รายงานสมมนาเร�อง

การวเคราะหหาปรมาณ Mitragynine ในปสสาวะของผท�ใชใบกระทอมโดยวธ High performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

ผใหสมมนา นา งสาวรสสคนธ ธนธระบรรจง รหสประจาตว 52312330

อาจารยท�ปรกษา ดร.ศรรตน ชสกลเกรยง

วนท�ใหสมมนา วนเสารท� 17 กรกฎาคม พ.ศ. 2553 สถานท� หอง 4205 อาคาร ว.4 เวลา 9.00-12.00 น.

วชา 510 701 สมมนาสาหรบนตวทยาศาสตร 1 ภาคตน ปการศกษา 2553

คานา

รายงานฉบบน เปนสวนหน�งของ วชาสมมนาสาหรบนตวทยาศาสตร 1 รหสวชา 510701

หลกสตรระดบปรญญามหาบณฑต คณะวทยาศาสตร สาขาวชานตวทยาศาสตร ภาคเรยนท� 1 ประจาปการศกษา 2553 โดยผจดทาไดทาการแปลและเรยบเรยงบทความตนฉบบภาษาองกฤษ เร�อง Quantitative analysis of mitragynine in human urine by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry จาก Journal of Chromatography B, 877 (2009) 2499–2505 เก�ยวกบการวเคราะหหาปรมาณ Mitragynine ในปสสาวะของผ ท�ใชใบกระทอมโดยวธ High performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

เน อหาของรายงานสมมนาฉบบน กลาวถง ในกรณท�มการใชกระทอมสามารถตรวจพบ ปรมาณของ Mitragynine ท�ตกคางอยในปสสาวะได ซ�งปรมาณท�นอยมากของ Mitragynine ในปสสาวะ สามารถตรวจไดโดยวธ High performance liquid chromatography รวมกบ Electrospray tandem mass spectrometry (HPLC-ESI/MS/MS) จากการทดลองใชสารละลาย Methyl t-butyl ether (MTBE) สกดเอา Mitragynine ออกมาและแยกวเคราะหสารผสมออกจากกนโดยใชคอลมน HILIC ซ�งเทคนค ESI/MS/MS ใหผลน ใช Triple quadrupole mass spectrometer ในการตรวจวเคราะหสารท�มประจบวก และใชโหมด Multiple reactions monitoring (MRM) ในงานวจยน Ajmalicine ซ�งมโครงสรางทางเคมคลายกบ Mitragynine ถกใชเปน Internal standard (IS) และคาการตรวจวเคราะหภายในวนเดยวกนและตางวนกนใหคาความแมนยาสง งานวจยน มความนาเช�อถอตามหลกเกณฑมาตรฐานเปนท�ยอมรบในระดบนานาชาต ขอขอบคณ อาจารย ดร.ศรรตน ชสกลเกรยง ท�กรณาชวยใหคาปรกษาแนะนา อาจารยดร. ศภชย ศภลกษณนาร และพ.ต.ท.กฤษฎา รบรวมทรพย ท�กรณาชวยใหขอเสนอแนะ ทาใหการสมมนาและรายงานฉบบน สมบรณ สาเรจลลวงไปดวยด ขอขอบคณผ เขารวมสมมนาทกทาน

ทายน ผจดทาหวงเปนอยางย�งวา รายงานฉบบน จะเปนประโยชนตอทานผอานท�มความ สนใจและตองการศกษาคนควา ตลอดจนเปนการเพ�มพนความรในเร�องดงกลาวไดไมมากกนอย

ผจดทา

นางสาวรสสคนธ ธนธระบรรจง

สารบญ

หนา คานา บทคดยอ 1. บทนา

ความเปนมาและความสาคญของปญหา 1-6 วตถประสงคของการวจย

2. การทดลอง 2.1 สารเคม 7 2.2 เคร�องมอท�ใชในการตรวจวเคราะห (LC-MS/MS) 8

2.3 ข นตอนการทา Mitragynine บรสทธn 9 2.4 การเตรยมสารละลายมาตรฐาน 10 2.5 การสกดตวอยางตรวจ 10

2.6 การทา Calibration 10-11

2.7 การพฒนาวธการทดลองและการควบคมคณภาพ 11 3.ผลการทดลองและการอภปราย

3.1 MS/MS optimization 12-15 3.2 การวเคราะหโดย LC 15-16

3.3 การประเมนผลการสกดดวย Liquid 17

3.4 การควบคมคณภาพและ Method validation 17-19 3.5 Application 19

4. สรป 20 ขอเสนอแนะ 21-22 เอกสารอางอง 23 วารสารการวจย Journal of Chromatography B, 877 (2009) 2499–2505 เอกสารประกอบการสมมนา

