Regulátoros T sejtek és sejtes környezetük immunmediált … · 2012. 5. 15. · Regulátoros T sejtek és sejtes környezetük immunmediált gyermekkori gasztroenterológiai

Regulátoros T sejtek és sejtes környezetük immunmediált gyermekkori

gasztroenterológiai kórképekben

Doktori értekezés

Dr. Cseh Áron

Semmelweis Egyetem Klinikai Orvostudományok Doktori Iskola

Témavezető: Dr. Veres Gábor, Ph.D., egyetemi docens

Hivatalos bírálók: Dr. Juhász Márk, Ph.D., egyetemi adjunktus Dr. Kriván Gergely, Ph.D.

Szigorlati bizottság elnöke: Dr. Szalai Csaba, Ph.D., az MTA doktora

Szigorlati bizottság tagjai: Dr. Nobilis András, Ph.D., egyetemi docens Dr. Sebe Attila, Ph.D.

Budapest, 2011

Tartalomjegyzék

2. oldal

1. Tartalomjegyzék

1. Tartalomjegyzék 2

2. Rövidítések jegyzéke 5

3. Bevezetés 7

3.1. Immunmechanizmusú kórképek 8

3.1.1. Crohn betegség 8

3.1.2. Cöliákia 11

3.1.3. Allergiás kolitisz 13

3.2. Az immunrendszer sejtes elemei 15

3.2.1. Regulátoros T sejtek (Treg) 15

3.2.1.1. Treg típusok 15

3.2.1.2. Treg-ek azonosítása 17

3.2.1.3. Treg sejtek működése 19

3.2.1.4. Treg terápia 21

3.2.2. Treg szabályozó sejtek 24

3.2.2.1. A DC sejtek 25

3.2.2.2. Monociták 29

3.2.3. Treg célsejtek 30

3.2.3.1. NK és NKT sejtek 30

Tartalomjegyzék

3. oldal

3.2.3.2. CD4 és CD8 limfociták 34

4. Célkitűzések 38

4.1. Crohn betegség 38

4.2. Cöliákia 38

4.3. Allergiás kolitisz 38

5. Betegek és módszerek 39

5.1. Egészséges és beteg csoportok 39

5.1.1. Crohn betegek 39

5.1.2. Cöliákia 41

5.1.3. Allergiás kolitisz 42

5.1.4. Egészséges kontrollok 43

5.2. Módszerek és statisztika 44

5.2.1. Minta előkészítés 44

5.2.2. Immunsejt markerek 46

5.2.3. Áramlási citométeres mérések 52

5.2.4. Citokin chip 55

5.2.5. Statisztika 55

6. Eredmények 57


Tartalomjegyzék

4. oldal

6.2. Cöliákia 63


7. Megbeszélés 70


7.2. Cöliákia 74


8. Következtetések 81

9. Összefoglalás 83

9.1. Összefoglaló 83

9.2. Summary 85

10. Irodalomjegyzék 87

11. Publikációk 102

11.1. A disszertáció alapjául szolgáló publikációk 102

11.2. A disszertációhoz kapcsolódó publikációk 103

11.3. Egyéb publikációk 104

12. Köszönetnyilvánítás 106

Rövidítések jegyzéke

5. oldal

2. Rövidítések jegyzéke

5-ASA 5-aminoszalicilát

AC allergiás kolitisz

APC antigén prezentáló sejt

AZT azathioprin

BMI testtömeg-index

CD Crohn betegség

CRP C-reaktív protein

CTLA-4 citotoxikus T limfocita antigén-4 (CD152)

DC dendritikus sejt

DNS dezoxiribonukleinsav

EC eozinofil kolitisz

FACS áramlási citométer

FoxP3 forkhead box P3 transzkripciós faktor

GCSF granulocita kolónia-stimuláló faktor

GFD gluténmentes diéta

GITR glükokortikoid indukálta tumor nekrózis faktor receptor gén

GMCSF granulocita-makrofág kolónia-stimuláló faktor

HC hematokézia

IBD gyulladásos bélbetegség

ICS inhalált kortikoszteroid

IDO indolamin 2,3-dioxigenáz

IEL intraepiteliális limfociták

IFNα interferon-alfa

IFN-γ interferon-gamma

IFX infliximab

Ig immunglobulin

IL interleukin

iNKT invariáns természetes T ölő sejt

LAG-3 limfocita aktivációs gén 3

LPS lipopoliszacharid (endotoxin)

Rövidítések jegyzéke

6. oldal

MCP-1 monocita kemoattraktáns protein-1

mDC mieloid dendritikus sejt

MHC fő hisztokompatibilitási komplex

MIP-1β makrofág inflammatórikus protein-1β

NK természetes ölő sejt

NKT természetes ölő T sejt

PBMC perifériás vér mononukleáris sejt

PBS foszfát-pufferelt fiziológiás sóoldat

pDC plazmocitoid dendritikus sejt

RA reumatoid artritisz

Tc citotoxikus T sejt (CD8)

TCR T sejt receptor (CD3)

TG transzglutamináz

TGF-ß transzformáló növekedési faktor béta

Th helper T sejt (CD4)

TLR Toll-like receptor

TNFα tumor nekrózis faktor alfa

Treg regulátoros T sejt

UC kolitisz ulceróza

Bevezetés

7. oldal

3. Bevezetés

A csecsemő-, és gyermekkori megbetegedések jelentős csoportját alkotják a

gasztroenterológiai kórképek. Ezek a kórképek kialakulásuk szerint alapvetően három

csoportba sorolhatóak: a fejlődési rendellenességgel járók, a felszívódási zavarok,

illetve azok, amelyekben gyulladásos folyamat játszik szerepet. A gyulladás hátterében

fertőzés, illetve autoimmun reakció állhat. A fertőzések pathomechanizmusa általában

ismert, lefolyásuk többnyire akut, kezelésük tüneti, ill. a bakteriális fertőzések egy

részében antibiotikumok adása szükséges. Az autoimmun betegségek ezzel szemben

krónikus jellegűek, kezelésük során a cél az immunrendszer kóros működésének a

modulációja. Az autoimmun betegségek kialakulásának módja kevéssé ismert, de egyre

több adat áll rendelkezésre arról, hogy az immunszabályozás zavara miként vesz részt a

létrejöttükben.

Munkám során azzal kapcsolatban kívántam adatokat gyűjteni, hogy a

vizsgálandó kórképek hátterében milyen immunfenotípus változások állnak, illetve az

általunk eddig ismert kezelési módok hogyan befolyásolják ezeket az esetleg fennálló

eltéréseket. A vizsgált gasztroenterológiai kórképek a Crohn betegség (CD), cöliákia, és

az allergiás kolitisz (AC) a csecsemő-, és gyermekkor eltérő időszakában és más-más

okokból alakulnak ki. Közös bennük azonban, hogy immunmediálta kórképek.

Feltételezések szerint a túlzott immunválasz gátlásában fő szerepet játszanak a

regulátoros T sejtek (Treg), ezért ez a sejtcsoport állt vizsgálatunk középpontjában.

Ugyanakkor az immunsejtek nem önállóan, hanem egymással szoros együttműködésben

és bonyolult kölcsönhatásban alakítják az immunválaszt, ezért a Treg sejteken túl sejtes

környezetük is vizsgálatra került.

Célunk volt olyan vizsgálati módszer kidolgozása és alkalmazása is, amely a

legkevesebb megterhelést jelenti a gyermekkorú betegek számára. Az áramlási

citométeres (FACS) vizsgálatokhoz igen kevés vérminta is elegendő, és a perifériáról

vett minta a rutin vérvételeken túl alig jelent a betegnek többletterhelést.

Dolgozatomban a vizsgált kórképekről, majd az immunrendszerről szóló irodalmi

áttekintés után ismertetem a vizsgálati módszereket és a betegeket, majd végül az

Bevezetés

8. oldal

eredményeket és az azokból levonható következtetéseket. A dolgozat megírásánál a

magyar orvosi nyelvvel kapcsolatos magyarító és egységességre törekvő ajánlásoknak

megfelelő irányelveket követtem. [1]

3.1. Immunmechanizmusú kórképek

3.1.1. Crohn betegség

A Crohn betegség (CD) a kolitisz ulcerózával (UC) együtt a krónikus gyulladásos

bélbetegségek (IBD) csoportját alkotja. A CD krónikus gyomor-bélrendszeri

megbetegedés, amit a bélrendszer nyálkahártyájának gyulladása jellemez, és a

genetikailag fogékony egyénekben az immunrendszer egyébként ártalmatlan luminális

antigénekre adott rendellenes válaszának következményeként alakul ki. [2] A betegség

az esetek 10-15%-ában 18 éves életkor előtt kerül felismerésre. [3] Prospektív hazai

adatok alapján a Crohn betegség incidenciája 3,8/100 000, amely megegyezik az

európai és észak-amerikai adatokkal. [4] A gyermekkori Crohn betegség számos

különbséget mutat a felnőttkori változathoz képest, így eltérő a betegség lokalizációja,

az immunszuppresszív terápiára adott válasz, és feltételezhetően különbözik a genetikai-

és immunfenotípus is. [5] A legelfogadottabb elméletek szerint az immunrendszer hibás

működése az, ami felnőttekben döntően hozzájárul a betegség kialakulásához, mind az

adaptív, mind a veleszületett immunitás érintettségével. [6-9]

Ismert, hogy az adaptív immunitás elemei közül felnőttkori CD-ben a perifériás

Treg szám alacsony terápia-naív (még nem kezelt) betegekben, és megemelkedik a

kezelés hatására vagy remisszióban. [10-12] Ugyanakkor a központi Treg-ek száma a

bélben megnövekszik a betegség aktív fázisában [11-13]. A Treg-ek célsejteiként

számon tartott effektor [14-16] és aktivált T sejtek [17-19] száma emelkedett a

periférián aktív CD-s betegekben. Régóta ismert az a tény is, hogy IBD-ben mind a

perifériás, mind a centrális T helper (Th) sejtek Th1 irányba polarizálódnak. [7] A

felnőttkori betegekben a veleszületett immunitás sejtjei közül az antigén prezentáló

sejtek (APC), ezen belül is a dendritikus sejtek (DC) száma csökken remisszióban és

relapszusban a periférián, míg a ezek a sejtek a szövetekben felszaporodnak. Ezzel

együtt az APC-k Toll-like receptor (TLR) 2 és 4 expressziója mind terápia naív, mind

kezelt betegekben magasabb az egészségeseknél. [20-22] Az APC-k másik

Bevezetés

9. oldal

csoportjának, a monocitáknak a prevalenciája nem változik a periférián, de magasabb

biopsziában, magasabb TLR-2 és 4 expressziót mutatva aktív fázisban és remisszióban

is. [23-26]

Jóval kevesebb adat áll ugyanakkor rendelkezésre arról, hogy gyermekkorban

milyen immunelváltozások állnak a CD hátterében. A legtöbb közlemény, ami erről a

korcsoportról eddig megjelent, főleg a kezelt beteg gyermekeket vizsgálta. Ugyanakkor

az a kevés adat, ami kezeletlen beteg gyermekektől származik, az adaptív immunitás

eltérő viselkedését írta le, így a Th1/Th2 arány Th2 felé való eltolódását, szemben a

felnőttekben megfigyeltekkel. [27-30] Újabban azonban a veleszületett immunitásnak

életkori sajátosságok miatt nagyobb szerepet tulajdonítanak ebben a korcsoportban,

ugyanis minél fiatalabb életkorra esik a betegségkezdet, annál nagyobb lehet a

veleszületett immunitás jelentősége. [3] Kevés adat áll rendelkezésre ebből az

életkorból, de ismert, hogy nem kezelt CD beteg gyermekekben a szöveti makrofágok

prevalenciája emelkedett [31], akárcsak a TLR-2 és TLR-4 expresszió [32].

A betegség kezelésére használt hagyományos és biológiai terápiát jelentő

gyógyszerekkel ezt a zavart immunműködést próbálják meg helyreállítani. A

hagyományos, első vonalbeli aminoszalicilátoknak (ASA), szteroidoknak és

immunszuppresszív szereknek, amik a leggyakrabban alkalmazottak a terápiában,

régóta ismert az immunrendszert befolyásoló hatásuk. [33] A kezelés következő

lépcsőjét jelentő biológiai terápiának, így a tumor nekrózis faktor-alfa (TNFα) inhibitor

infliximabnak (IFX) újabban kezdjük megismerni a pontos hatásmechanizmusát

(többnyire reumatoid artritiszes (RA) betegcsoportban), valamint leírták az egyes

sejtcsoportokra kifejtett hatását. [34] Az IFX fokozza mind a perifériás, mind a centrális

Treg [10,35], effektor és aktivált T [36,37] és Th1 sejtek [37,38] prevalenciáját. Az IFX

ugyanakkor csökkenti a természetes ölő (NK) sejtek [36], DC-k [39,40], és monociták

prevalenciáját [41,42], valamint a TLR-2 és 4 expressziót [43] a periférián.

Gyermekkorban ugyanakkor kevéssé ismert akár a konvencionális, akár pedig a

biológiai terápiának az immunsejtekre gyakorolt hatása.

Bevezetés

10. oldal

1. ábra A Crohn betegség feltételezett immunpatomechanizmusa. A tápcsatorna

immunrendszere közvetlen kapcsolatban van a béltartalom antigénjeivel, a lamina propriát csak

egy sejtsornyi epitél választja el a lumentől. Az epitél tartalmazza a Paneth és Goblet sejteket is,

ez utóbbiak hozzák létre a védőréteget a bélfalon. A dendritikus sejtek mintát vesznek a

béltartalom antigénjeiből. Ha magasabb az antigének száma vagy sérül az epitélium, akkor a

dendritikus sejtek a naív T sejteket aktiválják. Ezek a sejtek aztán tovább differenciálódnak T

helper 1, T helper 2, T helper 17 vagy regulátoros T sejt irányba, ezáltal kialakítva a jellemző

immunválaszt. [44]

Bevezetés

11. oldal

3.1.2. Cöliákia

A cöliákia világszerte a populáció közel egy százalékát érintő

vékonybélgyulladás. [45] A rendelkezésekre álló szűrő tesztekkel egyre gyakrabban

ismerik fel a néma cöliákiát is, így magyar adatok alapján a betegség prevalenciája 1:85.

[46] Gyermekkorban a tünetek intesztinális (széklet habitusának megváltozása, krónikus

hasi fájdalom, malabszorpciós tünetegyüttes) és extraintesztinális (vas háztartás zavara,

hepatitisz, oszteopénia, migrén, occipitális epilepszia) megjelenésűek lehetnek. [47] A

genetikailag fogékony egyénben a cöliákia tüneteit a táplálékkal felvett bizonyos

fehérjékre adott fokozott adaptív immunválasz okozza. [48] Újabban azonban a

veleszületett immunitás szerepét is feltételezik a betegség patomechanizmusában. [49-

51] A betegség kezelésében döntő jelentőségű a kiváltó okot jelentő antigének

eliminációja az étrendből (gluténmentes diéta, GFD), így a búza, rozs és árpa teljes

tilalma. A diéta a tünetek javulását hozza napokon vagy heteken belül, míg a

hisztológiai javulás hónapokon vagy éveken belül figyelhető csak meg. Amennyiben a

diéta hatására javulás nem következik be, ritkán szteroid vagy immunszuppresszáns

adása is szükséges lehet. Megfigyelték, hogy míg aktív cöliákiában az intraepiteliális

limfociták (IEL) többnyire CD3+CD8+, addig ezekben a diétára nem reagáló

refraktórikus esetekben CD3+CD8- immunfenotípusúak. [52]

Bár úgy tűnhet, hogy a kiváltó okot már régóta jól ismerjük, de a következményes

immunzavar egyes elemeinek a pontos szerepe, mind a mai napig nem egészen

tisztázott. A rendelkezésre álló adatok többsége az adaptív immunitás zavarát írja le

cöliákiában. Az összes T limfocita prevalenciáját alacsonyabbnak találták a periférián

[53], míg a biopsziás mintákban emelkedett volt arányuk az egészségesekhez képest

[48,54]. Az aktivált T sejtek prevalenciája ugyanakkor mind a periférián [53,55-58],

mind a biopsziás mintákban [59,60] megnövekedett. Ezzel együtt az egyik legfőbb, az

adaptív immunválaszt szabályozó Treg sejtek zavaráról is beszámoltak cöliákiában [61-

63].

Bevezetés

12. oldal

2. ábra A cöliákia immunpatomechanizmusa. A glutén a bélrendszer enzimjei hatására 33

aminósavból álló peptidre bomlik. Ez a peptid a vékonybél epitéliumán át felszívódik, és a

lamina propriánál a szöveti transzglutaminázok révén deaminálódik. A deaminált peptid az

antigén prezentáló sejtek révén felismerésre kerül. Ezt követően a T-sejt receptorok révén

autoreaktív CD4+ sejtek valamint T helper 1 és természetes ölő sejtek aktivációját okozzák. A

következményes gyulladás intraepiteliális limfociták felhalmozódását és a jellegzetes bélboholy

atrófiát eredményezi. [52]

A veleszületett immunitás sejtes elemeinek szerepe még kevésbé tisztázott a

cöliákia patomechanizmusában. [49,50,64] Az NK, természetes ölő T (NKT) és

invariáns természetes ölő T (iNKT) sejtek száma csökkent a betegek vérében [53,65-

67], és bélmintáiban [59,66]. Kevés és ellentmondásos adat áll rendelkezésre az APC-k

Bevezetés

13. oldal

eltéréseiről, mivel egy közlemény szerint a perifériás DC-k száma csökkent [67], míg

egy másik nem írt le változást ebben a sejtcsoportban [68]. A veleszületett immunitás

receptorai, így a TLR-2 és 4 expressziója ugyanakkor fokozódik a betegekből származó

biopsziákban. [69]

3.1.3. Allergiás kolitisz

A fejlett országokban az anyatejjel táplált csecsemőkben az allergiás kolitisz (AC)

az egyik leggyakoribb oka a hematokéziának (HC). [70] A HC friss vér megjelenése a

székletben, amely az egyébként egészségesnek imponáló csecsemőkben a fertőzések és

végbélrepedés után a leggyakoribb megjelenési formája a rektális vérzésnek. Az AC

jelenlegi tudásunk szerint az anyatejben kiválasztott antigénekkel szembeni

hiperszenzitivitás révén jön létre, és így az ételallergiák egy fajtájának tartjuk.

Súlyosabb formája az eozinofil kolitisz (EC), mivel az AC és EC elkülönítése biopsziás

mintában látható eozinofil számon alapul, és utóbbiban több, mint húsz eozinofil sejt

látható látóterenként a nagy nagyítású mikroszkópban. Az AC és EC kialakulásában

döntő szerepe van a tehéntej-fehérjéknek, amelyek az allergiás válasz leggyakoribb

kiváltó okai csecsemőkben, ugyanis a minden más tekintetben egészséges csecsemők

esetében 0,3-7,5%-ban okozói a HC-nek. [71] A HC-s csecsemők esetében az anyatejes

táplálás elhagyására gyakran megszűnnek a tünetek. Újabb adatok szerint azonban a

HC-s gyermekek mindössze 18%-ában áll fent valódi tehéntejallergia. [72]. A betegek

egy részében az anyai eliminációs diéta (tehéntej, tojás, szója, olajos magvak elhagyása)

nem segít, és súlyos esetben csak elementáris tápszerre való váltással szüntethetőek meg

a panaszok. A kórkép speciális sajátossága, hogy az esetek döntő részében a HC

spontán javul, amelynek pontos oka ismeretlen.

Egyre több adat utal arra, hogy az ételallergiák kialakulásában a

gyomorbélrendszer immunitásának késedelmes érése játszhat szerepet. [73] A higiénia

hipotézisnek megfelelően a szuboptimális mikroorganizmus expozíció miatt az adaptív

immunitás zavart szenved az ételallergiás egyénekben. [74] Az effektor T sejtek és

aktivált limfociták [75], valamint a Treg sejtek prevalenciája [76] alacsonyabb

ételallergiás gyermekek perifériás vérében. A sejtszámok változásával együtt a Th1/Th2

Bevezetés

14. oldal

arány Th2 irányba tolódik a betegekben, mind a sejtfelszíni markerek, mind a citokin

expresszió alapján. [77]

3. ábra A gyomorbélrendszeri hiperszenzitivitás kialakulása. Egészséges egyénben orális

tolerancia alakul ki a táplálék allergénekkel szemben. Allergiás egyénekben allergén specifikus

T helper (Th) 2 sejtek keletkeznek a naív Th0 sejtekből. Aktiválódásuk után a Th2 sejtek

különböző interleukineket (IL), így IL-4, IL-10 és IL-13-at termelnek. A regulátoros T sejtek

képesek a Th2 limfociták aktiválódását gátolni. [78]

Bevezetés

15. oldal

3.2. Az immunrendszer sejtes elemei

3.2.1. Regulátoros T sejtek (Treg)

A Treg sejtek az adaptív immunitásban központi szabályozó szerepet játszanak.

Humán perifériás vérmintában arányuk csak kb. 1-2%-a az összes fehérvérsejtnek, de

mégis az immun homeosztázis egyik legfontosabb fenntartói. A Treg-ek képesek más

immunsejtek működését gátolni, és így szabályozni az immunválaszt. Csökkent Treg

számot és működést számos autoimmun kórképben (szklerózis multiplex, reumatoid

artritisz, 1-es típusú diabétesz) leírtak. A Treg sejtek magas számát azonban

rosszindulatú daganatos betegségekben (tüdő-, hasnyálmirigy-, mellrák) figyelték meg.

[79]

1. táblázat A regulátoros T sejtek feltételezett funkciói. A táblázat az eddig in vivo és in vitro

bizonyított szabályozó feladatokat sorolja fel. [80]

1. Autoimmun folyamatok megakadályozása saját tolerancia kialakításával

2. Allergiás típusú immunfolyamatok gátlása

3. Orálisan bekerülő antigénekkel szembeni tolerancia kialakítása

4. Anyai tolerancia kialakítása a magzattal szemben

5. Patogén indukálta immunfolyamatok gátlása

6. Az effektor immunműködés szabályozása az immunválaszban

7. Gyenge stimulus által aktivált immunválasz gátlása

8. Kis affinitású autoreaktív limfociták gátlása

9. Effektor immunválasz nagyságának befolyásolása

10. Kommenzális baktériumok védelme az immunrendszerrel szemben

3.2.1.1. Treg típusok

A Treg-eket két csoportba osztják: megkülönböztetnek CD4 Treg és CD8 Treg

sejteket. A CD4 Treg-ek kialakulásuk alapján két típusra bonthatóak, a természetes

Treg-ekre (nTreg), amelyek folyamatosan expresszálnak CD25-öt és forkhead box P3

(FoxP3) transzkripciós faktort, valamint az ún. adaptív vagy indukált Treg-ekre (iTreg).

Bevezetés

16. oldal

2. táblázat Regulátoros T sejt (Treg) típusok jellemzői. Rövidítések: CTLA-4: citotoxikus T

limfocita antigén-4; GITR: glükokortikoid indukálta tumor nekrózis faktor receptor gén;

FoxP3: forkhead box P3 transzkripciós faktor; TGF-ß: transzformáló növekedési faktor béta;

APC: antigén prezentáló sejt; IL: interleukin. [81]

Természetes Treg

(nTreg) Indukált Treg

(iTreg) nTreg Tr1 Th3

Fenotípus CD4+CD25int/high,

CD127low CD4+CD25- CD4+CD25+

Egyéb markerek CTLA4+, GITR+,

FoxP3+, CD127low CD25low-variable,

CD45RBlow, FoxP3- CD25low-variable,

CD45RBlow, FoxP3+

Hatásmechanizmus kontaktus függő, granzim B-függő,

TGF-β termelő

citokinek révén, IL-10 termelő

TGF-β termelő

Célsejtek APC és effektor

T sejtek effektor T sejtek nem ismert

In vivo szerep autoreaktív T sejtek

gátlása

mukozális immunitás,

gyulladásos válasz

mukozális immunitás,

gyulladásos válasz

In vivo aktiváció CD3 és CD28, IL-2 hatására

CD3, IL-10 hatására CD3, TGF-β

hatására

Az nTreg-ek a csecsemőmirigyből származnak, és nagy mennyiségben

expresszálják a CD25 sejtfelszíni markert, vagyis az interleukin (IL) 2 receptort,

valamint intracellulárisan a FoxP3 transzkripciós faktort. Az nTreg-ek a CD4 pozitív

sejtpopuláció átlagosan 5-10%-át alkotják, egyszeres CD4 pozitív sejtekként már

különválnak, és pozitív szelekciójuk során a saját antigének iránt nagy affinitással

rendelkező sejtekként maradnak meg. [82] A limfociták Treg irányba való fejlődését a

feltételezések szerint a csecsemőmirigyben a saját antigénekkel való találkozás a T sejt

receptor (TCR) és a fő hisztokompatibilitási komplex II (MHC II) közötti kapcsolat

révén befolyásolja. [83]

Az iTreg-ek szintén a csecsemőmirigyből származnak, CD4 pozitív sejtekként

tovább differenciálódnak az adekvát antigén hatásra a veleszületett antigének, valamint

transzformáló növekedési faktor béta (TGF-ß), IL-4, és IL-10 stimuláció hatására CD25

és FoxP3 expresszáló sejtekké. [84]

Bevezetés

17. oldal

3.2.1.2. Treg-ek azonosítása

A régebben szuppresszor T sejteknek nevezett immunsejtek koncepciója az 1980-

as évek vége felé az alapján dőlt meg, hogy nem találtak olyan markert, amivel

egyértelműen azonosítani lehetett volna a populációjukat. [80] A Treg sejtek

azonosítására jelenleg is számos marker áll rendelkezésünkre, így a CD25 (IL-2R),

CTLA-4, GITR, LAG-3, CD127 (IL-7R), és a FoxP3. Mindegyikről ismert, hogy az

aktivált T sejtekre is jellemző marker, ezért úgy tartják, hogy a szuppresszor hatás

létrejöttéhez szükséges a sejtek aktivációja.

Az összes Treg marker közül a FoxP3 a jelenleg ismert legszélesebb körben

elfogadott, annak ellenére, hogy tudott az, hogy a Treg-ek kis százaléka FoxP3-ra

negatív. [80] A FoxP3 a limfoid szövetekben expresszálódik legnagyobb számban, ezen

belül az a αß T sejtekre jellemző, míg a B sejtekben, γδ T sejtekben, NK sejtekben,

makrofágokban és DC-kben alig detektálható. A FoxP3-at a CD4+ sejtek expresszálják a

legnagyobb számban, de CD8+ sejtekben is megtalálható kis számban. A klasszikus

Treg markerrel, a CD25-el nem teljes az expressziós átfedés, mert a nyirokcsomókban

és a lépben a kettős pozitív sejteken túl igen kis számban ugyan, de előfordulnak CD25-

FoxP3+ sejtek is.

A FoxP3 (Scurfin, IPEX, JM2) a regulátoros aktivitással bíró CD4 pozitív

sejtekben expresszálódik, mint a forkhead családba tartozó transzkripciós faktor. [85]

Genomiális analízisekben kimutatták, hogy bár pontos szerepe nem ismert, de nagyjából

700-1100 gén promoter régiójához kötődik, és minden esetben a TCR-en keresztüli

szignáltranszdukciót befolyásolja. [80] Mint minden transzkripciós faktor, a

transzkripciót mind aktiválni, mind gátolni képes, ahogy ezt ki is mutatták a Treg sejtek

esetében. A legfőbb bizonyíték a FoxP3 jelentőségére az, hogy naív T sejtekbe

retrovirális úton FoxP3-at juttatva szuppresszor funkciót nyernek. Ugyanakkor az in

vivo vagy in vitro generált Treg sejtek nem mindegyike expresszál FoxP3-at, hasonlóan

az IL-10 indukálta és IL-10-et is termelő Tr1 típusú Treg sejtekhez. Ezzel

összefüggésben megfigyelték, hogy bizonyos tartós citokin hatásokra képesek a Treg

sejtek T helper sejtekké alakulni, és a FoxP3 pozitivitásuk ebben az esetben elveszhet.

