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Tipos de curvas de saturacin de una enzima por su sustrato120
100
cooperatividad positiva cintica de Michaelis Menten
v (U/mg prot)
80
60
40
cooperatividad negativa
20
0 0 2 4 6 8 10
[S] (mM)Rosario A. Muoz-Clares
Cooperatividad entre los sitios activos Enzimas con cooperatividad positiva La unin del sustrato es cada vez ms fcil a medida que la enzima se satura ms y ms. Dependencia de velocidad inicial vs [S] sigmoidal.
Enzimas con cooperatividad negativa La unin del sustrato es cada vez ms difcil a medida que la enzima se satura ms y ms. Dependencia de velocidad inicial vs [S] hiperblica aparente.
Rosario A. Muoz-Clares
Cooperatividad positiva entre los sitios alostricos
La unin del efector alostrico (inhibidor o activador) es cada vez ms fcil a medida que la enzima se satura ms y ms por eeste ligando. Dependencia sigmoidal de la velocidad inicial vs la concentracin del efector alostrico.
Rosario A. Muoz-Clares
Curvas de saturacin sigmoidal por inhibidores y activadores
8
[S] = constante [E] = constante
10
cooperatividad positiva
8
v (U/mg prot.)
no cooperatividad4
v(U/mg prot)
6
6
sin cooperatividad
cooperatividad positiva2
4
[S] = constante [E] = constante
2
0 0 1 2 3 4
0 0 1 2 3 4 5
[Inhibidor] (mM)
[Activador] (mM)
Rosario A. Muoz-Clares
ENZIMAS ALOSTRICAS CON COOPERATIVIDAD POSITIVA DE UNIN
Son enzimas oligomricas que poseen varios sitios activos y varios sitios alostricos y exhiben una cintica de saturacin por sus sustratos y/o efectores alostricos de tipo sigmoidal, resultado de una unin cooperativa de estos ligandos.
Rosario A. Muoz-Clares
IMPORTANCIA FISIOLGICA DE LAS ENZIMAS ALOSTRICAS CON COOPERATIVIDAD POSITIVA DE UNIN Pueden ser reguladas por compuestos no anlogos del sustrato (retroinhibicin y retroactivacin). Permiten amplificar cambios pequeos en la concentracin de sus ligandos, tanto del sustrato como de los inhibidores o activadores, respondiendo con cambios grandes en la velocidad de la reaccin catalizada.
Rosario A. Muoz-Clares
IMPORTANCIA FISIOLGICA DE LAS ENZIMAS ALOSTRICAS CON COOPERATIVIDAD NEGATIVA DE UNIN
Permiten amortiguar cambios grandes en la concentracin de ligandos, respondiendo con cambios pequeos en la velocidad de la reaccin catalizada.
Rosario A. Muoz-Clares
Valores del cociente [S]90 / [S]10 Enzimas que siguen cintica Michaeliana [S]90/[S]10 = 81 Enzimas con cooperatividad positiva de unin [S]90/[S]10 < 81 Enzimas con cooperatividad negativa de unin [S]90/[S]10 > 81
Estos valores son igualmente vlidos para la saturacin por activadores o inhibidoresRosario A. Muoz-Clares
Saturacin sigmoidal por el sustrato(cooperatividad positiva)
Rosario A. Muoz-Clares
ECUACIN DE HILL
Vmax [S]nH v =nH S0.5
+
nH [S]
Rosario A. Muoz-Clares
Parmetros cinticos de la ecuacin de Hill
Vmax = velocidad lmite a la que tiende la reaccin cuando toda la enzima est saturada por el sustrato. S0.5 = concentracin de sustrato a la que se alcanza la mitad de la Vmax, es decir, el 50% de saturacin de la enzima por el sustrato (no confundir con Km que es un parmetro que slo existe cuando la cintica de saturacin es Michaeliana). nH = nmero de Hill, que indica el tipo y el grado de cooperatividad en la unin del ligando.Rosario A. Muoz-Clares
Valores del nmero de Hill (nH)
nH > 1 nH = 1 nH < 1
cooperatividad positiva no cooperatividad cooperatividad negativa
Rosario A. Muoz-Clares
Significado del nmero de Hill (nH)En la cooperatividad positiva Si se conoce el nmero de sitios de unin que posee la protena para el ligando, indica el grado de cooperatividad que existe entre los sitios para unirlo. El mximo valor que puede alcanzar nH es igual al nmero de sitios de unin que posee la enzima.