บทคดยอ

Mitragynine เปนสารอลคาลอยดหลกสาคญ ท�สกดจากใบของพชท�มช�อทางวทยาศาสตรวา Mitragyna speciosa Korth ซ�งพบในเอเชยตะวนออกเฉยงใต และในประเทศไทยเปนท�รจกกนโดยท�วไปในช�อวากระทอม เปนเวลาหลายศตวรรษแลวท�ใบกระทอมถกนามาใชประโยชนในการบาบดโรคและออกฤทธทางประสาทเพ�อชวยลดอาการเจบปวด เทยบไดกบสารจาพวกฝ� น ในกรณท�มการใชกระทอมสามารถn

ตรวจพบปรมาณของ Mitragynine ท�ตกคางอยในปสสาวะได ซ�งปรมาณท�นอยมากของ Mitragynine ในปสสาวะ สามารถตรวจไดโดยวธ High performance liquid chromatography รวมกบ Electrospray tandem mass spectrometry (HPLC-ESI/MS/MS) จากการทดลองใชสารละลาย Methyl t-butyl ether (MTBE) สกดเอา Mitragynine ออกมาและแยกวเคราะหสารผสมออกจากกนโดยใชคอลมน HILIC ซ�งเทคนค ESI/MS/MS ใหผลน ใช Triple quadrupole mass spectrometer ในการตรวจวเคราะหสารท�มประจบวก และใชโหมด Multiple reactions monitoring (MRM) ในงานวจยน Ajmalicine ซ�งมโครงสรางทางเคมคลายกบ Mitragynine ถกใชเปน Internal standard (IS) ของวธการทดลองท�ไดพฒนาข นมาน โดยในการวเคราะหปรมาณ Mitragynine ในปสสาวะ ท�ความเขมขน 3 ระดบ คอ 0.1, 1 และ 5 ng/ml ไดคา % Recovery เปน 90, 109 และ 98 และคา % RSD เปน 22, 12 และ 16 ตามลาดบ สวน Regression linearity ของ Mitragynine ซ�งทา Calibration ในชวงต งแต 0.01 ถง 5.0 ng/ml ใหผลคา Correlation coefficient มากกวา 0.995 โดยมคาขดจากดของการตรวจวด 0.02 ng/ml และคาการตรวจวเคราะหภายในวนเดยวกนและตางวนกนใหคาความแมนยาสง

Abstract

Mitragynine is the primary active alkaloid extracted from the leaves of Mitragyna speciosa Korth, a plant that originates in South-East Asia and is commonly known as kratom in Thailand. Kratom has been used for many centuries for their medicinal and psychoactive qualities, which are comparable to that of opiatebased drugs. Kratom abuse can lead to a detectable content of mitragynine residue in urine. Ultra trace amount of mitragynine in human urine was determined by a high performance liquid chromatography coupled to an electrospray tandem mass spectrometry (HPLC-ESI/MS/MS). Mitragynine was extracted by methyl t-butyl ether (MTBE) and separated on a HILIC column. The ESI/MS/MS was accomplished using a triple quadrupole mass spectrometer in positive ion detection and multiple reactions monitoring (MRM) mode. Ajmalicine, a mitragynine’s structure analog was selected as internal standard (IS) for method development. Quality control (QC) performed at three levels 0.1, 1 and 5 ng/ml of mitragynine in urine gave mean recoveries of 90, 109, and 98% with average relative standard deviation of 22, 12 and 16%, respectively. The regression linearity of mitragynine calibration ranged from 0.01 to 5.0 ng/ml was achieved with correlation coefficient greater than 0.995. A detection limit of 0.02 ng/ml and high precision data within-day and between days analysis were obtained.

1. บทนา

Mitragynine ช�อทางเคมคอ 9-methoxy-corynantheidine เปนสารอลคาลอยดหลกสาคญท�พบในพชกระทอม Mitragyna speciosa Korth ในประเทศไทยเปนท�รจกกนโดยท�วไปในช�อวากระทอม ( Shellard., 1974) ใบกระทอมไดถกนามาใชบรโภคตามทองถ�นในหลายประเทศของเอเชยตะวนออกเฉยงใต ประกอบดวย ประเทศไทย มาเลเซย และสหภาพพมา ต งแตกอนศตวรรษท� 19 เน�องจากพชกระทอมมฤทธบรรเทาปวด และออกฤทธกระตน n n (Babu et al., 2008) ในประเทศไทยกระทอมจดเปนยาเสพตดใหโทษประเภทท� 5 ตามพระราชบญญตยาเสพตดใหโทษ พ.ศ. 2522 ในใบกระทอมมสาร Mitragynine ทออกฤทธกระตนประสาทเชนเดยวกบใบโคคา ทาใหทางานไมเหนดเหน�อย ทนแดดn ไมรสกรอน และยงมฤทธกดn