Bevezetés

18. oldal

4. ábra A regulátoros T (Treg) sejtek populációinak eredete. A forkhead box P3 transzkripciós

faktor (FoxP3) expressziója a jelenleg legelfogadottabb marker a Treg sejtek azonosítására. A

természetes Treg sejtek prekurzoraikból alakulnak ki nem ismert módon a csecsemőmirigy

kortexében és medullájában lévő epiteliális és dendritikus sejtek hatására. Citokinek, így az

interleukin-2 (IL-2) és feltehetően a transzformáló növekedési faktor béta (TGF-β) szintén

szerepet játszanak a sejtvonal kialakulásában és élethosszig tartó FoxP3 expressziójuk

fenntartásában. A periférián a naív FoxP3+ Treg sejtek effektor Treg sejtekké alakulnak,

valamint de novo is keletkezhetnek naív FoxP3- sejtekből. In vitro TGF-β hatására alakulhatnak

ki nem stabilan FoxP3+ Treg sejtek. [86]

Bevezetés

19. oldal

A FoxP3 mutációja egerekben a Scurfy, míg emberekben az IPEX nevű

tünetegyüttest okozza (immun diszreguláció, poliendokrinopátia, enteropátia, X-

kromoszómához kapcsolt szindróma). (Sakaguchi 2005) Miután a FoxP3 intracelluláris

marker, azonosításához a sejtet fixálni és permeabilizálni kell, ezért élő sejtek

izolálására nem alkalmas. Régebben a CD4+CD25high sejtekként azonosították a Treg-

eket, ami csak megközelítőleg (kb. 90%) volt pontos eljárás, de élő sejtek vizsgálatát is

lehetővé tette. A CD25 az IL-2 receptor alfa lánca, és mivel az IL-2 elengedhetetlen a T

sejtek klonális expanziójához, minden aktivált T limfocitára jellemző. [80]

Újabban, a FoxP3+ sejtek elkülönítésével azonosították a CD127 (IL-7R) markert.

[87] A CD127 expresszió inverz módon korrelál a FoxP3 expresszióval, és a CD127 a

CD25 pozitív sejtek nagy részén jelen van. [88,89] A CD127 a heterodimér IL-7

receptor része, a sok más citokin receptort (IL-2R, IL-4R, IL-9R, IL-15R, IL-21R) is

alkotó gamma lánc mellett. A CD127 a timocitákon, T- és B- progenitor sejteken, érett

T sejteken, monocitákon, és egyéb limfoid és mieloid sejteken van jelen. Az IL-7R

fontos szerepet játszik az érett T sejtek proliferációjában és differenciációjában, és in

vitro megfigyelések alapján a CD127 expresszió csökken a T sejt aktivációt követően.

Feltételezések szerint a FoxP3 transzkripciós faktor a CD127 promoterére is hatással

van, és így csökkenti Treg-ekben a CD127 expressziót. [90]

3.2.1.3. Treg sejtek működése

A Treg-ek képesek számos immunsejt – így a CD4+, CD8+ limfociták, NK és

NKT sejtek, B sejtek és APC-k – aktivációját, proliferációját és effektor funkcióját, így

citokin termelését is szabályozni. [90] Gátló működésük döntően két mechanizmussal

valósulhat meg, egyrészt közvetlen sejt-sejt kontaktussal (CD39, CD73, és LAG-3-on

keresztül, vagy az APC-k és effektor T sejtek elpusztításával granzimek és perforinok

révén), másrészt szolubilis faktorokkal (immunszuppresszív citokinekkel, mint az IL-

10, TGF-ß, IL-35 és galectin-1, vagy a limfociták éréséhez szükséges IL-2 gátlása

révén). [91]

Bevezetés

20. oldal

5. ábra A Treg sejtek hatásmechanizmusai az effektor T sejteken. A Treg sejtek hatása közvetett

úton gátló citokinek (transzformáló növekedési faktor béta, TGF-β; interleukin 10, IL-10),

citolízis (granzimek), metabolikus gátlás (IL-2 abszorpció) és a DC-k (indolamin 2,3-

dioxigenáz, IDO) révén valósulhat meg. [92]

Nem ismert, hogy melyik mechanizmus a döntő, mert feltételezhetően az egyes

gátló hatások egymást erősítik, de a CTLA-4 függő szuppressziót tartják az egyik

legfontosabbnak. Először is a FoxP3-at expresszáló Treg sejtek konstitutívan és nagy

mennyiségben expresszálnak CTLA-4-et. [91] Másodszor, a CTLA-4 gátlásával szerv-

specifikus autoimmun betegségek, IBD, és cukorbetegség fellángolása érhető el

állatmodellben [93]. Harmadszor pedig a FoxP3 más transzkripciós faktorokkal együtt

fokozza a CTLA-4 expresszióját, ezáltal a CTLA-4 hiányos állatmodellekben a FoxP3

hiányhoz hasonló betegségek indukálhatóak. A Treg sejtek CTLA-4 dependens gátló

hatása döntően az APC-ken keresztül valósul meg. [94] In vitro a Treg sejtek az éretlen

DC-k körül összegyűlnek és a CTLA-4-nek a CD80 vagy CD86-hoz történő

Bevezetés

21. oldal

kapcsolódásuk révén a DC-k citokin termelését befolyásolják. In vivo pedig a Treg

sejtek két-foton mikroszkóppal leírt módon megakadályozzák az antigén-aktivált sejtek

és a DC-k közötti stabil kapcsolódás létrejöttét. Emellett ismert, hogy a FoxP3+ Treg

sejtek képesek bizonyos környezeti hatásokra differenciálódni, és további interleukinok

termelésével befolyásolni az immunválaszt (Th1, Th2, Th17 irányába). [95]

Arról, hogy pontosan hogyan különbözteti meg a Treg sejt a kórokozóra

specifikus és a saját szervezetre reaktív limfocitákat, nincsenek pontos ismereteink. [80]

A keresztregulációs modell szerint a Treg sejt szuppresszió antigén specifikus. A Treg

sejtek ezen felfogás szerint autoreaktívak, és a hasonló antigenitású T sejteket az APC-k

révén gátolják. A TCR szignál-erősség modell azt feltételezi, hogy a periférián lévő

autoreaktív T sejtek kis affinitású TCR-el rendelkeznek, mert a nagy affinitásúak

szelektálódtak a csecsemőmirigyben. A Treg-ek ezeket a kis affinitású TCR-eket

ismerik fel és ártalmatlanítják. A TLR-mediálta Treg blokád modellben a DC-k

aktivációja gátolja a Treg sejtek szuppresszor hatását, így képes aztán a patogén

specifikus adaptív immunválasz kialakulni. Az effektor regulációs modellben ezzel

szemben a DC-k átmenetileg információs hidat képeznek az orálisan immunizált Treg

és a naív CD4 sejtek között. Az immunizált T limfociták ezek alapján interleukinek

révén megtanítják a DC-knek, hogy milyen mintázatot adjanak tovább a naív sejteknek,

amelyek így hasonlítanak az immunizált Treg sejtekhez. Az asszociatív antigén

felismeréses modellben ezekkel ellentétben a Treg sejtek nem különböztetik meg a saját

vagy idegen antigenitású limfocitákat. Ezen elképzelés szerint a Treg sejtek csak az

adott immunválasz erősségét befolyásolják a Th sejtek révén, de egyformán reagálnak

mind az idegen, mind a saját immunhatásra.

3.2.1.4. Treg terápia

A Treg sejtek deficienciájából eredő kórképek jól ismertek, de az nem pontosan

ismert, hogy a sejteknek mi a pontos szerepe az immunmediálta betegségek

kialakulásában. [96] Állatmodellben a CD4+ sejtek interferon-gamma (IFN-γ) és DC-k

jelenlétében FoxP3+ sejtekké alakulnak, amik bőr és szigetsejt transzplantátumok

rejekcióját képesek megakadályozni. [97] Ugyanakkor a transzplantáció során

Bevezetés

22. oldal

alkalmazott immunszuppresszív szerek némelyikéről, így kalcineurin inhibitorokról

(főleg a ciklosporin A-ról) ismert, hogy gátolják a Treg működését, míg a rapamicin a

Treg-ek in vivo képződését és aktivitását fokozza állatmodellben. Rapamicinnel együtt

adva a Treg-ek lehetővé tették állatmodellekben a szívtranszplantátum hosszútávú

megmaradását, különösen nagy effektivitással az olyan esetekben, ahol mind a donor,

mind a recipiens APC-kre specifikusak Treg-eket alkalmaztak. [98]

A humán Treg sejtek azonosításával kapcsolatos nehézségek miatt nincs egységes

konszenzus abban a tekintetben, hogy melyik Treg populáció lenne optimális

sejtterápiás alkalmazásra. [97] Több országban lezajlott klinikai kutatás során

hemopoetikus őssejt transzplantációnál a graft versus host betegség kivédésére

eredményesen és mellékhatásoktól mentesen alkalmazták a Treg sejteket. [99] Ezentúl a

már kialakult rejekció gátlására és a tünetek enyhítésére is hatékonynak bizonyultak a

Treg sejtek. Az alkalmazott Treg sejtek anti-CD3/anti-CD28 aktivált CD25+CD127low

sejtek voltak, és nagyjából 1x105 Treg sejt/kg dózisban voltak klinikailag is hatásosak.

Mindezek az adatok, együtt a jelenleg is folyó kísérletekkel együtt alátámasztják a Treg

terápia klinikai hasznát, azonban technikai nehézségek még fennállnak. [100]

Mind gyakorlati, mind elméleti problémák megnehezítik a Treg terápia

bevezetését. Gyakorlati nehézséget jelent a Treg terápia bevezetésével kapcsolatosan

számos jelenség. [81] Először is a FoxP3+ populáció heterogenitása miatt a tovább

tenyésztendő sejtek pontos azonosítása szükséges. A CD25 és CD127 sejtfelszíni

markerek segítségével kiválogatott sejtek között kis számban lehetnek

CD45RO+FoxP3low nem regulátoros tulajdonságú sejtek is, amik proinflammatórikus

citokineket termelhetnek és tovább szaporítva ezeket súlyosbíthatják az adott kórkép

lefolyását. Bizonyos tanulmányok szerint a CD45RA+FoxP3low sejtekre kell esnie a

választásnak, mert ezek képesek az expanzió után leginkább megtartani FoxP3

expresszáló képességüket. Másodszor kimutatták, hogy a Treg sejtek hajlamosak az

apoptózisra és nehezen szaporodnak magas dózisú IL-2 jelenlétében is. Ugyanakkor a

naív T sejtek könnyen FoxP3+ Treg-ekké képesek alakulni, ez is az előbb említett

CD45RA+ sejtcsoport használatát támasztja alá. IL-2 hatására ugyanakkor a Treg-ek

gyulladásos citokinek termelésére lesznek képesek, ezért meg kell alkotni a

tenyészéshez tökéletes citokin miliőt is. A rapamicin (sirolimus) nagymértékben képes

Bevezetés

23. oldal

fokozni a Treg tisztaságot azáltal, hogy elpusztítja a nem Treg sejteket. Harmadszor

pedig, ha in vitro még sikerül is kitenyészteni a megfelelő minőségű és mennyiségű

Treg sejtet tartalmazó populációt, in vivo használhatósága akkor is kérdéses, különösen

proinflammatórikus környezetben. Állatmodellben leírták a Treg sejtek plaszticitását

Th1, Th2, Th17 irányban, patológiás körülmények között. Ugyanakkor állatmodellekből

az is ismert, hogy a Treg sejtek hónapokig képesek a túlélésre, de emberben még nem

ismert pontos élettartamuk. Nem ismert továbbá a FoxP3 expresszió stabilitása sem, de

a FoxP3 gén stabilitását hiszton deacetiláz gátlókkal, így például vorinostattal lehetne

befolyásolni. T sejtes limfómában már használják ezt a szert, de nem ismert még, hogy

Treg specifikus lenne-e a hatása.

Elméleti ellentmondások is megnehezítik a Treg terápiák bevezetését. Egyrészről

a Treg sejtek a már említett módon képesek Th irányban differenciálódni, és így például

Th17 típusú citokineket termelni. Ezek a sejtek pont az ellenkező hatást válthatják ki,

mint amire eredetileg a Treg sejteket bejuttatták, így fontos a minél tisztább és

homogénebb Treg populáció terápiás alkalmazása. [97] További megoldás lehet a már

említett rapamicin, vagy a retinolsav, amiről kimutatták, hogy gátolja az IL-17

polarizációt és fokozza a FoxP3 expressziót. Másrészről komoly gondot jelenthet az,

hogy egy autoimmun folyamat terápiájaként bejuttatott nagy mennyiségű szuppresszor

hatású immunsejt gátolhatja egy esetleges infekcióval szemben kialakítandó

immunválasz hatékonyságát éppúgy, mint a daganatmegelőző reakciókat. Irodalmi

adatok alapján ugyanis a Treg sejtek nagy száma hozzájárulhat fatális herpesz szimplex

vírusfertőzésekhez, és vesetranszplantáltakban új daganat kialakulásához. Éppen ezért

egy jövőbeni alkalmazás során fokozott megfigyelés lenne szükséges minden Treg

terápián átesett beteg esetében.

Bevezetés

24. oldal

3. táblázat A regulátoros T sejt (Treg) működés befolyásolásának klinikai lehetőségei.

Rövidítések: citotoxikus T limfocita antigén-4: CTLA-4; interleukin: IL. *Korlátozott

felhasználás bizonyos graft-versus-host reakciók esetében. [81]

Felhasználási terület

Használatban lévő módszerek

Lehetséges módszerek

Mellékhatások és hátrányok

Fertőzések Treg gátló molekulák

(CTLA-4 antitest, Ipilimumab)

Treg működés és differenciáció gátlás

Alacsony hatékonyság

Daganatok Treg gátló molekulák

(DAB389-IL-2, Denileukindifitox)

Treg gátló további molekulák

Autoimmunitás fokozódása

Autoimmunitás Treg expanziós

sejtterápia

Allergia

Treg szuppressziót utánzó molekulák (CTLA-4 Ig,

Abatacept) Treg szuppressziót utánzó molekulák

Daganat megelőző és egyéb immun-mechanizmusok

gátlása

Terhesség

Transzplantáció

Treg túlélést és fejlődést segítő molekulák

(rapamicin, Sirolimus)

Treg hatékonyságot és élettartamot fokozó

molekulák

Terhességben való használhatósága

kétséges

3.2.2. Treg szabályozó sejtek

A Treg sejtek hálózatban működnek az adaptív és veleszületett immunitás sejtes

elemeivel együtt. A veleszületett immunitás sejtes elemei közé tartoznak az antigén

prezentáló sejtek (APC). [101] Előbbiek közé tartoznak a dendritikus sejtek (DC,

mieloid és plazmocitoid) és a monociták (makrofágok). Ide soroljuk még a hízósejteket

és a granulocitákat is, valamint a komplement rendszer fehérjéit is. A szerzett (adaptív)

immunitás elemei a T (CD4, T helper és CD8, citotoxikus T) valamint a B sejtek, és az

utóbbi által termelt antitestek. Egyes szerzők ide sorolják még a természetes ölő (NK)

sejteket is. A két immunrendszer határán állnak a természetes ölő T sejtek (NKT),

valamint az olyan speciális csoportba tartozó T sejtek, mint a γδ T sejtek. A Treg sejtek

ezen sejtekre való hatása csak részben ismert, mi a munkánk során az eddigi irodalom

alapján a limfocita aktivációban felmerült célsejteket vizsgáltuk.

Bevezetés

25. oldal

6. ábra Treg sejtek, szabályozó és céljsejteinek kölcsönhatása a limfocita aktiváció

folyamatában. A nyilak aktivációt, a tompa végű vonalak gátlást fejeznek ki. Az egyes

sejttípusok nevei alatt azonosításukhoz használatos, illetve az általuk expresszált markerek

szerepelnek. A részleteket és a rövidítéseket ld. a szövegben.

3.2.2.1. A DC sejtek

A DC sejtek a legfőbb APC-k, vagyis az antigén feldolgozására és bemutatására

szolgáló sejtek az immunrendszerben. A szervezet olyan pontjain helyezkednek el, ahol

az antigénnel közvetlenül találkozhatnak (bőr, légzőrendszer, tápcsatorna). Bár éretlen

Bevezetés

26. oldal

formában is megtalálhatóak a vérben, aktiválódásuk során a nyirokcsomókba

vándorolnak, ahol a T és B sejtekkel kapcsolódva az adaptív immunválasz elindításában

játszanak szerepet. [102] Azonosításukban segít, hogy egy sor limfocita érési markert

nem (Lin1: CD3, CD14, CD16, CD19, CD20 és CD56), míg egy aktivációs markert, a

HLA-DR-t erősen expresszálják. Hagyományosan két csoportra osztjuk őket, az egyik a

mieloid DC (mDC, DC1), a másik a plazmocitoid DC (pDC, DC2). A mDC-k a

monocitákhoz hasonlatosak, IL-12 termelésre képesek, és két alcsoportjuk a gyakoribb

és legfőbb stimulátorként működő mDC-1, és a nagyon ritka, feltehetőleg

sebfertőzésekben szerepet játszó mDC-2. A pDC-k plazmasejthez hasonlatosak

kinézetre, régebben az interferon-alfa (IFNα) termelő képességük alapján interferon

produkáló sejtnek nevezték őket. [103]

Az mDC sejtekre jellemző, hogy az elkülönítésüket lehetővé tévő CD11c

(integrin) mellett TLR-2 és TLR-4-et is expresszálnak. [104] A TLR-ek a

sejtmembránon átérő molekulák, nem katalítikus receptor résszel és az IL-1R-al egyező

citoplazmatikus doménnel. Ezek a proteinek a veleszületett immunitás fő mediátorai,

amik a lipopoliszacharidokat (LPS), lipoproteineket, lipopeptideket, bakteriális

proteineket, virális ribonukleinsavat (RNS), és bakteriális vagy virális

dezoxiribonukleinsavat (DNS) képesek megkötni. Ezen kívül endogén ligandjaik

lehetnek a fibrinogén, a hősokk protein és a saját DNS is. Az antigén bekötődésével a

TLR aktiválódik és adapter molekulákat (MyD88, Tirap (Mal), Trif, és Tram) vonz a

citoplazmához, amelyek aztán protein kinázokon (IRAK1, IRAK4, TBK1, és IKKi)

keresztül a jel amplifikálódásához vezetnek, és végül akár több ezer gén aktiválódását

vagy gátlását eredményezik. A folyamat eredménye lehet a mikrobiális antigén

prezentációja más T sejteknek, vagy citokinek termelése is. Az aktivált Treg sejtek

képesek ezt a TLR függő mDC aktivációt gátolni, egyrészt a kostimulátoros molekulák

fokozott expressziójának, másrészt pedig a gyulladásos citokinek gátlása révén. [105]

Ugyanakkor kimutatták, hogy nagymennyiségű bakteriális LPS vagy DNS hatására

(sorrendben TLR-4 vagy TLR-9 révén) Treg jelenlétében is bekövetkezik a T sejt

proliferáció. [106]

A TLR-ek azonban nem csak az APC-ken, hanem mind a hagyományos, mind a

regulátoros T sejteken is megtalálhatóak. A TLR-2 ligáció a szuppresszor hatást

Bevezetés

27. oldal

csökkenti, részben az IL-2 termelés révén magán a Treg sejteken is. Ez a hatás

ugyanakkor csak átmeneti, mert a TLR-2 hatás elmúltával a Treg sejtek visszanyerik

szuppresszor hatásukat. Érdekes ugyanakkor, hogy a Treg működésre való hatás

(aktiválás vagy gátlás) mind magától a TLR típusától, mind pedig az antigén jellegétől

is függhet. [106] A legfrissebb adatok alapján a legtöbb hagyományos immunsejten is

expresszálódó TLR-eknek legalább egy része biztosan funkcionálisan aktív, mert ezen

sejtek stimulálása TLR agonistákkal APC hiányában is az effektor, ill. regulátoros

működésüket fokozza. [107] Ez a terület további kutatásokat igényel, de ilyen alapon

felvetődhet a TLR-ekre ható esetleges terápiás alkalmazások kifejlesztésének a

lehetősége is.

A pDC-k az mDC-kkel szemben CD11c-t vagy a monocitákkal szemben CD14-et nem

expresszálnak, de CD123-at (IL-3R) igen. Fontos szerepet játszanak az immunológiai

tolerancia létrejöttében. Az orális tolerancia kialakításában is a pDC-k a

kulcsfontosságúak. Ezek hiányában a bejuttatott antigénekkel szemben nem alakul ki a

T sejt mediálta tolerancia. [108] A külsőleg bejuttatott gasztrointesztinális eredetű orális

antigénnel találkozott pDC-k képesnek bizonyultak állatmodellben az antigén indukálta

CD4 és CD8 sejtes válasz szuppressziójára. [109] Ugyanígy, inhalatív antigének

hatására, ha pDC sejtek gátlásra kerülnek, akkor az asztmára jellemző tünetegyüttes

alakul ki, Th2 túlsúlyú immunválasszal. A pDC-k transzplantációs terápiában való

esetleges haszna az újabb kutatások alapján merült fel. Májtranszplantáció után

megfigyelték, hogy az immunszuppreszió hatékonysága összefügg a perifériás pDC

sejtszámmal, és a nagyobb pDC arány az mDC-kkel szemben jobb tolerálhatóságot

jelent a grafttal szemben. A donor antigénnel találkozott pDC sejtek a nyirokcsomókba

migrálnak, ahol alloantigén specifikus Treg választ indukálnak, és ezzel

immuntoleranciát fejlesztenek ki. Megfigyelték tovább, hogy a pDC sejtek expressziója

szoros összefüggést mutatott a FoxP3+ Treg sejtek számával olyan páciensekben,

akikben transzplantáció után kialakult az immuntolerancia. [109] Az autoimmun

folyamatokban szintén leírták a pDC sejtek jelentős szerepét. [102] Alacsony aktivitású

RA-ban leírták például, hogy a pDC-k a naív T sejtek IL-10 szekretáló Treg sejtekké

való differenciálódását segítik, és a pDC-k hiánya fokozza az autoimmun izületi

gyulladást. [110] A pDC-kre jellemző TLR-7 és TLR-9 közül a TLR-9-ről ismert, hogy

normál körülmények között szubcelluláris lokalizációban helyezkedik el, és más

Bevezetés

28. oldal

körülményekkel együtt ez hozzájárul ahhoz, hogy a szervezet a saját DNS-t ne ismerje

fel. [109] Bizonyos faktorok, így többek között antimikrobiális peptidek hatására

azonban a pDC-k felismerik a sajátot is, így a szervezet saját DNS szakaszát képesek

megkötni a pDC-k, és ezáltal az mDC-k aktiválódását okozhatják.

7. ábra A tolerogén dendritikus sejtek (DC) és regulátoros T sejtek (Treg) közötti kapcsolat

sematikus ábrázolása. A Treg sejtek a DC-k szabályozása révén az immunválaszt elősegítő

miliőt képesek kialakítani, de a DC-k szintén képesek a Treg érést befolyásolni. Rövidítések:

TGF-β: transzformáló növekedési faktor-béta; IL: interleukin; IDO: indolamin 2,3-dioxigenáz.

[110]

Bevezetés

29. oldal

A legújabb adatok alapján a Treg-ek befolyásolják a DC-k működését, de a DC-k

szintén fontosak a Treg-ek szabályozásában, tehát a kapcsolatuk kétirányú. [92] Egyik

irányban a Treg-ek és DC-k együtt tenyésztése során a DC-k CD80 és CD86 T sejt

kostimulátoros ligandok expressziója csökken, míg az immunszuppresszív hatású B7-

H3 és B7-H4 expressziója fokozódik, ezzel a Treg-ek a DC-k érését gátolhatják. [103]

Treg-ek nélkül a DC-k IL-6 proinflammatórikus citokint termelnek, míg Treg-ek

jelenlétében az immunszuppresszív hatású IL-10 termelés a jelentős. [94] Ugyanakkor

gyulladásos hatásra (így pl. LPS jelenlétében) ismét a proinflammatórikus citokin

termelés lesz a döntő. [103] Másik irányban viszont, a Treg-hez hasonlatos funkciójú

DC fajta, a pDC, képes a Treg sejtek serkentésére és így a perifériás tolerancia

fenntartására. Mind állatmodellben, mind humán ex vivo kísérletekben ezek a pDC-k

alkalmasnak bizonyultak a CD4+CD25+FoxP3+ sejtek indukálására, és így T sejt

populációk proliferációjának gátlására. [100] Ismert továbbá, hogy bakteriális triggerre

naív T sejtekből képesek szuppresszor tulajdonságú Treg sejtek képzését elősegíteni,

míg vírusok vagy CD40L hatására Th1 immunválaszt generálni. Ugyanakkor korábban

leírták, hogy IL-10 termelésre is képesek a pDC-k, ezért úgy tűnik, hogy a kiváltó

hatástól függően befolyásolják az immunválaszt. [103] Összességében tehát a Treg-ek

képesek a számukra kedvező immunszuppresszív miliőt kialakítani a velük találkozó

DC-k sejtfelszíni mintázat és citokin termelésének befolyásolásával, de a DC-k is

befolyásolni képesek visszacsatolás révén az immunszuppresszió mértékét.

3.2.2.2. Monociták

A monociták a perifériás vérben rövid ideig vannak jelen, a szövetekben

makrofágokká vagy DC-vé alakulhatnak. Fő feladatuk az antigén prezentálás (APC),

citokin termelés és fagocitózis. A monociták felszínén korlátozott a kostimulátoros

molekulák expressziója, ezért az effektor és memória T sejteket citokinek révén

stimulálják. [103]

A monociták két főbb csoportját különböztetjük meg. A klasszikus monociták az

összes keringő monocita 90-95%-át teszik ki, és CD14 expressziójuk alapján

különböztetjük meg őket. A szöveti makrofágokhoz hasonló többi monocitán viszont

Bevezetés

30. oldal

alacsonyabb a CD14 expresszió, de leírtak egy átmeneti csoportot is, ahol a CD14

expresszió közepes mértékű. A humán monociták több TLR-t is expresszálnak, de

legnagyobb mértékben TLR-2 és TLR-4-et. [111] A TLR-2 peptidoglikán, míg a TLR-4

LPS ligandja hatására indukálja a monocitákat és serkenti a gyulladásos citokinjeinek

termelését.

A monociták aktiválódása két útvonalon mehet végbe, ezek közül a régebb óta

ismert klasszikus folyamat mellett újabban leírták a gátló jellegű alternatív útvonalat is.

Az aktiválódás klasszikus útján a monociták proinflammatórikus szerepűek, és IFN-γ és

TNFα jelenlétében az antigén specifikus T sejt választ az antigén prezentálással és IL-

12 termelésével segítik elő. Az alternatív útvonalon azonban IL-4 és immunglobulin G

(IgG) immun komplexek jelenlétében nem képesek antigén prezentálásra, és IL-10-et

szekretálnak, ezáltal szuppresszív hatásúak. Ezek a sejtek képesek a Treg-ek

indukálására, és így a T sejt proliferáció gátlására is. Bakteriális fertőzés esetén az LPS

a szervezetben nagy mennyiségben jelenik meg, és a CD14 monocitákhoz kapcsolódva

kiváltja a T sejt választ. Szeptikus sokk esetén azonban a monociták váratlanul

abbahagyják az antigén bemutatását, és apoptózison mennek át. A legújabb adatok

alapján, ez a folyamat a Treg sejtek közvetítésével valósul meg. [112] Megemlítendő,

hogy néhány adat arra utal, hogy a DC-khez hasonlóan a monociták is képesek viszont

befolyásolni a Treg működést. [92]

3.2.3. Treg célsejtek

Habár az előzőekben több alkalommal is történt utalás arra, hogy a Treg sejtek és

sejtes környezetük között soha nem egyirányú a kapcsolat, most a hagyomány kedvéért

itt kerül tárgyalásra a klasszikusan a Treg sejtek által szabályozottnak mondott

immunsejtek csoportja (NK és NKT sejtek, CD4 és CD8 limfociták).

