RECOMBINAREA GENETICĂ LA EUCARIOTE

Recombinarea genetică este procesul prin care are loc transferul intra- sau intermolecular a

unor secvenţe de ADN, având ca rezultat modificări în înlănţuirea genelor sau a unor părţi din

gene. Se poate produce astfel, reasortarea unor nucleotide la nivelul aceleiaşi molecule de ADN sau între

molecule separate, rezultând, în final, una sau două molecule recombinate.

La eucariote procesul de recombinare genetică este legat de fenomenul sexualităţii şi se realizează

în special în cursul meiozei, fiind condiţionată de realizarea contactelor între cromosomi urmată de

disjuncţia independentă a perechilor de cromosomi (bivalenţi). În cazul organismelor eucariote au fost

descrise 3 tipuri de recombinare genetică:

- recombinarea intracromosomală – prin crossing-over (schimbul reciproc de segmente

cromosomale);

- recombinarea intercromosomală – prin disjuncţia independentă a cromosomilor omologi;

- recombinarea genetică nereciprocă – prin conversie genetică.

Recombinarea intracromosomală (crossing-over) se realizează atât în meioză cât şi în mitoză.

Ea poate avea loc intergenic, cât şi intragenic.

Recombinarea intragenică este un fenomen rar. Acest fenomen manifestă interferenţă negativă care

determină creşterea probabilităţii ca un al 2-lea crossing-over să aibă loc în apropierea primului.

Formarea bivalenţilor în meioză presupune participarea a 2 cromosomi de origine diferită (maternă şi

paternă), între care se stabilesc contacte intercromatidice (sinapse) ce conduce la formarea unei structuri

specializate numită complex sinaptinemal.

Importanţa complexului sinaptinemal în desfăşurarea recombinării genetice intracromosomale este

dovedită de faptul că la organismele la care nu se produce acest complex, nu are loc procesul de crossing-

over.

Formarea chiasmelor este dependentă de sinteze proteice ce au loc la sfârşitul zigotenului.

Procesul de recombinare genetică implică ruperea şi reunirea cromatidelor participante, fapt ce

conduce la un schimb reciproc de segmente de ADN de dimensiuni egale şi la apariţia de cromosomi

(iar apoi de gameţi) recombinaţi (Fig. 1).

1

Fenomenul de crossing-over se realizează mai mult sau mai puţin randomic, de-a lungul perechilor

de cromosomi omologi. Astfel, probabilitatea realizării recombinării între 2 loci creşte odată cu

distanţa dintre aceştia pe cromosomi.

Deoarece procesul de crossing-over afectează numai 2 dintre cromatidele bivalenţilor, doar 50 %

dintre produşii meiozei sunt de tip recombinat, restul de 50 % sunt de tip parental.

S-a constatat că între genele plasate pe cromosomii omologi, în afară de crossing-over simplu, pot

apărea şi crossing-overe multiple (Fig.2). Dacă procesul de recombinare are loc la nivelul unor gene

heterozigotze, indiferent de numărul de crossing-overe ce se realizează, procentul de recombinare nu

depăşeşte 50 %.

2

Procesul recombinării genetice poate avea loc şi în celulele somatice. Schimburile

intercromatidice (sister chromatid exchange) au fost evidenţiate mai ales în celulele mamaliene aflate

în cultură in vitro, ele nefiind urmate, de obicei, de modificări fenotipice deoarece cromatidele

implicate sunt identice.

Fenomenul recombinării mitotice a fost studiat în special în cazul fungilor (Aspergillus nidulans,

S. cerevisiae) la care în ciclul de viaţă predomină haplofaza.

Recombinarea mitotică poate avea loc în cursul metafazei şi presupune asocierea cromosomilor

omologi şi realizarea schimbului genetic înainte de diviziunea centromerului.

Procesul de crossing-over se poate produce şi la nivelul aceleiaşi gene (crossing-over intragenic).

