INFORME CINETICA ENZIMATICA

La cinética enzimática estudia la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas. Estos estudios proporcionan información directa acerca del mecanismo de la reacción catalítica y de la especifidad del enzima. La velocidad de una reacción catalizada por un enzima puede medirse con relativa facilidad, ya que en muchos casos no es necesario purificar o aislar el enzima. La medida se realiza siempre en las condiciones óptimas de pH, temperatura, presencia de cofactores, etc, y se utilizan concentraciones saturantes de sustrato. En estas condiciones, la velocidad de reacción observada es la velocidad máxima (Vmax). La velocidad puede determinarse bien midiendo la aparición de los productos o la desaparición de los reactivos.

 

Al seguir la velocidad de aparición de producto (o de desaparición del sustrato) en función del tiempo se obtiene la llamada curva de avance de la reacción, o simplemente, la cinética de la reacción. A medida que la reacción transcurre, la velocidad de acumulación del producto va disminuyendo porque se va consumiendo el sustrato de la reacción (Figura de la derecha). Para evitar esta complicación se procede a medir la velocidad inicial de la reacción (v0). La velocidad inicial de la reacción es igual a la pendiente de la curva de avance a tiempo cero (Figura de la derecha). De esta forma, la medida de v0 se realiza antes de que se consuma el 10% del total del sustrato, de forma que pueda considerarse la [S] como esencialmente constante a lo largo del experimento. Además, en estas condiciones no es necesario considerar la reacción inversa, ya que la cantidad de producto formada es tan pequeña que la reacción inversa apenas ocurre. De esta forma se simplifican enormemente las ecuaciones de velocidad.

 

Para estudiar la cinética enzimática se mide el efecto de la concentración inicial de sustrato sobre la velocidad inicial de la reacción, manteniendo la cantidad de enzima constante. Si representamos v0 frente a [S]0 obtenemos una gráfica como la de la Figura de la derecha. Cuando [S]0 es pequeña, la velocidad inicial es directamente proporcional a la concentración de sustrato, y por tanto, la reacción es de primer orden. A altas [S]0, el enzima se encuentra saturada por el sustrato, y la velocidad ya no depende de [S]0. En este punto, la reacción es de orden cero y la velocidad es máxima (Vmax).

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Experimento 2. Estudio de la influencia del pH

No hay imágenes ni resultados…

Los enzimas poseen grupos químicos ionizables (carboxilos -COOH; amino -NH2; tiol -SH; imidazol, etc.) en las

cadenas laterales de sus aminoácidos. Según el pH del medio, estos grupos pueden tener carga eléctrica positiva, negativa o neutra. Como la conformación de las proteínas depende, en parte, de sus cargas eléctricas, habrá un pH en el cual la conformación será la más adecuada para la actividad catalítica (Figura de la derecha). Este es el llamado pH óptimo.

La mayoría de los enzimas son muy sensibles a los cambios de pH. Desviaciones de pocas décimas por encima o por debajo del pH óptimo pueden afectar drásticamente su actividad. Así, la pepsina gástrica tiene un pH óptimo de 2, la ureasa lo tiene a pH 7 y la arginasa lo tiene a pH 10 (Figura de la izquierda). Como ligeros cambios del pH pueden provocar la desnaturalización de la proteína, los seres vivos han desarrollado sistemas más o menos complejos para mantener estable el pH intracelular: Los amortiguadores fisiológicos.

Experimento 3. Estudio de la influencia de c(S)

Resultados

CONCENTRACIÓN DEL SUSTRATO tiempo de reacción

Tubo 1 t2 10 min

Tubo 2 t3 15 min

Tubo 3 t3 15 min

Tubo 4 t3 15 min

El sustrato forma con la enzima el complejo Enzima – sustrato (ES), en donde el sustrato reacciona mucho mas fácil y rápidamente que en ausencia de la enzima, por una disminución de la energía de activación. A parte del complejo enzima – sustrato resultan los productor de la reacción, y la enzima queda en su condición original lista para aceptar otra molecula de sustrato:

De acuerdo con la ley de acción de masas, la velocidad de la reacción 3 sera proporcional ala concentración (ES), la cual a su vez depende de [€] y de [S]. Como E vuelve a quedar disponible al final de la reacción, podemos concluir que la velocidad de la reacción es directamente proporcional al [s].

Sin embargo, esta relación es validad cuando [s] es baja, y deja de serlo cuano aumenta. Con los valores muy altos de [S] la velocidad no cambia aunque [S] se siga aumentando, o sea que se ha alcanzado una velocidad máxima .