3.2.3.1. NK és NKT sejtek

Az NK és NKT sejtek az adaptív és veleszületett immunitás határán helyezkednek

el, szabályozott kapcsolatot teremtve a két rendszer között. Kezdetben az NK sejtek

onnan kapták a nevüket, hogy képesek voltak aktiválás nélkül is elpusztítani a sajátot

Bevezetés

31. oldal

jelentő MHC-I mintázattal nem rendelkező sejteket. Mindkét sejttípus azonosításában

segít az NK asszociálta marker (CD161) expresszió, de ezentúl az NKT sejtekre

jellemző, hogy TCR-t (CD3) is expresszálnak. Az NKT sejtek gyűjtőfogalmát azokra a

sejtekre szokták alkalmazni, amelyek egyrészt a CD161-et, másrészt egy meghatározott

TCR-t expresszálnak, amikkel az MHC-szerű CD1d által bemutatott glikolipideket

ismerik fel. A Cd1d függő NKT-k egy része félig-invariáns TCR-t (invariáns α láncot)

hordoz, ami a törzsfejlődés során érintetlen maradt, ezért ezeket szokták iNKT

sejteknek is nevezni. [113]

Az NK sejteket a veleszületett rendszer effektor sejtjeinek tartják, a vírusok,

paraziták, baktériumok és megváltozott sejtek elleni védekezésben vesznek részt. [114]

Egyrészről citokinek (IFNγ, TNFα, kolónia stimuláló faktorok és kemokinek)

termelésével, másrészről célsejtek elleni citotoxicitássukkal (perforinok, granzimek és

extrinsic apoptózis) hatnak. Az idegen vagy káros sejtek felismerését számos receptora

segíti, többek között a TLR-ek is. Az NK sejtek hiánya gyermekkorban ismerten az

Epstein-Barr vírusfertőzések és limfoproliferatív kórképekkel állhat összefüggésben.

Felnőttekben feltehetőleg szolíd tumorok jelenlétével függ össze ezen sejtek

deficienciája, így a legismertebb Chediak-Higashi szindrómában. Ebben a kórképben

hibás az NK sejtek citotoxicitása, így a malignus folyamatok kialakulásának

kétszázszorosára nő az esélye.

Az Treg sejtek képesek az NK sejteket mind in vivo, mind in vitro gátolni. [114]

Számos kutatás rávilágított, hogy ez a hatás döntően a TGF-ß segítségével valósul meg,

ugyanakkor az aktivált NK sejtek ellenállhatnak ennek a szuppresszor hatásnak. [115] A

DC-k szintén képesek az NK sejtek működését szabályozni. A DC-k az NK aktiválódás

kezdeti szakaszában hatva, annak a citolítikus hatását befolyásolják. [116] Ugyanakkor

az NK sejtek a DC-k érésében döntőek, valamint az érett DC-k citokin termelésének a

szabályozásában. Az NK sejtek számos úton befolyásolhatják a DC-k működését.

Elsősorban azáltal, hogy az NK sejtek sejtlízist okoznak, a folyamat során keletkező

antigéneket a DC-k ismerik fel, és így aktiválódnak. Másodsorban a nem hatásos,

éretlen DC-k szintén elpusztításra kerülnek az NK-k által, ezzel fokozva az

immunválasz hatékonyságát. Harmadsorban az NK-k által termelt Th1 citokinek

fokozzák magát az APC működést. Negyedrészt az NK sejtek fokozzák a DC-k érését az

Bevezetés

32. oldal

IL-12 citokin termelése révén. Végül ötödrészt, az NK sejtek által termelt granulocita-

makrofág kolónia stimuláló faktor a DC-k túlélését és a monocita prekurzorok DC-vé

érését serkentik. Újabban azonban kimutatták, hogy az NK sejtek hasonló

mechanizmusokkal nemcsak serkenteni, hanem gátolni is képesek a DC-k, és ezáltal az

immunválasz működését. Ha az NK/DC arány az NK sejtek felé tolódik el, akkor a

citolítikus hatás révén a DC-k működése is alapvetően gátolt lesz az NK sejtek által.

[116] Továbbá az NK sejtek direkt gátló hatását is leírták már az effektor T sejtekre,

ami részben az NKT sejtek hatására vezethető vissza.

A természetes ölő sejtek másik csoportjába tartozó NKT sejtek nem MHC-hoz

kapcsoltan ismerik fel az antigéneket, hanem a CD1d segítségével a többnyire invariáns

TCR-hez kötődve. A felismert glikolipidek mind endogén, mind exogén származásúak

lehetnek. [117] Két fajtájukat különböztetjük meg, az NKT I-ek expresszálják az

invariáns TCR-t, míg az elenyésző számú NKT II-k a nem invariáns TCR-t. Aktiváció

után az NKT-k képesek mind Th1 (IFN-γ), mind Th2 citokinek (IL-4) termelésére az

aktiváló ligand, az APC-val való kapcsolat és a citokin miliőnek megfelelően. Az NKT

sejteket, a Treg sejtek veleszületett immunitás részéről megjelenő segítőinek is tartják.

Az NKT-k által termelt IL-2 döntő jelentőségű a Treg-ek proliferációjában, viszont az

NKT-k nem képesek a Treg-ek szuppresszor funkcióját befolyásolni, csak a

proliferációját. Ugyanis, ha DC által aktivált Treg-eket NKT sejtek jelenlétében vagy

nélkülük tartották, a szuppresszió mértéke azonosnak bizonyult.

Az NKT sejtek sajátossága, hogy gyors citokin válaszra képesek, egyben azt is

jelenti, hogy ezzel az effektor immunválasz irányát képesek befolyásolni pro- vagy

antiinflammatórikus irányba. [117] Különlegességük még az, hogy igen ellenállóak az

apoptózissal szemben, köszönhetően a nagy mennyiségben expresszálódó

antiapoptotikus fehérjéknek (Bcl-2). Az NKT sejtek jelentőségét számos autoimmun és

daganatos folyamatban leírták már, legújabban az asztma patogenezisében

tulajdonítanak nagy szerepet ennek a sejtcsoportnak. Állatmodellben az NKT sejtek

képesnek bizonyultak csontvelő transzplantáció után a graft versus host betegség

kivédésére, míg hiányukban halálos kimenetelű lett a betegség. Az NKT sejtek tehát a

Treg-ekhez hasonlatos szabályozó szereppel bírnak. [118] Ugyanakkor döntő

különbségek is vannak a két sejtcsoport között. Egyrészt a Treg-ek MHC II

Bevezetés

33. oldal

bemutatásában ismerik fel az antigént, míg az NKT-k az MHC I-szerű CD1d-vel. A

Treg-eknek változatos TCR készletük van, míg az NKT-knak konzervatívabb. A Treg-

ek számtalan típusú antigént képesek felismerni, míg az NKT-k csak glikolipid

sajátosságúakat.

8. ábra A természetes ölő T sejtek (NKT) és regulátoros T sejtek (Treg) kapcsolata. A Treg-ek

képesek az NKT sejtek gátlására kontakt-dependens úton, míg az NKT-k a Treg működést

képesek serkenteni citokinek révén. A Treg-ek a T helper (Th) 1 és Th2 választ, míg az NKT-k

klasszikusan a CD8 valamint a Th1 és Th2 választ is befolyásolhatják. Az NKT-k közvetlenül a

dendritikus sejtek (DC) indukálásával is aktiválhatják a Treg működést. A serkentést nyíl, míg a

gátlást tompa végű vonal jelzi az ábrán. [118]

Bevezetés

34. oldal

3.2.3.2. CD4 és CD8 limfociták

Az effektor T sejtek két csoportját a helper T (Th) és citotoxikus T (Tc)

limfocitákat CD4 és CD8 expressziójuk alapján különböztetjük meg. [119,120] A CD4

glikoprotein az immunglobulin szupercsalád része, a TCR egyik koreceptora, ami az

APC-kkel való kapcsolódást segíti elő. A CD4 az intracelluláris részével a TCR által

generált szignált erősíti fel egy tirozin kináz révén, de közvetlenül is kapcsolatba lép

extracelluláris része segítségével az MHC II-vel. A CD8, ami szintén transzmembrán

glikoprotein és a TCR koreceptora, ezzel szemben az MHC I-hez kötődik. [119]

A Th sejtek prekurzor sejtjei a naív T sejtek (Th0), amik stimulus hatására

képesek pro- (Th1) vagy antiinflammatórikus (Th2) irányba differenciálódni. Naív T

sejtnek akkor nevezzük a limfocitát, ha még nem találkozott antigénnel, memória T

sejtnek a már stimulussal találkozott sejtet nevezzük. A két sejtcsoport elkülönítésére

lehetőséget ad a régebbi nevén közös fehérvérsejt antigénnek (CD45) nevezett marker

expressziója. [121] A naív sejtek ennek a protein tirozin foszfatáz kostimulátornak a

nagyobb CD45RA formáját expresszálják, míg az aktivált effektor vagy memória sejtek

a kisebb CD45R0 formát, amiből hiányzik az RA, RB, és RC exon. Ez a rövidebb forma

segíti elő az aktiválódást, a citoplazmatikus doménje egy tirozin kináz (Lck)

defoszforilálásával annak aktiválódását okozza. [119]

A Th1 és Th2 egyébként morfológiailag egyező sejtek csupán az általuk termelt

citokinekben különböznek. [122] A Th1 sejtek többek között IL-2-t termelnek, ami a T

sejtek proliferációját, és autokrin módon saját túlélésüket is segíti. Az IL-2 ezentúl a Tc

sejtek citotoxikus működését is stimulálja azáltal, hogy az aktivációs küszöbüket

csökkenti. A Th1 sejtek által termelt IFN-γ a makrofágokat aktiválja, az IFN-γ receptor

hiánya súlyos fertőzésekhez vezet. Az említett citokinek pozitív visszacsatolással

serkentik a Th0 sejtek differenciálódását, ezáltal a saját válasz erősítését. Az IFN-γ által

stimulált makrofágok termelte IL-12 ugyanis fokozza a T sejtek IFN-γ termelését. A

Th1 válasz tehát elsősorban a patogének elleni sejtes védekezésben fontos, de szerepe

van az autoimmun betegségek kialakulásában is. A Th2 sejtek ezzel szemben IL-4, IL-5,

IL-10, IL-13-at termelnek, ami az antitestes védekezést serkenti. Az IL-4 a B sejtek IgE

termelését fokozza, míg az IL-5 az eozinofil granulociták növekedését serkenti. Az IL-4

Bevezetés

35. oldal

ezek mellett pozitív visszacsatolással az immunválaszt a Th2 irányba tolja, elsősorban

az allergiás kórképek kialakulásának kedvezve. [123]

A Tc sejtek az NK sejtekhez hasonlóan az idegen antigénnel rendelkező sejtekhez

kötődnek és perforinokat juttatnak a sejtmembránjukba. [124] A Tc sejtek granzimeket

tartalmazó citoplazmatikus granulumai átjutnak a megtámadott sejtbe, ahol kaszpázokat

aktiválnak, amik a DNS fragmentálódását és apoptózist indukálnak. A Tc sejtek a

célsejt Fas halál ligandjaihoz is kapcsolódnak, ezen az úton is elősegítve az apoptózist.

A Th sejtekhez hasonlóan a Tc sejtek is differenciálódhatnak Tc1 és Tc2 altípusra, de

ezeknek a citokin termelő képessége korlátozott, és pontos szerepük sem ismert még.

[123] Ezentúl a CD8+ sejtek egy részének lehet szuppresszor hatása is, ezek szerepe

daganatos kórképekben vetődött fel, de pontos ismereteink még nincsenek

működésükről.

Az immunológiai tolerancia, vagyis az immunrendszer sajáttal szembeni

védelmének a kialakulásában két mechanizmus vesz részt. [125] Centrális

toleranciának nevezzük azt a folyamatot, amelyben az autoreaktív T sejtek a

csecsemőmirigyben negatív szelekción mennek át. Ismert azonban, hogy ezen a

folyamaton átjuthatnak olyan limfociták, amelyek MHC expressziója a feltételezések

szerint nem elég erős a kiválogatáshoz. Ugyanakkor valószínű az is, hogy nem minden

saját antigén kerül bemutatásra. A perifériás toleranciának köszönhetően mindezek

ellenére az autoreaktív T sejtek normálisan nem váltanak ki autoimmun reakciót a

szervezetben. A saját antigént prezentáló DC-k ugyanis nem aktiválódnak,

köszönhetően a kis számban expresszálódó kostimulátoroknak. Emiatt és az IL-10

termelő képességük hatására anergizálódnak és nem kerülnek aktivációra. A saját

antigének kostimulátorok nélküli prezentációja apoptózis révén okozza a limfociták

klonális delécióját. Az autoreaktív T sejtek a periférián a Treg sejtek által kerülnek

gátlásra a fentiekben már részben említett módon. Ezek a sejtek IL-10 és TGF-β

termelésük révén gátolják az autoreaktív sejtek proliferációját. [126]

Bevezetés

36. oldal

9. ábra A regulátoros T sejtek (Treg) különböző immunszuppresszív mechanizmusai. A Treg

sejtek mind a CD4+, mind pedig a CD8+ sejtek működését képesek gátolni kontakt dependens és

citokin útvonalon is. A dendritikus sejtek érését gátolják, de az érett dendritikus sejteket el is

pusztíthatják. Egyéb, nem limfoid sejtekre gyakorolt hatásuk elsősorban citokinek révén valósul

meg. [95]

A Treg sejtek és az effektor T sejtek kapcsolata akkor került az érdeklődés

középpontjába, amikor kimutatták, hogy a CD4+CD25+ sejtek depléciójával autoimmun

betegségek sorát képesek kialakítani, míg visszaadásuk megakadályozza azokat. [127]

A Treg kutatások során a célsejteket kétféle módon próbálták meg azonosítani. Egyrészt

APC-k hozzáadásával, mind az APC-k és az effektor sejtek, míg APC hiányában csak

Bevezetés

37. oldal

az effektor sejtekre való hatásuk vizsgálható. Habár a kölcsönös hatás miatt kissé

önkényes ez a felosztása a Treg célsejteknek, de az APC sejtekkel való kapcsolatot az

előzőekben már tárgyaltuk, ezért most csak a közvetlen effektor hatást foglaljuk össze.

A legtöbb kutatás rávilágított arra, hogy a Treg-ek hatásukat részben az IL-2 mRNS (és

más citokinek mRNS-ének) transzkripcionális gátlásával érik el. [128] Külső IL-2

adagolásnak nem volt hatása a szuppresszióra. A legelterjedtebb elképzelés szerint a

Treg-ek gátolják az IL-2 termelést még pontosan nem ismert módon. Egy másik

feltételezés szerint a Treg sejtek a magas affinitású receptoraikkal (CD122, CD132)

kompetitíven gátolják az IL-2 hatását az effektor sejteken, de erre nincs közvetlen

bizonyíték. A Treg sejtek más citokinek révén is kifejthetik hatásukat, az IL-10 és TGF-

β mellett újabban az IL-35 szerepét vetik fel. Más szekretált molekula révén is hatnak,

így a galektin-1 által, ami apoptózist és a gyulladásos citokinek termelésének gátlását

okozza, nem egyértelmű azonban, hogy szolúbilis citokinként vagy direkt sejt-

kölcsönhatás révén. Továbbá a Treg sejtek granzim A által perforin dependens úton az

aktivált CD4 és CD8 sejteket, míg granzim B révén perforin independens úton szintén

az effektor sejteket pusztítják.

Célkitűzések

38. oldal

4. Célkitűzések

Célkitűzésünk volt, hogy olyan kis mintaigényű FACS-módszert dolgozzunk ki a

Treg sejtek és sejtes környezetük vizsgálatára, amivel jellemezni lehet a csecsemő- és

gyermekkori gasztrointesztinális megbetegedéseket érintő immunfenotípust. Szempont

volt az is, hogy a kidolgozott módszert más immunmediálta kórképek vizsgálatára is fel

lehessen a későbbiekben használni (ld. disszertációhoz csatolt közlemények).

4.1. Crohn betegség

Célunk volt prospektív vizsgálatban meghatározni, hogy milyen immunfenotípus

eltérések vannak jelen frissen diagnosztizált, még nem kezelt Crohn beteg

gyermekekben, mind a veleszületett, mind a szerzett immunitás elemeiben. Crohn

betegségben szenvedő gyermekekben jellemeztük az adaptív és veleszületett

immunitásának fenotípusát. A konvencionális terápiában (aminoszalicilát, azathioprin,

szteroid) és a biológiai terápiában (IFX) részesülő betegekben szintén meghatároztuk az

immunfenotípust eltéréseit. Célkitűzésünk volt továbbá, a hagyományos terápiára

reagáló és remisszióba került, illetve a csak IFX terápiára reagáló, relapszusban lévő

betegek perifériás immunfenotípusának összehasonlítsuk.

4.2. Cöliákia

Meghatároztuk cöliákiás gyermekek perifériás immunsejt prevalenciáját. Egyrészt

frissen diagnosztizált gyermekekben vizsgáltuk az immunfenotípust, másrészt a diéta

hatására a tünetek és panaszok megszűntével is jellemeztük az immunrendszer sejtes

elemeinek prevalenciáját.

4.3. Allergiás kolitisz

A vizsgálat során frissen diagnosztizált AC-s gyermekek perifériás

immunfenotípusát vizsgáltuk. Vizsgálatunk tárgyát képezte az allergének elhagyása

utáni tünetmentes állapotban talált fenotípusváltozás jellemzése is.

Betegek és módszerek

39. oldal

5. Betegek és módszerek

5.1. Egészséges és beteg csoportok

Mindegyik vizsgálat rendelkezett etikai engedéllyel, és írásos beteg – kiskorúak

esetén szülői – beleegyező nyilatkozattal. A vérvételek időzítése úgy történt, hogy a

szokásos rutin vérvételekkel egyidőben történjenek, és külön megterhelést ne

jelentsenek a betegeknek és az egészséges kontrolloknak.

5.1.1. Crohn betegek

2007 szeptembere és 2009 augusztusa között az I. Sz. Gyermekklinika Gyermek-

gasztroenterológiai Szakrendelésén megjelent betegeket vontuk be a vizsgálatokba. Első

csoportként tizennégy kezeletlen, terápiában még nem részesült beteget vettünk fel.

Ezek a betegek semmilyen gyógyszert nem szedtek a diagnózis időpontjában. A CD

diagnózisát a Porto kritériumok alapján [129], az aktivitás indexet pedig a PCDAI

szerint (Pediatric Crohn’s Disease Activity Index) [130] határoztuk meg. Második

csoportját képezte a vizsgálatnak az a tíz gyermek, aki a hagyományos terápiára

(szteroid, azathioprin, (AZT) és 5-aminoszalicilát (5-ASA)) reagált. Ezek a betegek,

akinek a PCDAI értékük kezelés után kevesebb, mint 10 volt, alkották a remisszióba

került betegek csoportját. Harmadik populációba az a tizenkét beteg tartozott, akik a

hagyományos terápiára nem reagáltak, ezért infliximab (IFX) kezelést kaptak (5mg/ttkg

a 0., 2., és 6. héten). Ők alkották a relapszusos betegek csoportját, mert a PCDAI

pontszámuk magasabb volt, mint 30. Negyedik csoportba soroltuk a kontrollok tizenöt

fős populációja, akik életkorban és nemben illeszkedtek a betegekhez, és funkcionális

hasfájás miatt kerültek kivizsgálásra, de organikus betegség, gyulladás, laboratóriumi

eltérés nem igazolódott náluk.


40. oldal

4. táblázat A vizsgálatba bevont betegek és egészséges kontrollok klinikai adatai. Rövidítések:

IFX: infliximab; PCDAI: Pediatric Crohn's Disease Activity Index; L1: vékonybél, L2:

vastagbél, L3: vékony- és vastagbél lokalizáció a montreáli kritériumok alapján. (Satsangi

2006). Statisztika: vs. kontroll: *p<0,05, **p<0,01; ***p<0,01; vs. kezeletlen: +p<0,05,

+++p<0,01; vs. első remisszió: #p<0,01, ###p<0,01; vs. relapszus: ×p<0,05, ××p<0,05, ×××

p<0,001.

medián [interkvartilis

tartomány] kontroll

kezeletlen (hagyományos terápia előtt)

első remisszió (hagyományos terápia után)

relapszus (IFX

kezelés előtt)

IFX terápia

(2. kezelés előtt)

IFX terápia

(3. kezelés előtt)

Klinikai adatok n (fiú/lány) 15 (6/9) 14 (6/8) 10 (4/6) 12 (5/7)

életkor (év) 12

[8-16] 10

[8,5-13] 11,5

[9,5-15,5] 14

[11-16]

14.5 [11.5-

16]

14.5 [12-16]

testtömeg-index (kg/m2)

19,5 [16,5-22,3]

13,9 [12,5-15,8]***

18,6 [14,4-19,2]+

17,4 [14,1-19,5]*

18.8 [14.6-21.3]

19.25 [16.1-22.1]

testsúly (percentilis)

58 [35-79]

13 [4-23]***

24 [19-44]+

21 [7-28]*

23 [15-63]

35 [10-74]

betegség-tartam (hónap)

- 10

[8,5-13] 10,5

[8,5-15,5] 11,5

[9,25-15]

12 [9.5-15]

12 [10-15]

betegség aktivitás (PCDAI)

- 45

[39-58] 0

[0-5]+++ 45

[25-48]###

20 [7-

28]××

13 [2-

22]××× lokalizáció (n, montreáli kritérium)

- L1 (1), L2 (2), L3 (11)

L1 (0), L2 (2), L3 (8)

L1 (1), L2 (2), L3 (9)

Laboratóriumi adatok

fehérvérsejt szám (G/l)

7,9 [5,7-10,1]

12,4 [9,4-14,2]**

11,7 [8,4-14,4]

10,0 [8,2-11,2]

7,9 [5,5-10,6]

6,7 [4,5-

10,4]×

vérlemezke szám (G/l)

346 [288-375]

657 [451-746]**

442 [308-624]

479 [396-750]**

392 [293-523]

383 [308-483]×

szérum vas (μmol/l)

16 [14-21]

4 [2-12]*

8 [4-10]*

4 [2-7]***

5 [4-7]***

8 [6-8]**, ×

szérum albumin (g/l)

45 [44-49]

37 [34-39]***

42 [42-45]+

40 [36-41]***

41 [38-45]**

42 [38-45]**

C-reaktív protein (mg/l)

0 [0-1]

21 [5-65]***

7 [2-11]**, +

27 [9-55]#, ***

9 [3-

11]***

5 [1-

14]***, ×


41. oldal

Tizennégy kezeletlen, terápia naív betegből biopsziával igazoltan tizenegy esetben

mind a vékonybél, mind a vastagbél érintett volt, ami a montreáli kritériumok szerint L3

lokalizációnak felel meg. [131] A kezeletlen és a relapszusos CD betegekben

alacsonyabb volt a testtömeg-index és a testsúly. Az alacsonyabb testtömeg-index és

testsúly egy gyakori kórjelző tünet Crohn betegségben. [132] A csökkent

táplálékbevitel, étkezések utáni hasi görcsök, szisztémás citokin felszabadulás, és

malabszorptív hasmenés a lehetséges okai ennek a tünetnek. [33]

A rutin vérvételekkel egyidőben 6 ml heparinizált perifériás vér vétele történt a

kezeletlen betegektől a diagnózis és az első remisszió időpontjában a remisszióba

kerültek csoportjában, valamint az IFX terápia kezdete előtt, illetve 2 és 6 héttel később

a relapszusos populációban. Ebből a perifériás vérmintából lett meghatározva a

különböző fehérvérsejt populációk gyakorisága áramlási citométerrel.

5.1.2. Cöliákia

A vizsgálatba tíz gyermeket vontunk be az I. Sz. Gyermekklinika Gyermek-

gasztroenterológiai Szakrendelésén 2007 decembere és 2009 decembere között. A

cöliákia diagnózisa az érvényben lévő protokolloknak [133] és a Marsh kritériumoknak

megfelelően került felállításra [134]. Mindegyik betegben a transzglutamináz (TG) IgA

szint 200 U/l fölött volt, és a biopszia szövettani vizsgálata szubtotális vagy totális

bélboholy atrófiát és az IEL-k 40% fölötti emelkedett számát igazolta. Mindegyik

cöliákiával diagnosztizált gyermekben GFD-t indítottunk. A tünetek elmúltával, amikor

a TG IgA szint normalizálódott (10-40 U/l), ismételt vérvétel történt. Kontroll

populációnak 15, korban és nemben egyező gyermek szolgált, akik nem organikus

hasfájás miatt kerültek felvételre.

Mind a diagnózis felállításakor, mind a tünetek elmúltával, a rutin vérvételekkel

egyidőben 6 ml heparinizált perifériás vért vettünk, és immunfenotípizáltuk a betegeket

és az egészségeseket.


42. oldal

5. táblázat A vizsgálatban résztvevő betegek és egészségesek adatai. Rövidítések: GFD:

gluténmentes diéta; TG: transzglutamináz; Ig: immunglobulin. Statisztika: vs. kezeletlen

cöliákiás: **p<0,01; ***p<0,01.

medián [interkvartilis tartomány]

kontroll kezeletlen cöliákiás

(GFD előtt) kezelt cöliákiás

(GFD után) n (fiú/lány) 15 (6/9) 10 (4/6)

életkor (év) 3

[2-6] 3

[2-5] 4

[2,5-6,5] betegségtartam (hónap)

- 3,5

[2,5-5] 4

[3-6,5]

testsúly (kg) 15,5

[11-17,6] 16,5

[11,8-18,6]

TG (IgA, egység) - 264

[205-298] 29

[10-40]***

TG (IgG, egység) - 38

[21-56] 14

[7-34]**

5.1.3. Allergiás kolitisz

2006 szeptembere és 2008 januárja között az I. Sz. Gyermekklinika Gyermek-

gasztroenterológiai Szakrendelésén megjelent csecsemők közül 34 esetében volt a

panasz véres széklet (hematokézia, HC). A leggyakoribb okok, így a fertőzés és a

sérülés kizárása után anyai eliminációs étrend került bevezetésre (tehéntej és tojás

elhagyása az anyai étrendből). Egy hónap múlva ezek után már csak tizenegy

gyermeknél maradtak meg a HC-s tünetek. Ezeknél az anyatejet fogyasztó

gyermekeknél kolonoszkópia történt, ami alapján egy csecsemő Crohn betegnek

bizonyult. A maradék tíz gyermek került beválasztásra a vizsgálatba, akiknél AC volt a

végső diagnózis. Az AC diagnózisát a kolonoszkópia során látott jellegzetes képek

(limfonoduláris hiperplázia, LNH, vagy aftás lézió, APH), a biopsziás mintában

jelenlévő eozinofília (>6 egy nagy nagyítású látótérben), és az alapján állítottuk fel,

hogy a hosszabb utánkövetés (13-24 hónap) után sem tért vissza a HC a tartós anyai

eliminációs diéta (tej, tojás), illetve elementáris tápszerre való áttérés után (Neocate;

SHS Int, Liverpool, UK). Tíz, életkorban és nemben illő, anyatejet fogyasztó gyermek

szolgált kontrollként, akiknél a panaszok hátterében funkcionális hasfájás volt

igazolható.


