1

Reaktivniacute formy kysliacuteku

v lidskeacutem těle

Vyacutezbroj fagocytů

MUDr Jan Plaacuteteniacutek PhD

Uacutestav leacutekařskeacute biochemie a laboratorniacute diagnostiky 1LF UK

Co je volnyacute radikaacutel

- molekula atom nebo ion schopnyacute

samostatneacute existence kteryacute obsahuje alespoň

jeden nepaacuterovyacute elektron

O2middotndash

radikaacutel ion

molekula

2

K čemu vlastně potřebujeme kysliacutek

Přenos elektronů (oxidace) z organickyacutech laacutetek na kysliacutek uvolňuje obrovskeacute množstviacute energie

Př Glukosa

CC66HH1212OO66 + 6 O+ 6 O22 rarrrarrrarrrarr 6 CO6 CO22 + 6 H+ 6 H22OO

∆∆∆∆∆∆∆∆GGoorsquorsquo = = ndashndash 2820 2820 kJkJ mol mol (180 g glukosy)(180 g glukosy)

Reaktivitu kysliacuteku lze naviacutec regulovat katalyacutezou přechodnyacutemi kovy (železo měď)

Hořiacute cukr

3

4

Spinovaacute restrikce kysliacutekubull Normaacutelniacute (triplet) O2 je

biradikaacutel s vysokou afinitou k elektronům

bull Ale přiacutejem elektronu vyžadujeaby jeden ze staacutevajiacuteciacutechnepaacuterovyacutech elektronů změnilsvůj spin což je relativněpomalyacute proces

bull Bez teacuteto restrikce bychom v kysliacutekateacute atmosfeacuteře planetyokamžitě shořeli

bull Singletovyacute O2 je excitovanaacute vysoce reaktivniacute forma kysliacuteku

Dyacutechaciacute řetězec vnitřniacute

mitochondriaacutelniacute membraacuteny

5

elektrony proudiacute po spaacutedu redoxniacuteho

potenciaacutelu a končiacute na kysliacuteku

celkovaacute reakce

NADH + H+ + 12 O2 rarrrarrrarrrarr NAD+ + H2O

∆∆∆∆Gorsquo = ndash21925 kJ mol-1

Zaacuteroveň s proudem elektronů se pumpujiacute protony a vzniklyacute

protonovyacute gradient pak pohaacuteniacute synteacutezu ATP

6

Reaktivniacute formy kysliacuteku (ROS bdquokysliacutekoveacute radikaacutelyldquo) lze odvodit od meziproduktů redukce kysliacuteku na vodu

O2

2H2O

+4 e-

(+4 H+)

O2middotndash

superoxid

H2O2peroxid vodiacuteku

OHmiddothydroxylovyacute

radikaacutel

+3 e-

(+3 H+)

+2 e-

(+2 H+)

+1 e-

( +H2O )

Superoxidbull Zdroje v těle

ndash Uacutenik elektronů na kysliacutek

- Dyacutechaciacute řetězec v mitochondriiacutech

- Jineacute podobneacute redoxniacute systeacutemy např mikrosomaacutelniacutecytochrom P450 monooxygenasa

ndash NAD(P)H Oxidasa

- Fagocyty (rdquorespiratory burstrdquo)

- Nefagocytaacuterniacute buňky

ndash Některeacute enzymy

- Xanthinoxidasa

- Cyklooxygenasa

- Lipoxygenasa

ndash Reakce FeII-hemoglobinu s kysliacutekem

ndash Autooxidace (reakce s kysliacutekem) různyacutech laacutetek (askorbaacutet glutathion a jineacute thioly katecholaminy)

O2middotndash

7

Produkce superoxidu v dyacutechaciacutem řetězci

bull 1-2 z celkoveacutespotřeby O2 (in vivourčitě meacuteně)

bull Uacutenik elektronů z redoxniacutech centerkomplexů I a III předevšiacutem zesemiubichinonu

Vznik superoxidu z oxyhemoglobinu

Štiacutepek S et al Antioxidanty a volneacute radikaacutely ve zdraviacute a nemoci GradaPublishing Praha 2000

8

Superoxid

bull Vlastnosti

- Nepřiacuteliš reaktivniacute oxidačniacute i redukčniacute činidlo

- Omezenaacute možnost průchodu přes membraacuteny (jenskrz aniontoveacute kanaacutely nebo ve sveacute protonovaneacuteformě)

- Uvolňuje železo z Fe-S clusterů

bull Osud

ndash Dismutace

ndash Reakce s oxidem dusnatyacutem

O2middotndash

O2middotndash + O2

middotndash + 2 H+ rarr O2 + H2O2

NO + O2middotndash rarr OONOndash (peroxynitrit)

Peroxid vodiacuteku

bull Tvorba v těle

ndash Dismutace superoxidu (spontaacutenniacute nebokatalyzovanaacute superoxiddismutasou)

ndash Přiacutemo činnostiacute některyacutech enzymůbull Xanthinoxidasa

bull Monoaminooxidasa (MAO)

H2O2

O2middotndash + O2

middotndash + 2 H+ rarr O2 + H2O2

9

Peroxid vodiacuteku

bull Vlastnosti

- Neniacute radikaacutel

- Volně prochaacuteziacute skrz biologickeacute membraacuteny

- Saacutem o sobě celkem nereaktivniacute

- Ale rychle reaguje s redukovanyacutemi přechodnyacutemi kovyjako železo a měď (Fentonova reakce)

bull Osud

ndash Fentonova reakce

ndash Bezpečneacute odstraněniacute glutathionperoxidasou peroxiredoxinem nebo katalasou

H2O2

H2O2 + Fe2+ rarr OHndash + OHmiddot + Fe3+

hydroxylovyacute radikaacutel

Hydroxylovyacute radikaacutel

bull Vznik v těle

ndash Ionisačniacute zaacuteřeniacute

ndash Fentonova reakce

bull Vlastnosti

- Extreacutemně reaktivniacute Poškozuje biomolekuly bliacutezkomiacutesta sveacuteho vzniku

OH middot

H2O2 + Fe2+ rarr OHndash + OHmiddot + Fe3+

H2O rarr H + OHmiddot

10

Reaktivniacute formy kysliacuteku(Reactive Oxygen Species ROS)

bull Radikaacutelyndash Superoxid O2 middotndash

ndash Hydroperoxyl HO2middotndash Hydroxylovyacute radikaacutel OHmiddotndash Peroxyl ROOmiddotndash Alkoxyl ROmiddot

bull Ne-radikaacutelyndash Peroxid vodiacuteku H2O2

ndash Kyselina chlornaacute HClOndash Ozoacuten O3

ndash Singletovyacute kysliacutek 1O2

Oxid dusnatyacute

bull Vznik v těle

ndash NO synthasovaacute reakce

ndash Tři různeacute NO synthasy- NOS I (neuronaacutelniacute konstitutivniacute)- NOS II (fagocyty inducibilniacute)- NOS III (endoteliaacutelniacute konstitutivniacute)

NO middot

L-Arginin + O2 + NADPH rarr L-Citrulin + NADP+ +NO

11

Oxid dusnatyacute (NO) působiacute relaxaci hladkeacuteho svalstva

ceacutevniacute stěny

Oxid dusnatyacutebull Vlastnosti- Plynnyacute radikaacutel- Reakce s hemovyacutem železem guanylaacutetcyklasy

(hellipfyziologickeacute uacutečinky relaxace hladkeacuteho svalstva atd)- Reakce s hemovyacutem železem hemoglobinu (hellipfyziologickaacute

inaktivace)

- Reakce se sulfhydrylovou skupinou glutathionu atd nanitrosothiol (helliptransport NO)

- Reakce se superoxidem na peroxynitrit a konečněhydroxylovyacute radikaacutel (helliptoxicita)

NO middot

NO + O2middotndash rarr OONOndash peroxynitrit

OONOndash + H+ rarr HOONO rarr OHmiddot + NO2

kyselina peroxydusitaacute hydroxylovyacute radikaacutel

12

Reaktivniacute formy dusiacuteku(Reactive Nitrogen Species RNS)

bull Radikaacutelyndash Oxid dusnatyacute NOndash Oxid dusičityacute NO2

bull Ne-radikaacutelyndash Nitrosonium NO+

ndash Nitroxyl NOndash

ndash Kyselina dusitaacute HNO2

ndash Oxid dusityacute N2O3

ndash Oxid dusičityacute N2O4

ndash Nitronium NO2+

ndash Peroxynitrit ONOO ndash

ndash Alkylperoxynitrit ROONO

Oxidačniacute poškozeniacute biomolekul

bull Lipidy peroxidace polynenasycenyacutechmastnyacutech kyselin v membraacutenaacutech

bull Proteiny oxidace -SH karbonylace -NH2 hydroxylacenitrosylace aromatickyacutechAMK cross-linking degradace

bull Nukleoveacute kyseliny zlomy v řetězci DNA hydroxylace basiacute mutace kancerogenese

13

Peroxidace

lipidů (žluknutiacute)

Dalšiacute osud lipoperoxidů

14

Ionizačniacute zaacuteřeniacuteHydroxylovyacute radikaacutel vznikaacute ionizaciacute vody

H2O + hν rarr H + OHmiddot

Reaktivniacute formy kysliacuteku v organismu

Jednoelektronovou redukciacute kysliacuteku (mitochondrie NADPH oxidasa) vznikaacute superoxid O2

middotndash

Dismutace superoxidu produkuje peroxid vodiacutekuO2

middotndash + O2middotndash + 2 H+ rarr O2 + H2O2

Fentonova reakce s Fe nebo Cu vytvořiacute z peroxiduhydroxylovyacute radikaacutelH2O2 + Fe2+ rarr OHndash + OHmiddot + Fe3+

Kde jsou RONS prospěšneacute

I Aktivniacute centra enzymů

bull Monooxygenasy (cytochromy P450)

bull Ribonukleotidreduktasa (hellipsynteacuteza DNA)

bull Synteacuteza prostanoidů (enzymatickaacute lipoperoxidace)

bull Užitečneacute hemoveacute peroxidasy

15

Kde jsou RONS prospěšneacute

I Aktivniacute centra enzymů

bull Monooxygenasy (cytochromy P450)

ndash Detoxikace xenobiotik synteacuteza steroidniacutech hormonů a žlučovyacutech kyselin NO synthasy

Mechanismus v podstatě řiacutezenaacute Fentonova reakce

Fe3+ + SH + 2 e- + O2 + H+ rarr FeOOH SH

FeOOH SH rarr FeO3+ SH + H2O

FeO3+ SH rarr FeOH3+Sbull rarr Fe3+SOH rarr Fe3+ + SOH

Kde jsou RONS prospěšneacute

I Aktivniacute centra enzymů

bull Monooxygenasy (cytochromy P450)

bull Ribonukleotidreduktasa (hellipsynteacuteza DNA)

bull Synteacuteza prostanoidů (enzymatickaacute lipoperoxidace)

bull Užitečneacute hemoveacute peroxidasy

ndash Thyreoperoxidasa ve štiacutetneacute žlaacuteze

Iminus + H2O2 + 2H+ rarr I+ + 2H2O I+ joduje thyreoglobulin

ndash Myeloperoxidasa neutrofilů

ndash Laktoperoxidasa v mleacuteku hlenu dyacutechaciacutech cest a ve slinaacutech

SCNminus + H2O2 rarr OSCNminus + H2O

(hypothiokyanaacutet OSCNminus je baktericidniacute)

16

Kde jsou RONS prospěšneacute

II Signalizace

bull Např oxid dusnatyacute NOndash relaxace hladkeacuteho svalstva ceacutevniacute stěny

gastrointestinaacutelniacuteho traktu corpus cavernosumpenis

ndash neurotransmitter neuromodulaacutetor v CNS funkce v synaptickeacute plasticitě učeniacute a paměti

ndash inhibice adhese a agregace trombocytů ndash inhibice adhese leukocytůndash (atd)

Superoxid stejně tak uacutečinky protichůdneacute NO

OXID DUSNATYacuteProdukovaacuten NO synthasami

Vasodilatace inhibice aktivace leukocytů inhibice agregace destiček

atd

SUPEROXIDPEROXIDProdukovaacuten NADPH oxidasami

Vasokonstrikce aktivace leukocytů agregace destiček atd

A při setkaacuteniacute se navzaacutejem zničiacute

NO + O2middotndash rarr OONOndash

17

Koncept redoxniacute signalizace

bull Redoxniacute prostřediacute buňky - přibližně daacutenopoměrem GSHGSSG a NADHNAD

bull Redoxniacute sensory na proteinechndash kritickeacute -SH skupiny

ndash Fe-S centra

bull Ciacutele redoxniacute signalizacendash transkripčniacute faktory

ndash proteinkinasy a fosfatasy

Redoxniacutesignalizace

bull Oxidačniacute stres aktivuje určiteacute protein kinasy a transkripčniacute faktory

bull Vyacuteslednyacute efekt např stimulace proliferace senescence (staacuternutiacute) buněk

bull PůsobeniacuteROSantioxidantů v buňce může byacutet velmi specifickeacute

(T Finkel amp NJ Holbrook Nature 408 (2000) 239-247)

18

hellip a velmi

komplikovaneacute

Kde jsou RONS prospěšneacute

III Fagocytoacuteza

bull Neutrofily eosinofily monocyty makrofaacutegy mikroglie

bull Často je potřeba ciacutelovou čaacutestici označit (opsonizace)

bull Uacutekolem fagocytujiacuteciacute buňky je ciacutelovou čaacutestici

ndash Rozpoznat

ndash Pohltit

ndash Zabiacutet

ndash Straacutevit

copy 1998 Garland Publishing

19

Neutrofilniacute granulocyt

(polymorfonukleaacuter)

bull Segmentovaneacute jaacutedrobull Primaacuterniacute (azurofilniacute)

granula lysozym defensiny myeloperoxidasa proteasy

bull Specifickaacute (sekundaacuterniacute) granula NADPH oxidasa kobalofilin laktoferrin lysozym kolagenasa

bull Terciaacuterniacute granula gelatinasa a dalšiacute enzymy

Obrhttpblausencom

Obr httpwalchecklabumnedu_rsrc1417821135388research-interestsneutrophil-recruitment

20

Aktivace fagocytujiacuteciacute buňky

Respiračniacute vzplanutiacute

bull Naacutehleacute zvyacutešeniacute spotřeby kysliacuteku (pro produkci superoxidu ne respiraci)

bull Naacutehleacute zvyacutešeniacute spotřeby glukosy (pro pentosovyacute cyklus ndash dodaacutevaacuteNADPH pro NADPH oxidasu)

NADPH oxidasa

bull Membraacutenovyacute enzym produkujiacuteciacute superoxid vněnebo do fagosomu

bull Katalyzuje reakci

NADPH + 2O2 rarr NADP+ + H+ + 2O2middotndash

bull V klidu latentniacute sestavuje se z 6 podjednotek na buněčneacute membraacuteně při aktivaci fagocytu

bull Nezbytnaacute pro schopnost zabiacutet některeacute pohlceneacutebakterie (hereditaacuterniacute deficit chronickaacute septickaacute

granulomatosa)

bull Takeacute na endotelu a mnoha jinyacutech nefagocytaacuterniacutech buňkaacutech

21

Myeloperoxidasa

bull 2 ndash 5 všech proteinů v neutrofilechbull Hemoprotein zodpovědnyacute za zelenou barvu

hnisubull Nespecifickaacute peroxidasa v těle katalyzuje

předevšiacutem reakciClminus + H2O2 + H+ rarr HClO + H2O

bull Deficit u lidiacute častyacute (1 na 2000-4000) a nemaacutezaacutevažneacute přiacuteznaky

Kyselina chlornaacute

- Slabaacute kyselina (pKa = 75 HClO harr ClOminus + H+)- V kyseleacutem prostřediacute se snadno rozklaacutedaacute na plynnyacute

chlorHClO + H+ + Clminus harr Cl2 + H2O

- Silneacute oxidačniacute činidlo (2HClO + 2eminus rarr Cl2)

- Reakce s Fe2+ nebo superoxidem generuje hydroxylovyacute radikaacutel

HClO + Fe2+ rarr Clndash + Fe3+ + OHmiddotHClO + O2middotndash rarr Clndash + O2 + OHmiddot

- S organickyacutemi aminy poskytuje chloraminy

R-NH2 + HClO rarr R-NH-Cl + H2O

HClO

22

Dalšiacute zbraně neutrofilů

bull Velmi uacutečinneacute proteolytickeacute enzymy elastasa kolagenasa kathepsin G gelatinasa ad

bull Lysozym štěpiacute polysacharid bakteriaacutelniacute stěny Gram+ mikrobů

bull Laktoferrin bere bakteriiacutem železobull Defensiny kationickeacute proteiny tvořiacuteciacute kanaacutely v

bakteriaacutelniacute membraacuteněbull NETs (neutrophil extracellular traps) vlaacutekna z DNA

a serinovyacutech proteas tvořenaacute extracelulaacuterně

Synergie mezi generaacutetory radikaacutelů a dalšiacutemi zbraněmi

např HClO inhibuje α1-antitrypsin

RONS ve vyacutezbroji fagocytů

iNOS je důležitaacute pro makrofaacutegy ale nevyacuteznamnaacute u lidskyacutech neutrofilů Naopak makrofaacutegy nemajiacute myeloperoxidasu

2

K čemu vlastně potřebujeme kysliacutek

Přenos elektronů (oxidace) z organickyacutech laacutetek na kysliacutek uvolňuje obrovskeacute množstviacute energie

Př Glukosa

CC66HH1212OO66 + 6 O+ 6 O22 rarrrarrrarrrarr 6 CO6 CO22 + 6 H+ 6 H22OO

∆∆∆∆∆∆∆∆GGoorsquorsquo = = ndashndash 2820 2820 kJkJ mol mol (180 g glukosy)(180 g glukosy)

Reaktivitu kysliacuteku lze naviacutec regulovat katalyacutezou přechodnyacutemi kovy (železo měď)

Hořiacute cukr

3

4

Spinovaacute restrikce kysliacutekubull Normaacutelniacute (triplet) O2 je

biradikaacutel s vysokou afinitou k elektronům

bull Ale přiacutejem elektronu vyžadujeaby jeden ze staacutevajiacuteciacutechnepaacuterovyacutech elektronů změnilsvůj spin což je relativněpomalyacute proces

bull Bez teacuteto restrikce bychom v kysliacutekateacute atmosfeacuteře planetyokamžitě shořeli

bull Singletovyacute O2 je excitovanaacute vysoce reaktivniacute forma kysliacuteku

Dyacutechaciacute řetězec vnitřniacute

mitochondriaacutelniacute membraacuteny

5

elektrony proudiacute po spaacutedu redoxniacuteho

potenciaacutelu a končiacute na kysliacuteku

celkovaacute reakce

NADH + H+ + 12 O2 rarrrarrrarrrarr NAD+ + H2O

∆∆∆∆Gorsquo = ndash21925 kJ mol-1

Zaacuteroveň s proudem elektronů se pumpujiacute protony a vzniklyacute

protonovyacute gradient pak pohaacuteniacute synteacutezu ATP

6

Reaktivniacute formy kysliacuteku (ROS bdquokysliacutekoveacute radikaacutelyldquo) lze odvodit od meziproduktů redukce kysliacuteku na vodu

O2

2H2O

+4 e-

(+4 H+)

O2middotndash

superoxid

H2O2peroxid vodiacuteku

OHmiddothydroxylovyacute

radikaacutel

+3 e-

(+3 H+)

+2 e-

(+2 H+)

+1 e-

( +H2O )

Superoxidbull Zdroje v těle

ndash Uacutenik elektronů na kysliacutek

- Dyacutechaciacute řetězec v mitochondriiacutech

- Jineacute podobneacute redoxniacute systeacutemy např mikrosomaacutelniacutecytochrom P450 monooxygenasa

ndash NAD(P)H Oxidasa

- Fagocyty (rdquorespiratory burstrdquo)

- Nefagocytaacuterniacute buňky

ndash Některeacute enzymy

- Xanthinoxidasa

- Cyklooxygenasa

- Lipoxygenasa

ndash Reakce FeII-hemoglobinu s kysliacutekem

ndash Autooxidace (reakce s kysliacutekem) různyacutech laacutetek (askorbaacutet glutathion a jineacute thioly katecholaminy)

O2middotndash

7

Produkce superoxidu v dyacutechaciacutem řetězci

bull 1-2 z celkoveacutespotřeby O2 (in vivourčitě meacuteně)

bull Uacutenik elektronů z redoxniacutech centerkomplexů I a III předevšiacutem zesemiubichinonu

Vznik superoxidu z oxyhemoglobinu

Štiacutepek S et al Antioxidanty a volneacute radikaacutely ve zdraviacute a nemoci GradaPublishing Praha 2000

8

Superoxid

bull Vlastnosti

- Nepřiacuteliš reaktivniacute oxidačniacute i redukčniacute činidlo

- Omezenaacute možnost průchodu přes membraacuteny (jenskrz aniontoveacute kanaacutely nebo ve sveacute protonovaneacuteformě)

- Uvolňuje železo z Fe-S clusterů

bull Osud

ndash Dismutace

ndash Reakce s oxidem dusnatyacutem

O2middotndash

O2middotndash + O2

middotndash + 2 H+ rarr O2 + H2O2

NO + O2middotndash rarr OONOndash (peroxynitrit)

Peroxid vodiacuteku

bull Tvorba v těle

ndash Dismutace superoxidu (spontaacutenniacute nebokatalyzovanaacute superoxiddismutasou)

ndash Přiacutemo činnostiacute některyacutech enzymůbull Xanthinoxidasa

bull Monoaminooxidasa (MAO)

H2O2

O2middotndash + O2

middotndash + 2 H+ rarr O2 + H2O2

9

Peroxid vodiacuteku

bull Vlastnosti

- Neniacute radikaacutel

- Volně prochaacuteziacute skrz biologickeacute membraacuteny

- Saacutem o sobě celkem nereaktivniacute

- Ale rychle reaguje s redukovanyacutemi přechodnyacutemi kovyjako železo a měď (Fentonova reakce)

bull Osud

ndash Fentonova reakce

ndash Bezpečneacute odstraněniacute glutathionperoxidasou peroxiredoxinem nebo katalasou

H2O2

H2O2 + Fe2+ rarr OHndash + OHmiddot + Fe3+

hydroxylovyacute radikaacutel

Hydroxylovyacute radikaacutel

bull Vznik v těle

ndash Ionisačniacute zaacuteřeniacute

ndash Fentonova reakce

bull Vlastnosti

- Extreacutemně reaktivniacute Poškozuje biomolekuly bliacutezkomiacutesta sveacuteho vzniku

OH middot

H2O2 + Fe2+ rarr OHndash + OHmiddot + Fe3+

H2O rarr H + OHmiddot

10

Reaktivniacute formy kysliacuteku(Reactive Oxygen Species ROS)

bull Radikaacutelyndash Superoxid O2 middotndash

ndash Hydroperoxyl HO2middotndash Hydroxylovyacute radikaacutel OHmiddotndash Peroxyl ROOmiddotndash Alkoxyl ROmiddot

bull Ne-radikaacutelyndash Peroxid vodiacuteku H2O2

ndash Kyselina chlornaacute HClOndash Ozoacuten O3

ndash Singletovyacute kysliacutek 1O2

Oxid dusnatyacute

bull Vznik v těle

ndash NO synthasovaacute reakce

ndash Tři různeacute NO synthasy- NOS I (neuronaacutelniacute konstitutivniacute)- NOS II (fagocyty inducibilniacute)- NOS III (endoteliaacutelniacute konstitutivniacute)

NO middot

L-Arginin + O2 + NADPH rarr L-Citrulin + NADP+ +NO

11

Oxid dusnatyacute (NO) působiacute relaxaci hladkeacuteho svalstva

ceacutevniacute stěny

Oxid dusnatyacutebull Vlastnosti- Plynnyacute radikaacutel- Reakce s hemovyacutem železem guanylaacutetcyklasy

(hellipfyziologickeacute uacutečinky relaxace hladkeacuteho svalstva atd)- Reakce s hemovyacutem železem hemoglobinu (hellipfyziologickaacute

inaktivace)

- Reakce se sulfhydrylovou skupinou glutathionu atd nanitrosothiol (helliptransport NO)

- Reakce se superoxidem na peroxynitrit a konečněhydroxylovyacute radikaacutel (helliptoxicita)

NO middot

NO + O2middotndash rarr OONOndash peroxynitrit

OONOndash + H+ rarr HOONO rarr OHmiddot + NO2

kyselina peroxydusitaacute hydroxylovyacute radikaacutel

12

Reaktivniacute formy dusiacuteku(Reactive Nitrogen Species RNS)

bull Radikaacutelyndash Oxid dusnatyacute NOndash Oxid dusičityacute NO2

bull Ne-radikaacutelyndash Nitrosonium NO+

ndash Nitroxyl NOndash

ndash Kyselina dusitaacute HNO2

ndash Oxid dusityacute N2O3

ndash Oxid dusičityacute N2O4

ndash Nitronium NO2+

ndash Peroxynitrit ONOO ndash

ndash Alkylperoxynitrit ROONO

Oxidačniacute poškozeniacute biomolekul

bull Lipidy peroxidace polynenasycenyacutechmastnyacutech kyselin v membraacutenaacutech

bull Proteiny oxidace -SH karbonylace -NH2 hydroxylacenitrosylace aromatickyacutechAMK cross-linking degradace

bull Nukleoveacute kyseliny zlomy v řetězci DNA hydroxylace basiacute mutace kancerogenese

13

Peroxidace

lipidů (žluknutiacute)

Dalšiacute osud lipoperoxidů

14

Ionizačniacute zaacuteřeniacuteHydroxylovyacute radikaacutel vznikaacute ionizaciacute vody

H2O + hν rarr H + OHmiddot

Reaktivniacute formy kysliacuteku v organismu

Jednoelektronovou redukciacute kysliacuteku (mitochondrie NADPH oxidasa) vznikaacute superoxid O2

middotndash

Dismutace superoxidu produkuje peroxid vodiacutekuO2

middotndash + O2middotndash + 2 H+ rarr O2 + H2O2

Fentonova reakce s Fe nebo Cu vytvořiacute z peroxiduhydroxylovyacute radikaacutelH2O2 + Fe2+ rarr OHndash + OHmiddot + Fe3+

Kde jsou RONS prospěšneacute

I Aktivniacute centra enzymů

bull Monooxygenasy (cytochromy P450)

bull Ribonukleotidreduktasa (hellipsynteacuteza DNA)

bull Synteacuteza prostanoidů (enzymatickaacute lipoperoxidace)

bull Užitečneacute hemoveacute peroxidasy

15

Kde jsou RONS prospěšneacute

I Aktivniacute centra enzymů

bull Monooxygenasy (cytochromy P450)

ndash Detoxikace xenobiotik synteacuteza steroidniacutech hormonů a žlučovyacutech kyselin NO synthasy

