Testes Bioquímicos e Quantificação

Relatório de Microbiologia

Componentes do grupo: Giuseppina Provenzano, Juliana Marinho, Letícia Adão, Stephanie

Medeiros e Victória Bárbara.

Turma; QM 171

Professores: Bárbara e Eliezer.

I) Introdução

A identificação e quantificação dos micro-organismos em determinado material é de

extrema importância, principalmente para a saúde pública. Os micro-organismos patogênicos são

responsáveis por diversas doenças, e, portanto, tal controle de qualidade deve ser usado para

impedir a propagação das mesmas para humanos e animais, através de alimentos, remédios etc,

além de plantas.

O primeiro método usado para identificação de micro-organismos é a microscopia

eletrônica. Com isso, identifica-se a morfologia e fisiologia dos mesmos e selecionam-se testes

específicos para as possíveis espécies, através de cultivos em determinados meios contendo

nutrientes previamente definidos. A partir destes testes é possível definir características

metabólicas, e, consequentemente, fazer a identificação da espécie.

Com relação à quantificação, os métodos se dividem em duas classes: os que quantificam o

número total de células, ou seja, as mortas e vivas, e os que quantificam o número de células

viáveis, ou seja, só as vivas. A microscopia também é usada para quantificar os micro-organismos.

É um método de contagem do número de células totais, a não ser que seja utilizada uma técnica de

coloração especial. Porém, para quantificar, a microscopia pode não ser confiável.

Para realizar os testes quantitativos, a amostra a ser contada deve ser diluída quase sempre,

pois, contam-se colônias, e, portanto, esse número não pode ser muito elevado nem muito baixo,

entre 30 a 300 colônias. Faz-se, então, diluições seriadas da amostra, tendo cautela para se obter o

número de colônias apropriadas. Alguns métodos não se utilizam da formação de colônias para

fazer a quantificação, mas sim uma relação mássica.

II) Objetivos

Inoculação de bactérias na placa de petri para fins de quantificação e realização de testes

bioquímicos, comparando os resultados com os dados de literatura.

III) Materiais e Métodos

Materiais

- Alça bacteriológica

- Alça de drigaslki

- Béquer com álcool 70%

- 5 placas de petri com ágar

- 5 placas de petri sem meio

- 6 tubos pequenos vazios

- Tubo com cultura da bactéria Escherichia coli

- Tubo com cultura da bactéria Pseudomonas

- 2 tubos pequenos com meio contendo vermelho de metila(MR)

- 2 tubos pequenos com meio específico para teste de fermentação voges- proskauer(VP)

- 2 tubos pequenos contendo ágar SIM

- 2 tubos pequenos com ágar lisina de ferro(LIA)

- 4 tubos pequenos com meio OF para glicose, estando dois dentre estes com óleo

mineral

- 2 tubos pequenos com meio OF para manitol, estando um com óleo mineral

Métodos

Testes Bioquímicos

- Ensaio de MR e VP

Primeiramente, ligou-se o bico de bunsen a fim de criar uma zona de segurança microbiológica.

Flambou-se a alça bacteriológica, esperou-se esfriar um pouco e mergulhou a mesma no meio de

cultura. Em seguida, abriu-se o tubo de MR, com o auxílio do dedo mínimo, e passou para este tubo

a cultura. O mesmo procedimento foi feito para os tubos VP, a técnica foi aplicada para ambas as

culturas de Escherichia coli e Pseudomonas.

- Ensaio com tubo ágar SIM

Primeiramente, ligou-se o bico de bunsen a fim de criar uma zona de segurança microbiológica.

Flambou-se a alça bacteriológica, esperou-se esfriar um pouco e mergulhou a mesma no meio de

cultura. Em seguida, abriu-se o tubo de ágar SIM, com o auxílio do dedo mínimo, e passou-se a

alçada com a cultura até o fundo do tubo. A técnica foi aplicada para ambas as culturas de

Escherichia coli e Pseudomonas.

- Ensaio com tubo ágar LIA

Ligou-se o bico de bunsen a fim de criar uma zona de segurança microbiológica. Flambou-se a

alça bacteriológica, esperou-se esfriar um pouco e mergulhou a mesma no meio de cultura. Em

seguida, abriu-se o tubo de ágar SIM, com o auxílio do dedo mínimo, e passou-se a alça com a

cultura por cima do meio sólido, e posteriormente, colocou-se a mesma alçada dentro do ágar. A

técnica foi aplicada para ambas as culturas de Escherichia coli e Pseudomonas.