43. oldal

6. táblázat Az allergiás kolitiszes (AC) gyermekek alap klinikai karakterisztikája. Rövidítések:

HC: hematokézia; AC: allergiás kolitisz; NNL: nagy nagyítású látótér; LNH: limfonoduláris

hiperplázia; APH: aftás lézió; AD: atópiás dermatitisz; n.a.: nincs adat; F: fiú; L: lány.

beteg

(nem)

kor

(hó)

HC

tartam

(hó)

atópia

(családi)

eozinofil sejtek

aránya a

TVK-ben

kolonoszkópia

(kép)

eozinofil (40x-

es nagyítás /

látótér)

1 (F) 6,5 2 nincs 6% LNH, APH 17

2 (L) 4 2 AD 6,2% LNH, APH 14

3 (F) 3 2 AD 2,5% LNH 7

4 (F) 1 1 nincs 2% eritéma 20

5 (L) 6 2 nincs 2,1% LNH 9

6 (F) 4 2 AD 3% LNH 20

7 (F) 5 1 nincs 3,4% LNH 9

8 (F) 4 2 AD 12,8% LNH 41

9 (F) 6 3 nincs 3,4% LNH 38

10 (F) 5 1.5 nincs 1,4% LNH 18

A diagnózis időpontjában 2 ml heparinizált vért vettünk a rutin vizsgálatokkal

egyidőben. A második vérmintát a HC-s tünetek megszűnte után (2 [1-3] hónap múlva)

gyűjtöttük. Széklet hemoteszttel (HSV10; Diagnosticum Zrt, Budapest, HU) igazoltuk a

vérzés megszűntét. Az immunfenotípus vizsgálatokkal egyidőben a plazmából citokin

chip (Bio-Plex Protein Array system, Bio-Rad, Hemel Hempstead, UK) segítségével

meghatároztuk az IFN-γ/IL-4 arányt.

5.1.4. Egészséges kontrollok

Összesen 40 egészséges kontrollt vontunk be a vizsgálatokba, akiktől a rutin

vérvételek során egy csőnyi vérmintát vettünk az immunfenotípus meghatározáshoz.

CD vizsgálatához 15, cöliákiához 15, AC-hez 10 csecsemő, illetve gyermek szolgált

kontroll populációként. Az egyes esetekben alkalmazott kontrollok adatai a fenti

táblázatokban kerültek feltüntetésre.


44. oldal

5.2. Módszerek és statisztika

5.2.1. Minta előkészítés

Az immunsejt fenotípus vizsgálathoz 2-6 ml heparinizált perifériás vérmintát

gyűjtöttünk (BD Vacutainer, Beckton Dickinson & Co, Plymouth, UK), amit legfeljebb

12 órán át szobahőmérsékleten tároltunk. A vérvételek mindig a betegek rutin

kivizsgálásának részeként történtek, a megfelelő etikai engedélyek és írásos

beleegyezések birtokában. A levett vérmintát mostuk (23 °C, 200 g, 5 perc), a

vérplazmát leszívtuk, majd a minta fagyasztva került tárolásra (-80 °C) a citokinszint

méréshez. A maradék vérből a perifériás vér mononukleáris sejteket (PBMC) grádiens

centrifugálással szeparáltuk (Ficoll-Paque Plus, GE Healthcare Bio-Sciences, Uppsala,

Sweden). A vérmintát és a vérvételi csőből a maradék mintát foszfát-pufferelt

fiziológiás sóoldattal (PBS, Semmelweis Egyetem Központi Gyógyszertár, Budapest) 3

ml Ficoll oldatra óvatosan rárétegeztük. Ezután a mintát mostuk (23 °C, 400 g, 27 perc),

majd a határréteget (buffy coat) óvatosan leszívtuk, és PBS oldatban két alkalommal

ismét mostuk (23 °C, 200 g, 7 perc). Amennyiben a minták nem kerültek azonnal a

kvantitatív mérési fázisba, úgy a PBMC-t fagyasztva tároltuk a mérés időpontjáig

(-80°C). A fagyasztáshoz a PBMC-t 0,5 ml magzati borjúsavóban (FCS, Sigma-Aldrich,

St. Louis, MO, USA) reszuszpendáltuk. Ezek után 0,4 ml magzati borjúsavó és 0,1 ml

dimetil-szulfoxidból (DMSO, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) álló oldatot

óvatosan cseppenként adtunk a PBMC-hez, és azonnal lefagyasztottuk a mintát (-80°C).

A mérések előtt a lefagyasztott sejteket felolvaszottuk, és PBS oldatban két alkalommal

mostuk (23 °C, 200 g, 7 perc). Ezután a frissen szeparált, vagy a fagyasztva tárolt mintát

szétosztottuk annyi részre, ahány mérési panel meghatározása volt a cél, de legalább

1x106 sejtet jutattunk be panelenként a mintákba.

A sejtfelszíni méréshez panelenként a gyártó által előírt protokollnak megfelelő

mennyiségű fluoreszcens molekulával jelölt konjugált antitestet tartalmazó festéket

adtuk hozzá a megfelelő mennyiségű mintához majd inkubáltuk (4 °C, 30 perc). Ezután

a mintákhoz 0,5 ml PBS-t mérve a fölösleges, nem kötődött festéket lemostuk (23°C,

200 g , 7 perc). Következő lépésként 0,5 ml lizáló és fixáló oldat került a mintákhoz

(Lysing Solution, Beckton Dickinson & Co, Plymouth, UK), majd sötétben inkubáltuk


45. oldal

(23 °C, 20 perc). A mintákat mosás után (23°C, 200 g, 7 perc) 0,5 ml PBS-ben

reszuszpendáltuk a FACS-os méréshez.

7. táblázat Az alkalmazott sejtfelszíni és sejten belüli fluoreszcens festékek. A rövidítéseket és

a részleteket lásd a szövegben.

festék gyártó katalógus

Sejtfelszíni markerek

6b11 BD Pharmingen, Pe Anti-Human invariant NKT cell 552825

CCR4 BD Pharmingen, PE Mouse Anti-Human CCR4 551120

CD11c BD Pharmingen, APC Mouse Anti-Human CD11c 333144

CD123 BD Pharmingen, PE Mouse Anti-Human CD123 340545

CD14 BD Pharmingen, FITC Mouse Anti-Human CD11c 555397

CD161 BD Pharmingen, APC Mouse Anti-Human CD161 550968

CD25 BD Pharmingen, FITC Mouse Anti-Human CD25 555431

CD3 BD Pharmingen, PerCP DD3, Clone 345766

CD4 BD Pharmingen, Pe-Cy7 Mouse Anti-Human CD4, Clone 557852

CD45R0 BD Pharmingen, PEMouse Anti-Human CD45R0 555493

CD45RA BD Pharmingen, FITC Mouse Anti-Human CD45RA 335039

CD62L BD Pharmingen, PerCP Mouse Anti-Human CD62L 555545

CD69 BD Pharmingen, APC Mouse Anti-Human CD69 555533

CD8 BD Pharmingen, APC-Cy7 Mouse Anti-Human CD8, Clone 557834

CXCR3 BD Pharmingen, APC Mouse Anti-Human CD183 (CXCR3) 550967

HLA-DR BD Pharmingen, PerCP Mouse Anti-Human HLA-DR 347402

Lin-1 BD Pharmingen, FITC Mouse Anti-Human Lin-1 340546

TLR-2 eBioscience, PE-Cy7 Anti-mouse/human TLR2 (T2.5) 25-9024-80

TLR-4 eBioscience, Alexa Fluor700 Anti-human TLR4 (HTA125) 56-9917-71

Sejten belüli markerek

FoxP3 eBioscience, PE Anti-human Foxp3 Staining Set (PCH101) 72-5776-40

izotípus eBioscience, PE Anti-human PE IgG Isotype 12-4714-73

A sejten belüli FoxP3 meghatározáshoz először a sejtfelszíni festékeket (CD4,

CD25) adtuk hozzá a mintákhoz és inkubáltuk a protokolloknak megfelelően (4 °C, 30

perc). Ezután 1 ml fixáló és permeabilizáló oldatot (Fixation/Permeabilization Solution,

eBioscience, San Diego, CA, USA) adva a mintához újra inkubáció következett (4 °C,


46. oldal

30 perc). A mintákat 2 ml fixáló oldatban (Fixation Solution, eBioscience, San Diego,

CA, USA) mostuk (23 °C, 200 g, 7 perc). A PBMC-khez egyrészt a FoxP3 festéket (PE

Anti-human Foxp3 Staining Set, eBioscience, San Diego, CA, USA), másrészt az

izotípus kontrollt adtuk hozzá, majd inkubálásuk következett (23 °C, 30 perc). A festés

végével 2 ml fixáló oldatban került a minta mosásra (23°C, 200 g, 7 perc). Az azonnali

méréshez a 0,5 ml PBS-ben reszuszpendált mintát a gépbe helyezésének pillanatáig

jégen tartottuk.

5.2.2. Immunsejt markerek

A perifériás vérminták vizsgálatához szükséges panelek fluoreszcens festékek

kombinációit tartalmazták. [135-141] Ezeknek a segítségével kis mennyiségű

vérmintából több sejtpopuláció vizsgálata volt lehetséges, az áramlási citométer

szűrőinek igény szerint való kombinálásával. A bevezetésben részletesen tárgyalásra

került az immunsejtek patomechanizmusban betöltött szerepe, itt csak az egyes

populációk azonosításában fontos markerek és ezek élettani jelentőségét részletezzük a

módszertani leírásokon túl.

A CD3 a T sejt receptor komplex (TCR) egyik alkotóeleme. A CD3 membrán

fehérje funkciója a TCR kihorgonyzása a sejtmembránhoz, valamint a jelátvitelben való

részvétel. [142]

A CD4 antitestet kötő sejtek a T helper (Th), a CD8 antitesteket kötő sejtek

többsége citotoxikus T limfocita (Tc). A CD4 és a CD8 fehérjék a T-sejtek sejtfelszíni

fehérjéi, amelyek a fő hisztokompatibilitási komplex (MHC) állandó részéhez

kapcsolódnak és a TCR szignáljaival együtt, a T-sejt aktivációt eredményező jelátviteli

mechanizmusokban vesznek részt. A CD4 az MHC II, a CD8 pedig az MHC I

molekulák adhéziós és jelző koreceptorai. Az érett T-sejtek kb. 65 %-a CD4+, kb. 35 %-

a CD8+ a vérben. Fő funkciójuk az antigénfelismeréskor történő jelátvitel. Ezen kívül

erősítik a T-sejtek kötődését az APC-hez. A CD4+ T-sejtek citokintermelő helper sejtek,

és a sejten kívül mikróbák elleni védekezésben van jelentőségük, míg a CD8+ T-sejtek

az intracelluláris fertőzésekkel szemben hatékonyak. Emberben előfordulhat Tc-ként

működő CD4+ T-sejt is, de ezek a sejtek is MHC II-re korlátozottak. Így tehát a CD4,

ill. CD8 expressziója egy sejten azt határozza meg, hogy melyik MHC-re korlátozott, és


47. oldal

nem feltétlenül a sejt funkcióját. A Th sejtek fejlődésük folyamán effektor, azaz

aktiválódott helper sejtekké alakulhatnak. Elszenvedett infekció után egy részük

memória T sejtté, más részük regulátoros T sejtté differenciálódik. Az aktiválódott

CD4+ sejtek tovább differenciálódhatnak Th1 vagy Th2 irányba.

A CD8 sejtek a CD3+ sejtek olyan csoportját alkotják, amely direkt citotoxikus

hatással rendelkezik. A fertőző ágensek és a megváltozott működéssel rendelkező sejtek

felismerése révén képesek elpusztítani a fertőzött, valamint a tumor sejtté

transzformálódott szomatikus sejteket. Citotoxikus hatásukat két úton érhetik el.

Citotoxinokat (perforin, granulizin) szabadítanak fel, valamint Fas-ligand termelésével a

célsejtek apoptózisát indukálják. [142] Aktivációjukban a helper T sejtek játszanak

központi szerepet. Az NKT és invariáns NKT (iNKT) sejtek a CD8+ sejtek aktivációját

gátló hatással rendelkeznek. Az aktivált citotoxikus T sejtek egy kisebb hányada az

aktivált helper T sejtekhez hasonlóan képes Tc1 vagy Tc2 irányba differenciálódni.

Ezentúl ismert, hogy a Th sejtekhez hasonlóan a CD8 sejtek is képesek szabályozó

funkciókkal bíró Treg irányba differenciálódni bizonyos hatásokra. A CD8+ Treg

sejteket eddig csak nagyon kis számban azonosították, funkciójuk sem ismert, de

valószínűleg daganatos kórképek kialakulásában lehet jelentőségük.

A CXCR3 receptor, mely CD183-ként is ismert, a kemokin receptorok családjába

tartozik. Fokozott expressziója figyelhető meg a Th1 sejtek felszínén. A receptor

ligandja elősegíti a Th1 sejtek érési folyamatait, ezért a Th1 sejtek identifikálására

alkalmas. A Th1 sejtek fő funkciója a citokinek termelése. Szekretálnak IL-2-t,

interferon-gammát (IFN-γ), IL-12-t valamint limfotoxinokat (TNFβ). A Th1 sejtek

túlnyomó része CD4+ sejtekből, kisebb hányaduk CD8+, vagy NKT, esetleg regulátoros

T-sejtekből alakul ki. Az általuk elválasztott citokinek nem csak a Th1 sejtek effektor

funkcióiban játszanak szerepet, hanem befolyásolják a Th1 sejtek érési folyamatait is. A

szekretált citokinek elősegítik a CD4+ sejtek Th1 irányú fejlődését, míg gátolják a Th2

irányú differenciálódást. A legfontosabb Th1 sejt-kialakulást elősegítő citokin az IL-12.

A Th1 irányú differenciálódás a mikróbák megjelenése következtében aktiválódott

makrofágok, valamint NK sejtek IL-12 termelésének következménye. A Th1 sejtek

effektor funkciója a fagocitózis elősegítése fertőzések esetén. [143]


48. oldal

A CCR4, mely CD194 néven is ismert, a CXCR3 receptorhoz hasonlóan a

kemokin receptorok közé tartozik és alkalmas a Th2 sejtek kimutatására. A leukociták

által termelt kemokinek feladata a gyulladásos sejtek migrációjának befolyásolása. A

Th2 sejtek funkciója az IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10 és IL-13, továbbá TNF-α

elválasztás. A Th1 sejtek esetében ismertetett prekurzorokból alakulnak ki a Th2 sejtek.

[142] Az általuk elválasztott citokinek a Th1 irányú differenciálódást gátolják, míg a

Th2 irányút elősegítik. A Th2 sejtek képzését emberben helmintiázis, valamint az

allergiás megbetegedések segítik elő. E betegségek okozta krónikus T sejt stimuláció - a

veleszületett immunrendszer sejtjeinek közreműködése nélkül - az IL-4 termelése útján

a Th2 irányú differenciálódáshoz járul hozzá. A Th2 sejtek fő effektor funkciója az IgE-

valamint az eozinofil-, és masztocita-mediált immunválasz elősegítése.

Mind a CD45RO, mind a CD45RA aktivációs marker. Emberben a legtöbb naív T-

sejt felszínén megtalálható a CD45 egy izoformája, amelynek egy részét egy „A”

jelzésű exon kódolja, ezért ezt CD45RA-nak nevezik. Ezzel szemben, a legtöbb aktivált

és memória T-sejt a CD45 olyan izoformáját tartalmazza, melyből az „A” exon már

kivágódott, ez a CD45RO. [142]

A CD69, CD25, HLA-DR és CD62L szintén aktivációs markerek. A CD69

(activation inducer molecule, AIM) nagyon korai aktivációs marker, a CD25 (IL-2

receptor α lánca, IL-2R, Tac, p55) korai aktivációs marker, a HLA-DR (fő

hisztokompatibilitási komplex, MHC) késői aktivációs marker, CD62L (L-szelektin

ligand) késői aktivációs marker. A CD69 funkciója nem pontosan ismert, de a korai

aktivációs mechanizmusok jelátvitelében fontos antigén; aktivált T- és B-sejtek,

makrofágok, NK-sejtek, vérlemezkék, Langerhans-sejtek felszínén található meg. A

CD25 az aktivált T- és B-sejteken és monocitákon található, fő funkciója az IL-2 kötése.

Az IL-2 a regulátoros T-sejtek kialakulásához és működéséhez szükséges. A CD4+

Treg-eken nagy számban találunk CD25-öt, de más aktivációs markert nem. A HLA-DR

a humán MHC, a 6. kromoszóma rövid karján mintegy 4 megabázis területet foglal el.

Három régióban csoportosulnak a különböző lókuszok, melyek legjellemzőbb génjei a

polimorfizmusokat viselő I. és II. osztályú hisztokompatibilitási molekulákat kódolják.

Az I. osztályú kétláncú és doménszerkezetet mutató fehérjéket a HLA-A, -B, -C, -G, -E

stb. lókuszok determinálják. A II. osztályú, a HLA-DR, -DQ, -DP, -DO lókuszok által


49. oldal

meghatározott kettős láncú (alfa, béta) molekulák kisebb mértékű polimorfizmusát

külön gének kódolják (HLA-DRA, -DRB, -DQA, -DQB stb.). A CD62L megtalálható

T- és B-sejteken, monocitákon, NK-sejteken. Szerepe van a naív T-sejtek homingjában

a perifériás nyirokcsomókban (homing receptor), CD34-et köt, ami a sejt-sejt közötti

kapcsolatért felelős. Affinitása kicsi, ezért a fehérvérsejtek endotéliumhoz való kezdeti

kötődését, és azon való végiggördülését segíti a véráramlással szemben. [142]

A CD161 receptor a C-típusú lektinek családjába tartozik, homodimer láncokból

áll. A legtöbb NK sejten, invariáns NKT sejteken és citolítikus T-sejteken

expresszálódik. Az iNKT sejtek hasonlóak az NK sejtekhez a CD161 (NK-asszociálta

receptor) expresszióban. Az NK sejtek neve arra utal, hogy előzetes aktiváció nélkül is

képesek ellátni védekező feladataikat, a vírusok, valamint egyéb intracelluláris

kórokozókkal fertőződött sejtek elpusztítását. Minden olyan sejtet eliminálnak, melynek

felszínén nincs jelen az MHC I. A fertőzések és egyes, főként hematopoetikus eredetű

tumoros folyamatok a sejtek felszínén az MHC I kifejeződését gátolják, ezáltal válnak e

sejtek az NK sejtek célpontjaivá. Az NK sejtek effektor funkciója direkt citotoxikus

válaszreakció és a makrofág aktiváció, ez utóbbi IFN-γ termelése útján következik be.

Az NK sejtek elősegítik továbbá a nyugvó CD4+ sejtek aktivációs mechanizmusait. A

CD161 fehérje funkciója az NK sejtek citotoxicitásának és aktivitásának szabályozása.

Amennyiben az NK sejt CD3 pozitivitással rendelkezik, NKT sejtről beszélünk. Az

NKT sejtek APC-k által CD1d kontextusban bemutatott antigént ismerik fel, és gyors

Th1/Th2 citokin választ adnak. Így a DC, NK, B, T sejteket aktiválják, valamint a CD4

T sejtek Th1 vagy Th2 irányú differenciálódását szabályozzák. [143] A 6b11 anti-

invariáns NKT sejt (iNKT) ellenes antitest és így az iNKT sejtek (6b11+, CD3+)

vizsgálatára alkalmas. Az NKT sejtek ugyanis TCR receptoruk alapján invariáns NKT

és nem-invariáns NKT sejtek csoportjára oszthatóak. Az iNKT sejtek TCR-je

születéskor kialakult és nem esik át későbbi átrendeződésen. A CD1d reaktív iNKT

sejtek tovább oszthatóak klasszikus (Vα24Vβ11) és nem klasszikus (más Vα géneket

expresszáló) csoportra. Az iNKT sejtek eddig ismert feladata TCR révén gyors citokin

termelés, főleg IL-4 (Th0-ról Th2-re differenciációt fokozza) és IFN-γ (Th1- irányú

differenciációt okoz, APC-ket aktiválja) expresszió. Az NKT és iNKT sejtek ezeken

kívül gátolhatják a nyugvó CD8+ sejtek aktiválódási folyamatát is.


50. oldal

8. táblázat Példa panel összeállításokra BD FACS Aria típusú áramlási citométerre saját szűrő

beállításokkal sejtfelszíni és sejten belüli mérésekhez. Az alábbi panel összeállítások

mindegyike tartalmazza a feltüntetetteken kívül az FSC (szűrő nélkül) és SSC (488/10-es BP

szűrővel) paramétereket is. Rövidítések: FSC: forward scatter; SSC: side scatter; BP: band

pass; LP: long pass; NK: természetes ölő sejt; DC: denritikus sejt; Treg: regulátoros T sejt.

A DC sejtek vonal marker (Lineage-1, Lin-1) negativitásuk és HLA-DR

pozitivitásuk alapján azonosíthatóak. Az mDC sejtek CD11c-t (antigén felvétel, T-sejt

aktiváció, IL-12 termelés), míg a pDC sejtek CD123-at (szupresszor hatás, IFNα

termelés) expresszálnak. A Lin-1 koktél CD3, CD14, CD16, CD19, CD20 és CD56

elleni antitestekből áll. A CD14 (Mo2, lipopoliszacharid, LPS receptor): az LPS

indukálta makrofág aktivációban játszik szerepet, az LPS és LPS-kötő fehérjék

komplexét köti, a perifériás monociták markere. A CD16 (FcγRIII A és B) az immun-

komplex mediálta sejtaktivációban játszik szerepet. A CD19 (B4) a B-sejt aktivációban

Első szűrő beállításban mérhető panelek

Festék FITC PE PerCP PECy7 APC APCCy7

gerjesztés (nm)

488 488 490 488 650 633

emisszió (nm) 520 575 675 785 660 760

szűrő BP (LP)

530/30 (502)

576/26 (556)

675/20 (655)

780/60 (735)

660/20 (-)

780/60 (735)

T sejtek 1. CCR4 CD62L CD4 CXCR3 CD8

T sejtek 2. CD45RA CD45RO HLA-DR CD4 CD69 CD8

NK 6B11 CD3 CD11b CD161

Treg CD25 FoxP3 CD4 CD8

Második szűrő beállításban mérhető panelek

Festék FITC PE PerCP PECy7 APC Alexa 700

gerjesztés (nm)

488 488 490 488 650 702

emisszió (nm) 520 575 675 785 660 720

szűrő BP (LP)

530/30 (502)

576/26 (556)

675/20 (655)

780/60 (735)

660/20 (-)

695/40 (655)

DC Lin-1 CD123 HLA-DR TLR-2 CD11c TLR-4

monociták CD14 TLR-2 TLR-4


51. oldal

játszik szerepet, CD21-el és CD81-el képez komplexet, míg a CD20 (B1) a B-sejt

aktivációban és regulációban játszhat szerepet, kálcium-csatorna. CD56 (Leu-19,

NKH1) a homotípiás adhézióban szerepel, az N-CAM izoformája. A CD11c (CR4α

lánc, p150,95, alfaX integrin lánc), az integrin alfa családba tartozik, nem-kovalensen

kötődve a CD18-hoz a p150,95 integrint alkotja. Mieloid (monocita/makrofág,

granulocita, endotél) sejteken expresszálódik. AlfaX alegysége az integrin CR4-nek

(CD18-al asszociálva), amivel fibrinogént köt, hasonlóan a CD11b-hez. A CD123 (IL-

3Rα) a citokin receptor I-es típus, fibronektin III-as típus családba tartozik, a CD131

jelátviteli lánccal asszociálva. Csontvelő őssejteken, granulocitákon, monocitákon,

megakariocitákon expresszálódik, az IL-3 biológiai hatását közvetíti a CD131-el együtt.

Mind a monociták, mind a DC sejtek felszínén megtalálhatóak a TLR-2 és TLR-4

markerek. Ezek a markerek az APC-k sejtmembránján átérő molekulák, amik a

veleszületett immunitás fő mediátorai és többek között az LPS-t képesek megkötni, és

így járulnak hozzá a mikrobiális antigén prezentációjához és citokinek termeléséhez. A

TLR-2 monocitákon/makrofágokon, mDC és hízósejteken expresszálódik, míg a TLR-4

ezeken kívül még az intesztinális epitéliumon is.

A Treg sejteket FoxP3+ sejtekként azonosítottuk. A FoxP3 intracelluláris marker,

transzkripciós faktorként több gén átírását képes befolyásolni, hibás működése

autoimmun kórképek kialakulását okozza. A regulátoros T sejtek fejlődésében és

működésében a fokozott CD25 expresszió központi szerepet játszik. Amennyiben az IL-

2 receptor valamilyen genetikai defektusa áll fenn, úgy a regulátoros T sejtek működése

súlyosan károsodott. A Treg sejtek a T limfociták olyan szubpopulációját alkotják,

melynek szerepe az immunrendszer válaszának visszafogása, a túlzott aktiválódási

folyamatok korlátozása, azaz szuppresszor hatással rendelkeznek. Elősegítik a saját

antigénekkel szemben kialakuló tolerancia létrejöttét. A regulátoros T-sejtek

közvetlenül gátolhatják a nyugvó CD4+ sejtaktivációt, valamint közvetve, az NK sejtek

működésének gátlása révén, tovább csökkenthetik az aktiválódó Th sejtek számát. A

regulátoros T sejtek, a fentiekhez hasonlóan közvetlenül gátolják a CD8+ sejtaktivációt,

valamint effektor funkcióját is. A CD4 populáción belül a Treg sejtek aránya 1-10%

körül alakul perifériás vérmintában, de kevesebb, mint 1%-ban CD8 Treg sejtek is

azonosíthatóak.


52. oldal

5.2.3. Áramlási citométeres mérések

Az immunsejtek prevalenciáját áramlási citométerrel (BD FACS Aria, Beckton

Dickinson & Co, Plymouth, UK) mértük a Semmelweis Egyetem I. Sz. Gyermekklinika

kutatólaboratóriumában. A FACS vizsgálatok során fluoreszcens festékkel előre

konjugált antitesteket használunk a sejttípusok meghatározásához. A mérés során a

vizsgálandó sejtet tartalmazó egy sejtsor szélességű folyadékoszlopra lézerfényt irányít

a gép (488 nm-es kék, és 633 nm-es vörös fényt). Amikor a sejt (vagy 0,2-150 μm

méretű részecske) a lézerfény fókuszpontjába ér, a ráeső fény oldalirányba (side scatter)

és előrefelé (forward scatter) szóródik. Az előre szóródó fény a sejt (részecske)

méretéről ad információt, és további módosítás nélkül külön csatornán (forward scatter

characteristics, FSC) detektálható. Az oldalra szóródó fény a sejt granuláltságának,

morfológiai tulajdonságainak detektálására szolgál (side scatter characteristics, SSC). A

gerjesztés során keletkező fényszórási jelek mellett a különböző hullámhosszú,

jelöléstől függő fluoreszcens emissziós jelek keletkeznek. A fluoreszcens jeleket a

készülék optikai szűrők segítségével elkülöníti egymástól. A szűrők funkciója alapján

meg lehet különböztetni long pass (LP) és band pass (BP) szűrőket. A LP szűrők egy

meghatározott hullámhossznál nagyobb (felül áteresztő), vagy kisebb (alul áteresztő)

hullámhosszúságú fényt engednek át, a többi fényt pedig visszatükrözik. A BP szűrők

csak egy meghatározott tartományba eső fényjeleket engednek át (pl. 600-620 nm). A

jeleket erősítés majd analóg-digitális konverzió után számítógép gyűjti és elemzi. [144]

A nem fixált minták mérését a festés után a lehető leghamarabb kell elvégezni

(max. 1 óra a festéstől számítva), és a mintákat a gépbe helyezésének pillanatáig

sötétben és hűtve kell tárolni. Minden panel összeállítás előtt a gép használati

utasításának megfelelően kompenzációs számításokat végeztünk, egyszeresen festett és

negatív kontroll mintákkal. Az erősítések mértékét úgy állítottuk be, hogy az adott

festék esetén a negatív és pozitív populáció a lehető legjobban elkülöníthető legyen a

kapuzás során. A kapott kompenzációs értékek a fluoreszcens festékek spektrumának

átfedését mutatják, és a vizsgálatok során soha nem voltak nagyobbak, mint 10%. Egy

mintát véletlenszerűen többször is visszamértünk, hogy a mintán belüli szórásokat

ellenőrizhessük. Továbbá a gép rendszeresen minőségi kontrollon esett át az

előírásoknak megfelelő reagensekkel. A sejtfelszíni mérések során negatív és szükség


53. oldal

esetén izotípus kontroll mintákatat használtunk, míg a sejten belüli festések esetén

minden esetben izotípus kontrollt is, az autofluoreszenciából és nem specifikus

festődésből eredő zaj kiszűrésére. Minden panel mérésekor legalább 105 sejt mérése

történt a limfocita kapuban (FSC és SSC, valamint CD3 pozitivitás alapján). A mérési

eredmények ábrázolása dot-plot és hisztogram segítségével történt. A dot-ploton az

egyes sejtekről kapott fényjelek ábrázolhatóak intenzitásuk függvényében, míg a

hisztogram egy paraméter jelintenzitása alapján mutatja a sejtek megoszlását. A

kiértékelések a citométerhez mellékelt szoftver (FACS Diva, Beckton Dickinson & Co,

Plymouth, UK) segítségével történtek.