Mechanismus v podstatě řiacutezenaacute Fentonova reakce

Fe3+ + SH + 2 e- + O2 + H+ rarr FeOOH SH

FeOOH SH rarr FeO3+ SH + H2O

FeO3+ SH rarr FeOH3+Sbull rarr Fe3+SOH rarr Fe3+ + SOH

Kde jsou RONS prospěšneacute

I Aktivniacute centra enzymů

bull Monooxygenasy (cytochromy P450)

bull Ribonukleotidreduktasa (hellipsynteacuteza DNA)

bull Synteacuteza prostanoidů (enzymatickaacute lipoperoxidace)

bull Užitečneacute hemoveacute peroxidasy

ndash Thyreoperoxidasa ve štiacutetneacute žlaacuteze

Iminus + H2O2 + 2H+ rarr I+ + 2H2O I+ joduje thyreoglobulin

ndash Myeloperoxidasa neutrofilů

ndash Laktoperoxidasa v mleacuteku hlenu dyacutechaciacutech cest a ve slinaacutech

SCNminus + H2O2 rarr OSCNminus + H2O

(hypothiokyanaacutet OSCNminus je baktericidniacute)

16

Kde jsou RONS prospěšneacute

II Signalizace

bull Např oxid dusnatyacute NOndash relaxace hladkeacuteho svalstva ceacutevniacute stěny

gastrointestinaacutelniacuteho traktu corpus cavernosumpenis

ndash neurotransmitter neuromodulaacutetor v CNS funkce v synaptickeacute plasticitě učeniacute a paměti

ndash inhibice adhese a agregace trombocytů ndash inhibice adhese leukocytůndash (atd)

Superoxid stejně tak uacutečinky protichůdneacute NO

OXID DUSNATYacuteProdukovaacuten NO synthasami

Vasodilatace inhibice aktivace leukocytů inhibice agregace destiček

atd

SUPEROXIDPEROXIDProdukovaacuten NADPH oxidasami

Vasokonstrikce aktivace leukocytů agregace destiček atd

A při setkaacuteniacute se navzaacutejem zničiacute

NO + O2middotndash rarr OONOndash

17

Koncept redoxniacute signalizace

bull Redoxniacute prostřediacute buňky - přibližně daacutenopoměrem GSHGSSG a NADHNAD

bull Redoxniacute sensory na proteinechndash kritickeacute -SH skupiny

ndash Fe-S centra

bull Ciacutele redoxniacute signalizacendash transkripčniacute faktory

ndash proteinkinasy a fosfatasy

Redoxniacutesignalizace

bull Oxidačniacute stres aktivuje určiteacute protein kinasy a transkripčniacute faktory

bull Vyacuteslednyacute efekt např stimulace proliferace senescence (staacuternutiacute) buněk

bull PůsobeniacuteROSantioxidantů v buňce může byacutet velmi specifickeacute

(T Finkel amp NJ Holbrook Nature 408 (2000) 239-247)

18

hellip a velmi

komplikovaneacute

Kde jsou RONS prospěšneacute

III Fagocytoacuteza

bull Neutrofily eosinofily monocyty makrofaacutegy mikroglie

bull Často je potřeba ciacutelovou čaacutestici označit (opsonizace)

bull Uacutekolem fagocytujiacuteciacute buňky je ciacutelovou čaacutestici

ndash Rozpoznat

ndash Pohltit

ndash Zabiacutet

ndash Straacutevit

copy 1998 Garland Publishing

19

Neutrofilniacute granulocyt

(polymorfonukleaacuter)

bull Segmentovaneacute jaacutedrobull Primaacuterniacute (azurofilniacute)

granula lysozym defensiny myeloperoxidasa proteasy

bull Specifickaacute (sekundaacuterniacute) granula NADPH oxidasa kobalofilin laktoferrin lysozym kolagenasa

bull Terciaacuterniacute granula gelatinasa a dalšiacute enzymy

Obrhttpblausencom

Obr httpwalchecklabumnedu_rsrc1417821135388research-interestsneutrophil-recruitment

20

Aktivace fagocytujiacuteciacute buňky

Respiračniacute vzplanutiacute

bull Naacutehleacute zvyacutešeniacute spotřeby kysliacuteku (pro produkci superoxidu ne respiraci)

bull Naacutehleacute zvyacutešeniacute spotřeby glukosy (pro pentosovyacute cyklus ndash dodaacutevaacuteNADPH pro NADPH oxidasu)

NADPH oxidasa

bull Membraacutenovyacute enzym produkujiacuteciacute superoxid vněnebo do fagosomu

bull Katalyzuje reakci

NADPH + 2O2 rarr NADP+ + H+ + 2O2middotndash

bull V klidu latentniacute sestavuje se z 6 podjednotek na buněčneacute membraacuteně při aktivaci fagocytu

bull Nezbytnaacute pro schopnost zabiacutet některeacute pohlceneacutebakterie (hereditaacuterniacute deficit chronickaacute septickaacute

granulomatosa)

bull Takeacute na endotelu a mnoha jinyacutech nefagocytaacuterniacutech buňkaacutech

21

Myeloperoxidasa

bull 2 ndash 5 všech proteinů v neutrofilechbull Hemoprotein zodpovědnyacute za zelenou barvu

hnisubull Nespecifickaacute peroxidasa v těle katalyzuje

předevšiacutem reakciClminus + H2O2 + H+ rarr HClO + H2O

bull Deficit u lidiacute častyacute (1 na 2000-4000) a nemaacutezaacutevažneacute přiacuteznaky

Kyselina chlornaacute

- Slabaacute kyselina (pKa = 75 HClO harr ClOminus + H+)- V kyseleacutem prostřediacute se snadno rozklaacutedaacute na plynnyacute

chlorHClO + H+ + Clminus harr Cl2 + H2O

- Silneacute oxidačniacute činidlo (2HClO + 2eminus rarr Cl2)

- Reakce s Fe2+ nebo superoxidem generuje hydroxylovyacute radikaacutel

HClO + Fe2+ rarr Clndash + Fe3+ + OHmiddotHClO + O2middotndash rarr Clndash + O2 + OHmiddot

- S organickyacutemi aminy poskytuje chloraminy

R-NH2 + HClO rarr R-NH-Cl + H2O

HClO

22

Dalšiacute zbraně neutrofilů

bull Velmi uacutečinneacute proteolytickeacute enzymy elastasa kolagenasa kathepsin G gelatinasa ad

bull Lysozym štěpiacute polysacharid bakteriaacutelniacute stěny Gram+ mikrobů

bull Laktoferrin bere bakteriiacutem železobull Defensiny kationickeacute proteiny tvořiacuteciacute kanaacutely v

bakteriaacutelniacute membraacuteněbull NETs (neutrophil extracellular traps) vlaacutekna z DNA

a serinovyacutech proteas tvořenaacute extracelulaacuterně

Synergie mezi generaacutetory radikaacutelů a dalšiacutemi zbraněmi

např HClO inhibuje α1-antitrypsin

RONS ve vyacutezbroji fagocytů

iNOS je důležitaacute pro makrofaacutegy ale nevyacuteznamnaacute u lidskyacutech neutrofilů Naopak makrofaacutegy nemajiacute myeloperoxidasu

3

4

Spinovaacute restrikce kysliacutekubull Normaacutelniacute (triplet) O2 je

biradikaacutel s vysokou afinitou k elektronům

bull Ale přiacutejem elektronu vyžadujeaby jeden ze staacutevajiacuteciacutechnepaacuterovyacutech elektronů změnilsvůj spin což je relativněpomalyacute proces

bull Bez teacuteto restrikce bychom v kysliacutekateacute atmosfeacuteře planetyokamžitě shořeli

bull Singletovyacute O2 je excitovanaacute vysoce reaktivniacute forma kysliacuteku

Dyacutechaciacute řetězec vnitřniacute

mitochondriaacutelniacute membraacuteny

5

elektrony proudiacute po spaacutedu redoxniacuteho

potenciaacutelu a končiacute na kysliacuteku

celkovaacute reakce

NADH + H+ + 12 O2 rarrrarrrarrrarr NAD+ + H2O

∆∆∆∆Gorsquo = ndash21925 kJ mol-1

Zaacuteroveň s proudem elektronů se pumpujiacute protony a vzniklyacute

protonovyacute gradient pak pohaacuteniacute synteacutezu ATP

6

Reaktivniacute formy kysliacuteku (ROS bdquokysliacutekoveacute radikaacutelyldquo) lze odvodit od meziproduktů redukce kysliacuteku na vodu

O2

2H2O

+4 e-

(+4 H+)

O2middotndash

superoxid

H2O2peroxid vodiacuteku

OHmiddothydroxylovyacute

radikaacutel

+3 e-

(+3 H+)

+2 e-

(+2 H+)

+1 e-

( +H2O )

Superoxidbull Zdroje v těle

ndash Uacutenik elektronů na kysliacutek

- Dyacutechaciacute řetězec v mitochondriiacutech

- Jineacute podobneacute redoxniacute systeacutemy např mikrosomaacutelniacutecytochrom P450 monooxygenasa

ndash NAD(P)H Oxidasa

- Fagocyty (rdquorespiratory burstrdquo)

- Nefagocytaacuterniacute buňky

ndash Některeacute enzymy

- Xanthinoxidasa

- Cyklooxygenasa

- Lipoxygenasa

ndash Reakce FeII-hemoglobinu s kysliacutekem

ndash Autooxidace (reakce s kysliacutekem) různyacutech laacutetek (askorbaacutet glutathion a jineacute thioly katecholaminy)

O2middotndash

7

Produkce superoxidu v dyacutechaciacutem řetězci

bull 1-2 z celkoveacutespotřeby O2 (in vivourčitě meacuteně)

bull Uacutenik elektronů z redoxniacutech centerkomplexů I a III předevšiacutem zesemiubichinonu

Vznik superoxidu z oxyhemoglobinu

Štiacutepek S et al Antioxidanty a volneacute radikaacutely ve zdraviacute a nemoci GradaPublishing Praha 2000

8

Superoxid

bull Vlastnosti

- Nepřiacuteliš reaktivniacute oxidačniacute i redukčniacute činidlo

- Omezenaacute možnost průchodu přes membraacuteny (jenskrz aniontoveacute kanaacutely nebo ve sveacute protonovaneacuteformě)

- Uvolňuje železo z Fe-S clusterů

bull Osud

ndash Dismutace

ndash Reakce s oxidem dusnatyacutem

O2middotndash

O2middotndash + O2

middotndash + 2 H+ rarr O2 + H2O2

NO + O2middotndash rarr OONOndash (peroxynitrit)

Peroxid vodiacuteku

bull Tvorba v těle

ndash Dismutace superoxidu (spontaacutenniacute nebokatalyzovanaacute superoxiddismutasou)

ndash Přiacutemo činnostiacute některyacutech enzymůbull Xanthinoxidasa

bull Monoaminooxidasa (MAO)

H2O2

O2middotndash + O2

middotndash + 2 H+ rarr O2 + H2O2

9

Peroxid vodiacuteku

bull Vlastnosti

- Neniacute radikaacutel

- Volně prochaacuteziacute skrz biologickeacute membraacuteny

- Saacutem o sobě celkem nereaktivniacute

- Ale rychle reaguje s redukovanyacutemi přechodnyacutemi kovyjako železo a měď (Fentonova reakce)

bull Osud

ndash Fentonova reakce

ndash Bezpečneacute odstraněniacute glutathionperoxidasou peroxiredoxinem nebo katalasou

H2O2

H2O2 + Fe2+ rarr OHndash + OHmiddot + Fe3+

hydroxylovyacute radikaacutel

Hydroxylovyacute radikaacutel

bull Vznik v těle

ndash Ionisačniacute zaacuteřeniacute

ndash Fentonova reakce

bull Vlastnosti

- Extreacutemně reaktivniacute Poškozuje biomolekuly bliacutezkomiacutesta sveacuteho vzniku

OH middot

H2O2 + Fe2+ rarr OHndash + OHmiddot + Fe3+

H2O rarr H + OHmiddot

10

Reaktivniacute formy kysliacuteku(Reactive Oxygen Species ROS)

bull Radikaacutelyndash Superoxid O2 middotndash

ndash Hydroperoxyl HO2middotndash Hydroxylovyacute radikaacutel OHmiddotndash Peroxyl ROOmiddotndash Alkoxyl ROmiddot

bull Ne-radikaacutelyndash Peroxid vodiacuteku H2O2

ndash Kyselina chlornaacute HClOndash Ozoacuten O3

ndash Singletovyacute kysliacutek 1O2

Oxid dusnatyacute

bull Vznik v těle

ndash NO synthasovaacute reakce

ndash Tři různeacute NO synthasy- NOS I (neuronaacutelniacute konstitutivniacute)- NOS II (fagocyty inducibilniacute)- NOS III (endoteliaacutelniacute konstitutivniacute)

NO middot

L-Arginin + O2 + NADPH rarr L-Citrulin + NADP+ +NO

11

Oxid dusnatyacute (NO) působiacute relaxaci hladkeacuteho svalstva

ceacutevniacute stěny

Oxid dusnatyacutebull Vlastnosti- Plynnyacute radikaacutel- Reakce s hemovyacutem železem guanylaacutetcyklasy

(hellipfyziologickeacute uacutečinky relaxace hladkeacuteho svalstva atd)- Reakce s hemovyacutem železem hemoglobinu (hellipfyziologickaacute

inaktivace)

- Reakce se sulfhydrylovou skupinou glutathionu atd nanitrosothiol (helliptransport NO)

- Reakce se superoxidem na peroxynitrit a konečněhydroxylovyacute radikaacutel (helliptoxicita)

NO middot

NO + O2middotndash rarr OONOndash peroxynitrit

OONOndash + H+ rarr HOONO rarr OHmiddot + NO2

kyselina peroxydusitaacute hydroxylovyacute radikaacutel

12

Reaktivniacute formy dusiacuteku(Reactive Nitrogen Species RNS)

bull Radikaacutelyndash Oxid dusnatyacute NOndash Oxid dusičityacute NO2

bull Ne-radikaacutelyndash Nitrosonium NO+

ndash Nitroxyl NOndash

ndash Kyselina dusitaacute HNO2

ndash Oxid dusityacute N2O3

ndash Oxid dusičityacute N2O4

ndash Nitronium NO2+

ndash Peroxynitrit ONOO ndash

ndash Alkylperoxynitrit ROONO

Oxidačniacute poškozeniacute biomolekul

bull Lipidy peroxidace polynenasycenyacutechmastnyacutech kyselin v membraacutenaacutech

bull Proteiny oxidace -SH karbonylace -NH2 hydroxylacenitrosylace aromatickyacutechAMK cross-linking degradace

bull Nukleoveacute kyseliny zlomy v řetězci DNA hydroxylace basiacute mutace kancerogenese

13

Peroxidace

lipidů (žluknutiacute)

Dalšiacute osud lipoperoxidů

14

Ionizačniacute zaacuteřeniacuteHydroxylovyacute radikaacutel vznikaacute ionizaciacute vody

H2O + hν rarr H + OHmiddot

Reaktivniacute formy kysliacuteku v organismu

Jednoelektronovou redukciacute kysliacuteku (mitochondrie NADPH oxidasa) vznikaacute superoxid O2

middotndash

Dismutace superoxidu produkuje peroxid vodiacutekuO2

middotndash + O2middotndash + 2 H+ rarr O2 + H2O2

Fentonova reakce s Fe nebo Cu vytvořiacute z peroxiduhydroxylovyacute radikaacutelH2O2 + Fe2+ rarr OHndash + OHmiddot + Fe3+

Kde jsou RONS prospěšneacute

I Aktivniacute centra enzymů

bull Monooxygenasy (cytochromy P450)

bull Ribonukleotidreduktasa (hellipsynteacuteza DNA)

bull Synteacuteza prostanoidů (enzymatickaacute lipoperoxidace)

bull Užitečneacute hemoveacute peroxidasy

15

Kde jsou RONS prospěšneacute

I Aktivniacute centra enzymů

bull Monooxygenasy (cytochromy P450)

ndash Detoxikace xenobiotik synteacuteza steroidniacutech hormonů a žlučovyacutech kyselin NO synthasy

Mechanismus v podstatě řiacutezenaacute Fentonova reakce

Fe3+ + SH + 2 e- + O2 + H+ rarr FeOOH SH

FeOOH SH rarr FeO3+ SH + H2O

FeO3+ SH rarr FeOH3+Sbull rarr Fe3+SOH rarr Fe3+ + SOH

Kde jsou RONS prospěšneacute

I Aktivniacute centra enzymů

bull Monooxygenasy (cytochromy P450)

bull Ribonukleotidreduktasa (hellipsynteacuteza DNA)

bull Synteacuteza prostanoidů (enzymatickaacute lipoperoxidace)

bull Užitečneacute hemoveacute peroxidasy

ndash Thyreoperoxidasa ve štiacutetneacute žlaacuteze

Iminus + H2O2 + 2H+ rarr I+ + 2H2O I+ joduje thyreoglobulin

ndash Myeloperoxidasa neutrofilů

ndash Laktoperoxidasa v mleacuteku hlenu dyacutechaciacutech cest a ve slinaacutech

SCNminus + H2O2 rarr OSCNminus + H2O

(hypothiokyanaacutet OSCNminus je baktericidniacute)

16

Kde jsou RONS prospěšneacute

II Signalizace

bull Např oxid dusnatyacute NOndash relaxace hladkeacuteho svalstva ceacutevniacute stěny

gastrointestinaacutelniacuteho traktu corpus cavernosumpenis

ndash neurotransmitter neuromodulaacutetor v CNS funkce v synaptickeacute plasticitě učeniacute a paměti

ndash inhibice adhese a agregace trombocytů ndash inhibice adhese leukocytůndash (atd)

Superoxid stejně tak uacutečinky protichůdneacute NO

OXID DUSNATYacuteProdukovaacuten NO synthasami

Vasodilatace inhibice aktivace leukocytů inhibice agregace destiček

atd

SUPEROXIDPEROXIDProdukovaacuten NADPH oxidasami

Vasokonstrikce aktivace leukocytů agregace destiček atd

A při setkaacuteniacute se navzaacutejem zničiacute

NO + O2middotndash rarr OONOndash

17

Koncept redoxniacute signalizace

bull Redoxniacute prostřediacute buňky - přibližně daacutenopoměrem GSHGSSG a NADHNAD

bull Redoxniacute sensory na proteinechndash kritickeacute -SH skupiny

ndash Fe-S centra

bull Ciacutele redoxniacute signalizacendash transkripčniacute faktory

ndash proteinkinasy a fosfatasy

Redoxniacutesignalizace

bull Oxidačniacute stres aktivuje určiteacute protein kinasy a transkripčniacute faktory

bull Vyacuteslednyacute efekt např stimulace proliferace senescence (staacuternutiacute) buněk

bull PůsobeniacuteROSantioxidantů v buňce může byacutet velmi specifickeacute

(T Finkel amp NJ Holbrook Nature 408 (2000) 239-247)

18

hellip a velmi

komplikovaneacute

Kde jsou RONS prospěšneacute

III Fagocytoacuteza

bull Neutrofily eosinofily monocyty makrofaacutegy mikroglie

bull Často je potřeba ciacutelovou čaacutestici označit (opsonizace)

bull Uacutekolem fagocytujiacuteciacute buňky je ciacutelovou čaacutestici

ndash Rozpoznat

ndash Pohltit

ndash Zabiacutet

ndash Straacutevit

copy 1998 Garland Publishing

19

Neutrofilniacute granulocyt

(polymorfonukleaacuter)

bull Segmentovaneacute jaacutedrobull Primaacuterniacute (azurofilniacute)

granula lysozym defensiny myeloperoxidasa proteasy

bull Specifickaacute (sekundaacuterniacute) granula NADPH oxidasa kobalofilin laktoferrin lysozym kolagenasa

bull Terciaacuterniacute granula gelatinasa a dalšiacute enzymy

Obrhttpblausencom

Obr httpwalchecklabumnedu_rsrc1417821135388research-interestsneutrophil-recruitment

20

Aktivace fagocytujiacuteciacute buňky

Respiračniacute vzplanutiacute

bull Naacutehleacute zvyacutešeniacute spotřeby kysliacuteku (pro produkci superoxidu ne respiraci)

bull Naacutehleacute zvyacutešeniacute spotřeby glukosy (pro pentosovyacute cyklus ndash dodaacutevaacuteNADPH pro NADPH oxidasu)

NADPH oxidasa

bull Membraacutenovyacute enzym produkujiacuteciacute superoxid vněnebo do fagosomu

bull Katalyzuje reakci

NADPH + 2O2 rarr NADP+ + H+ + 2O2middotndash

bull V klidu latentniacute sestavuje se z 6 podjednotek na buněčneacute membraacuteně při aktivaci fagocytu

bull Nezbytnaacute pro schopnost zabiacutet některeacute pohlceneacutebakterie (hereditaacuterniacute deficit chronickaacute septickaacute

granulomatosa)

bull Takeacute na endotelu a mnoha jinyacutech nefagocytaacuterniacutech buňkaacutech

21

Myeloperoxidasa

bull 2 ndash 5 všech proteinů v neutrofilechbull Hemoprotein zodpovědnyacute za zelenou barvu

hnisubull Nespecifickaacute peroxidasa v těle katalyzuje

předevšiacutem reakciClminus + H2O2 + H+ rarr HClO + H2O

bull Deficit u lidiacute častyacute (1 na 2000-4000) a nemaacutezaacutevažneacute přiacuteznaky

Kyselina chlornaacute

- Slabaacute kyselina (pKa = 75 HClO harr ClOminus + H+)- V kyseleacutem prostřediacute se snadno rozklaacutedaacute na plynnyacute

chlorHClO + H+ + Clminus harr Cl2 + H2O

- Silneacute oxidačniacute činidlo (2HClO + 2eminus rarr Cl2)

- Reakce s Fe2+ nebo superoxidem generuje hydroxylovyacute radikaacutel

HClO + Fe2+ rarr Clndash + Fe3+ + OHmiddotHClO + O2middotndash rarr Clndash + O2 + OHmiddot

- S organickyacutemi aminy poskytuje chloraminy

R-NH2 + HClO rarr R-NH-Cl + H2O

HClO

22

Dalšiacute zbraně neutrofilů

bull Velmi uacutečinneacute proteolytickeacute enzymy elastasa kolagenasa kathepsin G gelatinasa ad

bull Lysozym štěpiacute polysacharid bakteriaacutelniacute stěny Gram+ mikrobů

bull Laktoferrin bere bakteriiacutem železobull Defensiny kationickeacute proteiny tvořiacuteciacute kanaacutely v

bakteriaacutelniacute membraacuteněbull NETs (neutrophil extracellular traps) vlaacutekna z DNA

a serinovyacutech proteas tvořenaacute extracelulaacuterně

Synergie mezi generaacutetory radikaacutelů a dalšiacutemi zbraněmi

např HClO inhibuje α1-antitrypsin

RONS ve vyacutezbroji fagocytů

iNOS je důležitaacute pro makrofaacutegy ale nevyacuteznamnaacute u lidskyacutech neutrofilů Naopak makrofaacutegy nemajiacute myeloperoxidasu

4

Spinovaacute restrikce kysliacutekubull Normaacutelniacute (triplet) O2 je

biradikaacutel s vysokou afinitou k elektronům

bull Ale přiacutejem elektronu vyžadujeaby jeden ze staacutevajiacuteciacutechnepaacuterovyacutech elektronů změnilsvůj spin což je relativněpomalyacute proces

bull Bez teacuteto restrikce bychom v kysliacutekateacute atmosfeacuteře planetyokamžitě shořeli

bull Singletovyacute O2 je excitovanaacute vysoce reaktivniacute forma kysliacuteku

Dyacutechaciacute řetězec vnitřniacute

mitochondriaacutelniacute membraacuteny

5

elektrony proudiacute po spaacutedu redoxniacuteho

potenciaacutelu a končiacute na kysliacuteku

celkovaacute reakce

NADH + H+ + 12 O2 rarrrarrrarrrarr NAD+ + H2O

∆∆∆∆Gorsquo = ndash21925 kJ mol-1

Zaacuteroveň s proudem elektronů se pumpujiacute protony a vzniklyacute

protonovyacute gradient pak pohaacuteniacute synteacutezu ATP

6

Reaktivniacute formy kysliacuteku (ROS bdquokysliacutekoveacute radikaacutelyldquo) lze odvodit od meziproduktů redukce kysliacuteku na vodu

O2

2H2O

+4 e-

(+4 H+)

O2middotndash

superoxid

H2O2peroxid vodiacuteku

OHmiddothydroxylovyacute

radikaacutel

+3 e-

(+3 H+)

+2 e-

(+2 H+)

+1 e-

( +H2O )

Superoxidbull Zdroje v těle

ndash Uacutenik elektronů na kysliacutek

- Dyacutechaciacute řetězec v mitochondriiacutech

- Jineacute podobneacute redoxniacute systeacutemy např mikrosomaacutelniacutecytochrom P450 monooxygenasa

ndash NAD(P)H Oxidasa

- Fagocyty (rdquorespiratory burstrdquo)

- Nefagocytaacuterniacute buňky

ndash Některeacute enzymy

- Xanthinoxidasa

- Cyklooxygenasa

- Lipoxygenasa

ndash Reakce FeII-hemoglobinu s kysliacutekem

ndash Autooxidace (reakce s kysliacutekem) různyacutech laacutetek (askorbaacutet glutathion a jineacute thioly katecholaminy)

O2middotndash

7

Produkce superoxidu v dyacutechaciacutem řetězci

bull 1-2 z celkoveacutespotřeby O2 (in vivourčitě meacuteně)

bull Uacutenik elektronů z redoxniacutech centerkomplexů I a III předevšiacutem zesemiubichinonu

Vznik superoxidu z oxyhemoglobinu

Štiacutepek S et al Antioxidanty a volneacute radikaacutely ve zdraviacute a nemoci GradaPublishing Praha 2000

8

Superoxid

bull Vlastnosti

- Nepřiacuteliš reaktivniacute oxidačniacute i redukčniacute činidlo

- Omezenaacute možnost průchodu přes membraacuteny (jenskrz aniontoveacute kanaacutely nebo ve sveacute protonovaneacuteformě)

- Uvolňuje železo z Fe-S clusterů

bull Osud

ndash Dismutace

ndash Reakce s oxidem dusnatyacutem

O2middotndash

O2middotndash + O2

middotndash + 2 H+ rarr O2 + H2O2

NO + O2middotndash rarr OONOndash (peroxynitrit)

Peroxid vodiacuteku

bull Tvorba v těle

ndash Dismutace superoxidu (spontaacutenniacute nebokatalyzovanaacute superoxiddismutasou)

ndash Přiacutemo činnostiacute některyacutech enzymůbull Xanthinoxidasa

bull Monoaminooxidasa (MAO)