În mecanismul molecular al recombinării genetice de tip crossing-over, sunt implicate proteine

specifice, procesul recombinării fiind asociat cu cel de reparare genetică.

Recombinarea intercromosomală are loc prin disjuncţia independentă a perechilor de

cromosomi care reprezintă suportul material pentru disjuncţia perechilor de factori ereditari.

Segregarea independentă are loc la trecerea celulelor sexuale de la metafaza I la anafaza I, când

are loc aşezarea întâmplătoare a cromosomilor de origine maternă sau paternă deasupra sau

dedesubtul planului ecuatorial al plăcii metafazice.

Acest comportament al cromosomilor de origine matenă, care se împerechează cu cei de origine

paternă şi apoi separarea perechilor respective, a fost comparat de către Muller cu formarea perechilor

de dansatori în timpul dansului şi separarea lor la sfârşitul acestuia. Din această cauză, Muller a

denumit acest comportament dansul cromosomilor . Cu cât numărul cromosomilor şi a genelor

conţinute este mai mare cu atât numărul de combinaţii posibile de gameţi şi de organisme este mai

mare. Posibilitatea ca un organism să fie asemănător cu altul este de (1/2) 2n, în care n =număr de

perechi de cromosomi, iar 2n reprezintă numărul total de cromosomi din complementul speciei

respective.

Conversia genică este o recombinare nereciprocă. In cadrul conversiei genice, un segment din

molecula de ADN a unei cromatide se desprinde şi se ataşeaza de alta cromatida. Este posibil, in acest

mod, ca un cromozom sa conţina o gena in doua exemplare (daca transferul s-a realizat intre

cromozomi omologi), iar altul o gena in minus. Are loc cu o frecventa mai mare in cursul diviziunii

meiotice dar poate avea loc si in celulele somatice. Ea a fost evidenţiată prin analiza tetradelor la

ciupercile din genurile Saccharomyces, Aspergillus, Neurospora unde apar abateri de la raportul

normal de segregare alelică, ca şi cum se produce o transformare a alelei A în a (Fig. 3).

3

Frecvenţa recombinării genetice nereciproce poate creşte de la un capăt la altul al unui locus genic,

fenomen numit polarizarea conversiei. Astfel , la fungi, în locul raportului de segregare normal de

4 : 4, se întâlnesv valori diferite ale acestui raport: 6 : 2, 5 : 3, 7: 1 sau chiar 8 :0. fenomenul

conversiei genice a fost evidenţiat şi la plante, în cazul unor gene ce intervin în determinismul

pigmentaţiei, precum şi la virusuri (în special bacteriofagi). Unii autori consideră că, de fapt,

conversia genică este consecinţa unui proces de recombinare, în urma căruia apar nepotriviri ale unor

baze azotate situate pe cromatide omoloage. Aceste zone de nepotrivire sunt reparate prin excizie şi

prin adăugarea nucleotidei corespunzătoare. Prin reparaţie poate reapărea astfel, tipul normal.

4

RECOMBINAREA GENETICĂ LA PROCARIOTE

La procariote au fost descrise mai multe căi de transfer de material genetic: transformare

genetică, conjugare, sexducţie şi transducţie, asociate cu mecanisme ce asigură integrarea noii

informaţii genetice în genomul gazdei. Indiferent de natura sa, transferul de gene reprezintă un fenomen

în care moeculele informaţionale îşi schimbă gazda, având de traversat două bariere celulare: una la ieşire

din celula donatoare şi alta la intrarea în celula receptoare.

1. Transformarea genetică

Fenomenul transformării genetice a fost descoperit în 1928 de către Griffith, în urma experimentelor

realizate cu pneumococi asupra şoarecilor. Ulterior , Avery, Mac Leod şi McCarthy, au descoperit, în

1944, că agentul transformant este reprezentat de ADN izolat din celulele bacteriene.

