tidak diekspresikan oleh sel B.ADDITIONAL INFORMATION:Positive Control: Tonsil, spleen, thymus Negative Control: Omit primary antibody, isotype control or absorption controlStandard Method: ABC Method or LSAB Method.Chromogen Substrate: DAB (3,3'-DIAMINOBENZIDINE)Counterstain: Mayer's Hematoxylin

Gambar A dan B negative controlGambar C dan D positive control terwarnai coklat

Imunohistokimia KolagenBACKGROUND:Lamina densa mrp lapisan setebal 40-60 nm salah satu pembentuk lamina basalis selain lapisan lamina lucida. Kolagen tipe IV terdapat dibagian lamina densa, bila menggunakan mikroskop elektron bisa teramati pada lamina densa dan lamina lucida. SOURCES/CLONES:Accurate (COL-4), Axcel (CIV22), Biodesign (1o42, MC4HA), Biogenesis (2D8/29), Biogenex (CIV22), Biotec (XCD02), Dako (CIV22), ICN (polyclonal, 1042), Immunotech (CIV22), Milab, Sanbio (SB11), SeraLab (1042) and Serotec (CIV22, PHM-12)Imunohistokimia Kolagen (tipe IV)APPLICATION:Diagnosis IHC kolagen tipe IV kebanyakan terpusat pada tumor invasif pada lamina basalis, sebagian tumor epitelial. IHC kolagen tipe IV juga digunakan utk membedakan hiperplasia sel C dengan karsinoma medular pada tiroid. ADDITIONAL INFORMATION:Positive Control: Skin, kidneyNegative Control: Omit primary antibody, isotype control, absorption control Standard Method: ABC Method atau LSAB MethodChromogen Substrate: DABCounterstain: Mayer's HematoxylinKolagen cancer mamae(+) Kolagen pada ginjal (+)

Imunohistokimia P53BACKGROUND:P53 berfungsi utk memprogram kematian sel, diferensiasi sel dan mengontrol mekanisme siklus sel. Terdapat pd nukleus (terikat dgn DNA), pd lengan pendek kromosom 17. P53 mewakili sebagai molekul yg paling sering berubah dlm perubahan genetis pada kanker.SOURCES/CLONES:Biodesign (Pab1801, 53-12), BioSource, Bioprobe (BP53-12), Chemicon, Cymbus Bioscience, Medac (CM-1), Dako (DO-7), GibcoBRL, Immunotech, Novocastra, Oncogene (Pab1801, Pab421, Pab122), Oncor, Pharmingen (G59-12), Serotec (Pab1801, BP53-12) and Signet.Antibodies to mutant p53Biogenesis, Chemicon and Oncogene (Pab240)Antibodies to Wild-Type p53Biodesign (Pab246), Oncogene (Pab1620) and Serotec (Pab246)Imunohistokimia P53APPLICATION:Deteksi P53 berdasarkan peningkatan konsentrasi protein pada tingkatan yg dpt terdeteksi. Umumnya, frekuensi hasil pengecatan positif sejalan dgn tumor yg disertai mutasi pada pemeriksaan sekuensing DNA. Analisis P53 pada kondisi neoplastic atau preneoplastik merupakan alat yg kuat dlm menyediakan informasi molekuler pd proses onkogen serta kemampuannya utk mendeteksi bentuk abnormal pada protein jaringan.ADDITIONAL INFORMATION:Positive Control: Skin cancer, tumorsNegative Control: Omit primary antibody, isotype control, absorption control Standard Method: ABC Method atau LSAB MethodChromogen Substrate: DABCounterstain: Mayer's Hematoxylinc-erbB2 staining is positive in (A) and negative in (B). p53 staining is positive in (C) and negative in (D). Slides were counterstained with Mayer's hemalum solution. Magnification, 100

Terima kasih