H2O2

O2middotndash + O2

middotndash + 2 H+ rarr O2 + H2O2

9

Peroxid vodiacuteku

bull Vlastnosti

- Neniacute radikaacutel

- Volně prochaacuteziacute skrz biologickeacute membraacuteny

- Saacutem o sobě celkem nereaktivniacute

- Ale rychle reaguje s redukovanyacutemi přechodnyacutemi kovyjako železo a měď (Fentonova reakce)

bull Osud

ndash Fentonova reakce

ndash Bezpečneacute odstraněniacute glutathionperoxidasou peroxiredoxinem nebo katalasou

H2O2

H2O2 + Fe2+ rarr OHndash + OHmiddot + Fe3+

hydroxylovyacute radikaacutel

Hydroxylovyacute radikaacutel

bull Vznik v těle

ndash Ionisačniacute zaacuteřeniacute

ndash Fentonova reakce

bull Vlastnosti

- Extreacutemně reaktivniacute Poškozuje biomolekuly bliacutezkomiacutesta sveacuteho vzniku

OH middot

H2O2 + Fe2+ rarr OHndash + OHmiddot + Fe3+

H2O rarr H + OHmiddot

10

Reaktivniacute formy kysliacuteku(Reactive Oxygen Species ROS)

bull Radikaacutelyndash Superoxid O2 middotndash

ndash Hydroperoxyl HO2middotndash Hydroxylovyacute radikaacutel OHmiddotndash Peroxyl ROOmiddotndash Alkoxyl ROmiddot

bull Ne-radikaacutelyndash Peroxid vodiacuteku H2O2

ndash Kyselina chlornaacute HClOndash Ozoacuten O3

ndash Singletovyacute kysliacutek 1O2

Oxid dusnatyacute

bull Vznik v těle

ndash NO synthasovaacute reakce

ndash Tři různeacute NO synthasy- NOS I (neuronaacutelniacute konstitutivniacute)- NOS II (fagocyty inducibilniacute)- NOS III (endoteliaacutelniacute konstitutivniacute)

NO middot

L-Arginin + O2 + NADPH rarr L-Citrulin + NADP+ +NO

11

Oxid dusnatyacute (NO) působiacute relaxaci hladkeacuteho svalstva

ceacutevniacute stěny

Oxid dusnatyacutebull Vlastnosti- Plynnyacute radikaacutel- Reakce s hemovyacutem železem guanylaacutetcyklasy

(hellipfyziologickeacute uacutečinky relaxace hladkeacuteho svalstva atd)- Reakce s hemovyacutem železem hemoglobinu (hellipfyziologickaacute

inaktivace)

- Reakce se sulfhydrylovou skupinou glutathionu atd nanitrosothiol (helliptransport NO)

- Reakce se superoxidem na peroxynitrit a konečněhydroxylovyacute radikaacutel (helliptoxicita)

NO middot

NO + O2middotndash rarr OONOndash peroxynitrit

OONOndash + H+ rarr HOONO rarr OHmiddot + NO2

kyselina peroxydusitaacute hydroxylovyacute radikaacutel

12

Reaktivniacute formy dusiacuteku(Reactive Nitrogen Species RNS)

bull Radikaacutelyndash Oxid dusnatyacute NOndash Oxid dusičityacute NO2

bull Ne-radikaacutelyndash Nitrosonium NO+

ndash Nitroxyl NOndash

ndash Kyselina dusitaacute HNO2

ndash Oxid dusityacute N2O3

ndash Oxid dusičityacute N2O4

ndash Nitronium NO2+

ndash Peroxynitrit ONOO ndash

ndash Alkylperoxynitrit ROONO

Oxidačniacute poškozeniacute biomolekul

bull Lipidy peroxidace polynenasycenyacutechmastnyacutech kyselin v membraacutenaacutech

bull Proteiny oxidace -SH karbonylace -NH2 hydroxylacenitrosylace aromatickyacutechAMK cross-linking degradace

bull Nukleoveacute kyseliny zlomy v řetězci DNA hydroxylace basiacute mutace kancerogenese

13

Peroxidace

lipidů (žluknutiacute)

Dalšiacute osud lipoperoxidů

14

Ionizačniacute zaacuteřeniacuteHydroxylovyacute radikaacutel vznikaacute ionizaciacute vody

H2O + hν rarr H + OHmiddot

Reaktivniacute formy kysliacuteku v organismu

Jednoelektronovou redukciacute kysliacuteku (mitochondrie NADPH oxidasa) vznikaacute superoxid O2

middotndash

Dismutace superoxidu produkuje peroxid vodiacutekuO2

middotndash + O2middotndash + 2 H+ rarr O2 + H2O2

Fentonova reakce s Fe nebo Cu vytvořiacute z peroxiduhydroxylovyacute radikaacutelH2O2 + Fe2+ rarr OHndash + OHmiddot + Fe3+

Kde jsou RONS prospěšneacute

I Aktivniacute centra enzymů

bull Monooxygenasy (cytochromy P450)

bull Ribonukleotidreduktasa (hellipsynteacuteza DNA)

bull Synteacuteza prostanoidů (enzymatickaacute lipoperoxidace)

bull Užitečneacute hemoveacute peroxidasy

15

Kde jsou RONS prospěšneacute

I Aktivniacute centra enzymů

bull Monooxygenasy (cytochromy P450)

ndash Detoxikace xenobiotik synteacuteza steroidniacutech hormonů a žlučovyacutech kyselin NO synthasy

Mechanismus v podstatě řiacutezenaacute Fentonova reakce

Fe3+ + SH + 2 e- + O2 + H+ rarr FeOOH SH

FeOOH SH rarr FeO3+ SH + H2O

FeO3+ SH rarr FeOH3+Sbull rarr Fe3+SOH rarr Fe3+ + SOH

Kde jsou RONS prospěšneacute

I Aktivniacute centra enzymů

bull Monooxygenasy (cytochromy P450)

bull Ribonukleotidreduktasa (hellipsynteacuteza DNA)

bull Synteacuteza prostanoidů (enzymatickaacute lipoperoxidace)

bull Užitečneacute hemoveacute peroxidasy

ndash Thyreoperoxidasa ve štiacutetneacute žlaacuteze

Iminus + H2O2 + 2H+ rarr I+ + 2H2O I+ joduje thyreoglobulin

ndash Myeloperoxidasa neutrofilů

ndash Laktoperoxidasa v mleacuteku hlenu dyacutechaciacutech cest a ve slinaacutech

SCNminus + H2O2 rarr OSCNminus + H2O

(hypothiokyanaacutet OSCNminus je baktericidniacute)

16

Kde jsou RONS prospěšneacute

II Signalizace

bull Např oxid dusnatyacute NOndash relaxace hladkeacuteho svalstva ceacutevniacute stěny

gastrointestinaacutelniacuteho traktu corpus cavernosumpenis

ndash neurotransmitter neuromodulaacutetor v CNS funkce v synaptickeacute plasticitě učeniacute a paměti

ndash inhibice adhese a agregace trombocytů ndash inhibice adhese leukocytůndash (atd)

Superoxid stejně tak uacutečinky protichůdneacute NO

OXID DUSNATYacuteProdukovaacuten NO synthasami

Vasodilatace inhibice aktivace leukocytů inhibice agregace destiček

atd

SUPEROXIDPEROXIDProdukovaacuten NADPH oxidasami

Vasokonstrikce aktivace leukocytů agregace destiček atd

A při setkaacuteniacute se navzaacutejem zničiacute

NO + O2middotndash rarr OONOndash

17

Koncept redoxniacute signalizace

bull Redoxniacute prostřediacute buňky - přibližně daacutenopoměrem GSHGSSG a NADHNAD

bull Redoxniacute sensory na proteinechndash kritickeacute -SH skupiny

ndash Fe-S centra

bull Ciacutele redoxniacute signalizacendash transkripčniacute faktory

ndash proteinkinasy a fosfatasy

Redoxniacutesignalizace

bull Oxidačniacute stres aktivuje určiteacute protein kinasy a transkripčniacute faktory

bull Vyacuteslednyacute efekt např stimulace proliferace senescence (staacuternutiacute) buněk

bull PůsobeniacuteROSantioxidantů v buňce může byacutet velmi specifickeacute

(T Finkel amp NJ Holbrook Nature 408 (2000) 239-247)

18

hellip a velmi

komplikovaneacute

Kde jsou RONS prospěšneacute

III Fagocytoacuteza

bull Neutrofily eosinofily monocyty makrofaacutegy mikroglie

bull Často je potřeba ciacutelovou čaacutestici označit (opsonizace)

bull Uacutekolem fagocytujiacuteciacute buňky je ciacutelovou čaacutestici

ndash Rozpoznat

ndash Pohltit

ndash Zabiacutet

ndash Straacutevit

copy 1998 Garland Publishing

19

Neutrofilniacute granulocyt

(polymorfonukleaacuter)

bull Segmentovaneacute jaacutedrobull Primaacuterniacute (azurofilniacute)

granula lysozym defensiny myeloperoxidasa proteasy

bull Specifickaacute (sekundaacuterniacute) granula NADPH oxidasa kobalofilin laktoferrin lysozym kolagenasa

bull Terciaacuterniacute granula gelatinasa a dalšiacute enzymy

Obrhttpblausencom

Obr httpwalchecklabumnedu_rsrc1417821135388research-interestsneutrophil-recruitment

20

Aktivace fagocytujiacuteciacute buňky

Respiračniacute vzplanutiacute

bull Naacutehleacute zvyacutešeniacute spotřeby kysliacuteku (pro produkci superoxidu ne respiraci)

bull Naacutehleacute zvyacutešeniacute spotřeby glukosy (pro pentosovyacute cyklus ndash dodaacutevaacuteNADPH pro NADPH oxidasu)

NADPH oxidasa

bull Membraacutenovyacute enzym produkujiacuteciacute superoxid vněnebo do fagosomu

bull Katalyzuje reakci

NADPH + 2O2 rarr NADP+ + H+ + 2O2middotndash

bull V klidu latentniacute sestavuje se z 6 podjednotek na buněčneacute membraacuteně při aktivaci fagocytu

bull Nezbytnaacute pro schopnost zabiacutet některeacute pohlceneacutebakterie (hereditaacuterniacute deficit chronickaacute septickaacute

granulomatosa)

bull Takeacute na endotelu a mnoha jinyacutech nefagocytaacuterniacutech buňkaacutech

21

Myeloperoxidasa

bull 2 ndash 5 všech proteinů v neutrofilechbull Hemoprotein zodpovědnyacute za zelenou barvu

hnisubull Nespecifickaacute peroxidasa v těle katalyzuje

předevšiacutem reakciClminus + H2O2 + H+ rarr HClO + H2O

bull Deficit u lidiacute častyacute (1 na 2000-4000) a nemaacutezaacutevažneacute přiacuteznaky

Kyselina chlornaacute

- Slabaacute kyselina (pKa = 75 HClO harr ClOminus + H+)- V kyseleacutem prostřediacute se snadno rozklaacutedaacute na plynnyacute

chlorHClO + H+ + Clminus harr Cl2 + H2O

- Silneacute oxidačniacute činidlo (2HClO + 2eminus rarr Cl2)

- Reakce s Fe2+ nebo superoxidem generuje hydroxylovyacute radikaacutel

HClO + Fe2+ rarr Clndash + Fe3+ + OHmiddotHClO + O2middotndash rarr Clndash + O2 + OHmiddot

- S organickyacutemi aminy poskytuje chloraminy

R-NH2 + HClO rarr R-NH-Cl + H2O

HClO

22

Dalšiacute zbraně neutrofilů

bull Velmi uacutečinneacute proteolytickeacute enzymy elastasa kolagenasa kathepsin G gelatinasa ad

bull Lysozym štěpiacute polysacharid bakteriaacutelniacute stěny Gram+ mikrobů

bull Laktoferrin bere bakteriiacutem železobull Defensiny kationickeacute proteiny tvořiacuteciacute kanaacutely v

bakteriaacutelniacute membraacuteněbull NETs (neutrophil extracellular traps) vlaacutekna z DNA

a serinovyacutech proteas tvořenaacute extracelulaacuterně

Synergie mezi generaacutetory radikaacutelů a dalšiacutemi zbraněmi

např HClO inhibuje α1-antitrypsin

RONS ve vyacutezbroji fagocytů

iNOS je důležitaacute pro makrofaacutegy ale nevyacuteznamnaacute u lidskyacutech neutrofilů Naopak makrofaacutegy nemajiacute myeloperoxidasu

5

elektrony proudiacute po spaacutedu redoxniacuteho

potenciaacutelu a končiacute na kysliacuteku

celkovaacute reakce

NADH + H+ + 12 O2 rarrrarrrarrrarr NAD+ + H2O

∆∆∆∆Gorsquo = ndash21925 kJ mol-1

Zaacuteroveň s proudem elektronů se pumpujiacute protony a vzniklyacute

protonovyacute gradient pak pohaacuteniacute synteacutezu ATP

6

Reaktivniacute formy kysliacuteku (ROS bdquokysliacutekoveacute radikaacutelyldquo) lze odvodit od meziproduktů redukce kysliacuteku na vodu

O2

2H2O

+4 e-

(+4 H+)

O2middotndash

superoxid

H2O2peroxid vodiacuteku

OHmiddothydroxylovyacute

radikaacutel

+3 e-

(+3 H+)

+2 e-

(+2 H+)

+1 e-

( +H2O )

Superoxidbull Zdroje v těle

ndash Uacutenik elektronů na kysliacutek

- Dyacutechaciacute řetězec v mitochondriiacutech

- Jineacute podobneacute redoxniacute systeacutemy např mikrosomaacutelniacutecytochrom P450 monooxygenasa

ndash NAD(P)H Oxidasa

- Fagocyty (rdquorespiratory burstrdquo)

- Nefagocytaacuterniacute buňky

ndash Některeacute enzymy

- Xanthinoxidasa

- Cyklooxygenasa

- Lipoxygenasa

ndash Reakce FeII-hemoglobinu s kysliacutekem

ndash Autooxidace (reakce s kysliacutekem) různyacutech laacutetek (askorbaacutet glutathion a jineacute thioly katecholaminy)

O2middotndash

7

Produkce superoxidu v dyacutechaciacutem řetězci

bull 1-2 z celkoveacutespotřeby O2 (in vivourčitě meacuteně)

bull Uacutenik elektronů z redoxniacutech centerkomplexů I a III předevšiacutem zesemiubichinonu

Vznik superoxidu z oxyhemoglobinu

Štiacutepek S et al Antioxidanty a volneacute radikaacutely ve zdraviacute a nemoci GradaPublishing Praha 2000

8

Superoxid

bull Vlastnosti

- Nepřiacuteliš reaktivniacute oxidačniacute i redukčniacute činidlo

- Omezenaacute možnost průchodu přes membraacuteny (jenskrz aniontoveacute kanaacutely nebo ve sveacute protonovaneacuteformě)

- Uvolňuje železo z Fe-S clusterů

bull Osud

ndash Dismutace

ndash Reakce s oxidem dusnatyacutem

O2middotndash

O2middotndash + O2

middotndash + 2 H+ rarr O2 + H2O2

NO + O2middotndash rarr OONOndash (peroxynitrit)

Peroxid vodiacuteku

bull Tvorba v těle

ndash Dismutace superoxidu (spontaacutenniacute nebokatalyzovanaacute superoxiddismutasou)

ndash Přiacutemo činnostiacute některyacutech enzymůbull Xanthinoxidasa

bull Monoaminooxidasa (MAO)

H2O2

O2middotndash + O2

middotndash + 2 H+ rarr O2 + H2O2

9

Peroxid vodiacuteku

bull Vlastnosti

- Neniacute radikaacutel

- Volně prochaacuteziacute skrz biologickeacute membraacuteny

- Saacutem o sobě celkem nereaktivniacute

- Ale rychle reaguje s redukovanyacutemi přechodnyacutemi kovyjako železo a měď (Fentonova reakce)

bull Osud

ndash Fentonova reakce

ndash Bezpečneacute odstraněniacute glutathionperoxidasou peroxiredoxinem nebo katalasou

H2O2

H2O2 + Fe2+ rarr OHndash + OHmiddot + Fe3+

hydroxylovyacute radikaacutel

Hydroxylovyacute radikaacutel

bull Vznik v těle

ndash Ionisačniacute zaacuteřeniacute

ndash Fentonova reakce

bull Vlastnosti

- Extreacutemně reaktivniacute Poškozuje biomolekuly bliacutezkomiacutesta sveacuteho vzniku

OH middot

H2O2 + Fe2+ rarr OHndash + OHmiddot + Fe3+

H2O rarr H + OHmiddot

10

Reaktivniacute formy kysliacuteku(Reactive Oxygen Species ROS)

bull Radikaacutelyndash Superoxid O2 middotndash

ndash Hydroperoxyl HO2middotndash Hydroxylovyacute radikaacutel OHmiddotndash Peroxyl ROOmiddotndash Alkoxyl ROmiddot

bull Ne-radikaacutelyndash Peroxid vodiacuteku H2O2

ndash Kyselina chlornaacute HClOndash Ozoacuten O3

ndash Singletovyacute kysliacutek 1O2

Oxid dusnatyacute

bull Vznik v těle

ndash NO synthasovaacute reakce

ndash Tři různeacute NO synthasy- NOS I (neuronaacutelniacute konstitutivniacute)- NOS II (fagocyty inducibilniacute)- NOS III (endoteliaacutelniacute konstitutivniacute)

NO middot

L-Arginin + O2 + NADPH rarr L-Citrulin + NADP+ +NO

11

Oxid dusnatyacute (NO) působiacute relaxaci hladkeacuteho svalstva

ceacutevniacute stěny

Oxid dusnatyacutebull Vlastnosti- Plynnyacute radikaacutel- Reakce s hemovyacutem železem guanylaacutetcyklasy

(hellipfyziologickeacute uacutečinky relaxace hladkeacuteho svalstva atd)- Reakce s hemovyacutem železem hemoglobinu (hellipfyziologickaacute

inaktivace)

- Reakce se sulfhydrylovou skupinou glutathionu atd nanitrosothiol (helliptransport NO)

- Reakce se superoxidem na peroxynitrit a konečněhydroxylovyacute radikaacutel (helliptoxicita)

NO middot

NO + O2middotndash rarr OONOndash peroxynitrit

OONOndash + H+ rarr HOONO rarr OHmiddot + NO2

kyselina peroxydusitaacute hydroxylovyacute radikaacutel

12

Reaktivniacute formy dusiacuteku(Reactive Nitrogen Species RNS)

bull Radikaacutelyndash Oxid dusnatyacute NOndash Oxid dusičityacute NO2

bull Ne-radikaacutelyndash Nitrosonium NO+

ndash Nitroxyl NOndash

ndash Kyselina dusitaacute HNO2

ndash Oxid dusityacute N2O3

ndash Oxid dusičityacute N2O4

ndash Nitronium NO2+

ndash Peroxynitrit ONOO ndash

ndash Alkylperoxynitrit ROONO

Oxidačniacute poškozeniacute biomolekul

bull Lipidy peroxidace polynenasycenyacutechmastnyacutech kyselin v membraacutenaacutech

bull Proteiny oxidace -SH karbonylace -NH2 hydroxylacenitrosylace aromatickyacutechAMK cross-linking degradace

bull Nukleoveacute kyseliny zlomy v řetězci DNA hydroxylace basiacute mutace kancerogenese

13

Peroxidace

lipidů (žluknutiacute)

Dalšiacute osud lipoperoxidů

14

Ionizačniacute zaacuteřeniacuteHydroxylovyacute radikaacutel vznikaacute ionizaciacute vody

H2O + hν rarr H + OHmiddot

Reaktivniacute formy kysliacuteku v organismu

Jednoelektronovou redukciacute kysliacuteku (mitochondrie NADPH oxidasa) vznikaacute superoxid O2

middotndash

Dismutace superoxidu produkuje peroxid vodiacutekuO2

middotndash + O2middotndash + 2 H+ rarr O2 + H2O2

Fentonova reakce s Fe nebo Cu vytvořiacute z peroxiduhydroxylovyacute radikaacutelH2O2 + Fe2+ rarr OHndash + OHmiddot + Fe3+

Kde jsou RONS prospěšneacute

I Aktivniacute centra enzymů

bull Monooxygenasy (cytochromy P450)

bull Ribonukleotidreduktasa (hellipsynteacuteza DNA)

bull Synteacuteza prostanoidů (enzymatickaacute lipoperoxidace)

bull Užitečneacute hemoveacute peroxidasy

15

Kde jsou RONS prospěšneacute

I Aktivniacute centra enzymů

bull Monooxygenasy (cytochromy P450)

ndash Detoxikace xenobiotik synteacuteza steroidniacutech hormonů a žlučovyacutech kyselin NO synthasy

Mechanismus v podstatě řiacutezenaacute Fentonova reakce

Fe3+ + SH + 2 e- + O2 + H+ rarr FeOOH SH

FeOOH SH rarr FeO3+ SH + H2O

FeO3+ SH rarr FeOH3+Sbull rarr Fe3+SOH rarr Fe3+ + SOH

Kde jsou RONS prospěšneacute

I Aktivniacute centra enzymů

bull Monooxygenasy (cytochromy P450)

bull Ribonukleotidreduktasa (hellipsynteacuteza DNA)

bull Synteacuteza prostanoidů (enzymatickaacute lipoperoxidace)

bull Užitečneacute hemoveacute peroxidasy

ndash Thyreoperoxidasa ve štiacutetneacute žlaacuteze

Iminus + H2O2 + 2H+ rarr I+ + 2H2O I+ joduje thyreoglobulin

ndash Myeloperoxidasa neutrofilů

ndash Laktoperoxidasa v mleacuteku hlenu dyacutechaciacutech cest a ve slinaacutech

SCNminus + H2O2 rarr OSCNminus + H2O

(hypothiokyanaacutet OSCNminus je baktericidniacute)

16

Kde jsou RONS prospěšneacute

II Signalizace

bull Např oxid dusnatyacute NOndash relaxace hladkeacuteho svalstva ceacutevniacute stěny

gastrointestinaacutelniacuteho traktu corpus cavernosumpenis

ndash neurotransmitter neuromodulaacutetor v CNS funkce v synaptickeacute plasticitě učeniacute a paměti

ndash inhibice adhese a agregace trombocytů ndash inhibice adhese leukocytůndash (atd)

Superoxid stejně tak uacutečinky protichůdneacute NO

OXID DUSNATYacuteProdukovaacuten NO synthasami

Vasodilatace inhibice aktivace leukocytů inhibice agregace destiček

atd

SUPEROXIDPEROXIDProdukovaacuten NADPH oxidasami

Vasokonstrikce aktivace leukocytů agregace destiček atd

A při setkaacuteniacute se navzaacutejem zničiacute

NO + O2middotndash rarr OONOndash

17

Koncept redoxniacute signalizace

bull Redoxniacute prostřediacute buňky - přibližně daacutenopoměrem GSHGSSG a NADHNAD

bull Redoxniacute sensory na proteinechndash kritickeacute -SH skupiny

ndash Fe-S centra

bull Ciacutele redoxniacute signalizacendash transkripčniacute faktory

ndash proteinkinasy a fosfatasy

Redoxniacutesignalizace

bull Oxidačniacute stres aktivuje určiteacute protein kinasy a transkripčniacute faktory

bull Vyacuteslednyacute efekt např stimulace proliferace senescence (staacuternutiacute) buněk

bull PůsobeniacuteROSantioxidantů v buňce může byacutet velmi specifickeacute

(T Finkel amp NJ Holbrook Nature 408 (2000) 239-247)

18

hellip a velmi

komplikovaneacute

Kde jsou RONS prospěšneacute

III Fagocytoacuteza

bull Neutrofily eosinofily monocyty makrofaacutegy mikroglie

bull Často je potřeba ciacutelovou čaacutestici označit (opsonizace)

bull Uacutekolem fagocytujiacuteciacute buňky je ciacutelovou čaacutestici

ndash Rozpoznat

ndash Pohltit

ndash Zabiacutet

ndash Straacutevit

copy 1998 Garland Publishing

19

Neutrofilniacute granulocyt

(polymorfonukleaacuter)

bull Segmentovaneacute jaacutedrobull Primaacuterniacute (azurofilniacute)

granula lysozym defensiny myeloperoxidasa proteasy

bull Specifickaacute (sekundaacuterniacute) granula NADPH oxidasa kobalofilin laktoferrin lysozym kolagenasa

bull Terciaacuterniacute granula gelatinasa a dalšiacute enzymy

Obrhttpblausencom

Obr httpwalchecklabumnedu_rsrc1417821135388research-interestsneutrophil-recruitment

20

Aktivace fagocytujiacuteciacute buňky

Respiračniacute vzplanutiacute

bull Naacutehleacute zvyacutešeniacute spotřeby kysliacuteku (pro produkci superoxidu ne respiraci)

bull Naacutehleacute zvyacutešeniacute spotřeby glukosy (pro pentosovyacute cyklus ndash dodaacutevaacuteNADPH pro NADPH oxidasu)

NADPH oxidasa

bull Membraacutenovyacute enzym produkujiacuteciacute superoxid vněnebo do fagosomu

bull Katalyzuje reakci

NADPH + 2O2 rarr NADP+ + H+ + 2O2middotndash

bull V klidu latentniacute sestavuje se z 6 podjednotek na buněčneacute membraacuteně při aktivaci fagocytu

bull Nezbytnaacute pro schopnost zabiacutet některeacute pohlceneacutebakterie (hereditaacuterniacute deficit chronickaacute septickaacute

granulomatosa)

bull Takeacute na endotelu a mnoha jinyacutech nefagocytaacuterniacutech buňkaacutech

21

Myeloperoxidasa

bull 2 ndash 5 všech proteinů v neutrofilechbull Hemoprotein zodpovědnyacute za zelenou barvu

hnisubull Nespecifickaacute peroxidasa v těle katalyzuje

předevšiacutem reakciClminus + H2O2 + H+ rarr HClO + H2O

bull Deficit u lidiacute častyacute (1 na 2000-4000) a nemaacutezaacutevažneacute přiacuteznaky

Kyselina chlornaacute

- Slabaacute kyselina (pKa = 75 HClO harr ClOminus + H+)- V kyseleacutem prostřediacute se snadno rozklaacutedaacute na plynnyacute

chlorHClO + H+ + Clminus harr Cl2 + H2O

- Silneacute oxidačniacute činidlo (2HClO + 2eminus rarr Cl2)

- Reakce s Fe2+ nebo superoxidem generuje hydroxylovyacute radikaacutel

HClO + Fe2+ rarr Clndash + Fe3+ + OHmiddotHClO + O2middotndash rarr Clndash + O2 + OHmiddot