ศนยประสาท เม�อกนจานวนมากทาใหประสาทมนชา เม�อเสพจนตดผวหนงจะดาเกรยมลกษณะเหมอนถกแดดจดเผา (พชกระทอมในสงคมไทย., 2548) สารสกดจากพชกระทอมน สามารถเคล�อนท�ผานเน อเย�อท�แบงก นระหวางระบบหมนเวยนเลอดกบสมอง (blood-brain barrier) เพ�อเขาไปออกฤทธท�ระบบประสาทn

สวนกลางได นอกจากน คณสมบตลดอาการเจบปวดของ Mitragynine ถกยบย งดวยการใชนาลอกโซน (naloxone) ซ�งเปนตวปดก นการกระตนท�ตวรบของสารฝ� น (opioid receptor) ท งหมด ผลดงกลาวน บงช วาการออกฤทธยบย งความรสกเจบปวดของ n Mitragynine มการกระตนท�ตวรบของสารฝ� น การคนพบน บงบอกวาการออกฤทธตอสมองคลายกบสารฝ� น n (Thongpradichote et al., 1998) กระทอมไดถกนามาใชเพ�อทดแทนฝ� น และในการรกษาอาการถอนยาของผ ท�ตดมอรฟน ( Takayama., 2004) สาหรบโครงสรางทางเมและคณสมบตทางเภสชวทยาของ Mitragynine น น ไดมการศกษาในลกษณะท�คลายๆกนเปนจานวนมาก(Thongpradichote et al., 1998) (Takayama., 2004) (Zacharias et al., 1965) (Takayama et al., 1995) เชนเดยวกบดานสารเสพตด ยาบรรเทาปวด และสารท�ทาใหเกดการกระตนท�เหมอนกนเน�องจากมการแยงจบกบ opioid receptors (Takayama et al., 2002) ไดมการศกษาการออกฤทธแกn

ปวด (antinociceptive action ) ของ Mitragynine พบวาการฉด Mitragynine เขาท�ชองทองหรอฉดโดยตรงเขาท�สมองของหนจะสามารถยบย งความเจบท�เกดจากการทดสอบดวยวธหนบหาง (tail-pinch test) และวธสมผสกบแผนความรอน (hot-plate test) (Matsumoto et al., 1996) Mitragynine ออกฤทธในn

สมองโดยอาศยการกระตนอยางเดนชดท�ตวรบของสารฝ� นชนด µ และ δ แตกมคาจาเพาะของการกระตนท�แตกตางไปจากมอรฟน (Thongpradichote et al., 1998) นอกจากการออกฤทธท�ตวรบของสารฝ� นในn

สมองแลว Mitragynine ยงออกฤทธลดความเจบปวดโดยการยบย งวถการสงความรสกเจบปวดไปสสมองn

ซ�งกคอการลด การรบรความเจบปวดน�นเอง โดย Mitragynine อาจอาศยกลไกท�เก�ยวของกบการลดรดบความแรงของการนาสญญาณประสาทเก�ยวกบความเจบ ปวดจากอวยวะท�มบาดแผลหรอถกกระแทกข นไปยงสมองเพ�อแปลผลเปนการรบรความเจบปวด ถาการนาสญญาณน ถกลดความแรงลงกจะทาใหสมองไดรบสญญาณนอยลง ซ�งจะทาใหมการแปลผลวาความรสกเจบน นลดนอยลงไปดวย โดยระบบท�เก�ยวของน จะมระบบเช�อมตอของกลมเซลประสาทท�เรยกวา descending noradrenergic system และ descending serotonergic system ท�ทาหนาท�ลดระดบการนาสญญาณประสาทของความรสกเจบลง

จากการศกษาผลของ Mitragynine พบวา Mitragynine สามารถออกฤทธผานการกระตนท� n descending noradrenergic system และ descending serotonergic system ในการลดอาการเจบปวด (Matsumoto et al., 1996) นอกจากน ยงมการศกษาผลของ mitragynine pseudoindoxyl เปรยบเทยบกบ mitragynine ในหลอดทดลองตอการหดตวของลาไสเลกและหลอดอสจของหนตะเภาเม�อกระตนดวยไฟฟาพบวา mitragynine pseudoindoxyl สามารถยบย งการหดตวของลาไสดดยขนาดของการตอบสนองจะแปรผนกบขนาดของสารท�ไดรบ โดย mitragynine pseudoindoxyl มความแรงในการออกฤทธมากกวา n mitragynine และมอรฟน 100 เทา และ 20 เทาตามลาดบ และสามารถตานฤทธไดดวย n naloxone ดงน น mitragynine pseudoindoxyl ออจออกฤทธในการยบย งการหดตวของกลามเน อเรยบของลาไสผานตวรบสารฝ� นชนด n