A baja [S], velodicada es directamente proporcional a [S]

A mu alta [S], velocidad es independiente de (S), ya no aumenta a pesar que aumente [S] y por tanto v = Vmax.

Existe un valor de [S] en el que v= Vmax/2, y ese valor recibe el nombre de Km, Constante de Michaelis.

Grafica 1

Con el siguiente ilustracion se entiende mejor, la gráfica anterior. Donde la enzima tiene 4 puntos activos, y alcanza su velocidad máxima cuando está saturada, es decir número activos = a moles de sustrato.

Imagen 1

Revisando la gráfica 2, la velocidad máxima “7 minutos 30 segundos” se alcanza con aproximadamente 0,43 ml de soluto. Cuando se supera esta concentración, la velocidad sigue siendo la misma, porque se saturan los sitios activos de las enzimas, y se debe esperar a que se produzca el producto y queden libres los sitios activos para generar mas productos.

Bibliografía

Información obtenida de Bioquímica Escrito por Antonio Peña - Las enzimas, aceleradores de reacción químicas pág. 193.

Experimento 1. Estudio de la influencia de c(e)

Resultados

No hay resultados de este experimento, solo hay las imágenes y para hacer la grafica es necesario tener los resutados en tiempo y concentración de la enzima. Si los conseguimos mañana, hacemos la gráfica.

Colocar Las Imágenes Aquí

ANALISIS DE RESULTADOS (TEORICO)

la velocidad de la reacción es directamente proporcional a la concentración de la enzima a cualquier concentración de sustrato. Por ejemplo, si la concentración de enzima es disminuida a la mitad, la velocidad inicial de la reacción (v0) es reducida también a la mitad de la original.

La velocidad de transformación de los sustratos de una reacción en los correspondientes productos, mediante una enzima y bajo condiciones de estado estacionario, es dependiente tanto de las concentraciones de la enzima como de los sustratos” si esta es baja”. Normalmente, esa dependencia puede ser expresada matemáticamente por la ecuación de Michaelis-Menten:

v= Vmax [S] / (Km + [S] )

Esta ecuación predice que la velocidad de formación de producto es saturable con respecto al sustrato, es decir existe una concentración de sustrato a partir del cual la v no aumenta de forma significativa.

La Vmax se denomina velocidad máxima, y depende de la concentración de enzima según una relación lineal:

Vmax = k2 [E]

La expresión de Michelis – Menten puede ser transformada algebraicamente en otras formas, que son más útiles para la expresión de los datos experimentales. Una de esas formas consiste en tomar los recíprocos (inversa) de ambos miembros de la ecuación.

ESPACIO PARA GRAFICA

Cuando se aumenta gradualmente la concentración de la enzima se aumenta también la cantidad de sitios activos que pueden recibir un sustrato y convertirlo en producto; cuando se crea el producto el sitio activo queda libre para recibir otro sustrato.por ende al aumentar la concentración de enzima disminuye la saturación de sustrato y se produce mas producto en menor de cantidad de tiempo.. Aumenta la velocidad de reacción.

GRUPO 4: INFLUENCIA DE LA TEMPERATURA (a 0 °C Y 40 °C)

PRUEBA DE 0°C y 40 °C

Resultados:

La siguiente tabla muestra las variaciones en los colores de la muestra al agregar el lugol.

Nota: para los tiempos to y t1, la cantidad de lugol agregado a la muestra sobrepaso los valores recomendados en la guía de laboratorio, es por ello que para estos dos tiempos los resultados no son verídicos. Los siguientes resultados si expresan el comportamiento normal del almidón en presencia de la enzima alfa- amilasa y su respectiva coloración con lugol.

Tiempo (lapsos de 5 minutos) Temperatura a 0°Ct0 El color dominante es el marrón

característico del lugol

t1 El color dominante es el marrón característico del lugol

t2 Presencia de color azult3 Presencia de color azult4 Presencia de color azult5 Presencia de color azult6 Presencia de color azult7 El color azul empieza disminuir en su

concentración en la muestra t8 La intensidad del color azul es menor, se

denota la presencia de lugol.t9 El color azul sigue presente pero la cantidad

de lugol es mayor. t10 Las imágenes muestran que no se realizo el

experimento para estos tiempos. t11 Las imágenes muestran que no se realizo el

experimento para estos tiempos.