- S organickyacutemi aminy poskytuje chloraminy

R-NH2 + HClO rarr R-NH-Cl + H2O

HClO

22

Dalšiacute zbraně neutrofilů

bull Velmi uacutečinneacute proteolytickeacute enzymy elastasa kolagenasa kathepsin G gelatinasa ad

bull Lysozym štěpiacute polysacharid bakteriaacutelniacute stěny Gram+ mikrobů

bull Laktoferrin bere bakteriiacutem železobull Defensiny kationickeacute proteiny tvořiacuteciacute kanaacutely v

bakteriaacutelniacute membraacuteněbull NETs (neutrophil extracellular traps) vlaacutekna z DNA

a serinovyacutech proteas tvořenaacute extracelulaacuterně

Synergie mezi generaacutetory radikaacutelů a dalšiacutemi zbraněmi

např HClO inhibuje α1-antitrypsin

RONS ve vyacutezbroji fagocytů

iNOS je důležitaacute pro makrofaacutegy ale nevyacuteznamnaacute u lidskyacutech neutrofilů Naopak makrofaacutegy nemajiacute myeloperoxidasu

6

Reaktivniacute formy kysliacuteku (ROS bdquokysliacutekoveacute radikaacutelyldquo) lze odvodit od meziproduktů redukce kysliacuteku na vodu

O2

2H2O

+4 e-

(+4 H+)

O2middotndash

superoxid

H2O2peroxid vodiacuteku

OHmiddothydroxylovyacute

radikaacutel

+3 e-

(+3 H+)

+2 e-

(+2 H+)

+1 e-

( +H2O )

Superoxidbull Zdroje v těle

ndash Uacutenik elektronů na kysliacutek

- Dyacutechaciacute řetězec v mitochondriiacutech

- Jineacute podobneacute redoxniacute systeacutemy např mikrosomaacutelniacutecytochrom P450 monooxygenasa

ndash NAD(P)H Oxidasa

- Fagocyty (rdquorespiratory burstrdquo)

- Nefagocytaacuterniacute buňky

ndash Některeacute enzymy

- Xanthinoxidasa

- Cyklooxygenasa

- Lipoxygenasa

ndash Reakce FeII-hemoglobinu s kysliacutekem

ndash Autooxidace (reakce s kysliacutekem) různyacutech laacutetek (askorbaacutet glutathion a jineacute thioly katecholaminy)

O2middotndash

7

Produkce superoxidu v dyacutechaciacutem řetězci

bull 1-2 z celkoveacutespotřeby O2 (in vivourčitě meacuteně)

bull Uacutenik elektronů z redoxniacutech centerkomplexů I a III předevšiacutem zesemiubichinonu

Vznik superoxidu z oxyhemoglobinu

Štiacutepek S et al Antioxidanty a volneacute radikaacutely ve zdraviacute a nemoci GradaPublishing Praha 2000

8

Superoxid

bull Vlastnosti

- Nepřiacuteliš reaktivniacute oxidačniacute i redukčniacute činidlo

- Omezenaacute možnost průchodu přes membraacuteny (jenskrz aniontoveacute kanaacutely nebo ve sveacute protonovaneacuteformě)

- Uvolňuje železo z Fe-S clusterů

bull Osud

ndash Dismutace

ndash Reakce s oxidem dusnatyacutem

O2middotndash

O2middotndash + O2

middotndash + 2 H+ rarr O2 + H2O2

NO + O2middotndash rarr OONOndash (peroxynitrit)

Peroxid vodiacuteku

bull Tvorba v těle

ndash Dismutace superoxidu (spontaacutenniacute nebokatalyzovanaacute superoxiddismutasou)

ndash Přiacutemo činnostiacute některyacutech enzymůbull Xanthinoxidasa

bull Monoaminooxidasa (MAO)

H2O2

O2middotndash + O2

middotndash + 2 H+ rarr O2 + H2O2

9

Peroxid vodiacuteku

bull Vlastnosti

- Neniacute radikaacutel

- Volně prochaacuteziacute skrz biologickeacute membraacuteny

- Saacutem o sobě celkem nereaktivniacute

- Ale rychle reaguje s redukovanyacutemi přechodnyacutemi kovyjako železo a měď (Fentonova reakce)

bull Osud

ndash Fentonova reakce

ndash Bezpečneacute odstraněniacute glutathionperoxidasou peroxiredoxinem nebo katalasou

H2O2

H2O2 + Fe2+ rarr OHndash + OHmiddot + Fe3+

hydroxylovyacute radikaacutel

Hydroxylovyacute radikaacutel

bull Vznik v těle

ndash Ionisačniacute zaacuteřeniacute

ndash Fentonova reakce

bull Vlastnosti

- Extreacutemně reaktivniacute Poškozuje biomolekuly bliacutezkomiacutesta sveacuteho vzniku

OH middot

H2O2 + Fe2+ rarr OHndash + OHmiddot + Fe3+

H2O rarr H + OHmiddot

10

Reaktivniacute formy kysliacuteku(Reactive Oxygen Species ROS)

bull Radikaacutelyndash Superoxid O2 middotndash

ndash Hydroperoxyl HO2middotndash Hydroxylovyacute radikaacutel OHmiddotndash Peroxyl ROOmiddotndash Alkoxyl ROmiddot

bull Ne-radikaacutelyndash Peroxid vodiacuteku H2O2

ndash Kyselina chlornaacute HClOndash Ozoacuten O3

ndash Singletovyacute kysliacutek 1O2

Oxid dusnatyacute

bull Vznik v těle

ndash NO synthasovaacute reakce

ndash Tři různeacute NO synthasy- NOS I (neuronaacutelniacute konstitutivniacute)- NOS II (fagocyty inducibilniacute)- NOS III (endoteliaacutelniacute konstitutivniacute)

NO middot

L-Arginin + O2 + NADPH rarr L-Citrulin + NADP+ +NO

11

Oxid dusnatyacute (NO) působiacute relaxaci hladkeacuteho svalstva

ceacutevniacute stěny

Oxid dusnatyacutebull Vlastnosti- Plynnyacute radikaacutel- Reakce s hemovyacutem železem guanylaacutetcyklasy

(hellipfyziologickeacute uacutečinky relaxace hladkeacuteho svalstva atd)- Reakce s hemovyacutem železem hemoglobinu (hellipfyziologickaacute

inaktivace)

- Reakce se sulfhydrylovou skupinou glutathionu atd nanitrosothiol (helliptransport NO)

- Reakce se superoxidem na peroxynitrit a konečněhydroxylovyacute radikaacutel (helliptoxicita)

NO middot

NO + O2middotndash rarr OONOndash peroxynitrit

OONOndash + H+ rarr HOONO rarr OHmiddot + NO2

kyselina peroxydusitaacute hydroxylovyacute radikaacutel

12

Reaktivniacute formy dusiacuteku(Reactive Nitrogen Species RNS)

bull Radikaacutelyndash Oxid dusnatyacute NOndash Oxid dusičityacute NO2

bull Ne-radikaacutelyndash Nitrosonium NO+

ndash Nitroxyl NOndash

ndash Kyselina dusitaacute HNO2

ndash Oxid dusityacute N2O3

ndash Oxid dusičityacute N2O4

ndash Nitronium NO2+

ndash Peroxynitrit ONOO ndash

ndash Alkylperoxynitrit ROONO

Oxidačniacute poškozeniacute biomolekul

bull Lipidy peroxidace polynenasycenyacutechmastnyacutech kyselin v membraacutenaacutech

bull Proteiny oxidace -SH karbonylace -NH2 hydroxylacenitrosylace aromatickyacutechAMK cross-linking degradace

bull Nukleoveacute kyseliny zlomy v řetězci DNA hydroxylace basiacute mutace kancerogenese

13

Peroxidace

lipidů (žluknutiacute)

Dalšiacute osud lipoperoxidů

14

Ionizačniacute zaacuteřeniacuteHydroxylovyacute radikaacutel vznikaacute ionizaciacute vody

H2O + hν rarr H + OHmiddot

Reaktivniacute formy kysliacuteku v organismu

Jednoelektronovou redukciacute kysliacuteku (mitochondrie NADPH oxidasa) vznikaacute superoxid O2

middotndash

Dismutace superoxidu produkuje peroxid vodiacutekuO2

middotndash + O2middotndash + 2 H+ rarr O2 + H2O2

Fentonova reakce s Fe nebo Cu vytvořiacute z peroxiduhydroxylovyacute radikaacutelH2O2 + Fe2+ rarr OHndash + OHmiddot + Fe3+

Kde jsou RONS prospěšneacute

I Aktivniacute centra enzymů

bull Monooxygenasy (cytochromy P450)

bull Ribonukleotidreduktasa (hellipsynteacuteza DNA)

bull Synteacuteza prostanoidů (enzymatickaacute lipoperoxidace)

bull Užitečneacute hemoveacute peroxidasy

15

Kde jsou RONS prospěšneacute

I Aktivniacute centra enzymů

bull Monooxygenasy (cytochromy P450)

ndash Detoxikace xenobiotik synteacuteza steroidniacutech hormonů a žlučovyacutech kyselin NO synthasy

Mechanismus v podstatě řiacutezenaacute Fentonova reakce

Fe3+ + SH + 2 e- + O2 + H+ rarr FeOOH SH

FeOOH SH rarr FeO3+ SH + H2O

FeO3+ SH rarr FeOH3+Sbull rarr Fe3+SOH rarr Fe3+ + SOH

Kde jsou RONS prospěšneacute

I Aktivniacute centra enzymů

bull Monooxygenasy (cytochromy P450)

bull Ribonukleotidreduktasa (hellipsynteacuteza DNA)

bull Synteacuteza prostanoidů (enzymatickaacute lipoperoxidace)

bull Užitečneacute hemoveacute peroxidasy

ndash Thyreoperoxidasa ve štiacutetneacute žlaacuteze

Iminus + H2O2 + 2H+ rarr I+ + 2H2O I+ joduje thyreoglobulin

ndash Myeloperoxidasa neutrofilů

ndash Laktoperoxidasa v mleacuteku hlenu dyacutechaciacutech cest a ve slinaacutech

SCNminus + H2O2 rarr OSCNminus + H2O

(hypothiokyanaacutet OSCNminus je baktericidniacute)

16

Kde jsou RONS prospěšneacute

II Signalizace

bull Např oxid dusnatyacute NOndash relaxace hladkeacuteho svalstva ceacutevniacute stěny

gastrointestinaacutelniacuteho traktu corpus cavernosumpenis

ndash neurotransmitter neuromodulaacutetor v CNS funkce v synaptickeacute plasticitě učeniacute a paměti

ndash inhibice adhese a agregace trombocytů ndash inhibice adhese leukocytůndash (atd)

Superoxid stejně tak uacutečinky protichůdneacute NO

OXID DUSNATYacuteProdukovaacuten NO synthasami

Vasodilatace inhibice aktivace leukocytů inhibice agregace destiček

atd

SUPEROXIDPEROXIDProdukovaacuten NADPH oxidasami

Vasokonstrikce aktivace leukocytů agregace destiček atd

A při setkaacuteniacute se navzaacutejem zničiacute

NO + O2middotndash rarr OONOndash

17

Koncept redoxniacute signalizace

bull Redoxniacute prostřediacute buňky - přibližně daacutenopoměrem GSHGSSG a NADHNAD

bull Redoxniacute sensory na proteinechndash kritickeacute -SH skupiny

ndash Fe-S centra

bull Ciacutele redoxniacute signalizacendash transkripčniacute faktory

ndash proteinkinasy a fosfatasy

Redoxniacutesignalizace

bull Oxidačniacute stres aktivuje určiteacute protein kinasy a transkripčniacute faktory

bull Vyacuteslednyacute efekt např stimulace proliferace senescence (staacuternutiacute) buněk

bull PůsobeniacuteROSantioxidantů v buňce může byacutet velmi specifickeacute

(T Finkel amp NJ Holbrook Nature 408 (2000) 239-247)

18

hellip a velmi

komplikovaneacute

Kde jsou RONS prospěšneacute

III Fagocytoacuteza

bull Neutrofily eosinofily monocyty makrofaacutegy mikroglie

bull Často je potřeba ciacutelovou čaacutestici označit (opsonizace)

bull Uacutekolem fagocytujiacuteciacute buňky je ciacutelovou čaacutestici

ndash Rozpoznat

ndash Pohltit

ndash Zabiacutet

ndash Straacutevit

copy 1998 Garland Publishing

19

Neutrofilniacute granulocyt

(polymorfonukleaacuter)

bull Segmentovaneacute jaacutedrobull Primaacuterniacute (azurofilniacute)

granula lysozym defensiny myeloperoxidasa proteasy

bull Specifickaacute (sekundaacuterniacute) granula NADPH oxidasa kobalofilin laktoferrin lysozym kolagenasa

bull Terciaacuterniacute granula gelatinasa a dalšiacute enzymy

Obrhttpblausencom

Obr httpwalchecklabumnedu_rsrc1417821135388research-interestsneutrophil-recruitment

20

Aktivace fagocytujiacuteciacute buňky

Respiračniacute vzplanutiacute

bull Naacutehleacute zvyacutešeniacute spotřeby kysliacuteku (pro produkci superoxidu ne respiraci)

bull Naacutehleacute zvyacutešeniacute spotřeby glukosy (pro pentosovyacute cyklus ndash dodaacutevaacuteNADPH pro NADPH oxidasu)

NADPH oxidasa

bull Membraacutenovyacute enzym produkujiacuteciacute superoxid vněnebo do fagosomu

bull Katalyzuje reakci

NADPH + 2O2 rarr NADP+ + H+ + 2O2middotndash

bull V klidu latentniacute sestavuje se z 6 podjednotek na buněčneacute membraacuteně při aktivaci fagocytu

bull Nezbytnaacute pro schopnost zabiacutet některeacute pohlceneacutebakterie (hereditaacuterniacute deficit chronickaacute septickaacute

granulomatosa)

bull Takeacute na endotelu a mnoha jinyacutech nefagocytaacuterniacutech buňkaacutech

21

Myeloperoxidasa

bull 2 ndash 5 všech proteinů v neutrofilechbull Hemoprotein zodpovědnyacute za zelenou barvu

hnisubull Nespecifickaacute peroxidasa v těle katalyzuje

předevšiacutem reakciClminus + H2O2 + H+ rarr HClO + H2O

bull Deficit u lidiacute častyacute (1 na 2000-4000) a nemaacutezaacutevažneacute přiacuteznaky

Kyselina chlornaacute

- Slabaacute kyselina (pKa = 75 HClO harr ClOminus + H+)- V kyseleacutem prostřediacute se snadno rozklaacutedaacute na plynnyacute

chlorHClO + H+ + Clminus harr Cl2 + H2O

- Silneacute oxidačniacute činidlo (2HClO + 2eminus rarr Cl2)

- Reakce s Fe2+ nebo superoxidem generuje hydroxylovyacute radikaacutel

HClO + Fe2+ rarr Clndash + Fe3+ + OHmiddotHClO + O2middotndash rarr Clndash + O2 + OHmiddot

- S organickyacutemi aminy poskytuje chloraminy

R-NH2 + HClO rarr R-NH-Cl + H2O

HClO

22

Dalšiacute zbraně neutrofilů

bull Velmi uacutečinneacute proteolytickeacute enzymy elastasa kolagenasa kathepsin G gelatinasa ad

bull Lysozym štěpiacute polysacharid bakteriaacutelniacute stěny Gram+ mikrobů

bull Laktoferrin bere bakteriiacutem železobull Defensiny kationickeacute proteiny tvořiacuteciacute kanaacutely v

bakteriaacutelniacute membraacuteněbull NETs (neutrophil extracellular traps) vlaacutekna z DNA

a serinovyacutech proteas tvořenaacute extracelulaacuterně

Synergie mezi generaacutetory radikaacutelů a dalšiacutemi zbraněmi

např HClO inhibuje α1-antitrypsin

RONS ve vyacutezbroji fagocytů

iNOS je důležitaacute pro makrofaacutegy ale nevyacuteznamnaacute u lidskyacutech neutrofilů Naopak makrofaacutegy nemajiacute myeloperoxidasu

7

Produkce superoxidu v dyacutechaciacutem řetězci

bull 1-2 z celkoveacutespotřeby O2 (in vivourčitě meacuteně)

bull Uacutenik elektronů z redoxniacutech centerkomplexů I a III předevšiacutem zesemiubichinonu

Vznik superoxidu z oxyhemoglobinu

Štiacutepek S et al Antioxidanty a volneacute radikaacutely ve zdraviacute a nemoci GradaPublishing Praha 2000

8

Superoxid

bull Vlastnosti

- Nepřiacuteliš reaktivniacute oxidačniacute i redukčniacute činidlo

- Omezenaacute možnost průchodu přes membraacuteny (jenskrz aniontoveacute kanaacutely nebo ve sveacute protonovaneacuteformě)

- Uvolňuje železo z Fe-S clusterů

bull Osud

ndash Dismutace

ndash Reakce s oxidem dusnatyacutem

O2middotndash

O2middotndash + O2

middotndash + 2 H+ rarr O2 + H2O2

NO + O2middotndash rarr OONOndash (peroxynitrit)

Peroxid vodiacuteku

bull Tvorba v těle

ndash Dismutace superoxidu (spontaacutenniacute nebokatalyzovanaacute superoxiddismutasou)

ndash Přiacutemo činnostiacute některyacutech enzymůbull Xanthinoxidasa

bull Monoaminooxidasa (MAO)

H2O2

O2middotndash + O2

middotndash + 2 H+ rarr O2 + H2O2

9

Peroxid vodiacuteku

bull Vlastnosti

- Neniacute radikaacutel

- Volně prochaacuteziacute skrz biologickeacute membraacuteny

- Saacutem o sobě celkem nereaktivniacute

- Ale rychle reaguje s redukovanyacutemi přechodnyacutemi kovyjako železo a měď (Fentonova reakce)

bull Osud

ndash Fentonova reakce

ndash Bezpečneacute odstraněniacute glutathionperoxidasou peroxiredoxinem nebo katalasou

H2O2

H2O2 + Fe2+ rarr OHndash + OHmiddot + Fe3+

hydroxylovyacute radikaacutel

Hydroxylovyacute radikaacutel

bull Vznik v těle

ndash Ionisačniacute zaacuteřeniacute

ndash Fentonova reakce

bull Vlastnosti

- Extreacutemně reaktivniacute Poškozuje biomolekuly bliacutezkomiacutesta sveacuteho vzniku

OH middot

H2O2 + Fe2+ rarr OHndash + OHmiddot + Fe3+

H2O rarr H + OHmiddot

10

Reaktivniacute formy kysliacuteku(Reactive Oxygen Species ROS)

bull Radikaacutelyndash Superoxid O2 middotndash

ndash Hydroperoxyl HO2middotndash Hydroxylovyacute radikaacutel OHmiddotndash Peroxyl ROOmiddotndash Alkoxyl ROmiddot

bull Ne-radikaacutelyndash Peroxid vodiacuteku H2O2

ndash Kyselina chlornaacute HClOndash Ozoacuten O3

ndash Singletovyacute kysliacutek 1O2

Oxid dusnatyacute

bull Vznik v těle

ndash NO synthasovaacute reakce

ndash Tři různeacute NO synthasy- NOS I (neuronaacutelniacute konstitutivniacute)- NOS II (fagocyty inducibilniacute)- NOS III (endoteliaacutelniacute konstitutivniacute)

NO middot

L-Arginin + O2 + NADPH rarr L-Citrulin + NADP+ +NO

11

Oxid dusnatyacute (NO) působiacute relaxaci hladkeacuteho svalstva

ceacutevniacute stěny

Oxid dusnatyacutebull Vlastnosti- Plynnyacute radikaacutel- Reakce s hemovyacutem železem guanylaacutetcyklasy

(hellipfyziologickeacute uacutečinky relaxace hladkeacuteho svalstva atd)- Reakce s hemovyacutem železem hemoglobinu (hellipfyziologickaacute

inaktivace)

- Reakce se sulfhydrylovou skupinou glutathionu atd nanitrosothiol (helliptransport NO)

- Reakce se superoxidem na peroxynitrit a konečněhydroxylovyacute radikaacutel (helliptoxicita)

NO middot

NO + O2middotndash rarr OONOndash peroxynitrit

OONOndash + H+ rarr HOONO rarr OHmiddot + NO2

kyselina peroxydusitaacute hydroxylovyacute radikaacutel

12

Reaktivniacute formy dusiacuteku(Reactive Nitrogen Species RNS)

bull Radikaacutelyndash Oxid dusnatyacute NOndash Oxid dusičityacute NO2

bull Ne-radikaacutelyndash Nitrosonium NO+

ndash Nitroxyl NOndash

ndash Kyselina dusitaacute HNO2

ndash Oxid dusityacute N2O3

ndash Oxid dusičityacute N2O4

ndash Nitronium NO2+

ndash Peroxynitrit ONOO ndash

ndash Alkylperoxynitrit ROONO

Oxidačniacute poškozeniacute biomolekul

bull Lipidy peroxidace polynenasycenyacutechmastnyacutech kyselin v membraacutenaacutech

bull Proteiny oxidace -SH karbonylace -NH2 hydroxylacenitrosylace aromatickyacutechAMK cross-linking degradace

bull Nukleoveacute kyseliny zlomy v řetězci DNA hydroxylace basiacute mutace kancerogenese

13

Peroxidace

lipidů (žluknutiacute)

Dalšiacute osud lipoperoxidů

14

Ionizačniacute zaacuteřeniacuteHydroxylovyacute radikaacutel vznikaacute ionizaciacute vody

H2O + hν rarr H + OHmiddot

Reaktivniacute formy kysliacuteku v organismu

Jednoelektronovou redukciacute kysliacuteku (mitochondrie NADPH oxidasa) vznikaacute superoxid O2

middotndash

Dismutace superoxidu produkuje peroxid vodiacutekuO2

middotndash + O2middotndash + 2 H+ rarr O2 + H2O2

Fentonova reakce s Fe nebo Cu vytvořiacute z peroxiduhydroxylovyacute radikaacutelH2O2 + Fe2+ rarr OHndash + OHmiddot + Fe3+

Kde jsou RONS prospěšneacute

I Aktivniacute centra enzymů

bull Monooxygenasy (cytochromy P450)

bull Ribonukleotidreduktasa (hellipsynteacuteza DNA)

bull Synteacuteza prostanoidů (enzymatickaacute lipoperoxidace)

bull Užitečneacute hemoveacute peroxidasy

15

Kde jsou RONS prospěšneacute

I Aktivniacute centra enzymů

bull Monooxygenasy (cytochromy P450)

ndash Detoxikace xenobiotik synteacuteza steroidniacutech hormonů a žlučovyacutech kyselin NO synthasy

Mechanismus v podstatě řiacutezenaacute Fentonova reakce

Fe3+ + SH + 2 e- + O2 + H+ rarr FeOOH SH

FeOOH SH rarr FeO3+ SH + H2O

FeO3+ SH rarr FeOH3+Sbull rarr Fe3+SOH rarr Fe3+ + SOH

Kde jsou RONS prospěšneacute

I Aktivniacute centra enzymů

bull Monooxygenasy (cytochromy P450)

bull Ribonukleotidreduktasa (hellipsynteacuteza DNA)

bull Synteacuteza prostanoidů (enzymatickaacute lipoperoxidace)

bull Užitečneacute hemoveacute peroxidasy

ndash Thyreoperoxidasa ve štiacutetneacute žlaacuteze

Iminus + H2O2 + 2H+ rarr I+ + 2H2O I+ joduje thyreoglobulin

ndash Myeloperoxidasa neutrofilů

ndash Laktoperoxidasa v mleacuteku hlenu dyacutechaciacutech cest a ve slinaacutech

SCNminus + H2O2 rarr OSCNminus + H2O

(hypothiokyanaacutet OSCNminus je baktericidniacute)

16

Kde jsou RONS prospěšneacute

II Signalizace

bull Např oxid dusnatyacute NOndash relaxace hladkeacuteho svalstva ceacutevniacute stěny

gastrointestinaacutelniacuteho traktu corpus cavernosumpenis

ndash neurotransmitter neuromodulaacutetor v CNS funkce v synaptickeacute plasticitě učeniacute a paměti

ndash inhibice adhese a agregace trombocytů ndash inhibice adhese leukocytůndash (atd)

Superoxid stejně tak uacutečinky protichůdneacute NO

OXID DUSNATYacuteProdukovaacuten NO synthasami

Vasodilatace inhibice aktivace leukocytů inhibice agregace destiček

atd

SUPEROXIDPEROXIDProdukovaacuten NADPH oxidasami

Vasokonstrikce aktivace leukocytů agregace destiček atd

A při setkaacuteniacute se navzaacutejem zničiacute

NO + O2middotndash rarr OONOndash

17

Koncept redoxniacute signalizace

bull Redoxniacute prostřediacute buňky - přibližně daacutenopoměrem GSHGSSG a NADHNAD

bull Redoxniacute sensory na proteinechndash kritickeacute -SH skupiny

ndash Fe-S centra

bull Ciacutele redoxniacute signalizacendash transkripčniacute faktory

ndash proteinkinasy a fosfatasy

Redoxniacutesignalizace

bull Oxidačniacute stres aktivuje určiteacute protein kinasy a transkripčniacute faktory

bull Vyacuteslednyacute efekt např stimulace proliferace senescence (staacuternutiacute) buněk

bull PůsobeniacuteROSantioxidantů v buňce může byacutet velmi specifickeacute

(T Finkel amp NJ Holbrook Nature 408 (2000) 239-247)

18

hellip a velmi

komplikovaneacute

Kde jsou RONS prospěšneacute

III Fagocytoacuteza

bull Neutrofily eosinofily monocyty makrofaacutegy mikroglie

bull Často je potřeba ciacutelovou čaacutestici označit (opsonizace)

bull Uacutekolem fagocytujiacuteciacute buňky je ciacutelovou čaacutestici

ndash Rozpoznat

ndash Pohltit

ndash Zabiacutet

ndash Straacutevit

copy 1998 Garland Publishing

19

Neutrofilniacute granulocyt

(polymorfonukleaacuter)

bull Segmentovaneacute jaacutedrobull Primaacuterniacute (azurofilniacute)

granula lysozym defensiny myeloperoxidasa proteasy

bull Specifickaacute (sekundaacuterniacute) granula NADPH oxidasa kobalofilin laktoferrin lysozym kolagenasa

bull Terciaacuterniacute granula gelatinasa a dalšiacute enzymy

Obrhttpblausencom

Obr httpwalchecklabumnedu_rsrc1417821135388research-interestsneutrophil-recruitment

20

Aktivace fagocytujiacuteciacute buňky

Respiračniacute vzplanutiacute

bull Naacutehleacute zvyacutešeniacute spotřeby kysliacuteku (pro produkci superoxidu ne respiraci)

bull Naacutehleacute zvyacutešeniacute spotřeby glukosy (pro pentosovyacute cyklus ndash dodaacutevaacuteNADPH pro NADPH oxidasu)

NADPH oxidasa

bull Membraacutenovyacute enzym produkujiacuteciacute superoxid vněnebo do fagosomu

bull Katalyzuje reakci

NADPH + 2O2 rarr NADP+ + H+ + 2O2middotndash

bull V klidu latentniacute sestavuje se z 6 podjednotek na buněčneacute membraacuteně při aktivaci fagocytu

bull Nezbytnaacute pro schopnost zabiacutet některeacute pohlceneacutebakterie (hereditaacuterniacute deficit chronickaacute septickaacute

granulomatosa)

bull Takeacute na endotelu a mnoha jinyacutech nefagocytaacuterniacutech buňkaacutech