10. ábra A regulátoros T sejtek (Treg) azonosítása. Az ábra bal részében látható, hogy a

CD4+CD25hi sejtpopuláció kijelölésével régebben hogyan azonosították a Treg sejteket. Ismert

azonban, hogy a CD4+CD25hi sejtcsoport nem csak Treg sejteket tartalmaz. Újabban ezért az

ábra jobb oldalán látható módon a CD4+ sejteken belül a FoxP3+ sejteket tekintik Treg-eknek a

jelenleg leginkább elfogadott protokollnak megfelelően. Ezt a populációt a CD4+ vagy a

CD4+CD25+/hi kapun belül szokták azonosítani attól függően, hogy csak a természetes vagy az

indukált Treg sejteket is beleveszik a számításba.

Az áramlási citométeres vizsgálatokban a PBMC populáción belül az egyes

sejttípusok prevalenciáját lehet meghatározni. Ezek a százalékos értékek egy adott

szülőpopuláción belül mutatják a vizsgált immunsejt előfordulási gyakoriságát.

Amennyiben egy sejttípus prevalenciáját vagy egy sejttípus bizonyos expresszióját

kívánják meghatározni, mindig százalékos (%) értékeket adnak meg, ami a jelölt

populáción belüli arányt jelenti. Az adott sejttípust a dot-plot segítségével két (vagy


54. oldal

újabban háromdimenziós dot-plotok segítségével három) marker kombinációjával lehet

azonosítani. Ritkán az adott expresszió mértékét hisztogram segítségével statisztikai

középértékkel adják meg, és így jellemzik az expresszió mértékét, mint jelintenzitást.

11. ábra Az áramlási citométeres kiértékelés menete. Az ábra bal felső képén a perifériás

mononukleáris sejteken (PBMC) belül a sejtméret (forward scatter characteristics, FSC) és

granuláltság (side scatter characteristics, SSC) alapján azonosítható a limfociták populációja.

Az ábra jobb felső képén limfocita kapun belül a CD4 és CD8 expresszió alapján dot-ploton a

CD4+CD8- sejtek a T helper (Th), míg a CD8+CD4- populáció pedig a T citotoxikus (Tc) sejtek

lesznek. Az ábra bal alsó részén a CD4 jelölés, míg az ábra jobb alsó részén a CD8 jelölés

hisztogramon való eloszlása látható.


55. oldal

5.2.4. Citokin chip

A perifériás vérmintából szeparált vérplazmát fagyasztva (-80 °C) tároltuk a

mérések időpontjáig. A mérések a Semmelweis Egyetem Központi Laboratóriumában

fehérje meghatározási módszerrel történtek (Bio-Plex Protein Array system, Bio-Rad,

Hemel Hempstead, UK). A Bio-Plex módszer a chiptechnikán és áramlási citométeres

módszeren egyszerre alapul, és lehetőséget ad egyszerre több (gyakorlatilag 27, de

elméletileg akár 100) analit meghatározására is. Olyan mikrogyöngyöket alkalmaznak

ugyanis, amelyeket két színnel jelölnek, ezzel közel 100 gyöngytípust tudnak létrehozni.

A gyöngyökhöz monoklonális antitesteket kötnek, majd fluoreszcens festéket. A mérés

során a kapillárison áthaladó gyöngyöket két színes lézer világítja meg. A piros fény a

gyöngy, a zöld fény pedig a fluoreszcens jel intenzitását teszi mérhetővé. A jelet analóg-

digitális konverzió után a gép szoftveresen kiértékeli, és egy standard görbéhez

viszonyítva adja meg a citokin szinteket (1,95-32 000 pg/ml tartományban). [145]

5.2.5. Statisztika

A statisztikai kiértékelés során minden esetben legelőször az adatok eloszlását

vizsgáltuk. Amennyiben a Kolmogorov-Smirnov, D’Agostino-Pearson, Shapiro-Wilk

tesztek eredménye szignifikáns volt (p<0,05), akkor a vizsgált populáció nem a Gauss-

féle eloszlást követte. Ebben az esetben nem paraméteres teszteket alkalmaztunk és a

centrális tendencia medián [interkvartilis tartomány: 25-75 percentilis], vagy medián

[tartomány] formában adtuk meg. Amennyiben az esetszám a gyermekgyógyászati

klinikai vizsgálatok sajátosságainak megfelelően alacsony (kevesebb, mint 20 fő) volt,

akkor szintén nem paraméteres teszteket alkalmaztunk. A vizsgálatok előtt power

számítások történtek, hogy a nem paraméteres eljárások használatával megnövekvő

másodfajú hiba lehetőségét kontrollálni lehessen. Nem paraméteres eloszlásnak

megfelelően nem párosított két csoport összehasonlítására a Mann-Whitney teszt, míg

párosított esetben a Wilcoxon teszt szolgált. Három, vagy több csoport

összehasonlítására nem párosított mintáknál a Kruskal-Wallis tesztet, míg párosított

esetben a Friedman tesztet használtuk. Post hoc számításokra a Dunn-féle teszt szolgált.

Nem normál eloszlásra való tekintettel korreláció vizsgálatokhoz a Spearman tesztet

alkalmaztuk. A befolyásoló faktorokra való korrekcióra többszörös regressziók


56. oldal

segítségével került sor. 2x2-es kontingencia táblákat a Fisher-féle egzakt teszttel,

nagyobb táblákat a χ2 próba segítségével értékeltünk ki. A grafikai ábrázolásra a nem

paraméteres eloszlást is jól reprezentáló Whiskers box-plotot használtuk, ahol a

középvonal a medián, a doboz az interkvartilisek, míg a bajusz a tartományt jelölte.

Mivel a fenotípus vizsgálatok hipotézis felvető vizsgálatok, ezért az ilyenkor szokásos

eljárásnak megfelelően nem történt korrekció a többszörös összehasonlításokra

(Bonferroni-hatás), és így az elsőfajú hiba 5%-nál magasabbnak adódhatott bizonyos

esetekben. [146] A 0,05-nél alacsonyabb p érték tekintendő szignifikánsnak minden

esetben, kivéve, ahol ezt külön jeleztük. A kiértékelésre a Statistica szoftvercsomagot

használtuk (Statistica 8, Statsoft, Tulsa, OK, USA).

Eredmények

57. oldal

6. Eredmények


A vizsgálat során összehasonlítottuk a kezeletlen betegek és a kontroll egyének

immunfenotípusát. CD beteg gyermekben az adaptív immunitás sejtes elemei közül az

aktivált (CD4+CD25+) sejtek prevalenciája magasabb volt. Ezzel együtt a Th1

elkötelezett sejtek (CD4+CXCR3+) aránya csökkent, és így a Th1/Th2 arány Th2

irányba eltolódott a terápiában még nem részesült beteg gyermekekben. Az effektor

vagy memória sejtek (CD4+CD45RO+) prevalenciája megnőtt, így a naív/memória

sejtek arányában eltolódás volt a memória sejtek irányába. A Treg sejtek

(CD4+CD25hiFoxP3+) aránya ugyanakkor nem különbözött a beteg és egészséges

csoport között, de jelentős különbségek voltak a veleszületett immunitás fenotípusában.

Az NK (CD3-CD161+) és az NKT (CD3+6b11+) sejtek prevalenciája alacsonyabb volt a

terápiában még nem részesült CD-s gyermekekben, mint a kontroll egyénekben. Az

APC sejtek aránya szintén különbözött a két csoport között. A DC-k (Lin1-HLA-DR+)

és ezen belül az mDC-k (CD11c+) prevalenciája magasabb volt, míg a pDC-k (CD123+)

prevalenciája alacsonyabb friss beteg gyermekekben, mint az egészségesekben. Ezáltal

az mDC/pDC arányban eltolódás volt az mDC-k irányába. A perifériás monociták

(CD14+) száma magasabb volt CD-s betegekben, mint a kontroll populációban.

Továbbá, mind a DC-k, mind a monociták esetében magasabb volt a TLR-2 és TLR-4

expresszió a frissen diagnosztizált kezeletlen betegekben az egészségekhez képest.

Megjegyzendő, hogy a 14 kezeletlen gyermekből 4 gyermek nem reagált a

hagyományos terápiára, ezekben a gyermekekben az immunfenotípus nem különbözött

a terápiára reagálókétól.

A vizsgálat második fázisában prospektíven az immunfenotípus hagyományos

kezelésre történő változását figyeltük meg. Az első remisszió alkalmával az adaptív

immunitásban a Th1/Th2 arány a Th1 felé tolódott, és normalizálódott az aktivált T

sejtek prevalenciájával együtt. A memória T sejtek aránya az emelkedett szinten maradt,

míg a többi adaptív immunsejté nem változott a kezelés előtti szinthez képest. A

veleszületett immunitás elemei közül az NK és NKT sejteké alacsony, míg a DC-k

prevalenciája magasabb maradt a kontrollokéhoz képest. Ugyanakkor, mind az

mDC/pDC arány, a monocita, és TLR-2 és TLR-4 expresszió normális volt ezekben a

betegekben a kontrollokkal összehasonlítva.

Eredmények

58. oldal

9. táblázat Az adaptív immunitás sejtes elemeinek prevalenciája Crohn beteg gyermekekben.

Az adatok medián [interkvartilis tartomány] formátumban vannak megadva. Rövidítések: IFX:

infliximab; PBMC: perifériás vér mononukleáris sejtek; aktivált (CD25+); naív (CD45RA+);

effektor (CD45RO+); Th1 (T helper 1 elkötelezett, CXCR3+); Th2 (T helper 2 elkötelezett,

CCR4+); Treg (regulátoros T sejt, CD25hiFoxP3+). Statisztika: vs. kontroll: *p<0,05, **p<0,01,

***p<0,01; vs. kezeletlen: +p<0,05, +++p<0,01; vs. relapszus: ×p<0,05, ××p<0,01.

sejt prevalencia a

jelzett populációban

kontroll kezeletlen

(hagyományos terápia előtt)

első remisszió (hagyományos

terápiára)

relapszus (IFX

terápia előtt)

IFX terápia (2. adag

előtt)


előtt)

n (fiú/lány) 15 (6/9) 14 (6/8) 10 (4/6) 12 (5/7)

PBMC-ben CD4+

35,16 [24,81-47,79]

36,52 [18,61- 44,06]

37,42 [22,27- 44,26]

39,12 [24,15-51,18]

39,77 [27,71-50,30]

35,65 [24,31-48,81]

CD4+-ben aktivált

5,92 [2,39-6,51]

10,61 [3,93-

19,04]*

5,03 [3,37-

7,93]+++

7,84 [5,30-11,67]*

7,24 [5,67-12,25]*

9,98 [5,45-

16,19]**

CD4+-ben naív

64,57 [59,86-73,03]

63,36 [41,19- 74,86]

61,31 [39,09- 73,05]

66,31 [60,44-71,79]

64,47 [53,90-77,87]

58,11 [53,51-64,96]

CD4+-ben effektor

21,91 [13,94-33,96]

31,29 [22,80- 55,78]*

33,97 [28,54- 39,44]*

29,47 [26,54-36,19]*

35,23 [27,74-40,36]*

37,62 [35,74-45,24]**,

×× naív / effektor arány

2,73 [1,60-4,97]

1,57 [1,02- 2,54]*

1,43 [1,14- 2,21]*

2,34 [1,66- 2,68]

1,79 [1,47-2,36]

1,52 [1,19-

1,74]*, ×

CD4+-ben Th1

16,19 [9,91-25,26]

6,49 [4,50-

7,67]***

12,89 [5,12-

19,03]+

10,90 [4,03-14,38]*

12,73 [8,12-15,81]

18,87 [12,51-38,11]×

CD4+-ben Th2

4,59 [2,78-5,51]

4,70 [1,98- 6,03]

5,06 [1,42- 8,48]

3,97 [2,27- 7,19]

4,61 [2,55-5,65]

4,46 [2,11- 8,16]

Th1 / Th2 arány

3,98 [3,06-5,12]

1,60 [0,50-

2,11]***

1,95 [0,43- 3,62]**

2,68 [0,85- 5,07]

2,68 [1,42-6,14]

3,25 [1,37-4,80]×

CD4+-ben Treg

1,25 [1,10-2,37]

1,36 [1,09- 2,48]

1,41 [1,07- 3,50]

1,31 [1,16- 2,63]

1,33 [1,07-2,99]

1,96 [1,47-

3,77]**, ×

Eredmények

59. oldal

12. ábra Az adaptív immunitás sejtes elemeinek prevalenciája Crohn beteg gyermekekben

(Whiskers box-plot: középvonal a medián, a doboz az interkvartilisek, a bajusz a tartományt

jelöli). Az (A) aktivált (CD4+CD25+), (B) effektor vagy memória (CD4+CXCR3+), (C) T helper

1 elkötelezett (Th1, CD4+CXCR3+) és (D) regulátoros T (CD4+CD25hiFoxP3+) limfociták

prevalenciája. Statisztika: vs. kontroll: *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,01; vs. kezeletlen: +p<0,05,

+++p<0,01; vs. relapszus: ×p<0,05, ××p<0,01.

Eredmények

60. oldal

10. táblázat A veleszületett immunitás sejteinek prevalenciája Crohn beteg gyermekekben. Az

adatok medián [interkvartilis tartomány] formátumban vannak megadva. Rövidítések: IFX:

infliximab; PBMC: perifériás vér mononukleáris sejtek; NKT (természetes ölő T, CD3+6b11+);

NK (természetes ölő, CD3-CD161+); DC (dendritikus sejt, Lin1-HLA-DR+), mDC (mieloid DC,

CD11c+), pDC (plazmocitoid DC, CD123+); monocita (CD14+); TLR-2 (Toll-like receptor 2);

TLR-4 (Toll-like receptor 4). Statisztika: vs. kontroll: *p<0,05, **p<0,01; ***p<0,001; vs.

kezeletlen: +p<0,05, ++p<0,01; vs. első remisszió: #p<0,05; vs. relapszus: ×p<0,05.

sejt prevalencia a

jelzett populációban

kontroll kezeletlen

(hagyományos terápia előtt)

első remisszió (hagyományos

terápiára)

relapszus (IFX

terápia előtt)


előtt)


előtt) n (fiú/lány) 15 (6/9) 14 (6/8) 10 (4/6) 12 (5/7)

PBMC-ben NKT

1,39 [0,81-2,42]

0,70 [0,11- 1,33]*

0,74 [0,37- 1,34]

0,72 [0,45-1,23]

0,73 [0,37-1,20]

0,83 [0,31-2,05]

PBMC-ben NK

3,17 [1,71-4,76]

1,73 [0,72- 3,49]*

1,98 [1,65- 2,97]

1,95 [0,72-4,81]

2,14 [0,66-4,78]

2,45 [1,26-4,85]

PBMC-ben DC

0,61 [0,10-2,15]

1,05 [0,54- 3,32]*

1,16 [0,58- 2,98]*

1,45 [1,09-3,46]*

0,86 [0,30-2,80]

0,82 [0,52-2,31]

DC-ben mDC

46,04 [37,14-52,30]

61,66 [45,37- 72,74]**

45,19 [37,83- 56,68]+

69,01 [40,11-

74,79]*, #

60,01 [48,03-68,50]*

57,39 [37,19-

64,14]*, ×

DC-ben pDC

27,38 [20,65-33,94]

19,26 [15,08- 24,58]*

21,61 [14,76- 32,61]*

18,33 [16,59-26,42]*

19,03 [17,26-32,38]

27,39 [19,68-36,70]×

mDC / pDC arány

1,85 [0,44-1,46]

3,05 [2,32-

6,11]***

2,35 [1,80-

9,10] **, +

3,50 [1,74-

7,79]***

3,04 [2,03-

4,65]***

2,20 [1,66-

5,54]**, ×

DC-ben TLR-2

8,80 [4,14-17,35]

55,08 [37,27-

57,94]***

17,32 [6,32-

32,54]+

38,70 [19,31-

54,59]**, #

25,89 [5,69-60,43]

16,70 [2,29-

42,61]×

DC-ben TLR-4

2,24 [0,90-2,78]

14,36 [6,26-

19,20]**

2,73 [1,35- 7,21]++

10,11 [2,29-

19,55]*, #

5,31 [2,81-13,42]

3,32 [0,10-6,05]×

PBMC-ben monocita

2,01 [1,38-3,82]

8,57 [3,82-

16,72]**

5,96 [2,49-

21,22]*, +

7,30 [2,65-

15,44]*

5,58 [2,78-17,52]*

5,31 [3,54-6,94]*

Monocitában TLR-2

16,44 [10,31-19,69]

29,65 [17,83- 39,77]*

20,92 [7,87-

29,15]+

20,63 [7,05-29,01]

19,89 [13,13-29,32]

18,52 [10,29-28,96]

Monocitában TLR-4

7,17 [0,45-14,73]

14,59 [3,01-

35,23]*

4,43 [1,82- 8,31]+

10,39 [2,10-26,54]

8,26 [2,71-17,56]

6,30 [2,48-18,94]

Eredmények

61. oldal

Eredmények

62. oldal

13. ábra (ld. az előző oldalon) A veleszületett immunitás sejtes elemeinek prevalenciája Crohn

beteg gyermekekben (Whiskers box-plot: középvonal a medián, a doboz az interkvartilisek, a

bajusz a tartományt jelöli). A (A) természetes ölő T sejtek (NKT, CD3+6b11+), (B) természetes

ölő sejtek (NK, CD3-CD161+), (C) dendritikus sejtek (DC, Lin1-HLA-DR+), (D) monociták

(CD14+), (E) Toll-like receptor 2 expresszáló DC és (F) Toll-like receptor 4 expresszáló DC-k

prevalenciája. Statisztika: vs. kontroll: *p<0,05, **p<0,01; ***p<0,001; vs. kezeletlen: +p<0,05,

++p<0,01; vs. első remisszió: #p<0,05; vs. relapszus: ×p<0,05.

Azokban a gyermekekben, akik relapszusban maradtak a hagyományos terápia

ellenére, az immunsejt fenotípus sokban hasonlított a kezeletlen CD-s gyermekekben

mérthez. Így tehát az adaptív immunsejtek közül ezekben a betegekben alacsonyabb

Th1, magasabb aktivált T sejt prevalenciát figyeltünk meg. A veleszületett

immunfenotípus tekintetében a relapszusos betegekben a magasabb monocita

prevalencia valamint TLR-2 és 4 expresszió szintén a kezeletlen betegekéhez volt

hasonló. A relapszusban lévő betegekben az mDC-k, akárcsak a TLR-2 és 4-et

expresszáló DC-k aránya, magasabb volt a remissziókban lévőkhöz képest.

Az IFX kezelés hatását két időpontban határoztuk meg (2 és 6 héttel a terápia

kezdete után). Az adaptív sejtek közül a Th1, aktivált T, és Treg prevalencia emelkedett

6 hét után. A veleszületett immunitás elemei közül a DC, mDC, pDC, monocita és a

TLR-2 és 4-et expresszáló DC-k és monociták prevalenciája normalizálódott a kezelés

hatására. Megjegyzendő, hogy 2 hét kezelés után szignifikáns eltéréseket nem, de a fent

részletezettekhez hasonló tendenciákat figyeltünk meg.

Eredmények

63. oldal

6.2. Cöliákia

A frissen diagnosztizált cöliákiásokban az adaptív immunitás elemei közül

alacsonyabb volt a CD4 limfociták prevalenciája a kontrollokéhoz képest, míg

magasabb a korai (CD69+) és késői (HLA-DR+) aktivációs markert expresszáló CD4

sejteké. Továbbá a Th1 populáció aránya szintén kisebb volt a friss cöliákiásokban.

11. táblázat Az adaptív immunitás elemeinek prevalenciája és arányai cöliákiásokban. Az

adatok medián [interkvartilis tartomány] formátumban vannak megadva. Rövidítések: GFD:

gluténmentes diéta; PBMC: perifériás vér mononukleáris sejtek; Th1 (T helper 1 elkötelezett,

CXCR3+), Th2 (T helper 2 elkötelezett, CCR4+), naív (CD45RA+), effektor (CD45RO+), korai

aktivációs markerek (CD25+ és CD69+), késői aktivációs markerek (CD62L+ és HLA-DR+),

Treg (regulátoros T sejtek, CD25hiFoxP3+). Statisztika: vs. kontroll: *p<0,05, **p<0,01;

***p<0,001; vs. friss cöliákiások: #p<0,05.

sejt prevalencia a szülő populációban

kontroll friss

cöliákiások diétázó cöliákiások

(GFD) n (fiú/lány) 15 (6/9) 10 (4/6)

PBMC-ben CD4+ 32,93

[28,07-35,86] 13,21

[11,85-22,97]* 20,34

[12,15-30,70]*, #

PBMC-ben CD8+ 16,71

[14,34-20,55] 15,80

[9,70-26,11] 13,59

[9,40-20,27]

CD4+ / CD8+ arány 2,05

[1,84-2,36] 0,87

[0,36-1,30]** 1,47

[0,87-1,74]#

CD4+-ben Th1 27,96

[19,41-34,46] 13,71

[2,87-27,48]* 23,06

[3,94-33,00]#

CD4+-ben Th2 9,13

[7,49-13,17] 9,92

[7,22-24,01] 8,27

[4,74-15,58]

Th1 / Th2 arány 3,61

[2,07-4,09] 1,20

[0,30-1,67]*** 1,96

[1,30-2,78]#

CD4+-ben naív 71,60

[67,94-80,23] 71,20

[45,83-81,35] 71,80

[61,83-75,31]

CD4+-ben effektor 19,88

[13,59-31,79] 19,60

[12,66-41,08] 17,82

[12,89-32,65]

naív/effektor arány 3,98

[1,85-5,57] 3,63

[1,25-4,64] 3,81

[2,08-4,42]

CD4+-ben CD25+ 11,71

[9,03-14,68] 11,66

[7,42-14,10] 11,19

[4,56-16,83]

CD4+-ben CD69+ 1,87

[1,76-2,08] 3,14

[2,11-4,59]* 1,80

[0,76-4,80]#

CD4+-ben CD62L+ 24,84

[17,32-30,32] 5,28

[4,15-13,09]** 10,78

[2,40-22,90]*,#

CD4+-ben HLA-DR+ 2,57

[1,88-3,40] 5,05

[3,33-8,58]* 5,67

[2,90-22,17]*

CD4+-ben Treg 2,44

[1,86-3,55] 2,97

[2,38-4,70] 3,52

[2,85-5,58]

Eredmények

64. oldal

Eredmények

65. oldal

14. ábra (ld. az előző oldalon) Az adaptív immunitás sejtjei és korrelációi cöliákiásokban. Az

(A) T helper limfociták (Th, CD4+), (B) Th1 elkötelezett limfociták (CXCR3+), (C) Korai

aktivációs markert expresszáló Th limfociták (CD69+), (D) Késői aktivációs markert

expresszáló Th limfociták (HLA-DR+), (E) CD4+ regulátoros T sejtek (Treg, CD25hiFoxP3+),

(F) Korreláció a T citotoxikus sejtek prevalenciája (Tc, CD8+) és a transzglutamináz szint (TG,

IgA, U/l) között diétázó cöliákiásokban (GFD), (G) Korreláció a korai aktivációs markert

expresszáló limfociták és TG szint között GFD-ben (H) Korreláció a késői aktivációs markert

expresszáló limfociták és TG szint között GFD-ben. Statisztika: vs. kontroll: *p<0,05, **p<0,01;

***p<0,001; vs. friss cöliákiások: #p<0,05.

12. táblázat A veleszületett immunitás elemeinek prevalenciája és arányai cöliákiásokban. Az

adatok medián [interkvartilis tartomány] formátumban vannak megadva. Rövidítések: GFD:

gluténmentes diéta; PBMC: perifériás vér mononukleáris sejtek; NK (természetes ölő sejtek,

CD3-CD161+); NKT (természetes ölő T sejtek, CD3+CD161+), iNKT (invariáns természetes ölő

T sejtek, CD3+6b11+), DC (dendritikus sejtek, Lin1-HLA-DR+), mDC (mieloid dendritikus

sejtek, CD11c+), pDC (plazmocitoid dendritikus sejtek, CD123+); monociták (CD14+); TLR-2

(Toll-like receptor 2); TLR-4 (Toll-like receptor 4). Statisztika: vs. kontroll: *p<0,05, **p<0,01;

***p<0,001; vs. friss cöliákiások: #p<0,05, ##p<0,01.

sejt prevalencia a szülő populációban

kontroll friss

cöliákiások diétázó cöliákiások

(GFD) n (fiú/lány) 15 (6/9) 10 (4/6)

PBMC-ben NK 5,13

[3,62-7,79] 2,50

[0,96-3,96]** 2,49

[1,87-4,36]*

PBMC-ben NKT 2,18

[1,51-3,85] 0,89

[0,22-2,73]* 0,77

[0,38-2,27]*

PBMC-ben iNKT 0,61

[0,40-0,83] 0,40

[0,12-0,62]* 1,12

[0,57-1,37]*,##

PBMC-ben DC 1,49

[1,21-2,45] 4,37

[3,53-12,54]** 5,12

[3,58-7,36]*

PBMC-ben mDC 16,14

[11,25-24,27] 31,27

[17,83-41,61]* 19,00

[13,08-25,09]#

PBMC-ben pDC 11,61

[6,25-16,96] 7,91

[4,97-12,23] 3,95

[2,55-12,38]

mDC / pDC arány 1,72

[1,22-2,01] 3,94

[2,75-6,72]** 3,56

[1,61-5,20]

DC-ben TLR-2+ 3,99

[2,30-11,86] 27,10

[19,15-44,50]*** 24,32

[17,78-41,39]**

DC-ben TLR-4+ 2,90

[1,23-5,75] 9,08

[5,41-12,84]* 7,84

[4,10-9,13]

PBMC-ben monociták 1,69

[1,22-2,84] 2,65

[0,44-3,58] 2,33

[0,56-4,17]

monocitákban TLR-2+ 28,53

[23,93-31,85] 58,98

[50,05-70,16]*** 53,64

[35,41-64,25]*

monocitákban TLR-4+ 5,40

[2,90-19,85] 23,39

[14,54-30,77]* 13,04

[7,91-27,30]

Eredmények

66. oldal

Eredmények

67. oldal

15. ábra (ld. előző oldalon) A veleszületett immunitás sejtjei és korrelációi cöliákiásokban

(Whiskers box-plot: középvonal a medián, a doboz az interkvartilisek, a bajusz a tartományt

jelöli). Az (A) Invariáns természetes ölő sejtek (iNKT, CD3+6b11+), (B) Természetes ölő sejtek

(NK, CD3-CD161+), (C) Dendritikus sejtek (DC, Lin1-HLA-DR+), (D) Mieloid DC-k (mDC,

CD11c+), (E) Toll-like receptor (TLR) 2 expresszáló DC-k, (F) TLR-4 expresszáló DC-k, (G)

Korreláció a plazmocitoid DC-k (pDC, CD123+) és transzglutamináz szint (TG, IgA, U/l) között

diétázó cöliákiásokban (GFD), (H) Korreláció a TLR-2 expresszáló monociták (CD14+) és TG

szint között GFD-ben. Statisztika: vs. kontroll: *p<0,05, **p<0,01; ***p<0,001; vs. friss

cöliákiások: #p<0.05, ##p<0,01.