En la cooperatividad negativa Indica el grado de cooperatividad entre los sitios para unir al ligando.
Rosario A. Muoz-Clares
TRANSFORMACIN LINEAL DE LA ECUACIN DE HILL
log
v (Vmax - v)
= nHlog[S] nHlogS0.5
Rosario A. Muoz-Clares
Transformacin lineal de la ecuacin de Hill2
Log(v/(Vmax-v))
1
0
-1
-2
nH es la pendiente de la recta logS0.5 es la abscisa en el origen (cuando el eje y vale cero)
-3
LogS0.5
Log[S]Rosario A. Muoz-Clares
Mecanismos de regulacin enzimtica
Regulacin de la cantidad de la enzima
Regulacin de la actividad de la enzima
Rosario A. Muoz-Clares
Mecanismos de regulacin de la cantidad de las enzimas Regulacin transcripcional Sntesis de RNAm Maduracin y vida media del RNAm
Regulacin traduccional Sntesis de la protena
Regulacin postraduccional Degradacin de la protenaRosario A. Muoz-Clares
REGULACIN DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA Regulacin por molculas o iones Sustratos, productos, cofactores inhibidores, activadores, pH
Regulacin por modificacin qumica: Irreversible Zimgenos
Reversible Adicin de un grupo qumico Oxidacin-reduccin de cistenas
Regulacin por localizacin intracelular IsoenzimasRosario A. Muoz-Clares
Regulacin de la actividad de la enzima por proteolisis limitada Consiste en la hidrlisis de uno o pocos enlaces peptdicos especficos en la molcula precursora. Produce formas activas a partir de precursores inactivos (zimgenos). Requiere una proteasa especfica. Ejemplos de enzimas as reguladas: Proteasas digestivas Proteasas en la ruta de coagulacin de la sangre Proteasas en la ruta de muerte celular programada (apoptosis)
Rosario A. Muoz-Clares
ZIMGENOS Formas inactivas de enzimas que son convertidas a las formas activas por proteolisis en sitios especficos. En general son enzimas proteolticas que de sintetizarse activas produciran daos a la clula. Se activan una vez fuera de la clula que las produce (caso de las enzimas proteolticas digestivas o las que desencadenan la cascada para la coagulacin de la sangre) o cuando deben llevar a la muerte celular (caso de las caspasas en apoptosis).
Rosario A. Muoz-Clares
FORMACIN DE QUIMOTRIPSINA
Modificacin qumica reversible por adicin de un grupoRequiere: Molcula donadora que aporte el grupo que modifica a la enzima. Enzima que catalice la reaccin de modificacin. Enzima que catalice la reaccin de prdida de la modificacin.Rosario A. Muoz-Clares
Modificacin qumica reversible por fosforilacin
Modificaciones qumicas reversibles
Modificacin qumica reversible por oxidacin-reduccin de cistenas vecinasOxidantesSH SH (O2, H202, radicales libres, etc) S S
Reductores(DTT, 2-mercaptoetanol, glutatin, tiorredoxina, etc)
Cistenas vecinas
Disulfuro
Rosario A. Muoz-Clares
ISOENZIMAS
Protenas que en un organismo catalizan la misma reaccin pero estn codificadas por genes diferentes. Difieren en sus propiedades cinticas. Se expresan diferencialmente en diferentes tejidos, organelos o estados fisiolgicos o patolgicos.