21

Myeloperoxidasa

bull 2 ndash 5 všech proteinů v neutrofilechbull Hemoprotein zodpovědnyacute za zelenou barvu

hnisubull Nespecifickaacute peroxidasa v těle katalyzuje

předevšiacutem reakciClminus + H2O2 + H+ rarr HClO + H2O

bull Deficit u lidiacute častyacute (1 na 2000-4000) a nemaacutezaacutevažneacute přiacuteznaky

Kyselina chlornaacute

- Slabaacute kyselina (pKa = 75 HClO harr ClOminus + H+)- V kyseleacutem prostřediacute se snadno rozklaacutedaacute na plynnyacute

chlorHClO + H+ + Clminus harr Cl2 + H2O

- Silneacute oxidačniacute činidlo (2HClO + 2eminus rarr Cl2)

- Reakce s Fe2+ nebo superoxidem generuje hydroxylovyacute radikaacutel

HClO + Fe2+ rarr Clndash + Fe3+ + OHmiddotHClO + O2middotndash rarr Clndash + O2 + OHmiddot

- S organickyacutemi aminy poskytuje chloraminy

R-NH2 + HClO rarr R-NH-Cl + H2O

HClO

22

Dalšiacute zbraně neutrofilů

bull Velmi uacutečinneacute proteolytickeacute enzymy elastasa kolagenasa kathepsin G gelatinasa ad

bull Lysozym štěpiacute polysacharid bakteriaacutelniacute stěny Gram+ mikrobů

bull Laktoferrin bere bakteriiacutem železobull Defensiny kationickeacute proteiny tvořiacuteciacute kanaacutely v

bakteriaacutelniacute membraacuteněbull NETs (neutrophil extracellular traps) vlaacutekna z DNA

a serinovyacutech proteas tvořenaacute extracelulaacuterně

Synergie mezi generaacutetory radikaacutelů a dalšiacutemi zbraněmi

např HClO inhibuje α1-antitrypsin

RONS ve vyacutezbroji fagocytů

iNOS je důležitaacute pro makrofaacutegy ale nevyacuteznamnaacute u lidskyacutech neutrofilů Naopak makrofaacutegy nemajiacute myeloperoxidasu

8

Superoxid

bull Vlastnosti

- Nepřiacuteliš reaktivniacute oxidačniacute i redukčniacute činidlo

- Omezenaacute možnost průchodu přes membraacuteny (jenskrz aniontoveacute kanaacutely nebo ve sveacute protonovaneacuteformě)

- Uvolňuje železo z Fe-S clusterů

bull Osud

ndash Dismutace

ndash Reakce s oxidem dusnatyacutem

O2middotndash

O2middotndash + O2

middotndash + 2 H+ rarr O2 + H2O2

NO + O2middotndash rarr OONOndash (peroxynitrit)

Peroxid vodiacuteku

bull Tvorba v těle

ndash Dismutace superoxidu (spontaacutenniacute nebokatalyzovanaacute superoxiddismutasou)

ndash Přiacutemo činnostiacute některyacutech enzymůbull Xanthinoxidasa

bull Monoaminooxidasa (MAO)

H2O2

O2middotndash + O2

middotndash + 2 H+ rarr O2 + H2O2

9

Peroxid vodiacuteku

bull Vlastnosti

- Neniacute radikaacutel

- Volně prochaacuteziacute skrz biologickeacute membraacuteny

- Saacutem o sobě celkem nereaktivniacute

- Ale rychle reaguje s redukovanyacutemi přechodnyacutemi kovyjako železo a měď (Fentonova reakce)

bull Osud

ndash Fentonova reakce

ndash Bezpečneacute odstraněniacute glutathionperoxidasou peroxiredoxinem nebo katalasou

H2O2

H2O2 + Fe2+ rarr OHndash + OHmiddot + Fe3+

hydroxylovyacute radikaacutel

Hydroxylovyacute radikaacutel

bull Vznik v těle

ndash Ionisačniacute zaacuteřeniacute

ndash Fentonova reakce

bull Vlastnosti

- Extreacutemně reaktivniacute Poškozuje biomolekuly bliacutezkomiacutesta sveacuteho vzniku

OH middot

H2O2 + Fe2+ rarr OHndash + OHmiddot + Fe3+

H2O rarr H + OHmiddot

10

Reaktivniacute formy kysliacuteku(Reactive Oxygen Species ROS)

bull Radikaacutelyndash Superoxid O2 middotndash

ndash Hydroperoxyl HO2middotndash Hydroxylovyacute radikaacutel OHmiddotndash Peroxyl ROOmiddotndash Alkoxyl ROmiddot

bull Ne-radikaacutelyndash Peroxid vodiacuteku H2O2

ndash Kyselina chlornaacute HClOndash Ozoacuten O3

ndash Singletovyacute kysliacutek 1O2

Oxid dusnatyacute

bull Vznik v těle

ndash NO synthasovaacute reakce

ndash Tři různeacute NO synthasy- NOS I (neuronaacutelniacute konstitutivniacute)- NOS II (fagocyty inducibilniacute)- NOS III (endoteliaacutelniacute konstitutivniacute)

NO middot

L-Arginin + O2 + NADPH rarr L-Citrulin + NADP+ +NO

11

Oxid dusnatyacute (NO) působiacute relaxaci hladkeacuteho svalstva

ceacutevniacute stěny

Oxid dusnatyacutebull Vlastnosti- Plynnyacute radikaacutel- Reakce s hemovyacutem železem guanylaacutetcyklasy

(hellipfyziologickeacute uacutečinky relaxace hladkeacuteho svalstva atd)- Reakce s hemovyacutem železem hemoglobinu (hellipfyziologickaacute

inaktivace)

- Reakce se sulfhydrylovou skupinou glutathionu atd nanitrosothiol (helliptransport NO)

- Reakce se superoxidem na peroxynitrit a konečněhydroxylovyacute radikaacutel (helliptoxicita)

NO middot

NO + O2middotndash rarr OONOndash peroxynitrit

OONOndash + H+ rarr HOONO rarr OHmiddot + NO2

kyselina peroxydusitaacute hydroxylovyacute radikaacutel

12

Reaktivniacute formy dusiacuteku(Reactive Nitrogen Species RNS)

bull Radikaacutelyndash Oxid dusnatyacute NOndash Oxid dusičityacute NO2

bull Ne-radikaacutelyndash Nitrosonium NO+

ndash Nitroxyl NOndash

ndash Kyselina dusitaacute HNO2

ndash Oxid dusityacute N2O3

ndash Oxid dusičityacute N2O4

ndash Nitronium NO2+

ndash Peroxynitrit ONOO ndash

ndash Alkylperoxynitrit ROONO

Oxidačniacute poškozeniacute biomolekul

bull Lipidy peroxidace polynenasycenyacutechmastnyacutech kyselin v membraacutenaacutech

bull Proteiny oxidace -SH karbonylace -NH2 hydroxylacenitrosylace aromatickyacutechAMK cross-linking degradace

bull Nukleoveacute kyseliny zlomy v řetězci DNA hydroxylace basiacute mutace kancerogenese

13

Peroxidace

lipidů (žluknutiacute)

Dalšiacute osud lipoperoxidů

14

Ionizačniacute zaacuteřeniacuteHydroxylovyacute radikaacutel vznikaacute ionizaciacute vody

H2O + hν rarr H + OHmiddot

Reaktivniacute formy kysliacuteku v organismu

Jednoelektronovou redukciacute kysliacuteku (mitochondrie NADPH oxidasa) vznikaacute superoxid O2

middotndash

Dismutace superoxidu produkuje peroxid vodiacutekuO2

middotndash + O2middotndash + 2 H+ rarr O2 + H2O2

Fentonova reakce s Fe nebo Cu vytvořiacute z peroxiduhydroxylovyacute radikaacutelH2O2 + Fe2+ rarr OHndash + OHmiddot + Fe3+

Kde jsou RONS prospěšneacute

I Aktivniacute centra enzymů

bull Monooxygenasy (cytochromy P450)

bull Ribonukleotidreduktasa (hellipsynteacuteza DNA)

bull Synteacuteza prostanoidů (enzymatickaacute lipoperoxidace)

bull Užitečneacute hemoveacute peroxidasy

15

Kde jsou RONS prospěšneacute

I Aktivniacute centra enzymů

bull Monooxygenasy (cytochromy P450)

ndash Detoxikace xenobiotik synteacuteza steroidniacutech hormonů a žlučovyacutech kyselin NO synthasy

Mechanismus v podstatě řiacutezenaacute Fentonova reakce

Fe3+ + SH + 2 e- + O2 + H+ rarr FeOOH SH

FeOOH SH rarr FeO3+ SH + H2O

FeO3+ SH rarr FeOH3+Sbull rarr Fe3+SOH rarr Fe3+ + SOH

Kde jsou RONS prospěšneacute

I Aktivniacute centra enzymů

bull Monooxygenasy (cytochromy P450)

bull Ribonukleotidreduktasa (hellipsynteacuteza DNA)

bull Synteacuteza prostanoidů (enzymatickaacute lipoperoxidace)

bull Užitečneacute hemoveacute peroxidasy

ndash Thyreoperoxidasa ve štiacutetneacute žlaacuteze

Iminus + H2O2 + 2H+ rarr I+ + 2H2O I+ joduje thyreoglobulin

ndash Myeloperoxidasa neutrofilů

ndash Laktoperoxidasa v mleacuteku hlenu dyacutechaciacutech cest a ve slinaacutech

SCNminus + H2O2 rarr OSCNminus + H2O

(hypothiokyanaacutet OSCNminus je baktericidniacute)

16

Kde jsou RONS prospěšneacute

II Signalizace

bull Např oxid dusnatyacute NOndash relaxace hladkeacuteho svalstva ceacutevniacute stěny

gastrointestinaacutelniacuteho traktu corpus cavernosumpenis

ndash neurotransmitter neuromodulaacutetor v CNS funkce v synaptickeacute plasticitě učeniacute a paměti

ndash inhibice adhese a agregace trombocytů ndash inhibice adhese leukocytůndash (atd)

Superoxid stejně tak uacutečinky protichůdneacute NO

OXID DUSNATYacuteProdukovaacuten NO synthasami

Vasodilatace inhibice aktivace leukocytů inhibice agregace destiček

atd

SUPEROXIDPEROXIDProdukovaacuten NADPH oxidasami

Vasokonstrikce aktivace leukocytů agregace destiček atd

A při setkaacuteniacute se navzaacutejem zničiacute

NO + O2middotndash rarr OONOndash

17

Koncept redoxniacute signalizace

bull Redoxniacute prostřediacute buňky - přibližně daacutenopoměrem GSHGSSG a NADHNAD

bull Redoxniacute sensory na proteinechndash kritickeacute -SH skupiny

ndash Fe-S centra

bull Ciacutele redoxniacute signalizacendash transkripčniacute faktory

ndash proteinkinasy a fosfatasy

Redoxniacutesignalizace

bull Oxidačniacute stres aktivuje určiteacute protein kinasy a transkripčniacute faktory

bull Vyacuteslednyacute efekt např stimulace proliferace senescence (staacuternutiacute) buněk

bull PůsobeniacuteROSantioxidantů v buňce může byacutet velmi specifickeacute

(T Finkel amp NJ Holbrook Nature 408 (2000) 239-247)

18

hellip a velmi

komplikovaneacute

Kde jsou RONS prospěšneacute

III Fagocytoacuteza

bull Neutrofily eosinofily monocyty makrofaacutegy mikroglie

bull Často je potřeba ciacutelovou čaacutestici označit (opsonizace)

bull Uacutekolem fagocytujiacuteciacute buňky je ciacutelovou čaacutestici

ndash Rozpoznat

ndash Pohltit

ndash Zabiacutet

ndash Straacutevit

copy 1998 Garland Publishing

19

Neutrofilniacute granulocyt

(polymorfonukleaacuter)

bull Segmentovaneacute jaacutedrobull Primaacuterniacute (azurofilniacute)

granula lysozym defensiny myeloperoxidasa proteasy

bull Specifickaacute (sekundaacuterniacute) granula NADPH oxidasa kobalofilin laktoferrin lysozym kolagenasa

bull Terciaacuterniacute granula gelatinasa a dalšiacute enzymy

Obrhttpblausencom

Obr httpwalchecklabumnedu_rsrc1417821135388research-interestsneutrophil-recruitment

20

Aktivace fagocytujiacuteciacute buňky

Respiračniacute vzplanutiacute

bull Naacutehleacute zvyacutešeniacute spotřeby kysliacuteku (pro produkci superoxidu ne respiraci)

bull Naacutehleacute zvyacutešeniacute spotřeby glukosy (pro pentosovyacute cyklus ndash dodaacutevaacuteNADPH pro NADPH oxidasu)

NADPH oxidasa

bull Membraacutenovyacute enzym produkujiacuteciacute superoxid vněnebo do fagosomu

bull Katalyzuje reakci

NADPH + 2O2 rarr NADP+ + H+ + 2O2middotndash

bull V klidu latentniacute sestavuje se z 6 podjednotek na buněčneacute membraacuteně při aktivaci fagocytu

bull Nezbytnaacute pro schopnost zabiacutet některeacute pohlceneacutebakterie (hereditaacuterniacute deficit chronickaacute septickaacute

granulomatosa)

bull Takeacute na endotelu a mnoha jinyacutech nefagocytaacuterniacutech buňkaacutech

21

Myeloperoxidasa

bull 2 ndash 5 všech proteinů v neutrofilechbull Hemoprotein zodpovědnyacute za zelenou barvu

hnisubull Nespecifickaacute peroxidasa v těle katalyzuje

předevšiacutem reakciClminus + H2O2 + H+ rarr HClO + H2O

bull Deficit u lidiacute častyacute (1 na 2000-4000) a nemaacutezaacutevažneacute přiacuteznaky

Kyselina chlornaacute

- Slabaacute kyselina (pKa = 75 HClO harr ClOminus + H+)- V kyseleacutem prostřediacute se snadno rozklaacutedaacute na plynnyacute

chlorHClO + H+ + Clminus harr Cl2 + H2O

- Silneacute oxidačniacute činidlo (2HClO + 2eminus rarr Cl2)

- Reakce s Fe2+ nebo superoxidem generuje hydroxylovyacute radikaacutel

HClO + Fe2+ rarr Clndash + Fe3+ + OHmiddotHClO + O2middotndash rarr Clndash + O2 + OHmiddot

- S organickyacutemi aminy poskytuje chloraminy

R-NH2 + HClO rarr R-NH-Cl + H2O

HClO

22

Dalšiacute zbraně neutrofilů

bull Velmi uacutečinneacute proteolytickeacute enzymy elastasa kolagenasa kathepsin G gelatinasa ad

bull Lysozym štěpiacute polysacharid bakteriaacutelniacute stěny Gram+ mikrobů

bull Laktoferrin bere bakteriiacutem železobull Defensiny kationickeacute proteiny tvořiacuteciacute kanaacutely v

bakteriaacutelniacute membraacuteněbull NETs (neutrophil extracellular traps) vlaacutekna z DNA

a serinovyacutech proteas tvořenaacute extracelulaacuterně

Synergie mezi generaacutetory radikaacutelů a dalšiacutemi zbraněmi

např HClO inhibuje α1-antitrypsin

RONS ve vyacutezbroji fagocytů

iNOS je důležitaacute pro makrofaacutegy ale nevyacuteznamnaacute u lidskyacutech neutrofilů Naopak makrofaacutegy nemajiacute myeloperoxidasu

9

Peroxid vodiacuteku

bull Vlastnosti

- Neniacute radikaacutel

- Volně prochaacuteziacute skrz biologickeacute membraacuteny

- Saacutem o sobě celkem nereaktivniacute

- Ale rychle reaguje s redukovanyacutemi přechodnyacutemi kovyjako železo a měď (Fentonova reakce)

bull Osud

ndash Fentonova reakce

ndash Bezpečneacute odstraněniacute glutathionperoxidasou peroxiredoxinem nebo katalasou

H2O2

H2O2 + Fe2+ rarr OHndash + OHmiddot + Fe3+

hydroxylovyacute radikaacutel

Hydroxylovyacute radikaacutel

bull Vznik v těle

ndash Ionisačniacute zaacuteřeniacute

ndash Fentonova reakce

bull Vlastnosti

- Extreacutemně reaktivniacute Poškozuje biomolekuly bliacutezkomiacutesta sveacuteho vzniku

OH middot

H2O2 + Fe2+ rarr OHndash + OHmiddot + Fe3+

H2O rarr H + OHmiddot

10

Reaktivniacute formy kysliacuteku(Reactive Oxygen Species ROS)

bull Radikaacutelyndash Superoxid O2 middotndash

ndash Hydroperoxyl HO2middotndash Hydroxylovyacute radikaacutel OHmiddotndash Peroxyl ROOmiddotndash Alkoxyl ROmiddot

bull Ne-radikaacutelyndash Peroxid vodiacuteku H2O2

ndash Kyselina chlornaacute HClOndash Ozoacuten O3

ndash Singletovyacute kysliacutek 1O2

Oxid dusnatyacute

bull Vznik v těle

ndash NO synthasovaacute reakce

ndash Tři různeacute NO synthasy- NOS I (neuronaacutelniacute konstitutivniacute)- NOS II (fagocyty inducibilniacute)- NOS III (endoteliaacutelniacute konstitutivniacute)

NO middot

L-Arginin + O2 + NADPH rarr L-Citrulin + NADP+ +NO

11

Oxid dusnatyacute (NO) působiacute relaxaci hladkeacuteho svalstva

ceacutevniacute stěny

Oxid dusnatyacutebull Vlastnosti- Plynnyacute radikaacutel- Reakce s hemovyacutem železem guanylaacutetcyklasy

(hellipfyziologickeacute uacutečinky relaxace hladkeacuteho svalstva atd)- Reakce s hemovyacutem železem hemoglobinu (hellipfyziologickaacute

inaktivace)

- Reakce se sulfhydrylovou skupinou glutathionu atd nanitrosothiol (helliptransport NO)

- Reakce se superoxidem na peroxynitrit a konečněhydroxylovyacute radikaacutel (helliptoxicita)

NO middot

NO + O2middotndash rarr OONOndash peroxynitrit

OONOndash + H+ rarr HOONO rarr OHmiddot + NO2

kyselina peroxydusitaacute hydroxylovyacute radikaacutel

12

Reaktivniacute formy dusiacuteku(Reactive Nitrogen Species RNS)

bull Radikaacutelyndash Oxid dusnatyacute NOndash Oxid dusičityacute NO2

bull Ne-radikaacutelyndash Nitrosonium NO+

ndash Nitroxyl NOndash

ndash Kyselina dusitaacute HNO2

ndash Oxid dusityacute N2O3

ndash Oxid dusičityacute N2O4

ndash Nitronium NO2+

ndash Peroxynitrit ONOO ndash

ndash Alkylperoxynitrit ROONO

Oxidačniacute poškozeniacute biomolekul

bull Lipidy peroxidace polynenasycenyacutechmastnyacutech kyselin v membraacutenaacutech

bull Proteiny oxidace -SH karbonylace -NH2 hydroxylacenitrosylace aromatickyacutechAMK cross-linking degradace

bull Nukleoveacute kyseliny zlomy v řetězci DNA hydroxylace basiacute mutace kancerogenese

13

Peroxidace

lipidů (žluknutiacute)

Dalšiacute osud lipoperoxidů

14

Ionizačniacute zaacuteřeniacuteHydroxylovyacute radikaacutel vznikaacute ionizaciacute vody

H2O + hν rarr H + OHmiddot

Reaktivniacute formy kysliacuteku v organismu

Jednoelektronovou redukciacute kysliacuteku (mitochondrie NADPH oxidasa) vznikaacute superoxid O2

middotndash

Dismutace superoxidu produkuje peroxid vodiacutekuO2

middotndash + O2middotndash + 2 H+ rarr O2 + H2O2

Fentonova reakce s Fe nebo Cu vytvořiacute z peroxiduhydroxylovyacute radikaacutelH2O2 + Fe2+ rarr OHndash + OHmiddot + Fe3+

Kde jsou RONS prospěšneacute

I Aktivniacute centra enzymů

bull Monooxygenasy (cytochromy P450)

bull Ribonukleotidreduktasa (hellipsynteacuteza DNA)

bull Synteacuteza prostanoidů (enzymatickaacute lipoperoxidace)

bull Užitečneacute hemoveacute peroxidasy

15

Kde jsou RONS prospěšneacute

I Aktivniacute centra enzymů

bull Monooxygenasy (cytochromy P450)

ndash Detoxikace xenobiotik synteacuteza steroidniacutech hormonů a žlučovyacutech kyselin NO synthasy

Mechanismus v podstatě řiacutezenaacute Fentonova reakce

Fe3+ + SH + 2 e- + O2 + H+ rarr FeOOH SH

FeOOH SH rarr FeO3+ SH + H2O

FeO3+ SH rarr FeOH3+Sbull rarr Fe3+SOH rarr Fe3+ + SOH

Kde jsou RONS prospěšneacute

I Aktivniacute centra enzymů

bull Monooxygenasy (cytochromy P450)

bull Ribonukleotidreduktasa (hellipsynteacuteza DNA)

bull Synteacuteza prostanoidů (enzymatickaacute lipoperoxidace)

bull Užitečneacute hemoveacute peroxidasy

ndash Thyreoperoxidasa ve štiacutetneacute žlaacuteze

Iminus + H2O2 + 2H+ rarr I+ + 2H2O I+ joduje thyreoglobulin

ndash Myeloperoxidasa neutrofilů

ndash Laktoperoxidasa v mleacuteku hlenu dyacutechaciacutech cest a ve slinaacutech

SCNminus + H2O2 rarr OSCNminus + H2O

(hypothiokyanaacutet OSCNminus je baktericidniacute)

16

Kde jsou RONS prospěšneacute

II Signalizace

bull Např oxid dusnatyacute NOndash relaxace hladkeacuteho svalstva ceacutevniacute stěny

gastrointestinaacutelniacuteho traktu corpus cavernosumpenis

ndash neurotransmitter neuromodulaacutetor v CNS funkce v synaptickeacute plasticitě učeniacute a paměti

ndash inhibice adhese a agregace trombocytů ndash inhibice adhese leukocytůndash (atd)

Superoxid stejně tak uacutečinky protichůdneacute NO

OXID DUSNATYacuteProdukovaacuten NO synthasami

Vasodilatace inhibice aktivace leukocytů inhibice agregace destiček

atd

SUPEROXIDPEROXIDProdukovaacuten NADPH oxidasami

Vasokonstrikce aktivace leukocytů agregace destiček atd

A při setkaacuteniacute se navzaacutejem zničiacute

NO + O2middotndash rarr OONOndash

17

Koncept redoxniacute signalizace

bull Redoxniacute prostřediacute buňky - přibližně daacutenopoměrem GSHGSSG a NADHNAD

bull Redoxniacute sensory na proteinechndash kritickeacute -SH skupiny

ndash Fe-S centra

bull Ciacutele redoxniacute signalizacendash transkripčniacute faktory

ndash proteinkinasy a fosfatasy

Redoxniacutesignalizace

bull Oxidačniacute stres aktivuje určiteacute protein kinasy a transkripčniacute faktory

bull Vyacuteslednyacute efekt např stimulace proliferace senescence (staacuternutiacute) buněk

bull PůsobeniacuteROSantioxidantů v buňce může byacutet velmi specifickeacute

(T Finkel amp NJ Holbrook Nature 408 (2000) 239-247)

18

hellip a velmi

komplikovaneacute

Kde jsou RONS prospěšneacute

III Fagocytoacuteza

bull Neutrofily eosinofily monocyty makrofaacutegy mikroglie

bull Často je potřeba ciacutelovou čaacutestici označit (opsonizace)

bull Uacutekolem fagocytujiacuteciacute buňky je ciacutelovou čaacutestici

ndash Rozpoznat

ndash Pohltit

ndash Zabiacutet

ndash Straacutevit

copy 1998 Garland Publishing

19

Neutrofilniacute granulocyt

(polymorfonukleaacuter)

bull Segmentovaneacute jaacutedrobull Primaacuterniacute (azurofilniacute)

granula lysozym defensiny myeloperoxidasa proteasy

bull Specifickaacute (sekundaacuterniacute) granula NADPH oxidasa kobalofilin laktoferrin lysozym kolagenasa

bull Terciaacuterniacute granula gelatinasa a dalšiacute enzymy

Obrhttpblausencom

Obr httpwalchecklabumnedu_rsrc1417821135388research-interestsneutrophil-recruitment

20

Aktivace fagocytujiacuteciacute buňky

Respiračniacute vzplanutiacute

bull Naacutehleacute zvyacutešeniacute spotřeby kysliacuteku (pro produkci superoxidu ne respiraci)

bull Naacutehleacute zvyacutešeniacute spotřeby glukosy (pro pentosovyacute cyklus ndash dodaacutevaacuteNADPH pro NADPH oxidasu)

NADPH oxidasa

bull Membraacutenovyacute enzym produkujiacuteciacute superoxid vněnebo do fagosomu

bull Katalyzuje reakci

NADPH + 2O2 rarr NADP+ + H+ + 2O2middotndash

bull V klidu latentniacute sestavuje se z 6 podjednotek na buněčneacute membraacuteně při aktivaci fagocytu

bull Nezbytnaacute pro schopnost zabiacutet některeacute pohlceneacutebakterie (hereditaacuterniacute deficit chronickaacute septickaacute

granulomatosa)

bull Takeacute na endotelu a mnoha jinyacutech nefagocytaacuterniacutech buňkaacutech

21

Myeloperoxidasa

bull 2 ndash 5 všech proteinů v neutrofilechbull Hemoprotein zodpovědnyacute za zelenou barvu

hnisubull Nespecifickaacute peroxidasa v těle katalyzuje

předevšiacutem reakciClminus + H2O2 + H+ rarr HClO + H2O

bull Deficit u lidiacute častyacute (1 na 2000-4000) a nemaacutezaacutevažneacute přiacuteznaky

Kyselina chlornaacute

- Slabaacute kyselina (pKa = 75 HClO harr ClOminus + H+)- V kyseleacutem prostřediacute se snadno rozklaacutedaacute na plynnyacute

chlorHClO + H+ + Clminus harr Cl2 + H2O

- Silneacute oxidačniacute činidlo (2HClO + 2eminus rarr Cl2)

- Reakce s Fe2+ nebo superoxidem generuje hydroxylovyacute radikaacutel

HClO + Fe2+ rarr Clndash + Fe3+ + OHmiddotHClO + O2middotndash rarr Clndash + O2 + OHmiddot