A frissen diagnosztizált, még nem diétázó cöliákiásokban a veleszületett

immunitás elemei közül az NK, NKT, iNKT prevalenciája alacsonyabb volt, a

kontrollokkal való összehasonlításkor. Másrészről azt tapasztaltuk, hogy DC-k, főleg az

mDC-k aránya magasabb volt a betegek egyénekben. Az APC-k TLR-2 és 4

expressziója szintén emelkedett volt a frissen diagnosztizált cöliákiásokban az

egészségesekhez képest.

A GFD-vel a tünetek megszűnte után az adaptív immunitás eltérései

normalizálódtak. A CD4 limfociták prevalenciája a Th1 elkötelezett sejtekkel együtt

emelkedett a diétázó cöliákiásokban. Mind a korai (CD69+), mind a késői (CD62L+)

aktivációs markert expresszáló limfociták prevalenciája pedig normalizálódott a

diétával.

Érdekes módon, a veleszületett immunitás sejtes elemeinek eltérései a diétázó

cöliákiásokban is megmaradtak, egyedül az APC-k TLR-4 expressziója

normalizálódott. Diétázó (GFD) gyermekekben a transzglutamináz (TG) IgA szintje, és

a CD8+, CD4+CD69+, CD4+HLA-DR+, pDC és TLR-2 expresszáló monociták

prevalenciája között fordított korreláció állt fönn.

Eredmények

68. oldal


Az AC-s betegekben kezdetben alacsonyabb volt a Treg (CD4+FoxP3+)

prevalencia és ezzel összhangban az abszolút sejtszám, mint a kontroll egyénekben. Az

AC-s gyermekekben a naív/effektor (CD4+CD45RA+/CD4+CD45RO+) sejtek aránya

magasabb volt, és az aktivált (CD4+CD25+) sejteké alacsonyabb az egészségesekhez

viszonyítva. Megfigyeltük, hogy kezdetben alacsonyabb volt a beteg gyermekekben a

Th1/Th2 elkötelezett limfociták (CD4+CXCR3+/CD4+CXCR4+), és ezzel összhangban

az IFN-γ/IL-4 citokinek aránya is.

13. táblázat A perifériás vérsejt számok, limfocita populációk és citokinek prevalenciája és

arányai hematokéziás betegekben. Az adatok medián [tartomány] formátumban vannak

megadva. Rövidítések: AC: allergiás kolitisz; PBMC: perifériás vér mononukleáris sejtek.

Statisztika: kezdetben vs. kontroll: *p<0,05; kezdetben vs. tünetmentesen: #p<0,05.

AC beteg gyermekek kontrollok

kezdetben tünetmentesen n (fiú/lány) 10 (7/3) 10 (8/2)

életkor (hónap) 5

[1,5-12] 4,5

[1-6,5] 6

[2-10]

fehérvérsejtszám (G/l) 7,30

[6,10-9,60] 11,60

[8,50-17,00]* 11,05

[7,50-12,40]

limfocitaszám (%) 45,90

[24,90-63,10] 62,50

[24,70-75,50]* 63,60

[46,10-74,10]*

CD4+ / PBMC (%) 31,60

[3,20-58,82] 29,19

[8,52-51,10] 35,16

[2,63-57,90]

CD4+FOXP3+ / CD4+ (%) 5,29

[2,23-7,96] 2,52

[1,56-9,60]* 7,46

[1,67-14,67]#

CD4+FOXP3+ (G/l) 0,26

[0,08-0,38] 0,14

[0,09-0,58]* 0,49

[0,16-0,86]#

CD4+CD25hi / CD4+ (%) 6,04

[2,10-8,33] 2,73

[0,89-4,12]* 7,93

[1,30-10,70]# CD4CXCR3+ / CD4CCR4+ (arány)

2,93 [1,00-5,42]

0,77 [0,42-3,80]*

0,85 [0,56-2,90]

IFN-γ / IL-4 (arány) 10,90

[9,40-20,43] 8,98

[8,24-9,59]* 10,19

[7,91-10,84] CD4+CD45RA+ / CD4+CD45RO+ (arány)

3,54 [1,18-6,17]

13,60 [1,12-29,49]*

10,00 [2,71-27,41]

CD4+CD25+ / CD4+ (%) 10,03

[4,83-21,24] 4,23

[1,89-10,38]* 8,83

[2,60-14,67]

CD4+CD62L+ / CD4+ (%) 7,84

[0,35-9,28] 4,10

[0,93-9,35] 6,84

[0,97-11,44]

Eredmények

69. oldal

16. ábra Az immunfenotípus változása hematokéziás gyermekekben (Whiskers box-plot:

középvonal a medián, a doboz az interkvartilisek, a bajusz a tartományt jelöli). Az (A)

Regulátoros T sejtek (CD4+Foxp3+) sejtek prevalenciája, (B) Th1/Th2 elkötelezett

(CD4CXCR3+/CD4CCR4+), (C) Naív/effektor (CD4+CD45RA+/CD4+CD45RO+) limfociták

aránya. Statisztika: kezdetben vs. kontroll: *p<0,05; kezdetben vs. tünetmentesen: #p<0,05.

A vizsgálat második felében az immunfenotípus változását az AC-s tünetek

megszűntével is meghatároztuk. Tünetmentes csecsemőkbe a Treg sejtek prevalenciája

normális szintre emelkedett. Bár a többi vizsgált sejtcsoport szignifikánsan nem

változott a kezdetben mérttől, de a Th1/Th2 elkötelezett sejtek és citokinek aránya

ekkor már nem különbözött a kontrollokéhoz képest.

Megbeszélés

70. oldal

7. Megbeszélés


Vizsgálatunk során a terápia naív, frissen diagnosztizált CD-s gyermekekben az

adaptív immunitás elemei közül a perifériás CD4+ sejtek prevalenciája nem különbözött

a kontrolloktól, hasonlóan a korábban felnőttekben leírtakhoz. [147,148] Ugyanakkor a

Th1/Th2 arány Th2 irányba tolódott el, hasonlóan mások által frissen diagnosztizált

gyermekek perifériás vérében [27,28,30], és biopsziás mintáiban találtakhoz [29]. A

felnőttkori eltérésekhez hasonlóan az aktivált CD4+ sejtek magasabb arányát, és ezzel

együtt az effektor/naív sejt hányados csökkenését lehetett megfigyelni. [14-18] Azt a

feltételezést, hogy ez az eltérés az alacsonyabb Treg számból adódik, nem lehetett

megerősíteni, mivel a FoxP3+ sejtek prevalenciája nem tért el a normálistól. Ez

ellentétben áll a terápia naív felnőttekben leírtakkal, ahol Treg szám csökkenést

figyeltek meg. [10] A különbség az életkori sajátosságok mellett abból adódhatott, hogy

a vizsgálatban a Treg sejtek nem CD25hi expresszió alapján, hanem a sokkal

specifikusabb FoxP3+ transzkripciós faktor révén lettek azonosítva.

Az eredményeink új adatokkal szolgáltak arról, hogy a veleszületett immunitás

milyen szerepet játszik a terápia naív CD-s gyermekekben leírt Th2 eltolódásban. Míg

néhány előző közlemény leírta, hogy a felnőttkori CD patomechanizmusában az NK és

NKT sejteknek szerepe lehet [19,66,149,150], addig adataink bizonyítják, hogy CD-s

gyermekekben az egészségeshez képest alacsonyabb az NK és NKT prevalencia. Ezzel

együtt az APC-k, így a monociták és DC-k prevalenciájának és az mDC/pDC arányának

a növekedése is megfigyelhető volt. Ezek a sejtek az immunválasz elindítói, és ezzel az

effektor vagy memória sejtek arányának a növekedéséhez járulhatnak hozzá. Ahogy a

legújabb adatok bizonyítják, az mDC és pDC szubpopulációknak sajátos szabályozó

szerepük van, mivel az mDC sejtek a citokin miliőtől függően az immunválaszt nem

csak Th1, hanem Th2 irányba is befolyásolhatják. [151] A pDC-knek ezzel szemben a

Treg sejtek indukciójában tulajdonítanak újabban nagyobb szerepet. [152] Így az

mDC/pDC arány növekedése hozzájárulhat a betegekben az alacsonyabb Th1/Th2

arányhoz. Továbbá az eredményeink alapján a TLR-2 és TLR-4 immunaktivációban

szerepet játszó markereket expresszáló monociták és DC-k prevalenciája is

Megbeszélés

71. oldal

megnövekedett frissen diagnosztizált beteg gyermekekben az egészséges kontrollokhoz

képest. Ez a megfigyelés összhangban van a munkacsoportunk által korábban terápia

naív CD-s gyermekek biopsziás mintáiban leírt magasabb TLR-2 és TLR-4

expresszióval. [32]

Vizsgálatunkban prospektíven került meghatározásra a betegség aktivitásának- és

immunfenotípusának a változása is. A hagyományos terápiára reagáló betegekben az

első remisszió alkalmával az adaptív immunsejt prevalenciák nagy része a PCDAI-vel

együtt normalizálódott. A Th1 prevalencia megnőtt a terápia naívokhoz képest és a

Th1/Th2 aránnyal együtt normalizálódott az első remisszió alkalmával, ezzel mutatván

különbséget a felnőttkori immunfenotípushoz viszonyítva. [6-9]

Remisszióban a veleszületett immunválaszt szabályozó NK és NKT sejtek aránya

megnövekedett, és a terápia naívokban a kontrollokéhoz képest mért eltérés eltűnt.

Ezzel szemben felnőttkori kezelt CD-ben az NK és NKT prevalenciáját korábban

alacsonyabbnak találták. [19,66,149,150] Mindemellett megállapítható, hogy az

mDC/pDC arány, és a TLR-2 és TLR-4-et expresszáló monociták és DC-k prevalenciája

normalizálódott a remisszió során. Gyermekekben ezek alapján a PCDAI csökkenésével

az immuneltérések nagy része normalizálódik. Ez eltérő a felnőttekben számos helyen

leírtakkal, a CD betegek idősebb populációjában ugyanis az aktivált és effektor T sejtek

prevalenciája magasabb marad a kezelés ellenére. [14-17,19,89] A Treg sejtek

feltehetően nem játszanak szerepet ebben a normalizációban, ugyanis prevalenciájuk

változatlan maradt a remisszióban.

Másik prospektív vizsgálatunkba tizenkét relapszusban lévő, a hagyományos

kezelésre nem reagáló CD-s gyermeket vontunk be, és kezeltünk IFX-el. Ezekben a

betegekben a szerzett és a természetes immunitás fenotípusa hasonló volt a kezelésben

nem részesültekéhez (leszámítva a normális NK és NKT arányokat).

Az IFX terápia során ugyanakkor a 6. héten markáns eltérések voltak a

relapszusos állapothoz képest, a Th1 és APC-k prevalenciája normalizálódott. Az

adaptív immunitás elemei közül érdekes módon, az aktivált T sejtek, memória sejtek, és

Treg-ek prevalenciája tovább emelkedett az IFX kezelés hatására. A Th1 elkötelezett

sejtek és citokinek arányának növekedését reumatoid arthritiszes betegekben már leírták

Megbeszélés

72. oldal

IFX kezelés hatására. [37,38] Mások szintén megfigyelték, hogy az IFX növeli az

aktivált és effektor T sejtek prevalenciáját. [36,37] Bár ennek a folyamatnak a pontos

magyarázata még nem ismert, de egy újabb feltételezés szerint az IFX gátolja a Th1 és

aktivált T sejtek vándorlását a gyulladásos területekre, ezáltal azok felszaporodnak a

perifériás vérben. [37,38] Elméletileg ez az immunfenotípus a fertőzések iránti

fogékonyságot növelheti. Ugyanakkor azt tapasztaltuk, hogy betegeink az IFX kezelés

alatt nem mutatták infekciók klinikai- és laboratóriumi jeleit. Érdekes módon, az IFX

kezelés a Treg számot is növelte a vizsgált betegekben. Ez a jelenség, aminek

feltehetően a magyarázata az, hogy a Treg sejtek ellenállóbbak az IFX indukálta

apoptózissal szemben, már ismert volt felnőtt CD betegek perifériás [10] és gyermekek

biopsziás mintáiban [35].

A veleszületett immunitás sejtes elemeinek, így a monocitáknak, mDC-knek,

TLR-2 és TLR-4-et expresszáló DC-knek a prevalenciája és az mDC/pDC sejteknek az

aránya normalizálódott az IFX kezeléssel. Az IFX kezelés természetes immunitásra

gyakorolt hatását korábban már RA-s és CD-s betegekben is felvetették. [39,41,42,153]

Megbeszélés

73. oldal

17. ábra Összefoglaló ábra a Crohn beteg gyermekekben talált perifériás immunfenotípus

változásokról. Kezeletlen CD betegekben az aktivált és effektor T sejtek prevalenciája

magasabb, míg a T helper 1 sejteké alacsonyabb. Hagyományos kezelés hatására mind az

aktivált és az effektor T sejtek aránya csökkent, mind pedig a T helper 1 sejtek aránya

emelkedett a kontroll értékek felé. Infliximab kezelés hatására a Th1 sejtek aránya szintén

emelkedett a normál szintre, de az effektor sejtek aránya is emelkedett tovább. A természetes ölő

és ölő T sejtek prevalenciája alacsonyabb betegekben, mint egészségesekben. A dendritikus

sejtek és monociták prevalenciája emelkedett kezeletlen betegekben, de mind a hagyományos,

mind pedig az infliximab kezelés hatására normalizálódik. Ugyanígy az emelkedett Toll-like

receptor expresszió is csökken a CD betegekben kezelés hatására. (A fehér nyíl a kezeletlen

betegekben talált eltéréseket mutatja az egészségesekhez képest, míg a szürke nyíl a

hagyományos vagy infliximab kezelés hatására bekövetkező hatásokat mutatja a kezeletlen vagy

a relapszusban találtakhoz képest.)

Megbeszélés

74. oldal

Eredményeink értékelése során nem szabad figyelmen kívül hagyni a korlátokat:

(1) Bár a párosított vizsgálatok korrekciót jelentettek az összehasonlítások számára, de a

többszörös összehasonlításokból eredendően megnövekedhetett az elsőfajú hiba aránya,

így a szignifikáns eredmények gyakorisága. (2) Perifériás immunsejt prevalenciákat

mértünk, amelyek nem feltétlenül tükrözik az intesztinális fenotípust. (3) Vizsgálatunk

során kapott immunológiai eltérések befolyásolhatták a betegpopuláció életkori

változásaiból eredő immunfenotípus-változások. Valamint az utánkövetés rövid

időtartama (10 hónap az első remisszióig, és 6 hét az IFX terápiáig) ezt a

hibalehetőséget minimálissá teszi.

A CD számos adaptív (csökkent Th1, emelkedett effektor és aktivált T sejt

prevalencia), és veleszületett (emelkedett DC, monocita és TLR-2, 4 expresszió)

immuneltéréssel járt. Ezeknek az adaptív és veleszületett immunfenotípus eltéréseknek

a nagy része a klinikai tünetek javulásával normalizálódott a hagyományos terápiára

reagálókban az első remisszió alkalmával, míg a hagyományos terápiára nem reagáló

relapszusban lévőkben az IFX kezelés hatására. Ezek a változások felvetik annak a

lehetőségét, hogy a gyermekkori CD-ben az immunfenotípus változások

összefüggésben állnak a betegség aktivitással.

7.2. Cöliákia

Frissen diagnosztizált cöliákiás gyermekekben számos eltérést figyeltünk meg az

adaptív immunitás sejtes elemei között. A CD4+ limfociták prevalenciája alacsonyabb

volt, a felnőttkori friss cöliákiás betegekhez hasonlóan. [53] Továbbá, a Th1/Th2

hányados csökkent a friss betegekben, hasonlóan a korábban leírtakhoz. [154] Ezek a

perifériás immunfenotípus változások eltérőek a biopsziás mintákban megfigyeltekkel,

amikben mások emelkedett limfocita és Th1 sejtszámot írtak le. [54,155] Előbbiek

alapján feltételezhető, hogy a perifériás csökkent sejtszám abból adódik, hogy az érintett

sejtpopuláció felszaporodik a mukozális kompartmentben. [156,157] Míg a

naív/memória sejtek aránya megegyezett a kontrollokéval, szemben a mások által

leírtakkal [56], addig az aktivált sejtek prevalenciája eltérő volt, attól függően, hogy

milyen aktivációs markert expresszáltak. A CD69 korai aktivációs marker expressziója

emelkedett és a késői aktivációs marker CD62L-t expresszáló limfociták aránya

Megbeszélés

75. oldal

alacsonyabb volt, megegyezően a korábban leírtakkal. [158,53,55,58] A CD25+ T

helper sejtek prevalenciája ugyanakkor megegyezett a vizsgált csoportokban,

ellentétben azzal, amit felnőttekben tapasztaltak. [53,55,57] Az aktivált limfociták

eltérései alátámasztják a szisztémás gyulladás jelenlétét cöliákiás kezeletlen betegekben,

és felvetik az adaptív immunitás szerepét. Eredményeink a felnőttekben találtakhoz

hasonlatosak, és azt mutatják, hogy a lokális immunmiliő és a perifériás

immunfenotípus között eltérések lehetnek. [156,157] Megjegyzendő, hogy vizsgálatunk

a FoxP3-at expresszáló Treg-ek perifériás prevalenciájában nem talált eltérést. Az eddig

gyermekekben ismert adatok ellentmondásosak, mivel nemrégiben nem találtak eltérést

a FoxP3+ Treg-ek számában [61], míg mások a CD4+CD25hi Treg-ek számának

csökkenését írták le [159]. Korábbi vizsgálatok alapján felnőttekben a FoxP3+ Treg

szám magasabbnak bizonyult. [160]

A frissen diagnosztizált, még nem diétázó cöliákiás gyermekekben a természetes

immunitás eltéréseit is leírtuk. Az egészségesekhez képest alacsonyabb NK, NKT,

iNKT prevalenciát tapasztaltunk, hasonlóan a mások által megfigyeltekkel. [53,65-67]

Az eddig ismertektől eltérően magasabb perifériás DC, és különösen mDC prevalencia

volt jellemző a betegekre. [68,161] Bár az mDC és Th1 prevalenciák között nem volt

összefüggés, de feltételezik, hogy az mDC-k hozzájárulhatnak a Th1/Th2 arány

megváltozásához. Nemrégiben az mDC-k által Th2 irányban történő differenciálódást is

leírták. [151] Másik fontos újdonság, hogy az APC-k általi TLR-2 és TLR-4 expresszió

fokozódását periférián is igazolni lehetett a cöliákiás betegekben, összhangban a

részben munkacsoportunktól származó korábbi biopsziás eredményekkel. [59,65,69]

Mivel a TLR-ek átmenetileg expresszálódnak aktiváció hatására, a fokozott

expressziójuk az APC-k folyamatos aktivációját bizonyítja, és így az adaptív

immunválasz fokozódásához is vezethetnek az aktivált CD4+ sejtek magasabb

prevalenciája révén.

Vizsgálatunk második részében a GFD hatása prospektíven az immunfenotípus

változását jellemeztük. A klinikai tünetek megszűntével, a TG szint minimálisra

csökkenésekor az adaptív immunsejtek közül a CD4, Th1, és az aktivált limfociták nagy

része, szintén normalizálódott. Érdekes módon, még a GFD diéta után is volt

összefüggés a TG valamint a CD8+, CD4+CD69+, és CD4+HLADR+ prevalenciák

Megbeszélés

76. oldal

között, ami alapján feltételezhető az immunrendszer kóros működése még GFD idején

is. [159,160] Az adaptív immunitás normalizációját már részben leírták, de nem

követéses vizsgálatokban, hanem eltérő egyénekből álló diéta előtti és diétázó

betegcsoportokban. [53,61,160] Eredményeink követéses vizsgálatból származtak, és

így az életkor változása befolyásolhatta az immunitás eltéréseit is. [162-164]

Ugyanakkor a 3 hónapos időtartam minimalizálhatja az ebből eredő hiba lehetőségét.

Érdekes módon a diétával járó adaptív immunváltozások nem jártak együtt a

veleszületett immunitás normalizálódásával. Az NK, NKT prevalencia csökkent, míg a

DC, TLR-2 és TLR-4-et expresszáló APC-k aránya emelkedett maradt. Ezzel együtt az

emelkedett TLR-2 és TLR-4-et expresszáló sejtek száma korrelált a maradék TG

szinttel, felvetve ezzel, hogy a tünetek megszűntével a veleszületett immunitás eltérései

továbbra is fennállhatnak. Ezek alapján a veleszületett immunitás dinamikájában eltérő

módon változik a GFD hatására, normalizációja lassabb lehet, szemben az adaptív

immunitáséval. Ezt a gondolatmenetet támasztja alá, hogy újonnan kórismézett

cöliákiásokban a γδT sejtek száma a diéta hatására nem normalizálódik [59], annak

ellenére, hogy GFD következtében megszűnik a boholyatrófia, normalizálódik a

korábban magas IEL szubpopulációk aránya, valamint a kóros Th1 citokinek

mennyisége. Ezzel összhangban, munkacsoportunk korábbi vizsgálataiban az újonnan

kórismézett cöliákiások mukozális biopsziás mintáiban a TLR-2 és TLR-4 fokozott

expressziója volt kimutatható, de meglepő módon ezek az eltérések a GFD után sem

normalizálódtak. [69] Mivel a γδT sejtek és a TLR-ek fontos szerepet töltenek be a

természetes immunitásban, feltételezhető, hogy cöliákiában a kezdeti noxa tartós

változásokat rögzíthet a veleszületett immunitás egyes elemeiben.

Megbeszélés

77. oldal

18. ábra Összefoglaló ábra a cöliákiás gyermekekben talált perifériás immunfenotípus

változásokról. Kezeletlen cöliákiásokban csökkent a CD4 limfociták prevalenciája, és

gluténmentes diéta hatására emelkedett. Ezzel egyidejúleg csökkent a T helper 1 elkötelezett

limfociták aránya, de emelkedett kezelés hatására. A korai aktivációs markert expresszáló CD4

sejtek prevalenciája magasabb, míg a későit expresszáló sejteké alacsonyabb, de közel

normalizálódik a kezeléssel. A természetes ölő és ölő T sejtek aránya alacsonyabb, és a kezelés

hatására csak az invariáns ölő T sejteké emelkedik. Ugyanígy az emelkedett dendritikus sejt, és

Toll-like receptor expresszió sem változik a kezelés hatására. (A fehér nyíl a kezeletlen

betegekben talált eltéréseket mutatja az egészségesekhez képest, míg a szürke nyíl a

gluténmentes kezelés hatására bekövetkező hatásokat mutatja a kezeletlen betegekhez képest.)

Összefoglalva, a gyermekkori cöliákiában mind az adaptív, mind a veleszületett

immunitás kóros fenotípusa jelen van. Az adaptív immunitás eltérései a GFD hatására

döntően normalizálódnak, de a természetes immunitás zavarai a tünetek megszűntével is

fennállhatnak.

Megbeszélés

78. oldal


A vizsgálatunkban bebizonyítottuk, hogy az AC (1) alacsonyabb Treg

prevalenciával, (2) a naív/memória sejtek arányának megnövekedésével, (3) az aktivált

T sejtek csökkenésével, és (4) a CD4+ limfociták Th2 irányába való eltolódásával jár.

Az AC tüneteinek megszűntével ezek az eltérések normalizálódtak. Ezek alapján

felvetődik annak a lehetősége, hogy a betegség hátterében az immunműködés zavara

állhat.

Az AC patomechanizmusa mind a mai napig nem ismert. [165] Korai vizsgálatok

AC-s gyermekekben a vastagbél epitéliumában a T sejtek megnövekedett számát [166],

és immunglobulin deficienciát [167] írtak le. A HC általában megszűnik az anyatejes

csecsemők esetében, amennyiben az édesanya elhagyja étrendéből a tehéntejet.

Ugyanakkor a legújabb vizsgálatok szerint a HC-s esetek majd 82%-a nem tehéntej

allergia, hanem más ételallergia miatt alakul ki. [72] Bár ezek alapján felmerül az

ételallergia jelentősége HC-s betegekben, egy friss tanulmány szerint az ételallergia

szűrővizsgálatok és a specifikus nutritív IgE mérések érdemben nem javítják a

diagnosztikus lehetőségeket. [72]

A mi vizsgálatunkban egyik gyermeknek sem volt tehéntej-allergiája, míg mind a

jellegzetes makroszkópikus (LNH, aftás lézió), és mikroszkópikus (eozinofília) leletek,

mind pedig az elementáris tápszerre adott pozitív reakció alátámasztotta az AC

diagnózisát. Olyan HC-s betegek kerültek bevonásra, akikben a tünetek egy hónap után

is fennálltak. Ezek alapján ki lehetett zárni az akut fertőzés, fisszúra lehetőségét,

endoszkópiával pedig a HC-val járó egyéb ritka okokat is.

Számos adat utal arra, hogy a Treg-eknek fontos szerepük lehet mind a

gyermekkori, mind pedig a felnőttkori ételallergia kialakulásában. [76] (Karlsson 2004)

Adataink szerint azonban az alacsonyabb Treg (CD4+FoxP3+) prevalencia mellett a

korai és késő aktiváció markereket (CD25+ és CD62L+) expresszáló, valamint az

effektor vagy memória sejtek (CD45RO+) aránya nem magasabb AC-s gyermekekben.

Ez az eltérés ellentmond annak, hogy a Treg sejtek az aktivált limfociták számát és

működését befolyásolnák. Az általunk megfigyelt immunfenotípus-eltérés ugyanakkor

jól beleillik a higiénia hipotézis kereteibe. [168] Valóban, a mikrobiális antigének jól

Megbeszélés

79. oldal

ismert indukálói a Treg differenciálódásnak, valamint a memória sejtek és T limfocita

aktivációnak. AC-s betegekben a Treg prevalenciának a memória és aktivált T sejtek

számával együtt való csökkenése az adaptív immunitás éretlenségét, a szuboptimális

antigén expozíció lehetőségét veti fel. [74] Ez az immunmechanizmus járulhat hozzá az

ugyancsak megfigyelt Th1/Th2 arány csökkenéséhez.

Elmondható, hogy újabb vizsgálatok alapján a gasztrointesztinális flóra és

bizonyos probiotikus baktériumoknak az ételallergiákban kifejtett jótékony hatása

részben a Treg indukció révén valósul meg. [169,170] A Lactobacillus reuteri és

Lactobacillus casei által indukált APC-k a Treg sejtek generációjához vezethetnek

[169], míg a szájon át adott probiotikumok egyértelműen a Treg szám növekedésével

járnak [170].

Az eredményeinek értékelése során figyelembe kell venni az alábbi korlátokat: (1)

A Treg sejteket a FoxP3 expresszió alapján azonosítottuk, ami a ma legelfogadottabb

markere ennek a sejtpopulációnak, és más meghatározási móddal ellentétben jól

reprodukálható. Ismert azonban, hogy létezhetnek FoxP3- Treg sejtek is. [171] (2) A

Treg célsejtek számának változásaiból indirekt módon lehet következtetni a Treg sejtek

megváltozott működésére, de direkt funkcionális vizsgálatokkal ezt meg kell erősíteni.

(3) Perifériás Treg prevalencia lett mérve, ezért a szisztémás immunváltozások kerültek

leírásra, ami bizonyos esetekben nem egyértelműen tükrözi a centrális eloszlást, vagy

akár azzal ellentétesen is alakulhat. [6] (4) Egyszerre volt jelen a Treg prevalencia

növekedése és a Th1/Th2 arány normalizálódása, de nem egyértelmű, hogy ok-okozati

összefüggéseiben melyik folyamat felelős a másikért. (5) A vizsgált betegek alacsony

száma a legfőbb korlátozó tényező, ezért a kapott eredmények további vizsgálatok

szükségességét hangsúlyozzák.