Rosario A. Muoz-Clares
DEPENDENCIA DE LA CONSTANTE DE VELOCIDAD DE LA TEMPERATURAS
k P
v = k [S] = k [X] Keq = [X] / [S] [X] = Keq [S] G = -RT ln Keq Keq = e- G /RT v = k Keq [S] = k e- G /RT [S]
k = k e- G /RTRosario A. Muoz-Clares
DETERMINACIN DE LA ENERGIA DE ACTIVACIN
k = k e- G /RT Lnk = Lnk - G/RTGraficar Lnk vs. 1/T Pendiente = - G/REn el caso de las reacciones catalizadas graficar Lnkcat o LnVmaxRosario A. Muoz-Clares
DETERMINACIN DE LA ENERGIA DE ACTIVACIN4.0 3.8 3.6 3.4
LnVmax
3.2 3.0 2.8 2.6 2.4 2.2 2.0 1.8 3.15 3.20 3.25 3.30 3.35 3.40
m = -Ea / R
3.45
3.50
3.55
1/T (K-1)Rosario A. Muoz-Clares
Determinar en cunto tiene una enzima que disminuir la energa de activacin de la reaccin no catalizada para incrementar esta velocidad 106 veces sin modificar ni la concentracin de sustratos ni la temperatura, 25 oC, a la que se lleva a cabo la reaccin. Discuta sus resultados. vc/vnc = 106 vc/vnc = kc / knc kc = k e- Gc /RT knc = k e- Gnc /RT vc/vnc = e (-Gc + Gnc)/ RT Ln106 = (Gnc - Gc) / RT Gnc - Gc = Ln106 RT Gnc - Gc = 13.8 x 1.987 cal K -1 mol-1 x 298.15 K = 8.175 cal mol-1 LA ENERGIA DE~ DOS PUENTES DE H!!!Rosario A. Muoz-Clares
Mecanismos de catlisis enzimtica
DISMINUCIN DE LA ENERGA DE ACTIVACIN DE LA REACCIN CATALIZADA CON RESPECTO A LA NO CATALIZADA
Rosario A. Muoz-Clares
Mecanismos de las enzimas para disminuir la energa de activacin de la reaccin catalizada Disminuir la entropa de activacin mediante efectos de proximidad, orientacin e inmovilizacin de los reactivos. Estabilizar el estado de transicin. Desestabilizar el complejo enzima-sustrato. Incrementar el nmero de pasos de la reaccin, cada uno de ellos con una menor energa de activacin que el(los) paso(s) de la reaccin no catalizada.Rosario A. Muoz-Clares
EFECTOS DE INMOVILACIN
Rosario A. Muoz-Clares
ANTICUERPOS CATALTICOS
Los anticuerpos obtenidos frente a un compuesto anlogo del estado de transicin de una reaccin catalizan esta reaccin al unirse al estado de transicin ms que al sustrato de la reaccin.
Rosario A. Muoz-Clares
Tipos de catlisis enzimtica
CATLISIS CIDO-BSICA CATLISIS ELECTROSTTICA CATLISIS COVALENTE CATLISIS POR IONES METLICOS
Rosario A. Muoz-Clares
Catlisis cido-bsica La catlisis cida general consiste en la transferencia de un protn desde un residuo de la enzima, que se comporta como un cido de Bronsted, al sustrato o intermediarios de la reaccin, disminuyndose as la energa libre del estado de transicin. La catlisis bsica general consiste en la transferencia de un protn desde el sustrato o intermediarios de la reaccin a un residuo de la enzima, que se comporta como una base de Bronsted, disminuyndose as la energa libre del estado de transicin. Si se dan ambos tipos de catlisis se tiene una catlisis cidobsica concertada.Rosario A. Muoz-Clares
Catlisis electrosttica La enzima estabiliza intermediarios o estados de transicin de la reaccin por neutralizacin de cargas gracias a la disposicin espacial en el sitio activo de residuos con carga opuesta. En otros casos la distribucin de cargas en el sitio activo sirve para guiar a sustratos cargados o polares a sus sitios de unin.
Rosario A. Muoz-Clares
Catlisis covalente La enzima forma transitoriamente un enlace covalente con el sustrato. La catlisis covalente consiste en tres pasos sucesivos: Ataque nucleoflico de la enzima sobre el sustrato (formacin del enlace covalente). Toma de electrones por el catalizador u otro sustrato (formacin del producto). Separacin del producto de la enzima (ruptura del enlace covalente, generalmente por hidrlisis).
Rosario A. Muoz-Clares
Pasos en la hidrlisis de un enlace peptdico por la quimiotripsina1. Activacin del grupo hidroxilo de la serina cataltica por abstraccin de un H+ que pasa a la histidina cataltica. La carga positiva deslocalizada del imidazol es neutralizada por la carga negativa del asprtico cataltico. 2. Unin especfica de la regin de la cadena polipeptdica que contiene el enlace que va a ser hidrolizado (un enlace en el que el carbonilo sea aportado por un residuo de aminocido aromtico). 3. Ataque nucleoflico de un in de la serina del sitio activo sobre el carbono del carbonilo del enlace peptdico que se va romper y formacin de un enlace covalente del sustrato con la enzima. En este intermediario el carbono del enlace peptdico pasa de ser trigonal (planar) a tetradrico.Rosario A. Muoz-Clares
Pasos en la hidrlisis de un enlace peptdico por la quimiotripsina4. Ruptura del enlace peptdico: El carbono del enlace peptdico pasa de ser tetradrico a trigonal (planar). Se libera un fragmento de la cadena polipeptdica que recibe un protn de la histidina cataltica para formar el grupo amino terminal de este fragmento saliente. Queda el otro fragmento de la cadena polipeptdica an unido covalentemente a la enzima. 5. Activacin de una molcula de agua por abstraccin de un H+ que pasa a la histidina cataltica. La carga positiva deslocalizada del imidazol es neutralizada por la carga negativa del asprtico cataltico.