- S organickyacutemi aminy poskytuje chloraminy

R-NH2 + HClO rarr R-NH-Cl + H2O

HClO

22

Dalšiacute zbraně neutrofilů

bull Velmi uacutečinneacute proteolytickeacute enzymy elastasa kolagenasa kathepsin G gelatinasa ad

bull Lysozym štěpiacute polysacharid bakteriaacutelniacute stěny Gram+ mikrobů

bull Laktoferrin bere bakteriiacutem železobull Defensiny kationickeacute proteiny tvořiacuteciacute kanaacutely v

bakteriaacutelniacute membraacuteněbull NETs (neutrophil extracellular traps) vlaacutekna z DNA

a serinovyacutech proteas tvořenaacute extracelulaacuterně

Synergie mezi generaacutetory radikaacutelů a dalšiacutemi zbraněmi

např HClO inhibuje α1-antitrypsin

RONS ve vyacutezbroji fagocytů

iNOS je důležitaacute pro makrofaacutegy ale nevyacuteznamnaacute u lidskyacutech neutrofilů Naopak makrofaacutegy nemajiacute myeloperoxidasu

10

Reaktivniacute formy kysliacuteku(Reactive Oxygen Species ROS)

bull Radikaacutelyndash Superoxid O2 middotndash

ndash Hydroperoxyl HO2middotndash Hydroxylovyacute radikaacutel OHmiddotndash Peroxyl ROOmiddotndash Alkoxyl ROmiddot

bull Ne-radikaacutelyndash Peroxid vodiacuteku H2O2

ndash Kyselina chlornaacute HClOndash Ozoacuten O3

ndash Singletovyacute kysliacutek 1O2

Oxid dusnatyacute

bull Vznik v těle

ndash NO synthasovaacute reakce

ndash Tři různeacute NO synthasy- NOS I (neuronaacutelniacute konstitutivniacute)- NOS II (fagocyty inducibilniacute)- NOS III (endoteliaacutelniacute konstitutivniacute)

NO middot

L-Arginin + O2 + NADPH rarr L-Citrulin + NADP+ +NO

11

Oxid dusnatyacute (NO) působiacute relaxaci hladkeacuteho svalstva

ceacutevniacute stěny

Oxid dusnatyacutebull Vlastnosti- Plynnyacute radikaacutel- Reakce s hemovyacutem železem guanylaacutetcyklasy

(hellipfyziologickeacute uacutečinky relaxace hladkeacuteho svalstva atd)- Reakce s hemovyacutem železem hemoglobinu (hellipfyziologickaacute

inaktivace)

- Reakce se sulfhydrylovou skupinou glutathionu atd nanitrosothiol (helliptransport NO)

- Reakce se superoxidem na peroxynitrit a konečněhydroxylovyacute radikaacutel (helliptoxicita)

NO middot

NO + O2middotndash rarr OONOndash peroxynitrit

OONOndash + H+ rarr HOONO rarr OHmiddot + NO2

kyselina peroxydusitaacute hydroxylovyacute radikaacutel

12

Reaktivniacute formy dusiacuteku(Reactive Nitrogen Species RNS)

bull Radikaacutelyndash Oxid dusnatyacute NOndash Oxid dusičityacute NO2

bull Ne-radikaacutelyndash Nitrosonium NO+

ndash Nitroxyl NOndash

ndash Kyselina dusitaacute HNO2

ndash Oxid dusityacute N2O3

ndash Oxid dusičityacute N2O4

ndash Nitronium NO2+

ndash Peroxynitrit ONOO ndash

ndash Alkylperoxynitrit ROONO

Oxidačniacute poškozeniacute biomolekul

bull Lipidy peroxidace polynenasycenyacutechmastnyacutech kyselin v membraacutenaacutech

bull Proteiny oxidace -SH karbonylace -NH2 hydroxylacenitrosylace aromatickyacutechAMK cross-linking degradace

bull Nukleoveacute kyseliny zlomy v řetězci DNA hydroxylace basiacute mutace kancerogenese

13

Peroxidace

lipidů (žluknutiacute)

Dalšiacute osud lipoperoxidů

14

Ionizačniacute zaacuteřeniacuteHydroxylovyacute radikaacutel vznikaacute ionizaciacute vody

H2O + hν rarr H + OHmiddot

Reaktivniacute formy kysliacuteku v organismu

Jednoelektronovou redukciacute kysliacuteku (mitochondrie NADPH oxidasa) vznikaacute superoxid O2

middotndash

Dismutace superoxidu produkuje peroxid vodiacutekuO2

middotndash + O2middotndash + 2 H+ rarr O2 + H2O2

Fentonova reakce s Fe nebo Cu vytvořiacute z peroxiduhydroxylovyacute radikaacutelH2O2 + Fe2+ rarr OHndash + OHmiddot + Fe3+

Kde jsou RONS prospěšneacute

I Aktivniacute centra enzymů

bull Monooxygenasy (cytochromy P450)

bull Ribonukleotidreduktasa (hellipsynteacuteza DNA)

bull Synteacuteza prostanoidů (enzymatickaacute lipoperoxidace)

bull Užitečneacute hemoveacute peroxidasy

15

Kde jsou RONS prospěšneacute

I Aktivniacute centra enzymů

bull Monooxygenasy (cytochromy P450)

ndash Detoxikace xenobiotik synteacuteza steroidniacutech hormonů a žlučovyacutech kyselin NO synthasy

Mechanismus v podstatě řiacutezenaacute Fentonova reakce

Fe3+ + SH + 2 e- + O2 + H+ rarr FeOOH SH

FeOOH SH rarr FeO3+ SH + H2O

FeO3+ SH rarr FeOH3+Sbull rarr Fe3+SOH rarr Fe3+ + SOH

Kde jsou RONS prospěšneacute

I Aktivniacute centra enzymů

bull Monooxygenasy (cytochromy P450)

bull Ribonukleotidreduktasa (hellipsynteacuteza DNA)

bull Synteacuteza prostanoidů (enzymatickaacute lipoperoxidace)

bull Užitečneacute hemoveacute peroxidasy

ndash Thyreoperoxidasa ve štiacutetneacute žlaacuteze

Iminus + H2O2 + 2H+ rarr I+ + 2H2O I+ joduje thyreoglobulin

ndash Myeloperoxidasa neutrofilů

ndash Laktoperoxidasa v mleacuteku hlenu dyacutechaciacutech cest a ve slinaacutech

SCNminus + H2O2 rarr OSCNminus + H2O

(hypothiokyanaacutet OSCNminus je baktericidniacute)

16

Kde jsou RONS prospěšneacute

II Signalizace

bull Např oxid dusnatyacute NOndash relaxace hladkeacuteho svalstva ceacutevniacute stěny

gastrointestinaacutelniacuteho traktu corpus cavernosumpenis

ndash neurotransmitter neuromodulaacutetor v CNS funkce v synaptickeacute plasticitě učeniacute a paměti

ndash inhibice adhese a agregace trombocytů ndash inhibice adhese leukocytůndash (atd)

Superoxid stejně tak uacutečinky protichůdneacute NO

OXID DUSNATYacuteProdukovaacuten NO synthasami

Vasodilatace inhibice aktivace leukocytů inhibice agregace destiček

atd

SUPEROXIDPEROXIDProdukovaacuten NADPH oxidasami

Vasokonstrikce aktivace leukocytů agregace destiček atd

A při setkaacuteniacute se navzaacutejem zničiacute

NO + O2middotndash rarr OONOndash

17

Koncept redoxniacute signalizace

bull Redoxniacute prostřediacute buňky - přibližně daacutenopoměrem GSHGSSG a NADHNAD

bull Redoxniacute sensory na proteinechndash kritickeacute -SH skupiny

ndash Fe-S centra

bull Ciacutele redoxniacute signalizacendash transkripčniacute faktory

ndash proteinkinasy a fosfatasy

Redoxniacutesignalizace

bull Oxidačniacute stres aktivuje určiteacute protein kinasy a transkripčniacute faktory

bull Vyacuteslednyacute efekt např stimulace proliferace senescence (staacuternutiacute) buněk

bull PůsobeniacuteROSantioxidantů v buňce může byacutet velmi specifickeacute

(T Finkel amp NJ Holbrook Nature 408 (2000) 239-247)

18

hellip a velmi

komplikovaneacute

Kde jsou RONS prospěšneacute

III Fagocytoacuteza

bull Neutrofily eosinofily monocyty makrofaacutegy mikroglie

bull Často je potřeba ciacutelovou čaacutestici označit (opsonizace)

bull Uacutekolem fagocytujiacuteciacute buňky je ciacutelovou čaacutestici

ndash Rozpoznat

ndash Pohltit

ndash Zabiacutet

ndash Straacutevit

copy 1998 Garland Publishing

19

Neutrofilniacute granulocyt

(polymorfonukleaacuter)

bull Segmentovaneacute jaacutedrobull Primaacuterniacute (azurofilniacute)

granula lysozym defensiny myeloperoxidasa proteasy

bull Specifickaacute (sekundaacuterniacute) granula NADPH oxidasa kobalofilin laktoferrin lysozym kolagenasa

bull Terciaacuterniacute granula gelatinasa a dalšiacute enzymy

Obrhttpblausencom

Obr httpwalchecklabumnedu_rsrc1417821135388research-interestsneutrophil-recruitment

20

Aktivace fagocytujiacuteciacute buňky

Respiračniacute vzplanutiacute

bull Naacutehleacute zvyacutešeniacute spotřeby kysliacuteku (pro produkci superoxidu ne respiraci)

bull Naacutehleacute zvyacutešeniacute spotřeby glukosy (pro pentosovyacute cyklus ndash dodaacutevaacuteNADPH pro NADPH oxidasu)

NADPH oxidasa

bull Membraacutenovyacute enzym produkujiacuteciacute superoxid vněnebo do fagosomu

bull Katalyzuje reakci

NADPH + 2O2 rarr NADP+ + H+ + 2O2middotndash

bull V klidu latentniacute sestavuje se z 6 podjednotek na buněčneacute membraacuteně při aktivaci fagocytu

bull Nezbytnaacute pro schopnost zabiacutet některeacute pohlceneacutebakterie (hereditaacuterniacute deficit chronickaacute septickaacute

granulomatosa)

bull Takeacute na endotelu a mnoha jinyacutech nefagocytaacuterniacutech buňkaacutech

21

Myeloperoxidasa

bull 2 ndash 5 všech proteinů v neutrofilechbull Hemoprotein zodpovědnyacute za zelenou barvu

hnisubull Nespecifickaacute peroxidasa v těle katalyzuje

předevšiacutem reakciClminus + H2O2 + H+ rarr HClO + H2O

bull Deficit u lidiacute častyacute (1 na 2000-4000) a nemaacutezaacutevažneacute přiacuteznaky

Kyselina chlornaacute

- Slabaacute kyselina (pKa = 75 HClO harr ClOminus + H+)- V kyseleacutem prostřediacute se snadno rozklaacutedaacute na plynnyacute

chlorHClO + H+ + Clminus harr Cl2 + H2O

- Silneacute oxidačniacute činidlo (2HClO + 2eminus rarr Cl2)

- Reakce s Fe2+ nebo superoxidem generuje hydroxylovyacute radikaacutel

HClO + Fe2+ rarr Clndash + Fe3+ + OHmiddotHClO + O2middotndash rarr Clndash + O2 + OHmiddot

- S organickyacutemi aminy poskytuje chloraminy

R-NH2 + HClO rarr R-NH-Cl + H2O

HClO

22

Dalšiacute zbraně neutrofilů

bull Velmi uacutečinneacute proteolytickeacute enzymy elastasa kolagenasa kathepsin G gelatinasa ad

bull Lysozym štěpiacute polysacharid bakteriaacutelniacute stěny Gram+ mikrobů

bull Laktoferrin bere bakteriiacutem železobull Defensiny kationickeacute proteiny tvořiacuteciacute kanaacutely v

bakteriaacutelniacute membraacuteněbull NETs (neutrophil extracellular traps) vlaacutekna z DNA

a serinovyacutech proteas tvořenaacute extracelulaacuterně

Synergie mezi generaacutetory radikaacutelů a dalšiacutemi zbraněmi

např HClO inhibuje α1-antitrypsin

RONS ve vyacutezbroji fagocytů

iNOS je důležitaacute pro makrofaacutegy ale nevyacuteznamnaacute u lidskyacutech neutrofilů Naopak makrofaacutegy nemajiacute myeloperoxidasu

11

Oxid dusnatyacute (NO) působiacute relaxaci hladkeacuteho svalstva

ceacutevniacute stěny

Oxid dusnatyacutebull Vlastnosti- Plynnyacute radikaacutel- Reakce s hemovyacutem železem guanylaacutetcyklasy

(hellipfyziologickeacute uacutečinky relaxace hladkeacuteho svalstva atd)- Reakce s hemovyacutem železem hemoglobinu (hellipfyziologickaacute

inaktivace)

- Reakce se sulfhydrylovou skupinou glutathionu atd nanitrosothiol (helliptransport NO)

- Reakce se superoxidem na peroxynitrit a konečněhydroxylovyacute radikaacutel (helliptoxicita)

NO middot

NO + O2middotndash rarr OONOndash peroxynitrit

OONOndash + H+ rarr HOONO rarr OHmiddot + NO2

kyselina peroxydusitaacute hydroxylovyacute radikaacutel

12

Reaktivniacute formy dusiacuteku(Reactive Nitrogen Species RNS)

bull Radikaacutelyndash Oxid dusnatyacute NOndash Oxid dusičityacute NO2

bull Ne-radikaacutelyndash Nitrosonium NO+

ndash Nitroxyl NOndash

ndash Kyselina dusitaacute HNO2

ndash Oxid dusityacute N2O3

ndash Oxid dusičityacute N2O4

ndash Nitronium NO2+

ndash Peroxynitrit ONOO ndash

ndash Alkylperoxynitrit ROONO

Oxidačniacute poškozeniacute biomolekul

bull Lipidy peroxidace polynenasycenyacutechmastnyacutech kyselin v membraacutenaacutech

bull Proteiny oxidace -SH karbonylace -NH2 hydroxylacenitrosylace aromatickyacutechAMK cross-linking degradace

bull Nukleoveacute kyseliny zlomy v řetězci DNA hydroxylace basiacute mutace kancerogenese

13

Peroxidace

lipidů (žluknutiacute)

Dalšiacute osud lipoperoxidů

14

Ionizačniacute zaacuteřeniacuteHydroxylovyacute radikaacutel vznikaacute ionizaciacute vody

H2O + hν rarr H + OHmiddot

Reaktivniacute formy kysliacuteku v organismu

Jednoelektronovou redukciacute kysliacuteku (mitochondrie NADPH oxidasa) vznikaacute superoxid O2

middotndash

Dismutace superoxidu produkuje peroxid vodiacutekuO2

middotndash + O2middotndash + 2 H+ rarr O2 + H2O2

Fentonova reakce s Fe nebo Cu vytvořiacute z peroxiduhydroxylovyacute radikaacutelH2O2 + Fe2+ rarr OHndash + OHmiddot + Fe3+

Kde jsou RONS prospěšneacute

I Aktivniacute centra enzymů

bull Monooxygenasy (cytochromy P450)

bull Ribonukleotidreduktasa (hellipsynteacuteza DNA)

bull Synteacuteza prostanoidů (enzymatickaacute lipoperoxidace)

bull Užitečneacute hemoveacute peroxidasy

15

Kde jsou RONS prospěšneacute

I Aktivniacute centra enzymů

bull Monooxygenasy (cytochromy P450)

ndash Detoxikace xenobiotik synteacuteza steroidniacutech hormonů a žlučovyacutech kyselin NO synthasy

Mechanismus v podstatě řiacutezenaacute Fentonova reakce

Fe3+ + SH + 2 e- + O2 + H+ rarr FeOOH SH

FeOOH SH rarr FeO3+ SH + H2O

FeO3+ SH rarr FeOH3+Sbull rarr Fe3+SOH rarr Fe3+ + SOH

Kde jsou RONS prospěšneacute

I Aktivniacute centra enzymů

bull Monooxygenasy (cytochromy P450)

bull Ribonukleotidreduktasa (hellipsynteacuteza DNA)

bull Synteacuteza prostanoidů (enzymatickaacute lipoperoxidace)

bull Užitečneacute hemoveacute peroxidasy

ndash Thyreoperoxidasa ve štiacutetneacute žlaacuteze

Iminus + H2O2 + 2H+ rarr I+ + 2H2O I+ joduje thyreoglobulin

ndash Myeloperoxidasa neutrofilů

ndash Laktoperoxidasa v mleacuteku hlenu dyacutechaciacutech cest a ve slinaacutech

SCNminus + H2O2 rarr OSCNminus + H2O

(hypothiokyanaacutet OSCNminus je baktericidniacute)

16

Kde jsou RONS prospěšneacute

II Signalizace

bull Např oxid dusnatyacute NOndash relaxace hladkeacuteho svalstva ceacutevniacute stěny

gastrointestinaacutelniacuteho traktu corpus cavernosumpenis

ndash neurotransmitter neuromodulaacutetor v CNS funkce v synaptickeacute plasticitě učeniacute a paměti

ndash inhibice adhese a agregace trombocytů ndash inhibice adhese leukocytůndash (atd)

Superoxid stejně tak uacutečinky protichůdneacute NO

OXID DUSNATYacuteProdukovaacuten NO synthasami

Vasodilatace inhibice aktivace leukocytů inhibice agregace destiček

atd

SUPEROXIDPEROXIDProdukovaacuten NADPH oxidasami

Vasokonstrikce aktivace leukocytů agregace destiček atd

A při setkaacuteniacute se navzaacutejem zničiacute

NO + O2middotndash rarr OONOndash

17

Koncept redoxniacute signalizace

bull Redoxniacute prostřediacute buňky - přibližně daacutenopoměrem GSHGSSG a NADHNAD

bull Redoxniacute sensory na proteinechndash kritickeacute -SH skupiny

ndash Fe-S centra

bull Ciacutele redoxniacute signalizacendash transkripčniacute faktory

ndash proteinkinasy a fosfatasy

Redoxniacutesignalizace

bull Oxidačniacute stres aktivuje určiteacute protein kinasy a transkripčniacute faktory

bull Vyacuteslednyacute efekt např stimulace proliferace senescence (staacuternutiacute) buněk

bull PůsobeniacuteROSantioxidantů v buňce může byacutet velmi specifickeacute

(T Finkel amp NJ Holbrook Nature 408 (2000) 239-247)

18

hellip a velmi

komplikovaneacute

Kde jsou RONS prospěšneacute

III Fagocytoacuteza

bull Neutrofily eosinofily monocyty makrofaacutegy mikroglie

bull Často je potřeba ciacutelovou čaacutestici označit (opsonizace)

bull Uacutekolem fagocytujiacuteciacute buňky je ciacutelovou čaacutestici

ndash Rozpoznat

ndash Pohltit

ndash Zabiacutet

ndash Straacutevit

copy 1998 Garland Publishing

19

Neutrofilniacute granulocyt

(polymorfonukleaacuter)

bull Segmentovaneacute jaacutedrobull Primaacuterniacute (azurofilniacute)

granula lysozym defensiny myeloperoxidasa proteasy

bull Specifickaacute (sekundaacuterniacute) granula NADPH oxidasa kobalofilin laktoferrin lysozym kolagenasa

bull Terciaacuterniacute granula gelatinasa a dalšiacute enzymy

Obrhttpblausencom

Obr httpwalchecklabumnedu_rsrc1417821135388research-interestsneutrophil-recruitment

20

Aktivace fagocytujiacuteciacute buňky

Respiračniacute vzplanutiacute

bull Naacutehleacute zvyacutešeniacute spotřeby kysliacuteku (pro produkci superoxidu ne respiraci)

bull Naacutehleacute zvyacutešeniacute spotřeby glukosy (pro pentosovyacute cyklus ndash dodaacutevaacuteNADPH pro NADPH oxidasu)

NADPH oxidasa

bull Membraacutenovyacute enzym produkujiacuteciacute superoxid vněnebo do fagosomu

bull Katalyzuje reakci

NADPH + 2O2 rarr NADP+ + H+ + 2O2middotndash

bull V klidu latentniacute sestavuje se z 6 podjednotek na buněčneacute membraacuteně při aktivaci fagocytu

bull Nezbytnaacute pro schopnost zabiacutet některeacute pohlceneacutebakterie (hereditaacuterniacute deficit chronickaacute septickaacute

granulomatosa)

bull Takeacute na endotelu a mnoha jinyacutech nefagocytaacuterniacutech buňkaacutech

21

Myeloperoxidasa

bull 2 ndash 5 všech proteinů v neutrofilechbull Hemoprotein zodpovědnyacute za zelenou barvu

hnisubull Nespecifickaacute peroxidasa v těle katalyzuje

předevšiacutem reakciClminus + H2O2 + H+ rarr HClO + H2O

bull Deficit u lidiacute častyacute (1 na 2000-4000) a nemaacutezaacutevažneacute přiacuteznaky

Kyselina chlornaacute

- Slabaacute kyselina (pKa = 75 HClO harr ClOminus + H+)- V kyseleacutem prostřediacute se snadno rozklaacutedaacute na plynnyacute

chlorHClO + H+ + Clminus harr Cl2 + H2O

- Silneacute oxidačniacute činidlo (2HClO + 2eminus rarr Cl2)

- Reakce s Fe2+ nebo superoxidem generuje hydroxylovyacute radikaacutel

HClO + Fe2+ rarr Clndash + Fe3+ + OHmiddotHClO + O2middotndash rarr Clndash + O2 + OHmiddot

- S organickyacutemi aminy poskytuje chloraminy

R-NH2 + HClO rarr R-NH-Cl + H2O

HClO

22

Dalšiacute zbraně neutrofilů

bull Velmi uacutečinneacute proteolytickeacute enzymy elastasa kolagenasa kathepsin G gelatinasa ad

bull Lysozym štěpiacute polysacharid bakteriaacutelniacute stěny Gram+ mikrobů

bull Laktoferrin bere bakteriiacutem železobull Defensiny kationickeacute proteiny tvořiacuteciacute kanaacutely v

bakteriaacutelniacute membraacuteněbull NETs (neutrophil extracellular traps) vlaacutekna z DNA

a serinovyacutech proteas tvořenaacute extracelulaacuterně

Synergie mezi generaacutetory radikaacutelů a dalšiacutemi zbraněmi

např HClO inhibuje α1-antitrypsin

RONS ve vyacutezbroji fagocytů

iNOS je důležitaacute pro makrofaacutegy ale nevyacuteznamnaacute u lidskyacutech neutrofilů Naopak makrofaacutegy nemajiacute myeloperoxidasu

12

Reaktivniacute formy dusiacuteku(Reactive Nitrogen Species RNS)

bull Radikaacutelyndash Oxid dusnatyacute NOndash Oxid dusičityacute NO2

bull Ne-radikaacutelyndash Nitrosonium NO+

ndash Nitroxyl NOndash

ndash Kyselina dusitaacute HNO2

ndash Oxid dusityacute N2O3

ndash Oxid dusičityacute N2O4

ndash Nitronium NO2+

ndash Peroxynitrit ONOO ndash

ndash Alkylperoxynitrit ROONO

Oxidačniacute poškozeniacute biomolekul

bull Lipidy peroxidace polynenasycenyacutechmastnyacutech kyselin v membraacutenaacutech

bull Proteiny oxidace -SH karbonylace -NH2 hydroxylacenitrosylace aromatickyacutechAMK cross-linking degradace

bull Nukleoveacute kyseliny zlomy v řetězci DNA hydroxylace basiacute mutace kancerogenese

13

Peroxidace

lipidů (žluknutiacute)

Dalšiacute osud lipoperoxidů

14

Ionizačniacute zaacuteřeniacuteHydroxylovyacute radikaacutel vznikaacute ionizaciacute vody

H2O + hν rarr H + OHmiddot

Reaktivniacute formy kysliacuteku v organismu

Jednoelektronovou redukciacute kysliacuteku (mitochondrie NADPH oxidasa) vznikaacute superoxid O2

middotndash

Dismutace superoxidu produkuje peroxid vodiacutekuO2

middotndash + O2middotndash + 2 H+ rarr O2 + H2O2

Fentonova reakce s Fe nebo Cu vytvořiacute z peroxiduhydroxylovyacute radikaacutelH2O2 + Fe2+ rarr OHndash + OHmiddot + Fe3+

Kde jsou RONS prospěšneacute

I Aktivniacute centra enzymů

bull Monooxygenasy (cytochromy P450)

bull Ribonukleotidreduktasa (hellipsynteacuteza DNA)

bull Synteacuteza prostanoidů (enzymatickaacute lipoperoxidace)

bull Užitečneacute hemoveacute peroxidasy

15

Kde jsou RONS prospěšneacute

I Aktivniacute centra enzymů

bull Monooxygenasy (cytochromy P450)

ndash Detoxikace xenobiotik synteacuteza steroidniacutech hormonů a žlučovyacutech kyselin NO synthasy

Mechanismus v podstatě řiacutezenaacute Fentonova reakce

Fe3+ + SH + 2 e- + O2 + H+ rarr FeOOH SH

FeOOH SH rarr FeO3+ SH + H2O

FeO3+ SH rarr FeOH3+Sbull rarr Fe3+SOH rarr Fe3+ + SOH

Kde jsou RONS prospěšneacute

I Aktivniacute centra enzymů

bull Monooxygenasy (cytochromy P450)

bull Ribonukleotidreduktasa (hellipsynteacuteza DNA)

bull Synteacuteza prostanoidů (enzymatickaacute lipoperoxidace)

bull Užitečneacute hemoveacute peroxidasy

ndash Thyreoperoxidasa ve štiacutetneacute žlaacuteze

Iminus + H2O2 + 2H+ rarr I+ + 2H2O I+ joduje thyreoglobulin

ndash Myeloperoxidasa neutrofilů

ndash Laktoperoxidasa v mleacuteku hlenu dyacutechaciacutech cest a ve slinaacutech

SCNminus + H2O2 rarr OSCNminus + H2O

(hypothiokyanaacutet OSCNminus je baktericidniacute)

16

Kde jsou RONS prospěšneacute

II Signalizace

bull Např oxid dusnatyacute NOndash relaxace hladkeacuteho svalstva ceacutevniacute stěny

gastrointestinaacutelniacuteho traktu corpus cavernosumpenis

ndash neurotransmitter neuromodulaacutetor v CNS funkce v synaptickeacute plasticitě učeniacute a paměti

ndash inhibice adhese a agregace trombocytů ndash inhibice adhese leukocytůndash (atd)

Superoxid stejně tak uacutečinky protichůdneacute NO

OXID DUSNATYacuteProdukovaacuten NO synthasami

Vasodilatace inhibice aktivace leukocytů inhibice agregace destiček

atd

SUPEROXIDPEROXIDProdukovaacuten NADPH oxidasami

Vasokonstrikce aktivace leukocytů agregace destiček atd

A při setkaacuteniacute se navzaacutejem zničiacute

NO + O2middotndash rarr OONOndash

17

Koncept redoxniacute signalizace

bull Redoxniacute prostřediacute buňky - přibližně daacutenopoměrem GSHGSSG a NADHNAD

bull Redoxniacute sensory na proteinechndash kritickeacute -SH skupiny

ndash Fe-S centra

bull Ciacutele redoxniacute signalizacendash transkripčniacute faktory

ndash proteinkinasy a fosfatasy

Redoxniacutesignalizace

bull Oxidačniacute stres aktivuje určiteacute protein kinasy a transkripčniacute faktory

bull Vyacuteslednyacute efekt např stimulace proliferace senescence (staacuternutiacute) buněk

bull PůsobeniacuteROSantioxidantů v buňce může byacutet velmi specifickeacute

(T Finkel amp NJ Holbrook Nature 408 (2000) 239-247)