Amennyiben az AC valóban az ételallergia egy korai formájának bizonyul, és a

kialakulásában a higiénia hipotézis érvényesül, akkor a csecsemők antigén expozíciója

(orális vakcinákkal vagy probiotikumokkal) segíthetne a betegség kezelésében.

Megbeszélés

80. oldal

19. ábra Összefoglaló ábra a hematokéziás gyermekekben talált perifériás immunfenotípus

változásokról. A kezeletlen betegekben a regulátoros T sejtek, az aktivált, effektor és T helper 1

limfociták prevalenciája alacsonyabb volt. Tünetmentesen a regulátoros T sejtek prevalenciája

és T helper sejtek aránya normalizálódott. (A fehér nyíl a kezeletlen betegekben talált

eltéréseket mutatja az egészségesekhez képest, míg a szürke nyíl az elementáris tápszerre való

áttérés utáni tünetmentes állapotban bekövetkező változásokat a kezeletlen betegekhez

viszonyítva.)

Következtetések

81. oldal

8. Következtetések

(1) A frissen diagnosztizált Crohn beteg gyermekekben mind az adaptív, mind a

veleszületett immunitásért felelős sejtek prevalenciája jellegzetes eltéréseket mutat. A

Th1/Th2 arány Th2 irányba eltolódik, az effektor T sejtek, és aktivációs markereket

hordozó T limfociták prevalenciája magasabb. Az antigén prezentáló DC és monocita

sejtek, valamint a Toll-like receptor expressziójuk emelkedik a kezeletlen betegekben.

(2) A hagyományos terápiával kezelt Crohn betegekben az észlelt adaptív és

veleszületett immunfenotípus eltérések az első remisszió alkalmával a klinikai tünetek

javulásával normalizálódnak. Ugyanakkor a hagyományos terápiára nem reagáló

relapszusban lévőkben ezek az eltérések részben továbbra is fennállnak, és a

hagyományos terápiára remisszióba kerültekhez képest fokozódik az mDC prevalencia

és TLR expresszió.

(3) A hagyományos terápiára nem reagáló Crohn beteg gyermekekben az adaptív

és veleszületett immunitás elemei normalizálódnak az infliximab kezelés hatására. Az

infliximab kezelés ugyanakkor az adaptív immunitás elemei közül tovább fokozza az

effektor limfociták, T-helper 1 és regulátoros T sejtek prevalenciáját.

(4) A gyermekkori frissen diagnosztizált cöliákiában mind az adaptív, mind a

veleszületett immunitás fenotípusa eltér az egészségesétől. Az összes CD4, illetve Th1

sejtek prevalenciája csökken, míg ezzel egyidőben a korai aktivációs markert

expresszáló T sejtek aránya emelkedik, a késői sejteké pedig csökken. A természetes ölő

sejtek prevalenciája alacsonyabb, míg a DC és monocita sejtek, valamint ezek Toll-like

receptor expressziója magasabb a kezeletlen betegekben.

(5) Az adaptív immunitás eltérései, így a Th1 irányú eltolódás és az aktivált sejtek

aránya gluténmentes diéta hatására cöliákiás gyermekekben döntően normalizálódik, de

a természetes immunitás zavarai, az antigén prezentáló DC és monociták magasabb

prevalenciája a tünetek megszűntével is fennállnak.

Következtetések

82. oldal

(6) Allergiás kolitiszes csecsemőkben az elementáris tápszerre való áttérés előtt

kezdetben alacsonyabb regulátoros T sejt, T helper 1, effektor és aktivált limfocita

prevalencia figyelhető meg.

(7) Allergiás kolitiszes csecsemőkben a hematokézia megszűntével a regulátoros

T sejtek prevalenciája normalizálódik, valamint eltűnik a Th1/Th2 arányban mért

eltolódás is.

Összefoglalás

83. oldal

9. Összefoglalás

9.1. Összefoglaló

Bevezetés: A csecsemő- és gyermekkort érintő gasztrointesztinális kórképek közül

a Crohn betegséget, cöliákiát és allergiás kolitiszt vizsgáltuk. Mindhárom kórkép

immunmediálta megbetegedés, amelyeknek azonban pontos immunmechanizmusa nem

ismert. Mind az adaptív, mind a veleszületett immunitás sejtes elemei érintettek

lehetnek a betegségek kialakulásában, központi szerepben az egyik legfőbb szabályozó

sejtcsoporttal, a regulátoros T sejtekkel.

Célkitűzés: Olyan kis mintaigényű áramlási citométeres módszert kívántunk

kidolgozni, amely alkalmas a regulátoros T sejtek és sejtes környezetük vizsgálatára kis

mennyiségű perifériás vérmintából. Ezzel a módszerrel kívántuk jellemezni a csecsemő-

és gyermekkori gasztrointesztinális megbetegedéseket érintő immunfenotípus

változásokat.

Eredmények: Frissen diagnosztizált Crohn beteg gyermekekben a T helper 1

sejtek aránya csökken, és az aktivált és effektor T sejtek prevalenciája emelkedik.

Hagyományos kezelés hatására mind az aktivált és az effektor T sejtek aránya kisebb,

mind pedig a T helper 1 sejtek aránya nagyobb. Infliximab kezelés hatására a T helper 1

sejtek aránya szintén a normál szintre emelkedik, de az effektor sejtek aránya is tovább

emelkedik. A természetes ölő és ölő T sejtek prevalenciája alacsonyabb a betegekben,

mint az egészségesekben. A dendritikus sejtek és monociták prevalenciája magasabb

kezeletlen betegekben, de mind a hagyományos, mind pedig az infliximab kezelés

hatására ez normalizálódik. Ugyanígy Crohn betegekben, kezelés hatására az

emelkedett Toll-like receptor expresszió is lecsökken.

Kezeletlen cöliákiásokban csökken a CD4 limfociták prevalenciája, míg

gluténmentes diéta hatására emelkedik. Csökken a T helper 1 elkötelezett limfociták

aránya is, de emelkedik kezelés hatására. A korai aktivációs markert expresszáló CD4

sejtek prevalenciája megnő, míg a későit expresszáló sejteké lecsökken, de közel

normalizálódik a kezeléssel. Ugyanakkor a természetes ölő és ölő T sejtek aránya

alacsonyabb, de a kezelés hatására csak az invariáns ölő T sejteké emelkedik. Az

Összefoglalás

84. oldal

emelkedett dendritikus sejt, és Toll-like receptor expresszió sem változik a kezelés

hatására.

Az allergiás kolitiszes csecsemőkben az elementáris tápszerre való áttérés előtt

kezdetben alacsonyabb regulátoros T sejt, T helper 1, effektor és aktivált limfocita

prevalencia figyelhető meg Tünetmentes állapotban a hematokézia megszűntével a

regulátoros T sejtek prevalenciája és T helper sejtek aránya normalizálódik.

Következtetések A frissen diagnosztizált Crohn beteg gyermekekben a

felnőttekétől eltérő immunfenotípus eltérések vannak jelen. Az adaptív és veleszületett

immunitást is érintő eltérések a remisszióba kerültekben a hagyományos kezelés

hatására többnyire normalizálódnak, míg a relapszusban lévőkben csak infliximab

kezelés hatására változnak.

A még diétában nem részesült cöliákiás gyermekekben mind az adaptív, mind a

veleszületett immunitás fokozott aktivációja megfigyelhető. Gluténmentes diéta

hatására az adaptív immunitás sejtes elemei normalizálódnak, míg a veleszületett

immunsejtek eltérései továbbra is fennmaradnak.

Az allergiás kolitisz tüneteként jelentkező hematokézia csecsemőkben elementáris

tápszerre való váltással minden esetben megszűnik. A kezeletlen állapotban jelen lévő

allergiás típusú immunfenotípus az immunrendszer éretlenségére utal.

Összefoglalás

85. oldal

9.2. Summary

Background: Gastrointestinal diseases affecting the childhood such as Crohn’s

disease, celiac disease and allergic colitis were investigated. The pathomechanism of

these immunmediated diseases is not fully known. However, both the innate and

adaptive immunity including regulatory T cells, the main suppressor cell type can be

involved .

Aim: To develop a flow cytometry procedure to investigate the regulatory T cells

along with their cellular network in small children. To characterize immune phenotype

in pediatric gastrointestinal disorders.

Results: In newly diagnosed children with Crohn’s disease the prevalence of T

helper 1, activated and effector T cells increased. With conventional therapy the

prevalence of activated and effector T cells decreased, while that of T helper 1

increased. Infliximab therapy also normalized the T helper 2 shifts, but increased the

prevalence of effector cells. Natural killer and natural killer T cells were lower in

patients than in controls. The prevalence of dendritic cells and monocytes, particularly

of those expressing Toll-like receptor are increased in therapy-naïve patients, but

normalized with the conventional and biological therapy.

Untreated celiac patients had lower than normal CD4 lymphocyte prevalence and

T helper 1 ratio; these values increased with gluten-free diet. The prevalence of T

lymphocytes expressing early activation markers is increased, while that of expressing

late activation markers are decreased. These abnormalities were normalized in patients

on diet. In untreated celiac disease the numbers of natural killer and natural killer T cells

are decreased; on therapy just the prevalence of invariant natural killer T cells is

increased. The prevalence of antigen presenting dendritic cells including those

expressing Toll-like receptors is increased in children with celiac disease.

Allergic colitis presents with lower prevalence of regulatory T cells, and that of

activated, effector and T helper 1 lymphocytes. After the cessation of symptoms the

prevalence of regulatory T cells and T helper shift normalized.

Összefoglalás

86. oldal

Conclusions: The adaptive immune phenotype of children with newly diagnosed

Crohn’s disease is different than in adulthood. The alterations of cell prevalence values

of innate and adaptive immunity are ameliorated with conventional therapy, but in non-

responding patients only infliximab therapy had an impact on immune phenotype.

In untreated celiac patients the activation of innate and adaptive immune cells

were detected. On gluten-free diet, the prevalence of cells responsible for adaptive

immunity is normalized, but that of innate immune cells remained unaltered.

Allergic colitis leading in hematochezia responds to elementary formula. In

untreated patients immune phenotype resembles to that observed in allergic disorders.

Irodalomjegyzék

87. oldal

10. Irodalomjegyzék

1. Fábián P, Magasi P. Orvosi helyesírási szótár. Akadémiai Kiadó 1992.

2. Dubinsky M. Special issues in pediatric inflammatory bowel disease. World J

Gastroenterol. 2008;14:413-20.

3. Nieuwenhuis EE, Escher JC. Early onset IBD: what’s the difference? Dig Liver Dis.

2008;40:12-5.

4. Veres G. és a Magyar Gyermek IBD-regiszter részvevői: A magyarországi

gyermekkori gyulladásos bélbetegségek (IBD) regiszterének első éves (2007)

elemzése. Gyermekgyógyászat. 2008;59:282–287.

5. Shaoul R, Karban A, Reif S, Weiss B, Shamir R, Tamir A, Davidovich O, Halevi J,

Silver EL, Levine A. Disease behavior in children with Crohn's disease: the effect

of disease duration, ethnicity, genotype, and phenotype. Dig Dis Sci. 2009;54:142-

50.

6. Himmel ME, Hardenberg G, Piccirillo CA, Steiner TS, Levings MK. The role of T-

regulatory cells and Toll-like receptors in the pathogenesis of human

inflammatory bowel disease. Immunology. 2008;125:145-53.

7. Zenewicz LA, Antov A, Flavell RA. CD4 T-cell differentiation and inflammatory

bowel disease. Trends Mol Med. 2009;15:199-207.

8. van Lierop PP, Samsom JN, Escher JC, Nieuwenhuis EE. Role of the innate immune

system in the pathogenesis of inflammatory bowel disease. J Pediatr Gastroenterol

Nutr 2009; 48: 142-51.

9. Sartor RB. Mechanisms of disease: pathogenesis of Crohn's disease and ulcerative

colitis. Nat Clin Pract Gastroenterol Hepatol 2006;3:390-407.

10. Chamouard P, Monneaux F, Richert Z, Voegeli AC, Lavaux T, Gaub MP, Baumann

R, Oudet P, Muller S. Diminution of Circulating CD4+CD25 high T cells in naïve

Crohn’s disease. Dig Dis Sci. 2009;54:2084-93.

11. Maul J, Loddenkemper C, Mundt P, Berg E, Giese T, Stallmach A, Zeitz M,

Duchmann R. Peripheral and intestinal regulatory CD4+CD25(high) T cells in

inflammatory bowel disease. Gastroenterology. 2005;128:1868–78.

12. Saruta M, Yu QT, Fleshner PR, Mantel PY, Schmidt-Weber CB, Banham AH,

Papadakis KA. Characterization of FOXP3+CD4+ regulatory T cells in Crohn’s

Irodalomjegyzék

88. oldal

disease. Clin Immunol. 2007;125:281–90.

13. Makita S, Kanai T, Oshima S, Uraushihara K, Totsuka T, Sawada T, Nakamura T,

Koganei K, Fukushima T, Watanabe M. CD4+CD25bright T cells in human

intestinal lamina propria as regulatory cells. J Immunol. 2004;173:3119–30.

14. Roman LI, Manzano L, De La Hera A, Abreu L, Rossi I, Alvarez-Mon M.

Expanded CD4+CD45RO+ phenotype and defective proliferative response in T

lymphocytes from patients with Crohn's disease. Gastroenterology.

1996;110:1008-19.

15. Alkim C, Balci M, Alkim H, Dağli U, Parlak E, Tezel A, Ulker A. The importance

of peripheral immune cells in inflammatory bowel disease. Turk J Gastroenterol.

2007;18:82-8.

16. García de Tena J, Manzano L, Leal JC, San Antonio E, Sualdea V, Alvarez-Mon M.

Active Crohn's disease patients show a distinctive expansion of circulating

memory CD4+CD45RO+CD28null T cells. J Clin Immunol 2004;24:185-96.

17. Rose M, Hildebrandt M, Fliege H, Seibold S, Mönnikes H, Klapp BF. T-cell

immune parameters and depression in patients with Crohn's disease. J Clin


18. Liu ZX, Hiwatashi N, Noguchi M, Toyota T. Increased expression of costimulatory

molecules on peripheral blood monocytes in patients with Crohn's disease. Scand J


19. Senju M, Hulstaert F, Lowder J, Jewell DP. Flow cytometric analysis of peripheral

blood lymphocytes in ulcerative colitis and Crohn's disease. Gut. 1991;32:779-83.

20. Baumgart DC, Metzke D, Schmitz J, Scheffold A, Sturm A, Wiedenmann B,

Dignass AU. Patients with active inflammatory bowel disease lack immature

peripheral blood plasmacytoid and myeloid dendritic cells. Gut. 2005;54:228-36.

21. Baumgart DC, Thomas S, Przesdzing I, Metzke D, Bielecki C, Lehmann SM,

Lehnardt S, Dörffel Y, Sturm A, Scheffold A, Schmitz J, Radbruch A.

Exaggerated inflammatory response of primary human myeloid dendritic cells to

lipopolysaccharide in patients with inflammatory bowel disease. Clin Exp

Immunol. 2009;157:423-36.

22. Hart AL, Al-Hassi HO, Rigby RJ, Bell SJ, Emmanuel AV, Knight SC, Kamm MA,

Stagg AJ. Characteristics of intestinal dendritic cells in inflammatory bowel

Irodalomjegyzék

89. oldal

diseases. Gastroenterology. 2005;129:50-65.

23. Frolova L, Drastich P, Rossmann P, Klimesova K, Tlaskalova-Hogenova H.

Expression of Toll-like receptor 2 (TLR2), TLR4, and CD14 in biopsy samples of

patients with inflammatory bowel diseases: upregulated expression of TLR2 in

terminal ileum of patients with ulcerative colitis. J Histochem Cytochem.

2008;56:267-74.

24. Kamada N, Hisamatsu T, Honda H, Kobayashi T, Chinen H, Kitazume MT,

Takayama T, Okamoto S, Koganei K, Sugita A, Kanai T, Hibi T. Human CD14+

macrophages in intestinal lamina propria exhibit potent antigen-presenting ability.

J Immunol. 2009;183:1724-31.

25. Cantó E, Ricart E, Monfort D, González-Juan D, Balanzó J, Rodríguez-Sánchez JL,

Vidal S. TNF alpha production to TLR2 ligands in active IBD patients. Clin

Immunol. 2006;119:156-65.

26. Grimm MC, Pavli P, Van de Pol E, Doe WF. Evidence for a CD14+ population of

monocytes in inflammatory bowel disease mucosa--implications for pathogenesis.

Clin Exp Immunol. 1995;100:291-7.

27. Mack DR, Beedle S, Warren J, Davis J, Gross T. Peripheral blood intracellular

cytokine analysis in children newly diagnosed with inflammatory bowel disease.

Pediatr Res. 2002;51:328-32.

28. Holland N, Dong J, Garnett E, Shaikh N, Huen K, Harmatz P, Olive A, Winter HS,

Gold BD, Cohen SA, Baldassano RN, Kirschner BS, Heyman MB. Reduced

intracellular T-helper 1 interferon-gamma in blood of newly diagnosed children

with Crohn’s disease and age-related changes in Th1/Th2 cytokine profiles.

Pediatr Res. 2008;63:257-62.

29. Desreumaux P, Brandt E, Gambiez L, Emilie D, Geboes K, Klein O, Ectors N,

Cortot A, Capron M, Colombel JF. Distinct cytokine patterns in early and chronic

ileal lesions of Crohn’s disease. Gastroenterology. 1997;113:118-26.

30. Jo Y, Matsumoto T, Yada S, Fujisawa K, Esaki M, Onai N, Matsushima K, Iida M.

CCR4 is an up-regulated chemokine receptor of peripheral blood memory CD4+ T

cells in Crohn’s disease. Clin Exp Immunol. 2003;132:332-8.

31. Perminow G, Reikvam DH, Lyckander LG, Brandtzaeg P, Vatn MH, Carlsen HS.

Increased number and activation of colonic macrophages in pediatric patients with

Irodalomjegyzék

90. oldal

untreated Crohn’s disease. Inflamm Bowel Dis. 2009;15:1368-78.

32. Szebeni B, Veres G, Dezsõfi A, Rusai K, Vannay A, Mraz M, Majorova E, Arató A.

Increased expression of Toll-like receptor (TLR) 2 and TLR4 in the colonic

mucosa of children with inflammatory bowel disease. Clin Exp Immunol.

2008;151:34-41.

33. Diefenbach KA, Breuer CK. Pediatric inflammatory bowel disease. World J


34. Veres G, Baldassano RN, Mamula P. Infliximab therapy in children and adolescents

with inflammatory bowel disease. Drugs 2007;67:1703-23.

35. Ricciardelli I, Lindley KJ, Londei M, Quaratino S. Anti tumour necrosis-alpha

therapy increases the number of FOXP3 regulatory T cells in children affected by

Crohn’s disease. Immunology. 2008;125:178-83.

36. Ferkolj I, Ihan A, Markovic S, Veceric Z, Pohar M. Infliximab reduces the number

of activated mucosal lymphocytes in patients with Crohn’s disease. J

Gastrointestin Liver Dis. 2006;15:231-5.

37. Aeberli D, Seitz M, Jüni P, Villiger PM. Increase of peripheral CXCR3 positive T

lymphocytes upon treatment of RA patients with TNF-alpha inhibitors.

Rheumatology (Oxford). 2005;44:172-5.

38. Maurice MM, van der Graaff WL, Leow A, Breedveld FC, van Lier RA, Verweij

CL. Treatment with monoclonal anti-tumor necrosis factor alpha antibody results

in an accumulation of Th1 CD4+ T cells in the peripheral blood of patients with

rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 1999;42:2166-73.

39. Richez C, Schaeverbeke T, Dumoulin C, Dehais J, Moreau JF, Blanco P. Myeloid

dendritic cells correlate with clinical response whereas plasmacytoid dendritic

cells impact autoantibody development in rheumatoid arthritis patients treated

with infliximab. Arthritis Res Ther. 2009;11:R100.

40. Balanescu A, Radu E, Nat R, Regalia T, Bojinca V, Ionescu R, Balanescu S, Savu

C, Predeteanu D. Early and late effect of infliximab on circulating dendritic cells

phenotype in rheumatoid arthritis patients. Int J Clin Pharmacol Res. 2005;25:9-

18.

41. Lügering A, Schmidt M, Lügering N, Pauels HG, Domschke W, Kucharzik T.

Infliximab induces apoptosis in monocytes from patients with chronic active

Irodalomjegyzék

91. oldal

Crohn’s disease by using a caspase-dependent pathway. Gastroenterology.

2001;121:1145-57.

42. Baert FJ, D’Haens GR, Peeters M, Hiele MI, Schaible TF, Shealy D, Geboes K,

Rutgeerts PJ. Tumor necrosis factor alpha antibody (infliximab) therapy

profoundly down-regulates the inflammation in Crohn’s ileocolitis.

Gastroenterology. 1999;116:22-8.

43. De Rycke L, Vandooren B, Kruithof E, De Keyser F, Veys EM, Baeten D. Tumor

necrosis factor alpha blockade treatment down-modulates the increased systemic

and local expression of Toll-like receptor 2 and Toll-like receptor 4 in

spondylarthropathy. Arthritis Rheum. 2005;52:2146-58.

44. Cho JH. The genetics and immunopathogenesis of inflammatory bowel disease. Nat

Rev Immunol. 2008;8:458-66.

45. Schuppan D, Junker Y, Barisani D. Celiac disease: from pathogenesis to novel

therapies. Gastroenterology. 2009;137:1912-33.

46. Korponay-Szabó IR, Kovács JB, Czinner A, Gorácz G, Vámos A, Szabó T. High

prevalence of silent celiac disease in preschool children screened with IgA/IgG

antiendomysium antibodies. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 1999;28:26-30.

47. Bardella MT, Fredella C, Saladino V, et al. Gluten intolerance: gender- and age-

related differences in symptoms. Scand J Gastroenterol. 2005;40:15-9.

48. Thomson AB, Keelan M, Thiesen A, Clandinin MT, Ropeleski M, Wild GE. Small

bowel review: diseases of the small intestine. Dig Dis Sci. 2001;46:2555-66.

49. Ciccocioppo R, Di Sabatino A, Corazza GR. The immune recognition of gluten in

celiac disease. Clin Exp Immunol. 2005;140:408-16.

50. Maiuri L, Ciacci C, Ricciardelli I, et al. Association between innate response to

gliadin and activation of pathogenic T cells in celiac disease. Lancet. 2003;362:30-

7.

51. Koning F. Celiac disease: sandwiched between innate and adaptive immune

responses induced by gluten. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 2008;46:E8-9.

52. Green PH, Cellier C. Celiac disease. N Engl J Med. 2007;357:1731-43.

53. Di Sabatino A, Bertrandi E, Casadei Maldini M, Pennese F, Proietti F, Corazza GR.

Phenotyping of peripheral blood lymphocytes in adult celiac disease.

Immunology. 1998;95:572-6.

Irodalomjegyzék

92. oldal

54. León F, Sánchez L, Camarero C, Roy G. Cytokine production by intestinal

intraepithelial lymphocyte subsets in celiac disease. Dig Dis Sci. 2005;50:593-

600.

55. O'Keeffe J, Mills K, Jackson J, Feighery C. T cell proliferation, MHC class II

restriction and cytokine products of gliadin-stimulated peripheral blood

mononuclear cells (PBMC). Clin Exp Immunol. 1999;117:269-76.

56. Kerttula TO, Hällström O, Mäki M. Phenotypical characterization of peripheral

blood T cells in patients with celiac disease: elevation of antigen-primed

CD45RO+ T lymphocytes. Immunology. 1995;86:104-9.

57. Penttila IA, Gibson CE, Forrest BD, Cummins AG, LaBrooy JT. Lymphocyte

activation as measured by interleukin-2 receptor expression to gluten fraction 111

in celiac disease. Immunol Cell Biol. 1990;68:155-60.

58. Perticarari S, Prodan M, Fragonas E, Canova S, Presani G. CD69 expression on

alpha-gliadin-specific T cells in celiac disease. Eur J Histochem. 2002;46:13-22.

59. Arató A, Savilahti E, Tainio VM, Verkasalo M, Klemola T. HLA-DR expression,

natural killer cells and IgE containing cells in the jejunal mucosa of celiac

children. Gut. 1987;28:988-94.

60. Halstensen TS, Farstad IN, Scott H, Fausa O, Brandtzaeg P. Intraepithelial TcR

alpha/beta+ lymphocytes express CD45RO more often than the TcR

gamma/delta+ counterparts in celiac disease. Immunology. 1990;71:460-6.

61. Granzotto M, dal Bo S, Quaglia S, Tommasini A, Piscianz E, Valencic E, Ferrara F,

Martelossi S, Ventura A, Not T. Regulatory T-cell function is impaired in celiac

disease. Dig Dis Sci. 2009;54:1513-9.

62. Tiittanen M, Westerholm-Ormio M, Verkasalo M, Savilahti E, Vaarala O.

Infiltration of forkhead box P3-expressing cells in small intestinal mucosa in

celiac disease but not in type 1 diabetes. Clin Exp Immunol. 2008;152:498-507.

63. Vorobjova T, Uibo O, Heilman K. Increased FOXP3 expression in small-bowel

mucosa of children with celiac disease and type I diabetes mellitus. Scand J


64. MacDonald TT, Vossenkamper A, Di Sabatino A. Antigen presenting cells and T

cell interactions in the gastrointestinal tract. Mol Nutr Food Res. 2009;53:947-51.

65. Bernardo D, van Hoogstraten IM, Verbeek WH, et al. Decreased circulating iNKT

Irodalomjegyzék

93. oldal

cell numbers in refractory celiac disease. Clin Immunol. 2008;126:172-9.

66. Grose RH, Thompson FM, Cummins AG. Deficiency of 6B11+ invariant NK T-

cells in celiac disease. Dig Dis Sci. 2008;53:1846-51.

67. van der Vliet HJ, von Blomberg BM, Nishi N, et al. Circulating V(alpha24+)

Vbeta11+ NKT cell numbers are decreased in a wide variety of diseases that are

characterized by autoreactive tissue damage. Clin Immunol. 2001;100:144-8.

68. Vuckovic S, Withers G, Harris M. Decreased blood dendritic cell counts in type 1

diabetic children. Clin Immunol. 2007;123:281–288.

69. Szebeni B, Veres G, Dezsofi A, et al. Increased mucosal expression of Toll-like

receptor (TLR)2 and TLR4 in celiac disease. J Pediatr Gastroenterol Nutr.

2007;45:187-93.

70. Machida HM, Catto Smith AG, Gall DG, et al. Allergic colitis in infancy: clinical

and pathologic aspects. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 1994;19:22-6.

71. Martorell A, Plaza AM, Boné J, Nevot S, García Ara MC, Echeverria L, Alonso E,

Garde J, Vila B, Alvaro M, Tauler E, Hernando V, Fernández M. Cow’s milk

protein allergy. A multi-centre study: clinical and epidemiological aspects.

Allergol Immunopathol (Madr). 2006;34:46-53.

72. Arvola T, Ruuska T, Keränen J. Rectal bleeding in infancy: clinical, allergological,

and microbiological examination. Pediatrics. 2006;117:e760-8.

73. Eigenmann PA. Mechanisms of food allergy. Pediatr Allergy Immunol. 2009;20:5-

11.

74. Prioult G, Nagler-Anderson C. Mucosal immunity and allergic responses: lack of

regulation and/or lack of microbial stimulation? Immunol Rev. 2005;206:204-18.

75. Beyer K, Renz H, Wahn U, et al. Changes in blood leukocyte distribution during

double-blind, placebo-controlled food challenges in children with atopic

dermatitis and suspected food allergy. Int Arch Allergy Immunol. 1998;116:110-5

76. Karlsson MR, Rugtveit J, Brandtzaeg P. Allergen-responsive CD4+CD25+

regulatory T cells in children who have outgrown cow’s milk allergy. J Exp Med.