- Ensaio com meio OF glicose

Trabalhando-se dentro da zona de segurança microbiológica, flambou-se a alça bacteriológica,

esperou-se esfriar um pouco e mergulhou a mesma no meio de cultura. Em seguida, abriu-se o tubo

de meio OF glicose, com o auxílio do dedo mínimo, e passou-se a alçada com a cultura até o fundo

do tubo. A técnica foi aplicada para ambas as culturas de Escherichia coli e Pseudomonas.

- Ensaio com meio OF manitol

Trabalhando-se dentro da zona de segurança microbiológica, flambou-se a alça bacteriológica,

esperou-se esfriar um pouco e mergulhou a mesma no meio de cultura. Em seguida, abriu-se o tubo

de meio OF manitol, com o auxílio do dedo mínimo, e passou-se a alçada com a cultura até o fundo

do tubo. Este teste foi realizado somente para a bactéria Pseudomonas.

Quantificação Microbiana

Para as técnicas que se seguem foi realizada, previamente, uma diluição do meio de cultura da

bactéria. Foram feitas seis diluições a partir da solução mãe. Pegou-se 1 mL da solução-mãe passou

para o tubo de diluição 10-1 , avolumando o mesmo, e posteriormente agitando o tubo.

Para a segunda diluição de 10-2, retirou-se 1 mL da diluição de 10-1, e passou-se para outro tubo

avolumando o mesmo. Este procedimento foi repetido, até chegar na diluição de 10-6.

- Técnica de Pour-Plate

Tomou-se 1 mL da diluição de 10-4 e passou-se para uma placa de petri; em seguida, pegou-se

duas placas de petri e colocou-se 1 mL da diluição de 10 -5. Fez-se o mesmo procedimento, porém

agora usando a diluição de 10-6.

Posteriormente, colocou-se o meio recém preparado com ágar por cima das diluições de cada

placa, dando uma leve balançada na mesma antes do ágar se solidificar.

- Técnica de Spread Plate

Em uma placa de petri com ágar, colocou-se 0,1 mL da diluição de 10 -4. Pegou-se uma alça de

drigalski, que estava mergulhada em um béquer com álcool 70%, passou a mesma três vezes no

fogo e espalhou o líquido por sobre o ágar. O procedimento foi repetido, tomando 0,1 mL das

diluições de 10-5 e 10-6 e colocando em quatro placas com ágar, sendo duas para cada diluição.

IV) Resultados e Discussão

Resultados: Quantificação Bacteriana

4.1) Resultados: Testes Bioquímicos

Meio Bactéria

Escherichia coli Pseudomonas

MR VP

MP - A parte superior do meio

se tornou vermelho

VP - A parte superior do meio

se tornou preta

MP - Não houve alterações

VP - A parte superior do meio

se tornou preta

SIM O meio tornou-se vermelho na

parte superior e ficou turvoNão houve alterações

LIA O meio tornou-se roxo O meio tornou-se roxo

Meio OF Glicose

Com óleo - O meio tornou-se

laranja - amarelado

Sem óleo - O meio tornou-se

laranja - - amarelado

Com óleo - O meio tornou-se

laranja - amarelado

Sem óleo - O meio tornou-se

laranja - - amarelado

Meio OF Manitol X

Com óleo - O meio tornou-se

laranja

Sem óleo - O meio tornou-se

laranja - - amarelado

4.1.1) Vermelho de Metila e Voges-Proskauer (MR VP)

Este teste avalia a via fermentativa realizada pela bactéria e contém os testes vermelho de

metila e Voges-Proskauer.

O teste vermelho de metila é um teste qualitativo para identificar se a bactéria produz

ácidos fortes (ácido acético, fórmico e lático) a partir da glicose através da via de fermentação de

ácido mista. Como é produzido um ácido, isso fará que o pH do meio se torne ácido. O vermelho de

metila, possui coloração vermelha em pH abaixo de 4,4 e coloração amarela em pH acima de 6,2.

Os meios em que foram inoculadas as bactérias possuíam a coloração amarelo claro (figura

1) Portanto, o resultado é positivo se houver a alteração da coloração do meio para vermelho e, a

permanência da coloração, negativo.