18

hellip a velmi

komplikovaneacute

Kde jsou RONS prospěšneacute

III Fagocytoacuteza

bull Neutrofily eosinofily monocyty makrofaacutegy mikroglie

bull Často je potřeba ciacutelovou čaacutestici označit (opsonizace)

bull Uacutekolem fagocytujiacuteciacute buňky je ciacutelovou čaacutestici

ndash Rozpoznat

ndash Pohltit

ndash Zabiacutet

ndash Straacutevit

copy 1998 Garland Publishing

19

Neutrofilniacute granulocyt

(polymorfonukleaacuter)

bull Segmentovaneacute jaacutedrobull Primaacuterniacute (azurofilniacute)

granula lysozym defensiny myeloperoxidasa proteasy

bull Specifickaacute (sekundaacuterniacute) granula NADPH oxidasa kobalofilin laktoferrin lysozym kolagenasa

bull Terciaacuterniacute granula gelatinasa a dalšiacute enzymy

Obrhttpblausencom

Obr httpwalchecklabumnedu_rsrc1417821135388research-interestsneutrophil-recruitment

20

Aktivace fagocytujiacuteciacute buňky

Respiračniacute vzplanutiacute

bull Naacutehleacute zvyacutešeniacute spotřeby kysliacuteku (pro produkci superoxidu ne respiraci)

bull Naacutehleacute zvyacutešeniacute spotřeby glukosy (pro pentosovyacute cyklus ndash dodaacutevaacuteNADPH pro NADPH oxidasu)

NADPH oxidasa

bull Membraacutenovyacute enzym produkujiacuteciacute superoxid vněnebo do fagosomu

bull Katalyzuje reakci

NADPH + 2O2 rarr NADP+ + H+ + 2O2middotndash

bull V klidu latentniacute sestavuje se z 6 podjednotek na buněčneacute membraacuteně při aktivaci fagocytu

bull Nezbytnaacute pro schopnost zabiacutet některeacute pohlceneacutebakterie (hereditaacuterniacute deficit chronickaacute septickaacute

granulomatosa)

bull Takeacute na endotelu a mnoha jinyacutech nefagocytaacuterniacutech buňkaacutech

21

Myeloperoxidasa

bull 2 ndash 5 všech proteinů v neutrofilechbull Hemoprotein zodpovědnyacute za zelenou barvu

hnisubull Nespecifickaacute peroxidasa v těle katalyzuje

předevšiacutem reakciClminus + H2O2 + H+ rarr HClO + H2O

bull Deficit u lidiacute častyacute (1 na 2000-4000) a nemaacutezaacutevažneacute přiacuteznaky

Kyselina chlornaacute

- Slabaacute kyselina (pKa = 75 HClO harr ClOminus + H+)- V kyseleacutem prostřediacute se snadno rozklaacutedaacute na plynnyacute

chlorHClO + H+ + Clminus harr Cl2 + H2O

- Silneacute oxidačniacute činidlo (2HClO + 2eminus rarr Cl2)

- Reakce s Fe2+ nebo superoxidem generuje hydroxylovyacute radikaacutel

HClO + Fe2+ rarr Clndash + Fe3+ + OHmiddotHClO + O2middotndash rarr Clndash + O2 + OHmiddot

- S organickyacutemi aminy poskytuje chloraminy

R-NH2 + HClO rarr R-NH-Cl + H2O

HClO

22

Dalšiacute zbraně neutrofilů

bull Velmi uacutečinneacute proteolytickeacute enzymy elastasa kolagenasa kathepsin G gelatinasa ad

bull Lysozym štěpiacute polysacharid bakteriaacutelniacute stěny Gram+ mikrobů

bull Laktoferrin bere bakteriiacutem železobull Defensiny kationickeacute proteiny tvořiacuteciacute kanaacutely v

bakteriaacutelniacute membraacuteněbull NETs (neutrophil extracellular traps) vlaacutekna z DNA

a serinovyacutech proteas tvořenaacute extracelulaacuterně

Synergie mezi generaacutetory radikaacutelů a dalšiacutemi zbraněmi

např HClO inhibuje α1-antitrypsin

RONS ve vyacutezbroji fagocytů

iNOS je důležitaacute pro makrofaacutegy ale nevyacuteznamnaacute u lidskyacutech neutrofilů Naopak makrofaacutegy nemajiacute myeloperoxidasu

13

Peroxidace

lipidů (žluknutiacute)

Dalšiacute osud lipoperoxidů

14

Ionizačniacute zaacuteřeniacuteHydroxylovyacute radikaacutel vznikaacute ionizaciacute vody

H2O + hν rarr H + OHmiddot

Reaktivniacute formy kysliacuteku v organismu

Jednoelektronovou redukciacute kysliacuteku (mitochondrie NADPH oxidasa) vznikaacute superoxid O2

middotndash

Dismutace superoxidu produkuje peroxid vodiacutekuO2

middotndash + O2middotndash + 2 H+ rarr O2 + H2O2

Fentonova reakce s Fe nebo Cu vytvořiacute z peroxiduhydroxylovyacute radikaacutelH2O2 + Fe2+ rarr OHndash + OHmiddot + Fe3+

Kde jsou RONS prospěšneacute

I Aktivniacute centra enzymů

bull Monooxygenasy (cytochromy P450)

bull Ribonukleotidreduktasa (hellipsynteacuteza DNA)

bull Synteacuteza prostanoidů (enzymatickaacute lipoperoxidace)

bull Užitečneacute hemoveacute peroxidasy

15

Kde jsou RONS prospěšneacute

I Aktivniacute centra enzymů

bull Monooxygenasy (cytochromy P450)

ndash Detoxikace xenobiotik synteacuteza steroidniacutech hormonů a žlučovyacutech kyselin NO synthasy

Mechanismus v podstatě řiacutezenaacute Fentonova reakce

Fe3+ + SH + 2 e- + O2 + H+ rarr FeOOH SH

FeOOH SH rarr FeO3+ SH + H2O

FeO3+ SH rarr FeOH3+Sbull rarr Fe3+SOH rarr Fe3+ + SOH

Kde jsou RONS prospěšneacute

I Aktivniacute centra enzymů

bull Monooxygenasy (cytochromy P450)

bull Ribonukleotidreduktasa (hellipsynteacuteza DNA)

bull Synteacuteza prostanoidů (enzymatickaacute lipoperoxidace)

bull Užitečneacute hemoveacute peroxidasy

ndash Thyreoperoxidasa ve štiacutetneacute žlaacuteze

Iminus + H2O2 + 2H+ rarr I+ + 2H2O I+ joduje thyreoglobulin

ndash Myeloperoxidasa neutrofilů

ndash Laktoperoxidasa v mleacuteku hlenu dyacutechaciacutech cest a ve slinaacutech

SCNminus + H2O2 rarr OSCNminus + H2O

(hypothiokyanaacutet OSCNminus je baktericidniacute)

16

Kde jsou RONS prospěšneacute

II Signalizace

bull Např oxid dusnatyacute NOndash relaxace hladkeacuteho svalstva ceacutevniacute stěny

gastrointestinaacutelniacuteho traktu corpus cavernosumpenis

ndash neurotransmitter neuromodulaacutetor v CNS funkce v synaptickeacute plasticitě učeniacute a paměti

ndash inhibice adhese a agregace trombocytů ndash inhibice adhese leukocytůndash (atd)

Superoxid stejně tak uacutečinky protichůdneacute NO

OXID DUSNATYacuteProdukovaacuten NO synthasami

Vasodilatace inhibice aktivace leukocytů inhibice agregace destiček

atd

SUPEROXIDPEROXIDProdukovaacuten NADPH oxidasami

Vasokonstrikce aktivace leukocytů agregace destiček atd

A při setkaacuteniacute se navzaacutejem zničiacute

NO + O2middotndash rarr OONOndash

17

Koncept redoxniacute signalizace

bull Redoxniacute prostřediacute buňky - přibližně daacutenopoměrem GSHGSSG a NADHNAD

bull Redoxniacute sensory na proteinechndash kritickeacute -SH skupiny

ndash Fe-S centra

bull Ciacutele redoxniacute signalizacendash transkripčniacute faktory

ndash proteinkinasy a fosfatasy

Redoxniacutesignalizace

bull Oxidačniacute stres aktivuje určiteacute protein kinasy a transkripčniacute faktory

bull Vyacuteslednyacute efekt např stimulace proliferace senescence (staacuternutiacute) buněk

bull PůsobeniacuteROSantioxidantů v buňce může byacutet velmi specifickeacute

(T Finkel amp NJ Holbrook Nature 408 (2000) 239-247)

18

hellip a velmi

komplikovaneacute

Kde jsou RONS prospěšneacute

III Fagocytoacuteza

bull Neutrofily eosinofily monocyty makrofaacutegy mikroglie

bull Často je potřeba ciacutelovou čaacutestici označit (opsonizace)

bull Uacutekolem fagocytujiacuteciacute buňky je ciacutelovou čaacutestici

ndash Rozpoznat

ndash Pohltit

ndash Zabiacutet

ndash Straacutevit

copy 1998 Garland Publishing

19

Neutrofilniacute granulocyt

(polymorfonukleaacuter)

bull Segmentovaneacute jaacutedrobull Primaacuterniacute (azurofilniacute)

granula lysozym defensiny myeloperoxidasa proteasy

bull Specifickaacute (sekundaacuterniacute) granula NADPH oxidasa kobalofilin laktoferrin lysozym kolagenasa

bull Terciaacuterniacute granula gelatinasa a dalšiacute enzymy

Obrhttpblausencom

Obr httpwalchecklabumnedu_rsrc1417821135388research-interestsneutrophil-recruitment

20

Aktivace fagocytujiacuteciacute buňky

Respiračniacute vzplanutiacute

bull Naacutehleacute zvyacutešeniacute spotřeby kysliacuteku (pro produkci superoxidu ne respiraci)

bull Naacutehleacute zvyacutešeniacute spotřeby glukosy (pro pentosovyacute cyklus ndash dodaacutevaacuteNADPH pro NADPH oxidasu)

NADPH oxidasa

bull Membraacutenovyacute enzym produkujiacuteciacute superoxid vněnebo do fagosomu

bull Katalyzuje reakci

NADPH + 2O2 rarr NADP+ + H+ + 2O2middotndash

bull V klidu latentniacute sestavuje se z 6 podjednotek na buněčneacute membraacuteně při aktivaci fagocytu

bull Nezbytnaacute pro schopnost zabiacutet některeacute pohlceneacutebakterie (hereditaacuterniacute deficit chronickaacute septickaacute

granulomatosa)

bull Takeacute na endotelu a mnoha jinyacutech nefagocytaacuterniacutech buňkaacutech

21

Myeloperoxidasa

bull 2 ndash 5 všech proteinů v neutrofilechbull Hemoprotein zodpovědnyacute za zelenou barvu

hnisubull Nespecifickaacute peroxidasa v těle katalyzuje

předevšiacutem reakciClminus + H2O2 + H+ rarr HClO + H2O

bull Deficit u lidiacute častyacute (1 na 2000-4000) a nemaacutezaacutevažneacute přiacuteznaky

Kyselina chlornaacute

- Slabaacute kyselina (pKa = 75 HClO harr ClOminus + H+)- V kyseleacutem prostřediacute se snadno rozklaacutedaacute na plynnyacute

chlorHClO + H+ + Clminus harr Cl2 + H2O

- Silneacute oxidačniacute činidlo (2HClO + 2eminus rarr Cl2)

- Reakce s Fe2+ nebo superoxidem generuje hydroxylovyacute radikaacutel

HClO + Fe2+ rarr Clndash + Fe3+ + OHmiddotHClO + O2middotndash rarr Clndash + O2 + OHmiddot

- S organickyacutemi aminy poskytuje chloraminy

R-NH2 + HClO rarr R-NH-Cl + H2O

HClO

22

Dalšiacute zbraně neutrofilů

bull Velmi uacutečinneacute proteolytickeacute enzymy elastasa kolagenasa kathepsin G gelatinasa ad

bull Lysozym štěpiacute polysacharid bakteriaacutelniacute stěny Gram+ mikrobů

bull Laktoferrin bere bakteriiacutem železobull Defensiny kationickeacute proteiny tvořiacuteciacute kanaacutely v

bakteriaacutelniacute membraacuteněbull NETs (neutrophil extracellular traps) vlaacutekna z DNA

a serinovyacutech proteas tvořenaacute extracelulaacuterně

Synergie mezi generaacutetory radikaacutelů a dalšiacutemi zbraněmi

např HClO inhibuje α1-antitrypsin

RONS ve vyacutezbroji fagocytů

iNOS je důležitaacute pro makrofaacutegy ale nevyacuteznamnaacute u lidskyacutech neutrofilů Naopak makrofaacutegy nemajiacute myeloperoxidasu

14

Ionizačniacute zaacuteřeniacuteHydroxylovyacute radikaacutel vznikaacute ionizaciacute vody

H2O + hν rarr H + OHmiddot

Reaktivniacute formy kysliacuteku v organismu

Jednoelektronovou redukciacute kysliacuteku (mitochondrie NADPH oxidasa) vznikaacute superoxid O2

middotndash

Dismutace superoxidu produkuje peroxid vodiacutekuO2

middotndash + O2middotndash + 2 H+ rarr O2 + H2O2

Fentonova reakce s Fe nebo Cu vytvořiacute z peroxiduhydroxylovyacute radikaacutelH2O2 + Fe2+ rarr OHndash + OHmiddot + Fe3+

Kde jsou RONS prospěšneacute

I Aktivniacute centra enzymů

bull Monooxygenasy (cytochromy P450)

bull Ribonukleotidreduktasa (hellipsynteacuteza DNA)

bull Synteacuteza prostanoidů (enzymatickaacute lipoperoxidace)

bull Užitečneacute hemoveacute peroxidasy

15

Kde jsou RONS prospěšneacute

I Aktivniacute centra enzymů

bull Monooxygenasy (cytochromy P450)

ndash Detoxikace xenobiotik synteacuteza steroidniacutech hormonů a žlučovyacutech kyselin NO synthasy

Mechanismus v podstatě řiacutezenaacute Fentonova reakce

Fe3+ + SH + 2 e- + O2 + H+ rarr FeOOH SH

FeOOH SH rarr FeO3+ SH + H2O

FeO3+ SH rarr FeOH3+Sbull rarr Fe3+SOH rarr Fe3+ + SOH

Kde jsou RONS prospěšneacute

I Aktivniacute centra enzymů

bull Monooxygenasy (cytochromy P450)

bull Ribonukleotidreduktasa (hellipsynteacuteza DNA)

bull Synteacuteza prostanoidů (enzymatickaacute lipoperoxidace)

bull Užitečneacute hemoveacute peroxidasy

ndash Thyreoperoxidasa ve štiacutetneacute žlaacuteze

Iminus + H2O2 + 2H+ rarr I+ + 2H2O I+ joduje thyreoglobulin

ndash Myeloperoxidasa neutrofilů

ndash Laktoperoxidasa v mleacuteku hlenu dyacutechaciacutech cest a ve slinaacutech

SCNminus + H2O2 rarr OSCNminus + H2O

(hypothiokyanaacutet OSCNminus je baktericidniacute)

16

Kde jsou RONS prospěšneacute

II Signalizace

bull Např oxid dusnatyacute NOndash relaxace hladkeacuteho svalstva ceacutevniacute stěny

gastrointestinaacutelniacuteho traktu corpus cavernosumpenis

ndash neurotransmitter neuromodulaacutetor v CNS funkce v synaptickeacute plasticitě učeniacute a paměti

ndash inhibice adhese a agregace trombocytů ndash inhibice adhese leukocytůndash (atd)

Superoxid stejně tak uacutečinky protichůdneacute NO

OXID DUSNATYacuteProdukovaacuten NO synthasami

Vasodilatace inhibice aktivace leukocytů inhibice agregace destiček

atd

SUPEROXIDPEROXIDProdukovaacuten NADPH oxidasami

Vasokonstrikce aktivace leukocytů agregace destiček atd

A při setkaacuteniacute se navzaacutejem zničiacute

NO + O2middotndash rarr OONOndash

17

Koncept redoxniacute signalizace

bull Redoxniacute prostřediacute buňky - přibližně daacutenopoměrem GSHGSSG a NADHNAD

bull Redoxniacute sensory na proteinechndash kritickeacute -SH skupiny

ndash Fe-S centra

bull Ciacutele redoxniacute signalizacendash transkripčniacute faktory

ndash proteinkinasy a fosfatasy

Redoxniacutesignalizace

bull Oxidačniacute stres aktivuje určiteacute protein kinasy a transkripčniacute faktory

bull Vyacuteslednyacute efekt např stimulace proliferace senescence (staacuternutiacute) buněk

bull PůsobeniacuteROSantioxidantů v buňce může byacutet velmi specifickeacute

(T Finkel amp NJ Holbrook Nature 408 (2000) 239-247)

18

hellip a velmi

komplikovaneacute

Kde jsou RONS prospěšneacute

III Fagocytoacuteza

bull Neutrofily eosinofily monocyty makrofaacutegy mikroglie

bull Často je potřeba ciacutelovou čaacutestici označit (opsonizace)

bull Uacutekolem fagocytujiacuteciacute buňky je ciacutelovou čaacutestici

ndash Rozpoznat

ndash Pohltit

ndash Zabiacutet

ndash Straacutevit

copy 1998 Garland Publishing

19

Neutrofilniacute granulocyt

(polymorfonukleaacuter)

bull Segmentovaneacute jaacutedrobull Primaacuterniacute (azurofilniacute)

granula lysozym defensiny myeloperoxidasa proteasy

bull Specifickaacute (sekundaacuterniacute) granula NADPH oxidasa kobalofilin laktoferrin lysozym kolagenasa

bull Terciaacuterniacute granula gelatinasa a dalšiacute enzymy

Obrhttpblausencom

Obr httpwalchecklabumnedu_rsrc1417821135388research-interestsneutrophil-recruitment

20

Aktivace fagocytujiacuteciacute buňky

Respiračniacute vzplanutiacute

bull Naacutehleacute zvyacutešeniacute spotřeby kysliacuteku (pro produkci superoxidu ne respiraci)

bull Naacutehleacute zvyacutešeniacute spotřeby glukosy (pro pentosovyacute cyklus ndash dodaacutevaacuteNADPH pro NADPH oxidasu)

NADPH oxidasa

bull Membraacutenovyacute enzym produkujiacuteciacute superoxid vněnebo do fagosomu

bull Katalyzuje reakci

NADPH + 2O2 rarr NADP+ + H+ + 2O2middotndash

bull V klidu latentniacute sestavuje se z 6 podjednotek na buněčneacute membraacuteně při aktivaci fagocytu

bull Nezbytnaacute pro schopnost zabiacutet některeacute pohlceneacutebakterie (hereditaacuterniacute deficit chronickaacute septickaacute

granulomatosa)

bull Takeacute na endotelu a mnoha jinyacutech nefagocytaacuterniacutech buňkaacutech

21

Myeloperoxidasa

bull 2 ndash 5 všech proteinů v neutrofilechbull Hemoprotein zodpovědnyacute za zelenou barvu

hnisubull Nespecifickaacute peroxidasa v těle katalyzuje

předevšiacutem reakciClminus + H2O2 + H+ rarr HClO + H2O

bull Deficit u lidiacute častyacute (1 na 2000-4000) a nemaacutezaacutevažneacute přiacuteznaky

Kyselina chlornaacute

- Slabaacute kyselina (pKa = 75 HClO harr ClOminus + H+)- V kyseleacutem prostřediacute se snadno rozklaacutedaacute na plynnyacute

chlorHClO + H+ + Clminus harr Cl2 + H2O

- Silneacute oxidačniacute činidlo (2HClO + 2eminus rarr Cl2)

- Reakce s Fe2+ nebo superoxidem generuje hydroxylovyacute radikaacutel

HClO + Fe2+ rarr Clndash + Fe3+ + OHmiddotHClO + O2middotndash rarr Clndash + O2 + OHmiddot

- S organickyacutemi aminy poskytuje chloraminy

R-NH2 + HClO rarr R-NH-Cl + H2O

HClO

22

Dalšiacute zbraně neutrofilů

bull Velmi uacutečinneacute proteolytickeacute enzymy elastasa kolagenasa kathepsin G gelatinasa ad

bull Lysozym štěpiacute polysacharid bakteriaacutelniacute stěny Gram+ mikrobů

bull Laktoferrin bere bakteriiacutem železobull Defensiny kationickeacute proteiny tvořiacuteciacute kanaacutely v

bakteriaacutelniacute membraacuteněbull NETs (neutrophil extracellular traps) vlaacutekna z DNA

a serinovyacutech proteas tvořenaacute extracelulaacuterně

Synergie mezi generaacutetory radikaacutelů a dalšiacutemi zbraněmi

např HClO inhibuje α1-antitrypsin

RONS ve vyacutezbroji fagocytů

iNOS je důležitaacute pro makrofaacutegy ale nevyacuteznamnaacute u lidskyacutech neutrofilů Naopak makrofaacutegy nemajiacute myeloperoxidasu

15

Kde jsou RONS prospěšneacute

I Aktivniacute centra enzymů

bull Monooxygenasy (cytochromy P450)

ndash Detoxikace xenobiotik synteacuteza steroidniacutech hormonů a žlučovyacutech kyselin NO synthasy

Mechanismus v podstatě řiacutezenaacute Fentonova reakce

Fe3+ + SH + 2 e- + O2 + H+ rarr FeOOH SH

FeOOH SH rarr FeO3+ SH + H2O

FeO3+ SH rarr FeOH3+Sbull rarr Fe3+SOH rarr Fe3+ + SOH

Kde jsou RONS prospěšneacute

I Aktivniacute centra enzymů

bull Monooxygenasy (cytochromy P450)

bull Ribonukleotidreduktasa (hellipsynteacuteza DNA)

bull Synteacuteza prostanoidů (enzymatickaacute lipoperoxidace)

bull Užitečneacute hemoveacute peroxidasy

ndash Thyreoperoxidasa ve štiacutetneacute žlaacuteze

Iminus + H2O2 + 2H+ rarr I+ + 2H2O I+ joduje thyreoglobulin

ndash Myeloperoxidasa neutrofilů

ndash Laktoperoxidasa v mleacuteku hlenu dyacutechaciacutech cest a ve slinaacutech

SCNminus + H2O2 rarr OSCNminus + H2O

(hypothiokyanaacutet OSCNminus je baktericidniacute)

16

Kde jsou RONS prospěšneacute

II Signalizace

bull Např oxid dusnatyacute NOndash relaxace hladkeacuteho svalstva ceacutevniacute stěny

gastrointestinaacutelniacuteho traktu corpus cavernosumpenis

ndash neurotransmitter neuromodulaacutetor v CNS funkce v synaptickeacute plasticitě učeniacute a paměti

ndash inhibice adhese a agregace trombocytů ndash inhibice adhese leukocytůndash (atd)

Superoxid stejně tak uacutečinky protichůdneacute NO

OXID DUSNATYacuteProdukovaacuten NO synthasami

Vasodilatace inhibice aktivace leukocytů inhibice agregace destiček

atd

SUPEROXIDPEROXIDProdukovaacuten NADPH oxidasami

Vasokonstrikce aktivace leukocytů agregace destiček atd

A při setkaacuteniacute se navzaacutejem zničiacute

NO + O2middotndash rarr OONOndash

17

Koncept redoxniacute signalizace

bull Redoxniacute prostřediacute buňky - přibližně daacutenopoměrem GSHGSSG a NADHNAD

bull Redoxniacute sensory na proteinechndash kritickeacute -SH skupiny

ndash Fe-S centra

bull Ciacutele redoxniacute signalizacendash transkripčniacute faktory

ndash proteinkinasy a fosfatasy

Redoxniacutesignalizace

bull Oxidačniacute stres aktivuje určiteacute protein kinasy a transkripčniacute faktory

bull Vyacuteslednyacute efekt např stimulace proliferace senescence (staacuternutiacute) buněk

bull PůsobeniacuteROSantioxidantů v buňce může byacutet velmi specifickeacute

(T Finkel amp NJ Holbrook Nature 408 (2000) 239-247)

18

hellip a velmi

komplikovaneacute

Kde jsou RONS prospěšneacute

III Fagocytoacuteza

bull Neutrofily eosinofily monocyty makrofaacutegy mikroglie

bull Často je potřeba ciacutelovou čaacutestici označit (opsonizace)

bull Uacutekolem fagocytujiacuteciacute buňky je ciacutelovou čaacutestici

ndash Rozpoznat

ndash Pohltit

ndash Zabiacutet

ndash Straacutevit

copy 1998 Garland Publishing

19

Neutrofilniacute granulocyt

(polymorfonukleaacuter)

bull Segmentovaneacute jaacutedrobull Primaacuterniacute (azurofilniacute)

granula lysozym defensiny myeloperoxidasa proteasy

bull Specifickaacute (sekundaacuterniacute) granula NADPH oxidasa kobalofilin laktoferrin lysozym kolagenasa

bull Terciaacuterniacute granula gelatinasa a dalšiacute enzymy

Obrhttpblausencom

Obr httpwalchecklabumnedu_rsrc1417821135388research-interestsneutrophil-recruitment

20

Aktivace fagocytujiacuteciacute buňky

Respiračniacute vzplanutiacute

bull Naacutehleacute zvyacutešeniacute spotřeby kysliacuteku (pro produkci superoxidu ne respiraci)

bull Naacutehleacute zvyacutešeniacute spotřeby glukosy (pro pentosovyacute cyklus ndash dodaacutevaacuteNADPH pro NADPH oxidasu)

NADPH oxidasa

bull Membraacutenovyacute enzym produkujiacuteciacute superoxid vněnebo do fagosomu

bull Katalyzuje reakci

NADPH + 2O2 rarr NADP+ + H+ + 2O2middotndash

bull V klidu latentniacute sestavuje se z 6 podjednotek na buněčneacute membraacuteně při aktivaci fagocytu

bull Nezbytnaacute pro schopnost zabiacutet některeacute pohlceneacutebakterie (hereditaacuterniacute deficit chronickaacute septickaacute

granulomatosa)

bull Takeacute na endotelu a mnoha jinyacutech nefagocytaacuterniacutech buňkaacutech

21

Myeloperoxidasa

bull 2 ndash 5 všech proteinů v neutrofilechbull Hemoprotein zodpovědnyacute za zelenou barvu

hnisubull Nespecifickaacute peroxidasa v těle katalyzuje

předevšiacutem reakciClminus + H2O2 + H+ rarr HClO + H2O

bull Deficit u lidiacute častyacute (1 na 2000-4000) a nemaacutezaacutevažneacute přiacuteznaky