Rosario A. Muoz-Clares
Pasos en la hidrlisis de un enlace peptdico por la quimiotripsina
6. Ataque nucleoflico del in hidroxilo sobre el carbono del carbonilo formndose de nuevo un intermediario tetradrico. 7. Ruptura del enlace que este carbono formaba con la serina cataltica: El carbono pasa de nuevo a planar (doble enlace con el oxgeno). La histidina cataltica cede un protn a la serina facilitando la liberacin del otro fragmento de la cadena polipeptdicacon su grupo carboxilo terminal libre. La enzima regresa a su estado inicial.
Rosario A. Muoz-Clares
Estabilizacin del intermediario tetradrico en la hidrlisis de un enlace peptdico por la quimotripsina Ocurre por el movimiento que sufre la regin del sustrato unida al sitio activo cuando el carbono del enlace peptdico que va a romperse pasa de planar a tetradrico. El oxgeno ocupa entonces una posicin que le permite formar dos nuevos puentes de hidrgeno con residuos de aminocidos del sitio activo. Un tercer puente de hidrgeno se forma entre un NH de la cadena polipeptdica que va a romperse y un CO de la cadena polipptidica de la enzima. La estabilizacin de este intermediario por estos tres puentes de hidrgeno es un factor muy importante en la catlisis de esta enzima. La diferencia de actividad entre el quimotripsingeno y la quimotripsina se debe a que la conformacin del sitio activo en el primero no permite la formacin de estos puentes de hidrgeno con el intermediario tetradrico.Rosario A. Muoz-Clares
Funciones de los iones metlicos en la catlisis enzimtica Mediar reacciones de xido-reduccin. Hacer de puente entre sustratos o coenzimas y el sitio activo. Neutralizar cargas negativas de los intermediarios o estados de transicin. Promover la catlisis nucleoflica mediante la ionizacin del agua.Rosario A. Muoz-Clares
Funciones de los iones metlicos en la catlisis enzimtica Mediar reacciones de xido-reduccin Transferencia de electrones
Rosario A. Muoz-Clares
Funciones de los iones metlicos en la catlisis enzimtica Hacer de puente entre sustratos o coenzimas y el sitio activo Algunos compuestos necesitan formar un complejo con un metal, generalmente Mg2+, para as poder unirse al sitio activo de la enzima. Ejemplo de ellos son los nucletidos ATP y ADP que forman complejos con Mg2+ muy estables. El verdadero sustrato de las reacciones en las que participan no es el nucletido libre sino el complejo nucletido- Mg2+.
Rosario A. Muoz-Clares
Funciones de los iones metlicos en la catlisis enzimtica
Neutralizar cargas negativas en intermediarios o estados de transicin. Aunque los sustratos de la reaccin sean neutros, durante el transcurso de la reaccin pueden surgir intermediarios o estados de transicin con cargas negativas que son estabilizados por un ion metlico, generalmente Mg2+, facilitando de esta forma el avance de la reaccin hacia el producto.
Rosario A. Muoz-Clares
Funciones de los iones metlicos en la catlisis enzimtica Promover la catlisis nucleoflica mediante la ionizacin del agua. El ion hidroxilo es un buen agente nucleoflico pero su concentracin en un medio acuoso a pH neutro es muy baja. Ciertos metales, muy frecuentemente Zn2+, que son grupos prostticos del sitio activo de algunas enzimas estn coordinados a una molcula de agua y de esta forma aumentan notablemente su acidez, permitiendo as que el agua est como ion hidroxilo a pH neutro. La funcin de este metal es por ello incrementar la concentracin de iones hidroxilo en el sitio activo de la enzima que usa a este ion como agente nucleoflico en la catlisis. Ejemplos: anhidrasa carbnica, carboxilasa C.Rosario A. Muoz-Clares