Figura 1. Meio MR Figura 2. MR Pseudomonas Figura 3. MR E. coli

Dessa forma a E. coli obteve um resultado positivo para o teste pois houve a mudança da

cor do meio para o vermelho(figura 3). Assim, a glicose inicialmente foi convertida a ácido

pirúvico e este sofreu uma fermentação ácida mista, havendo assim a formação de ácido. Desta

forma, o pH do meio diminuiu e houve a alteração da cor do indicador para o vermelho. Já para a

Pseudomonas, o resultado foi negativo, uma vez que não houve a alteração da coloração(figura 2)

Já o teste de Voges Proskauer diferencia os micro-organismos que realizam a fermentação

pela via butilenoglicólica da glicose. Nesse teste, quando o ácido pirúvico passar pela fermentação

pela via butilenoglicólica haverá a formação de acetoína (acetilmetilcarbinol).

Para revelar o resultado do teste, primeiramente, há a adição de KOH. Pois a acetoína é

oxidada a diacetil, pelo oxigênio atmosférico em ambiente constituído basicamente por hidróxido

de potássio. Em seguida, há a adição de α-naftol, e com isso o diacetil será convertido há um

complexo vermelho. Dessa forma, o resultado é positivo quando houver alteração da coloração do

meio para vermelho(figura 4).

Figura 4. meio VP Figura 5. VP E. coli Figura 6. VP Pseudomonas

Com a análise dos resultados, poderia-se concluir que para ambas as bactérias o resultado

foi negativo, uma vez que não houve a formação da coloração vermelha, a coloração gerada é

resultado da mistura dos reagentes utilizados(figuras 5 e 6).

Porém o resultado do teste é inconclusivo uma vez que não se há certeza de que os reagentes

estavam em condições adequadas para o uso. Mas na literatura é dito que ambas bactéricas possuem

resultados negativos, como foi obtido no teste. Porém se a bactéria analisada possuísse resultado

positivo, poderia se obter através do teste um resultado errôneo devido à condição do reagente.

4.1.2) Meio SIM

O Meio SIM é um teste bioquímico com base na motilidade dos micro-organismos e

produção de sulfeto e indol.

A produção de sulfeto permite verificar se a bactéria é capaz de degradar tiossulfato devido

possuir a enzima tiossulfato redutase. Nesta redução dos compostos de enxofre, haverá a formação

de ácido sulfídrico, que é incolor, porém este reagirá com o indicador que é o ferro, formando um

precipitado preto, devido à produção de sulfato ferroso. Como pode se observar nas reações abaixo:

Desta forma, o resultado positivo para a produção de sulfeto é o aparecimento de precipitado

preto no meio. Assim, ambas bactérias analisadas possuem resultado negativo, uma vez que em

ambos os teste não houve a formação de precipitado(figuras 8 e 9).

O meio SIM também permite verificar se há produção de indol. A produção de indol será

decorrente da ação da enzima triptofanase sobre o triptofano existente no meio, que pode ser

observado na reação abaixo:

Para ser identificada a produção de indol é adicionado o reagente de Kovacs, e o resultado

positivo será o aparecimento de uma coloração avermelhada.

Assim, a E. Coli possui resultado positivo (figura 8), uma vez que, o meio se tornou vermelho, o

que não ocorre com a Pseudomonas que teve o resultado para o teste negativo (figura 9).

A motilidade é observada através do aspecto do meio, em que verifica se a bactéria cresceu

apenas no local em que foi inoculada ou por todo o meio. Esse teste é verificado através da turbidez

do meio. A E. coli apresentou o meio turvo e a bactéria foi capaz de crescer por todo o meio,

possuindo portanto motilidade. Já a Pseudomonas teve resultado negativo, pois houve o

crescimento apenas no local aonde foi inoculada.

Figura 7. ágar SIM Figura 8. E. coli Figura 9. Pseudomonas

4.1.3) LIA (Lysine Iron Agar)

O meio LIA permite verificar se a bactéria possui a lisina descarboxilase (LDC). Esta enzima

atua descarboxilando a lisina presente nos aminoácidos. O meio contém o indicador púrpura de

bromocresol que apresenta coloração amarela em pH abaixo de 5,2 e roxo em pH acima de 6,8.