Kyselina chlornaacute

- Slabaacute kyselina (pKa = 75 HClO harr ClOminus + H+)- V kyseleacutem prostřediacute se snadno rozklaacutedaacute na plynnyacute

chlorHClO + H+ + Clminus harr Cl2 + H2O

- Silneacute oxidačniacute činidlo (2HClO + 2eminus rarr Cl2)

- Reakce s Fe2+ nebo superoxidem generuje hydroxylovyacute radikaacutel

HClO + Fe2+ rarr Clndash + Fe3+ + OHmiddotHClO + O2middotndash rarr Clndash + O2 + OHmiddot

- S organickyacutemi aminy poskytuje chloraminy

R-NH2 + HClO rarr R-NH-Cl + H2O

HClO

22

Dalšiacute zbraně neutrofilů

bull Velmi uacutečinneacute proteolytickeacute enzymy elastasa kolagenasa kathepsin G gelatinasa ad

bull Lysozym štěpiacute polysacharid bakteriaacutelniacute stěny Gram+ mikrobů

bull Laktoferrin bere bakteriiacutem železobull Defensiny kationickeacute proteiny tvořiacuteciacute kanaacutely v

bakteriaacutelniacute membraacuteněbull NETs (neutrophil extracellular traps) vlaacutekna z DNA

a serinovyacutech proteas tvořenaacute extracelulaacuterně

Synergie mezi generaacutetory radikaacutelů a dalšiacutemi zbraněmi

např HClO inhibuje α1-antitrypsin

RONS ve vyacutezbroji fagocytů

iNOS je důležitaacute pro makrofaacutegy ale nevyacuteznamnaacute u lidskyacutech neutrofilů Naopak makrofaacutegy nemajiacute myeloperoxidasu

16

Kde jsou RONS prospěšneacute

II Signalizace

bull Např oxid dusnatyacute NOndash relaxace hladkeacuteho svalstva ceacutevniacute stěny

gastrointestinaacutelniacuteho traktu corpus cavernosumpenis

ndash neurotransmitter neuromodulaacutetor v CNS funkce v synaptickeacute plasticitě učeniacute a paměti

ndash inhibice adhese a agregace trombocytů ndash inhibice adhese leukocytůndash (atd)

Superoxid stejně tak uacutečinky protichůdneacute NO

OXID DUSNATYacuteProdukovaacuten NO synthasami

Vasodilatace inhibice aktivace leukocytů inhibice agregace destiček

atd

SUPEROXIDPEROXIDProdukovaacuten NADPH oxidasami

Vasokonstrikce aktivace leukocytů agregace destiček atd

A při setkaacuteniacute se navzaacutejem zničiacute

NO + O2middotndash rarr OONOndash

17

Koncept redoxniacute signalizace

bull Redoxniacute prostřediacute buňky - přibližně daacutenopoměrem GSHGSSG a NADHNAD

bull Redoxniacute sensory na proteinechndash kritickeacute -SH skupiny

ndash Fe-S centra

bull Ciacutele redoxniacute signalizacendash transkripčniacute faktory

ndash proteinkinasy a fosfatasy

Redoxniacutesignalizace

bull Oxidačniacute stres aktivuje určiteacute protein kinasy a transkripčniacute faktory

bull Vyacuteslednyacute efekt např stimulace proliferace senescence (staacuternutiacute) buněk

bull PůsobeniacuteROSantioxidantů v buňce může byacutet velmi specifickeacute

(T Finkel amp NJ Holbrook Nature 408 (2000) 239-247)

18

hellip a velmi

komplikovaneacute

Kde jsou RONS prospěšneacute

III Fagocytoacuteza

bull Neutrofily eosinofily monocyty makrofaacutegy mikroglie

bull Často je potřeba ciacutelovou čaacutestici označit (opsonizace)

bull Uacutekolem fagocytujiacuteciacute buňky je ciacutelovou čaacutestici

ndash Rozpoznat

ndash Pohltit

ndash Zabiacutet

ndash Straacutevit

copy 1998 Garland Publishing

19

Neutrofilniacute granulocyt

(polymorfonukleaacuter)

bull Segmentovaneacute jaacutedrobull Primaacuterniacute (azurofilniacute)

granula lysozym defensiny myeloperoxidasa proteasy

bull Specifickaacute (sekundaacuterniacute) granula NADPH oxidasa kobalofilin laktoferrin lysozym kolagenasa

bull Terciaacuterniacute granula gelatinasa a dalšiacute enzymy

Obrhttpblausencom

Obr httpwalchecklabumnedu_rsrc1417821135388research-interestsneutrophil-recruitment

20

Aktivace fagocytujiacuteciacute buňky

Respiračniacute vzplanutiacute

bull Naacutehleacute zvyacutešeniacute spotřeby kysliacuteku (pro produkci superoxidu ne respiraci)

bull Naacutehleacute zvyacutešeniacute spotřeby glukosy (pro pentosovyacute cyklus ndash dodaacutevaacuteNADPH pro NADPH oxidasu)

NADPH oxidasa

bull Membraacutenovyacute enzym produkujiacuteciacute superoxid vněnebo do fagosomu

bull Katalyzuje reakci

NADPH + 2O2 rarr NADP+ + H+ + 2O2middotndash

bull V klidu latentniacute sestavuje se z 6 podjednotek na buněčneacute membraacuteně při aktivaci fagocytu

bull Nezbytnaacute pro schopnost zabiacutet některeacute pohlceneacutebakterie (hereditaacuterniacute deficit chronickaacute septickaacute

granulomatosa)

bull Takeacute na endotelu a mnoha jinyacutech nefagocytaacuterniacutech buňkaacutech

21

Myeloperoxidasa

bull 2 ndash 5 všech proteinů v neutrofilechbull Hemoprotein zodpovědnyacute za zelenou barvu

hnisubull Nespecifickaacute peroxidasa v těle katalyzuje

předevšiacutem reakciClminus + H2O2 + H+ rarr HClO + H2O

bull Deficit u lidiacute častyacute (1 na 2000-4000) a nemaacutezaacutevažneacute přiacuteznaky

Kyselina chlornaacute

- Slabaacute kyselina (pKa = 75 HClO harr ClOminus + H+)- V kyseleacutem prostřediacute se snadno rozklaacutedaacute na plynnyacute

chlorHClO + H+ + Clminus harr Cl2 + H2O

- Silneacute oxidačniacute činidlo (2HClO + 2eminus rarr Cl2)

- Reakce s Fe2+ nebo superoxidem generuje hydroxylovyacute radikaacutel

HClO + Fe2+ rarr Clndash + Fe3+ + OHmiddotHClO + O2middotndash rarr Clndash + O2 + OHmiddot

- S organickyacutemi aminy poskytuje chloraminy

R-NH2 + HClO rarr R-NH-Cl + H2O

HClO

22

Dalšiacute zbraně neutrofilů

bull Velmi uacutečinneacute proteolytickeacute enzymy elastasa kolagenasa kathepsin G gelatinasa ad

bull Lysozym štěpiacute polysacharid bakteriaacutelniacute stěny Gram+ mikrobů

bull Laktoferrin bere bakteriiacutem železobull Defensiny kationickeacute proteiny tvořiacuteciacute kanaacutely v

bakteriaacutelniacute membraacuteněbull NETs (neutrophil extracellular traps) vlaacutekna z DNA

a serinovyacutech proteas tvořenaacute extracelulaacuterně

Synergie mezi generaacutetory radikaacutelů a dalšiacutemi zbraněmi

např HClO inhibuje α1-antitrypsin

RONS ve vyacutezbroji fagocytů

iNOS je důležitaacute pro makrofaacutegy ale nevyacuteznamnaacute u lidskyacutech neutrofilů Naopak makrofaacutegy nemajiacute myeloperoxidasu

17

Koncept redoxniacute signalizace

bull Redoxniacute prostřediacute buňky - přibližně daacutenopoměrem GSHGSSG a NADHNAD

bull Redoxniacute sensory na proteinechndash kritickeacute -SH skupiny

ndash Fe-S centra

bull Ciacutele redoxniacute signalizacendash transkripčniacute faktory

ndash proteinkinasy a fosfatasy

Redoxniacutesignalizace

bull Oxidačniacute stres aktivuje určiteacute protein kinasy a transkripčniacute faktory

bull Vyacuteslednyacute efekt např stimulace proliferace senescence (staacuternutiacute) buněk

bull PůsobeniacuteROSantioxidantů v buňce může byacutet velmi specifickeacute

(T Finkel amp NJ Holbrook Nature 408 (2000) 239-247)

18

hellip a velmi

komplikovaneacute

Kde jsou RONS prospěšneacute

III Fagocytoacuteza

bull Neutrofily eosinofily monocyty makrofaacutegy mikroglie

bull Často je potřeba ciacutelovou čaacutestici označit (opsonizace)

bull Uacutekolem fagocytujiacuteciacute buňky je ciacutelovou čaacutestici

ndash Rozpoznat

ndash Pohltit

ndash Zabiacutet

ndash Straacutevit

copy 1998 Garland Publishing

19

Neutrofilniacute granulocyt

(polymorfonukleaacuter)

bull Segmentovaneacute jaacutedrobull Primaacuterniacute (azurofilniacute)

granula lysozym defensiny myeloperoxidasa proteasy

bull Specifickaacute (sekundaacuterniacute) granula NADPH oxidasa kobalofilin laktoferrin lysozym kolagenasa

bull Terciaacuterniacute granula gelatinasa a dalšiacute enzymy

Obrhttpblausencom

Obr httpwalchecklabumnedu_rsrc1417821135388research-interestsneutrophil-recruitment

20

Aktivace fagocytujiacuteciacute buňky

Respiračniacute vzplanutiacute

bull Naacutehleacute zvyacutešeniacute spotřeby kysliacuteku (pro produkci superoxidu ne respiraci)

bull Naacutehleacute zvyacutešeniacute spotřeby glukosy (pro pentosovyacute cyklus ndash dodaacutevaacuteNADPH pro NADPH oxidasu)

NADPH oxidasa

bull Membraacutenovyacute enzym produkujiacuteciacute superoxid vněnebo do fagosomu

bull Katalyzuje reakci

NADPH + 2O2 rarr NADP+ + H+ + 2O2middotndash

bull V klidu latentniacute sestavuje se z 6 podjednotek na buněčneacute membraacuteně při aktivaci fagocytu

bull Nezbytnaacute pro schopnost zabiacutet některeacute pohlceneacutebakterie (hereditaacuterniacute deficit chronickaacute septickaacute

granulomatosa)

bull Takeacute na endotelu a mnoha jinyacutech nefagocytaacuterniacutech buňkaacutech

21

Myeloperoxidasa

bull 2 ndash 5 všech proteinů v neutrofilechbull Hemoprotein zodpovědnyacute za zelenou barvu

hnisubull Nespecifickaacute peroxidasa v těle katalyzuje

předevšiacutem reakciClminus + H2O2 + H+ rarr HClO + H2O

bull Deficit u lidiacute častyacute (1 na 2000-4000) a nemaacutezaacutevažneacute přiacuteznaky

Kyselina chlornaacute

- Slabaacute kyselina (pKa = 75 HClO harr ClOminus + H+)- V kyseleacutem prostřediacute se snadno rozklaacutedaacute na plynnyacute

chlorHClO + H+ + Clminus harr Cl2 + H2O

- Silneacute oxidačniacute činidlo (2HClO + 2eminus rarr Cl2)

- Reakce s Fe2+ nebo superoxidem generuje hydroxylovyacute radikaacutel

HClO + Fe2+ rarr Clndash + Fe3+ + OHmiddotHClO + O2middotndash rarr Clndash + O2 + OHmiddot

- S organickyacutemi aminy poskytuje chloraminy

R-NH2 + HClO rarr R-NH-Cl + H2O

HClO

22

Dalšiacute zbraně neutrofilů

bull Velmi uacutečinneacute proteolytickeacute enzymy elastasa kolagenasa kathepsin G gelatinasa ad

bull Lysozym štěpiacute polysacharid bakteriaacutelniacute stěny Gram+ mikrobů

bull Laktoferrin bere bakteriiacutem železobull Defensiny kationickeacute proteiny tvořiacuteciacute kanaacutely v

bakteriaacutelniacute membraacuteněbull NETs (neutrophil extracellular traps) vlaacutekna z DNA

a serinovyacutech proteas tvořenaacute extracelulaacuterně

Synergie mezi generaacutetory radikaacutelů a dalšiacutemi zbraněmi

např HClO inhibuje α1-antitrypsin

RONS ve vyacutezbroji fagocytů

iNOS je důležitaacute pro makrofaacutegy ale nevyacuteznamnaacute u lidskyacutech neutrofilů Naopak makrofaacutegy nemajiacute myeloperoxidasu

18

hellip a velmi

komplikovaneacute

Kde jsou RONS prospěšneacute

III Fagocytoacuteza

bull Neutrofily eosinofily monocyty makrofaacutegy mikroglie

bull Často je potřeba ciacutelovou čaacutestici označit (opsonizace)

bull Uacutekolem fagocytujiacuteciacute buňky je ciacutelovou čaacutestici

ndash Rozpoznat

ndash Pohltit

ndash Zabiacutet

ndash Straacutevit

copy 1998 Garland Publishing

19

Neutrofilniacute granulocyt

(polymorfonukleaacuter)

bull Segmentovaneacute jaacutedrobull Primaacuterniacute (azurofilniacute)

granula lysozym defensiny myeloperoxidasa proteasy

bull Specifickaacute (sekundaacuterniacute) granula NADPH oxidasa kobalofilin laktoferrin lysozym kolagenasa

bull Terciaacuterniacute granula gelatinasa a dalšiacute enzymy

Obrhttpblausencom

Obr httpwalchecklabumnedu_rsrc1417821135388research-interestsneutrophil-recruitment

20

Aktivace fagocytujiacuteciacute buňky

Respiračniacute vzplanutiacute

bull Naacutehleacute zvyacutešeniacute spotřeby kysliacuteku (pro produkci superoxidu ne respiraci)

bull Naacutehleacute zvyacutešeniacute spotřeby glukosy (pro pentosovyacute cyklus ndash dodaacutevaacuteNADPH pro NADPH oxidasu)

NADPH oxidasa

bull Membraacutenovyacute enzym produkujiacuteciacute superoxid vněnebo do fagosomu

bull Katalyzuje reakci

NADPH + 2O2 rarr NADP+ + H+ + 2O2middotndash

bull V klidu latentniacute sestavuje se z 6 podjednotek na buněčneacute membraacuteně při aktivaci fagocytu

bull Nezbytnaacute pro schopnost zabiacutet některeacute pohlceneacutebakterie (hereditaacuterniacute deficit chronickaacute septickaacute

granulomatosa)

bull Takeacute na endotelu a mnoha jinyacutech nefagocytaacuterniacutech buňkaacutech

21

Myeloperoxidasa

bull 2 ndash 5 všech proteinů v neutrofilechbull Hemoprotein zodpovědnyacute za zelenou barvu

hnisubull Nespecifickaacute peroxidasa v těle katalyzuje

předevšiacutem reakciClminus + H2O2 + H+ rarr HClO + H2O

bull Deficit u lidiacute častyacute (1 na 2000-4000) a nemaacutezaacutevažneacute přiacuteznaky

Kyselina chlornaacute

- Slabaacute kyselina (pKa = 75 HClO harr ClOminus + H+)- V kyseleacutem prostřediacute se snadno rozklaacutedaacute na plynnyacute

chlorHClO + H+ + Clminus harr Cl2 + H2O

- Silneacute oxidačniacute činidlo (2HClO + 2eminus rarr Cl2)

- Reakce s Fe2+ nebo superoxidem generuje hydroxylovyacute radikaacutel

HClO + Fe2+ rarr Clndash + Fe3+ + OHmiddotHClO + O2middotndash rarr Clndash + O2 + OHmiddot

- S organickyacutemi aminy poskytuje chloraminy

R-NH2 + HClO rarr R-NH-Cl + H2O

HClO

22

Dalšiacute zbraně neutrofilů

bull Velmi uacutečinneacute proteolytickeacute enzymy elastasa kolagenasa kathepsin G gelatinasa ad

bull Lysozym štěpiacute polysacharid bakteriaacutelniacute stěny Gram+ mikrobů

bull Laktoferrin bere bakteriiacutem železobull Defensiny kationickeacute proteiny tvořiacuteciacute kanaacutely v

bakteriaacutelniacute membraacuteněbull NETs (neutrophil extracellular traps) vlaacutekna z DNA

a serinovyacutech proteas tvořenaacute extracelulaacuterně

Synergie mezi generaacutetory radikaacutelů a dalšiacutemi zbraněmi

např HClO inhibuje α1-antitrypsin

RONS ve vyacutezbroji fagocytů

iNOS je důležitaacute pro makrofaacutegy ale nevyacuteznamnaacute u lidskyacutech neutrofilů Naopak makrofaacutegy nemajiacute myeloperoxidasu

19

Neutrofilniacute granulocyt

(polymorfonukleaacuter)

bull Segmentovaneacute jaacutedrobull Primaacuterniacute (azurofilniacute)

granula lysozym defensiny myeloperoxidasa proteasy

bull Specifickaacute (sekundaacuterniacute) granula NADPH oxidasa kobalofilin laktoferrin lysozym kolagenasa

bull Terciaacuterniacute granula gelatinasa a dalšiacute enzymy

Obrhttpblausencom

Obr httpwalchecklabumnedu_rsrc1417821135388research-interestsneutrophil-recruitment

20

Aktivace fagocytujiacuteciacute buňky

Respiračniacute vzplanutiacute

bull Naacutehleacute zvyacutešeniacute spotřeby kysliacuteku (pro produkci superoxidu ne respiraci)

bull Naacutehleacute zvyacutešeniacute spotřeby glukosy (pro pentosovyacute cyklus ndash dodaacutevaacuteNADPH pro NADPH oxidasu)

NADPH oxidasa

bull Membraacutenovyacute enzym produkujiacuteciacute superoxid vněnebo do fagosomu

bull Katalyzuje reakci

NADPH + 2O2 rarr NADP+ + H+ + 2O2middotndash

bull V klidu latentniacute sestavuje se z 6 podjednotek na buněčneacute membraacuteně při aktivaci fagocytu

bull Nezbytnaacute pro schopnost zabiacutet některeacute pohlceneacutebakterie (hereditaacuterniacute deficit chronickaacute septickaacute

granulomatosa)

bull Takeacute na endotelu a mnoha jinyacutech nefagocytaacuterniacutech buňkaacutech

21

Myeloperoxidasa

bull 2 ndash 5 všech proteinů v neutrofilechbull Hemoprotein zodpovědnyacute za zelenou barvu

hnisubull Nespecifickaacute peroxidasa v těle katalyzuje

předevšiacutem reakciClminus + H2O2 + H+ rarr HClO + H2O

bull Deficit u lidiacute častyacute (1 na 2000-4000) a nemaacutezaacutevažneacute přiacuteznaky

Kyselina chlornaacute

- Slabaacute kyselina (pKa = 75 HClO harr ClOminus + H+)- V kyseleacutem prostřediacute se snadno rozklaacutedaacute na plynnyacute

chlorHClO + H+ + Clminus harr Cl2 + H2O

- Silneacute oxidačniacute činidlo (2HClO + 2eminus rarr Cl2)

- Reakce s Fe2+ nebo superoxidem generuje hydroxylovyacute radikaacutel

HClO + Fe2+ rarr Clndash + Fe3+ + OHmiddotHClO + O2middotndash rarr Clndash + O2 + OHmiddot

- S organickyacutemi aminy poskytuje chloraminy

R-NH2 + HClO rarr R-NH-Cl + H2O

HClO

22

Dalšiacute zbraně neutrofilů

bull Velmi uacutečinneacute proteolytickeacute enzymy elastasa kolagenasa kathepsin G gelatinasa ad

bull Lysozym štěpiacute polysacharid bakteriaacutelniacute stěny Gram+ mikrobů

bull Laktoferrin bere bakteriiacutem železobull Defensiny kationickeacute proteiny tvořiacuteciacute kanaacutely v

bakteriaacutelniacute membraacuteněbull NETs (neutrophil extracellular traps) vlaacutekna z DNA

a serinovyacutech proteas tvořenaacute extracelulaacuterně

Synergie mezi generaacutetory radikaacutelů a dalšiacutemi zbraněmi

např HClO inhibuje α1-antitrypsin

RONS ve vyacutezbroji fagocytů

iNOS je důležitaacute pro makrofaacutegy ale nevyacuteznamnaacute u lidskyacutech neutrofilů Naopak makrofaacutegy nemajiacute myeloperoxidasu

20

Aktivace fagocytujiacuteciacute buňky

Respiračniacute vzplanutiacute

bull Naacutehleacute zvyacutešeniacute spotřeby kysliacuteku (pro produkci superoxidu ne respiraci)

bull Naacutehleacute zvyacutešeniacute spotřeby glukosy (pro pentosovyacute cyklus ndash dodaacutevaacuteNADPH pro NADPH oxidasu)

NADPH oxidasa

bull Membraacutenovyacute enzym produkujiacuteciacute superoxid vněnebo do fagosomu

bull Katalyzuje reakci

NADPH + 2O2 rarr NADP+ + H+ + 2O2middotndash

bull V klidu latentniacute sestavuje se z 6 podjednotek na buněčneacute membraacuteně při aktivaci fagocytu

bull Nezbytnaacute pro schopnost zabiacutet některeacute pohlceneacutebakterie (hereditaacuterniacute deficit chronickaacute septickaacute

granulomatosa)

bull Takeacute na endotelu a mnoha jinyacutech nefagocytaacuterniacutech buňkaacutech

21

Myeloperoxidasa

bull 2 ndash 5 všech proteinů v neutrofilechbull Hemoprotein zodpovědnyacute za zelenou barvu

hnisubull Nespecifickaacute peroxidasa v těle katalyzuje

předevšiacutem reakciClminus + H2O2 + H+ rarr HClO + H2O

bull Deficit u lidiacute častyacute (1 na 2000-4000) a nemaacutezaacutevažneacute přiacuteznaky

Kyselina chlornaacute

- Slabaacute kyselina (pKa = 75 HClO harr ClOminus + H+)- V kyseleacutem prostřediacute se snadno rozklaacutedaacute na plynnyacute

chlorHClO + H+ + Clminus harr Cl2 + H2O

- Silneacute oxidačniacute činidlo (2HClO + 2eminus rarr Cl2)

- Reakce s Fe2+ nebo superoxidem generuje hydroxylovyacute radikaacutel

HClO + Fe2+ rarr Clndash + Fe3+ + OHmiddotHClO + O2middotndash rarr Clndash + O2 + OHmiddot

- S organickyacutemi aminy poskytuje chloraminy

R-NH2 + HClO rarr R-NH-Cl + H2O

HClO

22

Dalšiacute zbraně neutrofilů

bull Velmi uacutečinneacute proteolytickeacute enzymy elastasa kolagenasa kathepsin G gelatinasa ad

bull Lysozym štěpiacute polysacharid bakteriaacutelniacute stěny Gram+ mikrobů

bull Laktoferrin bere bakteriiacutem železobull Defensiny kationickeacute proteiny tvořiacuteciacute kanaacutely v

bakteriaacutelniacute membraacuteněbull NETs (neutrophil extracellular traps) vlaacutekna z DNA

a serinovyacutech proteas tvořenaacute extracelulaacuterně

Synergie mezi generaacutetory radikaacutelů a dalšiacutemi zbraněmi

např HClO inhibuje α1-antitrypsin

RONS ve vyacutezbroji fagocytů

iNOS je důležitaacute pro makrofaacutegy ale nevyacuteznamnaacute u lidskyacutech neutrofilů Naopak makrofaacutegy nemajiacute myeloperoxidasu

21

Myeloperoxidasa

bull 2 ndash 5 všech proteinů v neutrofilechbull Hemoprotein zodpovědnyacute za zelenou barvu

hnisubull Nespecifickaacute peroxidasa v těle katalyzuje

předevšiacutem reakciClminus + H2O2 + H+ rarr HClO + H2O

bull Deficit u lidiacute častyacute (1 na 2000-4000) a nemaacutezaacutevažneacute přiacuteznaky

Kyselina chlornaacute

- Slabaacute kyselina (pKa = 75 HClO harr ClOminus + H+)- V kyseleacutem prostřediacute se snadno rozklaacutedaacute na plynnyacute

chlorHClO + H+ + Clminus harr Cl2 + H2O

- Silneacute oxidačniacute činidlo (2HClO + 2eminus rarr Cl2)

- Reakce s Fe2+ nebo superoxidem generuje hydroxylovyacute radikaacutel

HClO + Fe2+ rarr Clndash + Fe3+ + OHmiddotHClO + O2middotndash rarr Clndash + O2 + OHmiddot

- S organickyacutemi aminy poskytuje chloraminy

R-NH2 + HClO rarr R-NH-Cl + H2O

HClO

22

Dalšiacute zbraně neutrofilů

bull Velmi uacutečinneacute proteolytickeacute enzymy elastasa kolagenasa kathepsin G gelatinasa ad

bull Lysozym štěpiacute polysacharid bakteriaacutelniacute stěny Gram+ mikrobů

bull Laktoferrin bere bakteriiacutem železobull Defensiny kationickeacute proteiny tvořiacuteciacute kanaacutely v

bakteriaacutelniacute membraacuteněbull NETs (neutrophil extracellular traps) vlaacutekna z DNA

a serinovyacutech proteas tvořenaacute extracelulaacuterně

Synergie mezi generaacutetory radikaacutelů a dalšiacutemi zbraněmi

např HClO inhibuje α1-antitrypsin

RONS ve vyacutezbroji fagocytů

iNOS je důležitaacute pro makrofaacutegy ale nevyacuteznamnaacute u lidskyacutech neutrofilů Naopak makrofaacutegy nemajiacute myeloperoxidasu

22

Dalšiacute zbraně neutrofilů

bull Velmi uacutečinneacute proteolytickeacute enzymy elastasa kolagenasa kathepsin G gelatinasa ad

bull Lysozym štěpiacute polysacharid bakteriaacutelniacute stěny Gram+ mikrobů

bull Laktoferrin bere bakteriiacutem železobull Defensiny kationickeacute proteiny tvořiacuteciacute kanaacutely v

bakteriaacutelniacute membraacuteněbull NETs (neutrophil extracellular traps) vlaacutekna z DNA

a serinovyacutech proteas tvořenaacute extracelulaacuterně

Synergie mezi generaacutetory radikaacutelů a dalšiacutemi zbraněmi

např HClO inhibuje α1-antitrypsin

RONS ve vyacutezbroji fagocytů

iNOS je důležitaacute pro makrofaacutegy ale nevyacuteznamnaacute u lidskyacutech neutrofilů Naopak makrofaacutegy nemajiacute myeloperoxidasu