Transformarea genetică la bacterii presupune transferul unui fragment de ADN (cromosomal

sau plasmidial) de la o bacterie donatoare şi încorporarea acestuia în genomul unei bacterii

receptoare.

Asemenea fragmente de ADN sunt, în general, de dimensiuni mari (în medie de 20.000 perechi de

nucleotide), putând conţine gene utile care, pătrunse în bacteria receptoare, pot înlocui printr-un proces de

recombinare o secvenţă de nucleotide omoloagă din genomul acesteia. Informaţia genetică nou integrată

în cromosomul bacteriei receptoare este transmisă stabil de-a lungul generaţiilor.

Fenomenul de transformare genetică a fost evidenţiat prima dată la pneumococul Diploccocus

pneumoniae şi ulterior la Bacillus subtilis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Staphylococcus sp.,

etc.

Pentru a putea prelua ADN exogen din mediul extracelular, celulele receptoare trebuie să manifeste o

anumită stare specifică numită stare de competenţă. Aceasta presupune ca peretele celular şi membrana

celulară ale celulei bacteriene receptoare să fie permeabile pentru ADN exogen, iar celula să se afle într-o

anumită fază a ciclului de viaţă care să permită acceptarea acestuia. În cursul realizării competenţei are

loc activarea unor receptori specifici localizaţi la nivelul peretelui celular cu rol de legare a ADN exoged

la suprafaţa celulară. Numărul receptorilor activi, variază de la o specie bacteriană la alta, de exemplu: la

Streptococcus au fost identificaţi 80 de receptori, la Bacillus subtilis – 50, iar la Haemophilus doar 4

receptori.

La unele specii bacteriene, starea de competenţă este o stare naturală, fiziologică, apărând într-o

anumită etapă a ciclului de viaţă şi durează un anumit interval de timp. De exemplu, la Azotobacter,

Staphylococcus, Pneumococcus competenţa este maximă pe parcursul fazei logaritmice, în timp ce la alte

5

specii – Bacillus, Pseudomonas, Methylobacterium- competenţa este maximă la trecerea de la faza

logaritmică la cea staţionară.

În cazul altor specii, starea de competenţă poate fi indusă prin tratamente specifice (şoc de

temperatură, adăugarea unor ioni etc.).

Într-o populaţie bacteriană, proporţia celulelor capabile de a prelua ADN exogen poate fi estimată

pe baza frecvenţei de transformare, urmărind un anumit marker genetic. Pentru a se obţine o frecvenţă

ridicată de integrare/ transformare, este necesar ca ADN transformant să provină de la o tulpină bacteriană

înrudită (ADN omolog). În cazul utilizării unor organisme neînrudite (ADN heterolog), eficienţa

procesului de transformare este foarte scăzută.

Multe bacterii se pot liza în mod natural, mai ales în timpul etapelor finale ale ciclului celular. În

aceste condiţii, ADN este eliberat în mediu extracelular de unde poate fi preluat de alte bacterii aflate în

aceeaşi populaţie.

La bacterii, procesul natural de transformare genetică (cu fragmente de ADN cromosomal

eliberat prin metoda lizei celulelor bacteriene) se realizează în mai multe etape:

1. legarea reversibilă (adsorbţia) a moleculelor de ADN dublu catenar, la nivelul situsurilor

receptoare aflate pe suprafaţa celulară;

2. preluarea ADN exogen de către celulele competente;

3. convertirea ADN dublu catenar la forma monocatenară, prin degradarea uneia dintre catenele

moleculei iniţiale;

4. integrarea segmentului de ADN monocatenar în cromosomul celulei receptoare;

5. segregarea şi exprimarea fenotipică a noii informaţii genetice integrate în genomul celulei

gazdă.

Procesul de transformare este destul de răspândit în natură, mai ales în cazul tulpinilor bacteriene

înrudite, el jucând un rol important în evoluţia bacteriilor. Această concluzie este întărită şi de observaţia

că transferul de gene prin transformare genetică are loc nu numai pe orizontală (între bacterii înrudite) ci

şi între grupe de organisme neînrudite (fenomen ce explică, de exemplu, răspndirea rezistenţei la

antibiotice).