2004;199:1679-88.

77. Cox HE. Food allergy as seen by an allergist. J Pediatr Gastroenterol Nutr.

2008;47:S45-8.

78. Bischoff SC. Food allergy and eosinophilic gastroenteritis and colitis. Curr Opin

Irodalomjegyzék

94. oldal

Allergy Clin Immunol. 2010;10:238-45.

79. Cools N, Ponsaerts P, Van Tendeloo VFI, et al. Regulatory T Cells and Immune

Disease. Clin Dev Immunol. 2007;2007:89195-89206.

80. Corthay A. How do regulatory T cells work? Scand J Immunol. 2009;70:326-36.

81. Sakaguchi S, Miyara M, Costantino CM, Hafler DA. FOXP3+ regulatory T cells in

the human immune system. Nat Rev Immunol. 2010;10:490-500.

82. Piccirillo CA, Thornton AM. Cornerstone of peripheral tolerance: naturally

occurring CD4+CD25+ regulatory T cells. Trends Immunol. 2004;25:374-380.

83. Fehérvari Z, Sakaguchi S. Development and function of CD25+CD4+ regulatory T

cells. Curr Opin Immunol. 2004;16(2):203-208.

84. Chatenoud L, Bach JF. Adaptive human regulatory T cells: myth or reality? J Clin

Invest. 2006;116:2325-2327.

85. Fontenot JD, Rudensky AY. A well adapted regulatory contrivance: regulatory T

cell development and the forkhead family transcription factor Foxp3. Nat

Immunol. 2005;6(4):331-337.

86. Huehn J, Polansky JK, Hamann A. Epigenetic control of FOXP3 expression: the key

to a stable regulatory T-cell lineage? Nat Rev Immunol. 2009;9:83-9.

87. Banham AH. Cell-surface IL-7 receptor expression facilitates the purification of

FOXP3(+) regulatory T cells. Trends Immunol. 2006;27:541-4

88. Seddiki N, Santner-Nanan B, Martinson J, et al. Expression of interleukin (IL)-2 and

IL-7 receptors discriminates between human regulatory and activated T cells. J

Exp Med. 2006;203:1693-1700.

89. Liu W, Putnam AL, Xu-Yu Z, et al. CD127 expression inversely correlates with

FoxP3 and suppressive function of human CD4+ Treg cells. J Exp Med.

2006;203(7):1701-1711.

90. Hofmeister R, Khaled AR, Benbernou N, Rajnavolgyi E, Muegge K, Durum SK.

Interleukin-7: physiological roles and mechanisms of action. Cytokine Growth

Factor Rev. 1999;10:41-60.

91. Wing K, Sakaguchi S. Regulatory T cells exert checks and balances on self

tolerance and autoimmunity. Nat Immunol. 2010;11:7-13.

92. Vignali DA, Collison LW, Workman CJ. How regulatory T cells work. Nat Rev

Immunol. 2008;8:523-32.

Irodalomjegyzék

95. oldal

93. Takahashi T, Tagami T, Yamazaki S, Uede T, Shimizu J, Sakaguchi N, Mak TW,

Sakaguchi S. Immunologic self-tolerance maintained by CD25+CD4+ regulatory

T cells constitutively expressing cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4. J.

Exp. Med. 2000;192:303–310.

94. Dejean AS, Beisner DR, Ch'en IL, Kerdiles YM, Babour A, Arden KC, Castrillon

DH, DePinho RA, Hedrick SM. Transcription factor Foxo3 controls the

magnitude of T cell immune responses by modulating the function of dendritic

cells. Nat Immunol. 2009; 10:504-13.

95. Campbell DJ, Koch MA. Phenotypical and functional specialization of FOXP3(+)

regulatory T cells. Nat Rev Immunol. 2011;11:119-30.

96. Sakaguchi S. Naturally arising Foxp3-expressing CD25+CD4+ regulatory T cells in

immunological tolerance to self and non-self. Nat Immunol. 2005;6:345-352.

97. Wieckiewicz J, Goto R, Wood JK. T regulatory cells and the control of

alloimmunity: from characterisation to clinical application. Curr Opin Immunol.

2010;22: 662–668.

98. Joffre O, Santolaria T, Calise D, Al Saati T, Hudrisier D, Romagnoli P, van

Meerwijk JP. Prevention of acute and chronic allograft rejection with

CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T lymphocytes. Nat Med. 2008;14:88-92.

99. Riley JL, June CH, Blazar BR. Human T regulatory cell therapy: take a billion or so

and call me in the morning. Immunity. 2009;30:656-65.

100. Langier S, Sade K, Kivity S. Regulatory T cells: the suppressor arm of the immune

system. Autoimmun Rev. 2010;10:112-5.

101. Dranoff G. Cytokines in cancer pathogenesis and cancer therapy. Nat Rev Cancer.

2004;4:11-22.

102. Swiecki M, Colonna M. Unraveling the functions of plasmacytoid dendritic cells

during viral infections, autoimmunity, and tolerance. Immunol Rev.

2010;234:142-62.

103. Mahnke K, Bedke T, Enk AH. Regulatory conversation between antigen

presenting cells and regulatory T cells enhance immune suppression. Cell

Immunol. 2007;250:1-13.

104. Ito T, Yang M, Wang YH, Lande R, Gregorio J, Perng OA, Qin XF, Liu YJ, Gilliet

M. Plasmacytoid dendritic cells prime IL-10-producing T regulatory cells by

Irodalomjegyzék

96. oldal

inducible costimulator ligand. J Exp Med. 2007;204:105-15.

105. Houot R, Perrot I, Garcia E, Durand I, Lebecque S. Human CD4+CD25high

regulatory T cells modulate myeloid but not plasmacytoid dendritic cells

activation. J Immunol. 2006;176:5293-8.

106. Walker LS. Regulatory T cells overturned: the effectors fight back. Immunology.

2009;126:466-74.

107. Kulkarni R, Behboudi S, Sharif S. Insights into the role of Toll-like receptors in

modulation of T cell responses. Cell Tissue Res. 2011;343:141-52.

108. Lutz MB, Kurts C. Induction of peripheral CD4+ T-cell tolerance and CD8+ T-cell

cross-tolerance by dendritic cells. Eur J Immunol. 2009;39:2325-30.

109. Matta BM, Castellaneta A, Thomson AW. Tolerogenic plasmacytoid DC. Eur J

Immunol. 2010;40:2667-76.

110. Hubert P, Jacobs N, Caberg JH, Boniver J, Delvenne P. The cross-talk between

dendritic and regulatory T cells: good or evil? J Leukoc Biol. 2007;82:781-94.

111. Cole JE, Georgiou E, Monaco C. The expression and functions of toll-like

receptors in atherosclerosis. Mediators Inflamm. 2010;2010:393946.

112. Venet F, Pachot A, Debard AL, Bohe J, Bienvenu J, Lepape A, Powell WS,

Monneret G. Human CD4+CD25+ regulatory T lymphocytes inhibit

lipopolysaccharide-induced monocyte survival through a Fas/Fas ligand-

dependent mechanism. J Immunol. 2006;177:6540-7.

113. Nowak M, Stein-Streilein J. Invariant NKT cells and tolerance. Int Rev Immunol.

2007;26:95-119.

114. Ralainirina N, Poli A, Michel T, Poos L, Andrès E, Hentges F, Zimmer J. Control

of NK cell functions by CD4+CD25+ regulatory T cells. J Leukoc Biol.

2007;81:144-53.

115. Ghiringhelli F, Ménard C, Martin F, Zitvogel L. The role of regulatory T cells in

the control of natural killer cells: relevance during tumor progression. Immunol

Rev. 2006;214:229-38.

116. Zhang C, Zhang J, Tian Z. The regulatory effect of natural killer cells: do "NK-reg

cells" exist? Cell Mol Immunol. 2006;3:241-54.

117. Kohrt HE, Pillai AB, Lowsky R, Strober S. NKT cells, Treg, and their interactions

in bone marrow transplantation. Eur J Immunol. 2010;40:1862-9.

Irodalomjegyzék

97. oldal

118. La Cava A, Van Kaer L, Fu-Dong-Shi. CD4+CD25+ Tregs and NKT cells:

regulators regulating regulators. Trends Immunol. 2006;27:322-7.

119. Chaplin DD. Overview of the immune response. J Allergy Clin Immunol.

2010;125:S3-23.

120. Kindt T. J., Osborne B. A., Goldsby R. A. Kuby. Immunology 6th Edition 2007.

W. H. Freeman and Company. USA

121. Borish LC, Steinke JW. 2. Cytokines and chemokines. J Allergy Clin Immunol.

2003;111:S460-75.

122. Parkin J, Cohen B. An overview of the immune system. Lancet. 2001;357:1777-

89.

123. Borish LC, Steinke JW. 2. Cytokines and chemokines. J Allergy Clin Immunol.

2003;111:S460-75.

124. Zhang N, Bevan MJ. CD8(+) T cells: foot soldiers of the immune system.

Immunity. 2011;35:161-8.

125. Alam R, Gorska M. 3. Lymphocytes. J Allergy Clin Immunol. 2003;111:S476-85.

126. Shevach EM. Mechanisms of foxp3+ T regulatory cell-mediated suppression.

Immunity. 2009;30:636-45.

127. Sakaguchi S., Sakaguchi N., Asano M., Itoh M., and Toda M. Immunologic self-

tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor a-chains

(CD25). J Immunol. 1995;155,1151-1164.

128. Leguern C. Regulatory T cells for tolerance therapy: revisiting the concept. Crit

Rev Immunol. 2011;31:189-207.

129. IBD Working Group of the European Society for Paediatric Gastroenterology,

Hepatology and Nutrition. Inflammatory bowel disease in children and

adolescents: recommendations for diagnosis—the Porto criteria. J Pediatr

Gastroenterol Nutr. 2005;41:1-7.

130. Hyams JS, Ferry GD, Mandel FS, Gryboski JD, Kibort PM, Kirschner BS,

Griffiths AM, Katz AJ, Grand RJ, Boyle JT, et al. Development and validation of

a pediatric Crohn’s disease activity index. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 1991;12:

439-47.

131. Satsangi J, Silverberg MS, Vermeire S, Colombel JF. The Montreal classification

of inflammatory bowel disease: controversies, consensus, and implications. Gut

Irodalomjegyzék

98. oldal

2006; 55: 749-53

132. Mamula P, Markowitz JE, Baldassano RN. Inflammatory bowel disease in early

childhood and adolescence: special considerations. Gastroenterol Clin North Am.

2003;32:967-95.

133. Walker-Smith JA, Guandalini S, Schmitz J. Revised criteria for diagnosis of celiac

disease. Report of Working Group of European Society of Paediatric

Gastroenterology and Nutrition. Arch Dis Child. 1990;65:909-11.

134. Marsh M. Gluten, major histocompability complex and small intestine.

Gastroenterology. 1992;102:330–54.

135. Cseh Á, Bohács A, Müller V, Szalay B, Losonczy Gy, Tulassay T, Vásárhelyi B,

Tamási L. Az asztma megváltoztatja a perifériás dendritikus sejtarányt. Med

Thorac. 2010;63:358-362.

136. Cseh A, Bohács A, Szalay B, Losonczy G, Tulassay T, Vásárhelyi B, Tamási L.

Peripheral dendritic cells in asthma. J Investig Allergol Clin Immunol.

2010;20:533-5.

137. Cseh A, Molnár K, Pintér P, Szalay B, Szebeni B, Treszl A, Arató A, Vásárhelyi

B, Veres G. Regulatory T cells and T helper subsets in breast-fed infants with

hematochezia caused by allergic colitis. J Pediatr Gastroenterol Nutr.

2010;51:675-7.

138. Cseh A, Vasarhelyi B, Molnar K, Szalay B, Svec P, Treszl A, Dezsofi A, Lakatos

PL, Arato A, Tulassay T, Veres G. Immune phenotype in children with therapy-

naïve, remitted and relapsed Crohn’s disease. World J Gastroenterol.

2010;16:6001-9.

139. Cseh Á, Vásárhelyi B, Szalay B, Molnár K, Nagy-Szakál D, Treszl A, Vannay Á,

Arató A, Tulassay T, Veres G. Immune phenotype of children with newly

diagnosed and gluten-free diet-treated celiac disease. Dig Dis Sci. 2011;56:792-8.

140. Bohács A, Cseh A, Stenczer B, Müller V, Gálffy G, Molvarec A, Rigó J Jr,

Losonczy G, Vásárhelyi B, Tamási L. Effector and regulatory lymphocytes in

asthmatic pregnant women. Am J Reprod Immunol. 2010;64:393-401.

141. Mácsai E, Cseh A, Budai G, Mészáros G, Vásárhelyi B, Fischer K, Szabó A,

Treszl A. Effect of 3 months of doxazosin therapy on T-cell subsets in type 2

diabetic patients. J Int Med Res. 2009;37:1982-7.

Irodalomjegyzék

99. oldal

142. Abbas AK, Lichtman AH. Cellular and molecular immunology. Elsevier Science.

Philadelphia, 2003.

143. Farkas KM. Rizikófaktorok vizsgálata gyermekkori migrénformákban. Rektori

dolgozat, 2009.

144. Mészáros G, Toldi G. Sejtélettani folyamatok jellemzése áramlási citometriával.

Rektori dolgozat, 2010.

145. Bekő G. Multiplex szérum-citokinszint vizsgálatok jelentősége különböző

kórképekben. Doktori értekezés, 2009.

146. Brown JD. The use of multiple t tests in language research. TESOL Quarterly.

1990;24,770-773.

147. Selby WS, Jewell DP. T lymphocyte subsets in inflammatory bowel disease:

peripheral blood. Gut. 1983;24:99-105.

148. Yuan SZ, Hanauer SB, Kluskens LF, Kraft SC. Circulating lymphocyte

subpopulations in Crohn’s disease. Gastroenterology. 1983;85:1313-8.

149. van Ierssel GJ, van der Sluys Veer A, Verspaget HW, Griffioen G, van Hogezand

RA, Lamers CB. Contribution of plasma cortisol to corticosteroid-suppressed

peripheral blood natural killer cell activity in Crohn's disease. Immuno-

pharmacology 1995;29:11-17.

150. Kontiainen S, Scheinin T, Halme L. Number of activated T-helper cells and NK

cells in peripheral blood is decreased in severe Crohn's disease. APMIS

1996;104:355-361.

151. Kool M, Lambrecht BN. Dendritic cells in asthma and COPD: opportunities for

drug development. Curr Opin Immunol. 2007;19:701-10.

152. de Heer HJ, Hammad H, Kool M, Lambrecht BN. Dendritic cell subsets and

immune regulation in the lung. Semin Immunol. 2005;17:295-303.

153. De Rycke L, Vandooren B, Kruithof E, De Keyser F, Veys EM, Baeten D. Tumor

necrosis factor alpha blockade treatment down-modulates the increased systemic

and local expression of Toll-like receptor 2 and Toll-like receptor 4 in

spondylarthropathy. Arthritis Rheum. 2005;52:2146-58.

154. Mastrandrea F, Semeraro FP, Coradduzza G, et al. CD34+ hemopoietic precursor

and stem cells traffic in peripheral blood of celiac patients is significantly

increased but not directly related to epithelial damage severity. Eur Ann Allergy

Irodalomjegyzék

100. oldal

Clin Immunol. 2008;40:90-103.

155. Lahat N, Shapiro S, Karban A, Gerstein R, Kinarty A, Lerner A. Cytokine profile

in celiac disease. Scand J Immunol. 1999;49:441-6.

156. Saurer L, Mueller C. T cell-mediated immunoregulation in the gastrointestinal

tract. Allergy. 2009;64:505-19.

157. O'Donoghue DP, Lancaster-Smith M, Laviniere P, Kumar PJ. T cell depletion in

untreated adult celiac disease. Gut. 1976;17:328-31. O'Donoghue DP, Lancaster-

Smith M, Laviniere P, Kumar PJ. T cell depletion in untreated adult celiac disease.

Gut. 1976;17:328-31.

158. Kantele JM, Savilahti E, Westerholm-Ormio M, et al. Decreased numbers of

circulating plasmablasts and differences in IgA1-plasmablast homing to skin in

celiac disease and dermatitis herpetiformis. Clin Exp Immunol. 2009;156:535-41.

159. Agardh D, Lynch K, Brundin C, Ivarsson SA, Lernmark A, Cilio CM. Reduction

of tissue transglutaminase autoantibody levels by gluten-free diet is associated

with changes in subsets of peripheral blood lymphocytes in children with newly

diagnosed celiac disease. Clin Exp Immunol. 2006;144:67-75.

160. Frisullo G, Nociti V, Iorio R, et al. Increased CD4+CD25+Foxp3+ T cells in

peripheral blood of celiac disease patients: correlation with dietary treatment. Hum

Immunol. 2009;70:430-5.

161. Ciccocioppo R, Ricci G, Rovati B, et al. Reduced number and function of

peripheral dendritic cells in celiac disease. Clin Exp Immunol. 2007;149:487-96.

162. Weiskopf D, Weinberger B, Grubeck-Loebenstein B. The aging of the immune

system. Transpl Int. 2009;22:1041-50.

163. Aspinall R. Age-related changes in the function of T cells. Microsc Res Tech.

2003;62:508-13.

164. Verkasalo MA, Arató A, Savilahti E, Tainio VM. Effect of diet and age on jejunal

and circulating lymphocyte subsets in children with celiac disease: persistence of

CD4-8-intraepithelial T cells through treatment. Gut. 1990;31:422-5.

165. Lake AM. Food-induced eosinophilic proctocolitis. J Pediatr Gastroenterol Nutr.

2000;30:S58-60.

166. Ormälä T, Rintala R, Savilahti E. T cells of the colonic mucosa in patients with

infantile colitis. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 2001;33:133-8.

Irodalomjegyzék

101. oldal

167. Ojuawo A, St Louis D, Lindley KJ, et al. Non-infective colitis in infancy: evidence

in favour of minor immunodeficiency in its pathogenesis. Arch Dis Child.

1997;76:345-8.

168. Romagnani S. The increased prevalence of allergy and the hygiene hypothesis:

missing immune deviation, reduced immune suppression, or both? Immunology.

2004;112:352-63.

169. Smits HH, Engering A, van der Kleij D, et al. Selective probiotic bacteria induce

IL-10-producing regulatory T cells in vitroin vitro by modulating dendritic cell

function through dendritic cell-specific intercellular adhesion molecule 3-grabbing

nonintegrin. J Allergy Clin Immunol. 2005;115:1260-7.

170. de Roock S, van Elk M, van Dijk ME, et al. Lactic acid bacteria differ in their

ability to induce functional regulatory T cells in humans. Clin Exp Allergy.

2010;40:103-10.

Publikációk

102. oldal

11. Publikációk

11.1. A disszertáció alapjául szolgáló publikációk

Cseh Á, Vásárhelyi B, Szalay B, Molnár K, Nagy-Szakál D, Treszl A, Vannay Á, Arató

A, Tulassay T, Veres G: „Immune phenotype of children with newly diagnosed

and gluten-free diet-treated celiac disease” (Digestive Diseases and Sciences

2011;56:792-8. IF: 2,060)

Cseh A, Molnár K, Pintér P, Szalay B, Szebeni B, Treszl A, Arató A, Vásárhelyi B,

Veres G.: „Regulatory T cells and T helper subsets in breast-fed infants with

hematochezia caused by allergic colitis” (Journal of Pediatric Gastroenterology

and Nutrition 2010;51:675-7. IF: 2,180)

Cseh A, Vasarhelyi B, Molnar K, Szalay B, Svec P, Treszl A, Dezsofi A, Lakatos PL,

Arato A, Tulassay T, Veres G.: „Immune phenotype in children with therapy-

naïve, remitted and relapsed Crohn’s disease” (World Journal of Gastroenterolgy

2010;16:6001-9. IF: 2,240)

Összesített IF: 6,480

Publikációk

103. oldal

11.2. A disszertációhoz kapcsolódó publikációk

Cseh A, Bohács A, Szalay B, Losonczy G, Tulassay T, Vásárhelyi B, Tamási L:

„Peripheral dendritic cells in asthma” (Journal of Investigational Allergology and

Clinical Immunology 2010;20:533-5. IF: 1,489)

Bohács A, Cseh A, Stenczer B, Müller V, Gálffy G, Molvarec A, Rigó J Jr, Losonczy

G, Vásárhelyi B, Tamási L: „Effector and regulatory lymphocytes in asthmatic

pregnant women” (American Journal of Reproductive Immunology 2010;64:393-

401. IF: 2,451)

Mácsai E, Cseh A, Budai G, Mészáros G, Vásárhelyi B, Fischer K, Szabó A, Treszl A.:

„Effect of 3 months of doxazosin therapy on T-cell subsets in type 2 diabetic

patients” (The Journal of International Medical Research 2009;37:1982-7. IF:

0,938)

Cseh Á, Bohács A, Müller V, Szalay B, Losonczy Gy, Tulassay T, Vásárhelyi B,

Tamási L: „Az asztma megváltoztatja a perifériás dendritikus sejtarányt”

(Medicina Thoracalis 2010;LXIII:358-362.)


Publikációk

104. oldal

11.3. Egyéb publikációk

Vásárhelyi B, Cseh A, Kocsis I, Treszl A, Györffy B, Rigó J Jr.: “Three mechanisms in

the pathogenesis of pre-eclampsia suggested by over-represented transcription

factor-binding sites detected with comparative promoter analysis” (Molecular

Human Reproduction 2006;12:31-4. IF: 2,760)

Cseh Á. Oh., Rigó J. Jr. Dr.,Vásárhelyi B. Dr., Páli A. Oh., Győrffy B. Dr.: “Szerepet

játszanak-e a transzkripciós faktorok az endometriózis kialakulásában?” (Magyar

Nőorvosok Lapja 2007;70:183-186.)

Páli A., Arató A., Dezsőfi A., Cseh Á., Treszl A., Veress G., Szőnyi L.: „Wilson-kór

vagy epeút-elzáródás?” (Gyermekgyógyászat 2007;58:350-353.)

Gyorffy A, Baranyai Z, Cseh A, Munkácsy G, Jakab F, Tulassay Z, Gyorffy B.:

„Promoter analysis suggest, the implications of NFkB/C-REL transcription factors

in biliary atresia.” (Hepato-Gastroenterology 2008;55:1189-92. IF: 0,680)

Szebeni B., Sziksz E., Prókai Á., Gál K., Vannay Á., Cseh Á., Veres G., Dezsőfi A.,

Korponay Szabó I., Bodánszky H., Arató A.: “Fokozott szérum és glükokortikoid

regulált kináz-1 expresszió gyermekkori cöliákiában” (Gyermekgyógyászat

2009;60:67-73.)

Cseh A, Szebeni B, Szalay B, Vásárhelyi B.: “Az Akt enzim: új terápiás célpont rákban

és cukorbetegségben?” (Orvosi Hetilap 2009;150:373-8.)

Gyarmati B, Beko G, Szalay B, Cseh A, Vásárhelyi B, Treszl A.: „Maternal cytokine

balance on 3rd postpartum day is not affected by the mode of delivery after

healthy pregnancies” (The Journal of International Medical Research

2010;38:208-13. IF: 1,068)

Szebeni B, Vannay A, Sziksz E, Prókai A, Cseh A, Veres G, Dezsőfi A, Győrffy H,

Szabó IK, Arató A.: „Increased Expression of Serum- and Glucocorticoid-

Publikációk

105. oldal

regulated Kinase-1 in the Duodenal Mucosa of Children With Coeliac Disease” (J

Pediatr Gastroenterol Nutr 2010;50:147-53. IF: 2,180)

Szakál DN, Gyorffy H, Arató A, Cseh A, Molnár K, Papp M, Dezsofi A, Veres G.:

„Mucosal expression of claudins 2, 3 and 4 in proximal and distal part of

duodenum in children with coeliac disease.” (Virchows Archiv 2010;456:245-50.

IF: 2,336)

Gyarmati B, Szabó E, Szalay B, Cseh A, Czuczy N, Toldi G, Vásárhelyi B, Takáts Z.:

„Emelkedett hepcidinszint nőgyógyászati műtéteket követő harmadik napon”

(Orvosi Hetilap 2010;151:1790-4.)

Molnár K, Vannay Á, Szebeni B, Sziksz E, Cseh Á, Bánki NF, Dezsőfi A, Arató A,

Tulassay T, Veres G, Győrffy H, Lakatos PL, Papp M: „Intesztinális alkalikus

foszfatáz vizsgálata krónikus bélgyulladásban (IBD) szenvedő gyermekek

bélnyálkahártyájában” (Gyermekgyógyászat 2011;62:105-109.)

Gál K, Cseh A, Szalay B, Rusai K, Vannay A, Lukácsovits J, Heemann U, Szabó AJ,

Losonczy G, Tamási L, Müller V: „Effect of cigarette smoke and dexamethasone

on Hsp72 system of alveolar epithelial cells” (Cell Stress Chaperones. Epub ahead

of print. DOI: 10.1007/s12192-010-0249z IF: 3,162)

Gyarmati B, Szabó E, Szalay B, Czuczy N, Toldi G, Cseh Á, Vásárhelyi B, Takáts Z:

„Serum maternal hepcidin levels three days after delivery are higher compared to

those measured at parturition” (The Journal of Obstetrics and Gynaecology

Research. Accepted. IF: 0,869)


Köszönetnyilvánítás

106. oldal

12. Köszönetnyilvánítás

Köszönettel tartozom mindenek előtt Dr. Tulassay Tivadarnak Professzor Úrnak,

kutatócsoportunk vezetőjének, aki biztosította számomra a kutatómunka elvégzéséhez

szükséges szellemi műhelyt, és akinek az irányítása alatt működő kutatócsoport

tagjaként elsajátíthatattam a megfelelő kérdésfeltevés, módszerkeresés,

vizsgálattervezés technikáját, az adatok értékelésének és értelmezésének képességét.

Ez a munka nem jöhetett volna létre témavezetőm, Dr. Veres Gábor, valamint Dr.

Vásárhelyi Barna nélkül. Köszönöm, hogy mind szakmailag, mind emberileg mellettem

álltak, köszönöm a sok észrevételt, tanácsot, és a felbecsülhetetlen segítséget a

tudományos kutatói magatartás és gondolkodás elsajátításához.

Köszönettel tartozom Dr. Treszl Andrásnak, Dr. Szebeni Beátának és Dr. Vannay

Ádámnak, akik bevezettek a gyakorlati kutatómunka rejtelmeibe, és így fontos szerepet

vállaltak abban, hogy ez a munka megszülethessen.

Köszönöm továbbá Dr. Arató András Professzor Úrnak, Dr. Reusz György

Professzor Úrnak, és Dr. Szabó Attilának, akik ugyancsak felbecsülhetetlen módon

hozzájárultak ahhoz, hogy lehetőségem legyen eredményeinket mind hazai, mind

nemzetközi szinten is közzétenni.

Köszönöm a labor kutatóinak és PhD hallgató társaimnak, hogy olyan légkör

alakulhatott ki, amelyben mindannyiunknak lehetősége volt nemcsak szakmailag, de

emberileg is sokat fejlődni. Külön köszönettel tartozom Bernát Máriának vizsgálataim

során nyújtott felbecsülhetetlen technikai és emberi segítségéért, valamint az I. Sz.

Gyermekklinika valamennyi munkatársának, hogy segítő, baráti körülmények között

végezhettem doktori munkámat.

Végül, de nem utoljára, hálámat fejezem ki családtagjaimnak, különösképpen

Feleségemnek és Édesanyámnak, akiknek megértő türelmessége és féltő szeretete nélkül

ezeket az eredményeket nem érhettem volna el.

Documents

Regulátoros T sejtek és sejtes környezetük immunmediált … · 2012. 5. 15. · Regulátoros T sejtek és sejtes környezetük immunmediált gyermekkori gasztroenterológiai