En las siguientes imágenes se muestran los resultados del experimento.

Imagen 4.1.1 resultados prueba a Temperatura de 0°C.

ANALISIS DE RESULTADOS

Fundamento teórico del experimento

En general, los aumentos de temperatura aceleran las reacciones químicas: por cada 10ºC de incremento, la velocidad de reacción se duplica. Las reacciones catalizadas por enzimas siguen esta ley general. Sin embargo, al ser proteínas, a partir de cierta temperatura, se empiezan a desnaturalizar por el calor. La temperatura a la cual la actividad catalítica es máxima se

llama temperatura óptima (Figura de la derecha). Por encima de esta temperatura, el aumento de velocidad de la reacción debido a la temperatura es contrarrestado por la pérdida de actividad catalítica debida a la desnaturalización térmica, y la actividad enzimática decrece rápidamente hasta anularse.

Para el caso especifico de nuestro experimento, la temperatura se mantiene constante, pero el factor determinante de la reacción radica en el tiempo que permanece a la misma temperatura. Entre mayor tiempo permanece la muestra ( alfa amilasa y a1-4 del almidón) a la misma temperatura la reacción empieza a acabar con el sustrato y es por ello que para los últimos tiempos (t7, t8 y t9) la presencia del precipitado azul es menor y al contrario la cantidad de lugol aumenta considerablemente. Esto se debe a que el lugol genera un complejo ioduro de almidón, de una coloración azul – violeta intenso que permite identificar la presencia de polisacáridos en la muestra. Es así que cuando se acaba el sustrato, en este caso el alfa 1-4 del almidón se deja se observar el precipitado color azul-violeta intenso.

PRUEBA DE 40ºC

Resultados

Tiempo (lapsos de 5 minutos) Temperatura a 40 °Ct0 Se excedió en la cantidad de lugol a aplicar

t1 Presencia de precipitado color azul

t2 Presencia de precipitado color azult3 Presencia de precipitado color azult4 Presencia de precipitado color azult5 Presencia de precipitado color azul

t6 Presencia de precipitado color azul, presencia de coloración marrón (lugol).

t7 Presencia de precipitado color azul, desaparece la presencia de lugol en la muestra.

t8 Presencia de precipitado color azul, aparece de nuevo los residuos de lugol.

t9 Las imágenes muestran que no se realizo el experimento para estos tiempos. No hay ninguna coloración

t10 Las imágenes muestran que no se realizo el experimento para estos tiempos. No hay ninguna coloración

t11 Las imágenes muestran que no se realizo el experimento para estos tiempos. No hay ninguna coloración.

Nota: En la prueba a 40 °C se presenta continuidad en los resultados de la tonalidad del precipitado (color azul), pero la presencia del lugol no es continua, ya que aparentemente aparece en t6 pero en t7 desaparece por completo, para luego reaparecer en t8. Para esta prueba se debe ignorar la muestra del tiempo t0, que también contiene exceso de lugol.

Imagen 4.1.2 resultados para prueba a temperatura de 40 °C

Analisis de resultados:

Para no repetir las mismas conclusiones anteriores, solo cabe agregar que la velocidad de la reacción para una temperatura mayor (40 ºC) es mayor que a temperauras menores, es por ello que la presencia intermitente de lugol puede deberse a la temperatura a la cual se mantenia la muestra, pero este fenómeno puede estar relacionado con la poca agitación del tubo de ensayo, por lo cual en algunos momentos la muestra podria tener mayor concentración de almidon y en otras mucho menor.

Experimento 4: Influencia De La Tmepratura (50 °C y temperatura Ambiente)

Resultados: Colocar aquí los resultados Pues no estan completos estos de aca.

Analisis de resultados

- Temperatura del ambiente y 50 °C Partiendo de los mismo principios físicos y químicos expuestos con anterioridad, se pueden explicar los fenomenos ocurridos con estas temperaturas. Para los cambios ocurridos en la muestra con la temperatura ambiente, se puede decir que la temperatura no influye notablemente en los cambios ocurridos a nivel de la racción, para este caso la velocidad de la reacción depende netamente de la enzima. Para los resultados ontenidos con la temperatura a 50 C, se puede concluir que hay una mayor velocidad de la reacción en comparación con los resultados de la temperatura ambiente, esto se comprueba con la pequeña cantidad de presipitado azul-violeta retenido en la placa de porcelana para los tiempos t4 y t5. A una mayor temperatura mayor velocidad de la reacción.