2. Conjugarea bacteriană

Conjugarea bacteriană reprezintă un mod de transfer unidirecţional de ADN de la o celulă

donatoare la o celulă receptoare prin intermediul unei legături intercelulare directe (pil de sex) şi

condiţonat de prezenţa în bacteria donatoare a unui element genetoic specializat numit conjugon.

6

Fenomenul conjugării a fost descoperit în 1946 (de către Lederberg şi Tatum) în urma

experimentelor cu tulpini de Escherichia coli ce conţineau sau nu o plasmidă specifică notată F. Din

acest punct de vedere, celulele bacteriene care conţin plasmida F ( factorul F) sunt notate F +, iar cele

care nu conţin această plasmidă sunt notate F -. În cazul bacteriilor Gram negative, în afară de

plasmida F, funcţiile necesare procesului de conjugare se găsesc la nivelul mai multor plasmide. De

exemplu, în cazul plasmidelor de rezistenţă la antibiotice (plasmida RP4) şi plasmidele Col ce conţin

determinanţi genetici pentru sinteza colicinelor.

Factorul F este alcătuit din ADN dublu catenar circular cu o lungime de 94,5 kb şi în număr de 1-2

copii/celulă. Transferul prin conjugare al acestor plasmide se datorează prezenţei unei regiuni

specifice, regiunea tra, ce reprezintă cca 30 % din lungimea plasmidei F. Cu excepţia fectorului F,

celelalte plasmide conjugative pot include şi alte tipuri de gene: pentru rezistenţa la antibiotice,

toleranţă la metale grele, virulenţă patogenitate etc.

Studiile asupra procesului de conjugare efectuate la E. coli , au permis stabilirea etapelor

acestuia:

Formarea şi stabilirea agregatelor de conjugare;

Pregătirea ADN pentru transfer

Transferul ADN conjugativ

Refacerea structurii circulare şi dublu catenare a ADN transferat.

În prima etapă are loc sinteza de către celula donatoare a pililor de sex – structuri specializate,

tubulare, localizate la suprafaţa celulară, alcătuite din molecule de pilină (proteină a cărei sinteză este

codificată de gene plasmidiale).

A 2-a etapă a conjugării presupune intervenţia unei proteine, codificată de genele plasmidiale, care

are rolul de a realiza o crestătură monocatenară la nivelul genei oriT (originea transferului). La nivelul

capătului 5’ al catenei de ADN crestată, se leagă o proteină specifică, codificată tot de gene plasmidiale

de la nivelul regiunii tra. Are loc apoi, transferul catenei crestate, începând cu capătul 5’ , transferul fiind

cuplat cu procesul de replicare al plasmidei, conform modelului cercului rotativ. In acest fel, pe măsură ce

procesul de replicare avansează, una dintre catenele vechi (cea crestată) se deplasează prin pilul de sex în

celula receptoare (Fig. 1).

In acelaşi timp, în celula donatoare are loc restabilirea structurii factorului F. la nivel populaţiei de

bacterii, consecinţa transferului factorului F este masculinizarea acesteia, adică se produce generalizarea

caracterului F +al celulelor bacteriene.

7

Fig. 1. Reprezentarea schematică a procesului de conjugare

Un tip special de conjugare este cel realizat între celulele bacteriene care conţin factorul F integrat în

cromosom (celule de tip Hfr) şi celulele de tip F – (Fig. 2). Integrarea factorului F în cromosomul

bacterian nu se realizează la întâmplare , ci la nivelul unor situsuri ce prezintă omologie între cele două

tipuri de molecule. Celulele rezultate în urma unui asemenea proces de integrare , au primit denumirea de

celule de tip Hfr (High frequency of recombination).