O meio inicialmente apresenta a coloração amarela, isso ocorre pois o meio contém glicose e com

isso há a fermentação da glicose e consequentemente a produção de ácido. Isso fará com que o pH

diminua e o meio apresente a coloração amarela.

Para a ação da enzima lisina descarboxilase é necessário que o meio esteja ácido, e isso é obtido

pela fermentação da glicose. As bactérias que possuem a enzima descarboxilam a lisina com a

formação de amina (cadaverina) que tornará o meio básico como se pode observar pelo esquema

abaixo:

Como o meio se tornará basico, haverá a viragem do indicador e o meio apresentará a coloração

roxa. Portanto, o resultado será positivo quando o meio apresentar a coloração roxa e negativo

quando este possuir a coloração amarela.

Figura 10. ágar LIA Figura 11. E. coli Figura 12. Pseudomonas

Dessa forma pôde-se observar que ambas as bactérias testadas conseguem descarboxilar a lisina, ou

seja, resultado negativo, pois ambas possuíam o meio com coloração roxa.

4.1.4) OF Glicose

O teste de fermentação de glicose tem por objetivo fazer a diferenciação bioquímica de

baseada na metabolização de carboidratos por via oxidativa ou fermentativa em sistema fechado

(com óleo, figura 14).

No tubo contendo E.coli (figura 15 e 16) a cor amarela do meio indica a mudança de pH do

meio de neutro (verde) para ácido (amarelo). A mudança no meio indica a formação de ácido

proveniente da degradação da glicose. A E.coli degradou a glicose tanto no tubo aberto quanto no

tubo selado com óleo impedindo a entrada de ar (figura 15 e 16). A partir destes resultados conclui-

se que a E.coli é anaeróbia facultativa, pois seu metabolismo funciona em ambientes com ou sem

oxigênio.

No tubo contendo a bactéria Pseudomonas observou-se o mesmo resultado, indicando que

esta também possui um metabolismo anaeróbio facultativo (figura 15 e 16).

Figura 13. meio OF Figura 14. OF com óleo Figura 15. OF E. coli Figura 16. OF com óleo

e Pseudomonas E. coli e Pseudomonas

respectivamente respectivamente

4.1.4) OF Manitol

O meio OF contendo manitol, tem por objetivo observar a capacidade de uma determinada

bactéria degradar este carboidrato tanto em ambiente aeróbio quanto anaeróbio (figuras 17 e 18).

A Pseudomonas apresentou capacidade de degradar este carboidrato tanto no tubo aberto

quanto no tubo selado com óleo, indicado pela cor amarela do meio indicando formação de ácido

(figura 19). Este resultado indica que a mesma é anaeróbia facultativa.

Figura 17. OF manitol Figura 18. OF Manitol com óleo Figura 19. Pseudomonas

4.2) Quantificação

A técnica de quantificação visa efetuar a contagem total de bactérias numa amostra. Para isto

são feitas diluições em série da amostra a ser inoculada no meio. No método “Pour-Plate” uma

alíquota de 1ml da amostra com os microrganismos é adicionada à uma Placa de Petri sem, o meio

de cultura, que será posteriormente por cima dos microrganismos na placa. Este método favorece o

crescimento de bactérias anaeróbias. Já na técnica “Spread-Plate” uma alíquota da amostra

contendo os microrganismos é adicionada ao meio de cultura e espalhada com o auxílio de uma alça

de Drigalski.

No método “Pour-Plate” realizado não foi possível quantificar o número de células

microbianas, uma vez que o estas cresceram muito próximas e aglomeradas, sendo portanto

considerado <300.

No método “Spread-Plate” também não foi possível quantificar o número de células

microbianas, pelo mesmo motivo citado acima. Portanto, o número considerado foi <300.

V) Conclusão

Não foi possível obter colônias isoladas em nenhum dos métodos aplicados e em nenhuma

das diluições efetuadas, sendo assim é necessário mais cuidado em relação a inoculação das placas,

evitando carregar e espalhar excesso de material microbiológico nesta.

Em relação aos testes bioquímicos, é muito importante correlacionar os dados experimentais

com os dados catalogados, para identificar se o microorganismo em questão. Todavia, alguns erros

podem ocorrer, uma vez que nem sempre os dados téoricos e experimentais vão coincidir. Caso isso

ocorra, deve-se averiguar a procedência dos reagentes e dos demais materiais e refazendo o teste

para tomar alguma conclusão.

VI) Bibliografia

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