Modalitatea specifică de integrare a plasmidei F în cromosomul bacterian, face ca secvenţa oriT să fie

localizată aproape de una dintre marginile plasmidei linearizate şi integrate la capătul acesteia, consecinţa

fiind transferul specific al ADN monocatenar în celula receptoare.

In a 3-a etapă, în cazul transferului dintre bacteriile F + şi F -, după crestarea monocatenară la nivelul

secvenţei OriT, începe transferul AND monocatenar reprezentat de o scurtă secvenţă din plasmida F şi

apoi de o copie a AND cromosomal al gazdei (Fig. 2). Cea mai mare parte a plasmidei F rămâne la nivelul

celuilalt capăt al cromosomului, şi doar foarte rar este transferată în celula acceptoare. Cantitatea de

informaţie genetică transferată, proprie celulei donatoare, este direct proporţională cu timpul în care cele

două celule au stat în contact (cu cât contactul este mai lung, cu atât segmentul de ADN transferat va fi

8

mai mare). Astfel, pentru transferul complet al ADN cromosomal la E. coli sunt necesare aproximativ 90-

120 minute de contact între celule, în timp ce transferul plasmidei F din bacteria F + într-o bacterie F –

durează 2-3 min.

Procesul de transfer de segmente cromosomale din bacteria donor Hfr în cea acceptoare F – este urmat

de cele mai multe ori de transformare genetică (fenomen controlat de o serie de enzime sintetizate de

gazdă) ceea ce înseamnă că porţiuni din respectivul segment se integrează în genomul noii gazde fiind

menţinut şi transmis constant în generaţiile următoare.

Procesul de conjugare dintre celulele Hfr şi celulele de tip F – serveşte la realizarea hărţilor

cromosomale la bacterii , distanţa dintre gene (dispuse în ordine pe segmentul transferat) exprimându-se

în unităţi de timp (minute).

Transferul de gene cromosomale bacteriene mediat de plasmidele de sex este numit sexducţie. In

urma conjugării F + x F – se obţin doar celule de tip F + , care sunt parţial ‘ diploide ‘, conţinând alături de

genele proprii şi gene similare provenite de la bacteria donatoare.

3. Transducţia fagică

Transducţia fagică este procesul prin care un fragment din cromosomul bacterian este transferat de

la o bacterie la alta prin intermediul capsidei (învelişului proteic) anumitor bacteriofagi temperaţi.

Fenomenul a fost descris iniţial la bacteriofagi specifici unor tulpini de Salmonella typhimurium, iar

ulterior el a fost mai bine studiat în cazul fagului λ specific tulpinilor de E. Coli . In funcţie de structura

genetică a fagilor transductori şi de mecanismul de formare a materialului genetic al particulri fagice, au

fost descrise două tipuri de transducţie fagică: transducţie specializată şi transducţie generalizată.

Bacteiofagii ce realizează transducţia generalizată produc particule ce conţin, în cea mai mare

parte, ADN provenit din bacteria gazdă (din orice parte a cromosomului) şi doar o foarte mică parte

genom fagic.

În cazul fagilor ce determină transducţia specializată, ei produc particule ce conţin atât gene fagice

(majoritare) cât şi gene cromosomale bacteriene provenite dintr-o anumită regiune a cromosomului

bacterian. Cel mai cunoscut bacteriofag ce realizează transducţie specializată este fagul λ. În forma lui

naturală, fagul λ poate pşrelua, ca fag transductor, doar scurte secvenţe de ADN din genomul gazdei în

care s-a multiplicat (după ce a parcurs ciclul lizogen), dimensiunea acestora fiind limitată de capsida

fagică. Secvenţele pe care le poate prelua fagul λ sunt foarte precise.

Tranducţia generalizată este mediată de fagi virulenţi precum şi de anumiţi fagi temperaţi ai căror

genom nu se integrează la nivelul unor situsuri specifice din cromosomul gazdei (de exemplu fagul P1).

9