(µ-opioid receptor) นอกจากน mitragynine pseudoindoxyl ยงมฤทธใn นการยบย งการหดตวของกลามเน อเรยบในหลอดอสจ โดยมความแรงในการออกฤทธมากกวามอรฟน n 35 เทา และสามารถตานฤทธn

ดวย naltrindole จงเช�อวา mitragynine pseudoindoxyl อาจออกฤทธผานตวรบสารฝ� นชนด n (δ-opioid receptor) ซ�งเปนตวรบท�พบไดในกลามเน อเรยบของหลอดอสจ(Yamamoto et al., 1999) Mitragynine และสารท�คลายกนแสดงใหเหนวามผลยบย งในระบบการของเน อเย�อเซลประสาทในสตวทดลอง จากการศกษาผลของ Mitragynine กบเน อเย�อแบบนอกตวสตวทดลอง (in vitro study) โดยใชลาไสเลกสวนไอเลยม (ileum) ของหนตะเภา (guinea pig) เน อเย�อลาไสเลกท�นามาใชในการทดลองประกอบไปดวยกลามเน อเรยบท�มความไวตอการกระตนดวยกระแสไฟฟาใหหดตว ผลการศกษาน พบวา Mitragynine สามารถยบย งการหดตวของลาไสเลกท�เกดจากการกระตนดวยไฟฟาโดยมกลไกผานการทาหนาท�ของตวรบของสารฝ� น(Watanabe et al., 1997) Mitragynine มฤทธยบย งการหล�งกรดในกระเพาะอาหารn

(gastric secretion)ในหนขาว โดยฤทธน จะคลายกบฤทธของมอรฟนโดยออกฤทธผานตวรบสารฝ� น n n n

(Tsuchiya et al., 2002) นอกจาก Mitragynine ซ�งเปนอลคาลอยดท�เปนสารประกอบหลกแลว 7-hydroxymitragynine กเปนอกสารหน�งท�สกดไดจากพชกระทอมท�ถกนามาทดสอบ พบวา มฤทธลดอาการn

เจบปวดและมผลตอลาไสเลกสวนไอเลยมของหนตะเภาและในหนขาวท�มชวตดวยความแรงการออกฤทธท�n

สงกวามอรฟนและยงสามารถออกฤทธไดแมกระท�งn ใหทางปาก(Matsumoto et al., 2004) การคนพบน แสดงใหเหนวายงมสารอลคาลอยดท�เปนองคประกอบยอยท�สามารถออกทธไดดกวา n Mitragynine ท�เปนสารประกอบหลก

ถงอยางไรกตาม ในขณะน คณสมบตทางเภสทวทยาเปนส�งท�นาสนใจ แตงานในดานวธการตรวจวเคราะหเก�ยวกบ Mitragynine ยงมอยนอยมาก และขอมลของการศกษาวเคราะหของตวอยางตรวจในคนกเชนเดยวกน ปจจบนกระทอมมการแพรหลายไปท�ว สามารถหาไดงายทางอนเทอรเนต สะทอนใหเหนถงความตองการซ อ(demand) อยางกวางขวางในท�วโลก จากแนวโนมของการใชกระทอม บงช วากระทอมไมไดเปนสารเสพตดท�ถกควบคม ซ�งนาไปสการแทนท�ของสารเสพตดท�คลายกบมอรฟน เน�องจากการใชประโยชนของกระทอม ยงไมไดถกตดตาม ควบคมดแลกากบ โดยการสารวจตรวจสอบ จากหนวยงานดานสารเสพตดของชาตสวนใหญรวมท งสหรฐอเมรกา (Babu et al., 2008) (Assanangkornchai et al., 2007)

ไดมการรองขอจาก New York State Poison Control Center วา ควรมการเตอนประชาชนอยางเรงดวน พรอมท งมวธดาเนนการ เพ�อคนหาผใชสารน เน�องจากพบวาคนไขไมมการตอบสนองหลงจากใชกระทอม ในการศกษาวจยคร งน ไดอธบายถงความกาวหนาของวธการตรวจวเคราะหท�เหมาะสมใน bioanalytical การตรวจหาปรมาณท�นอยมากของ Mitragynine ท�มอยในตวอยางปสสาวะของผ ท�ใชใบกระทอม โดยวธ HPLC-ESI/MS/MS มสารหลายชนดไดถกพจารณาถงความเปนไปไดท�จะใชเปน Internal Standard (IS) ของวธการทดลองท�ไดพฒนาข นมาน ซ�งตวอยางของไอโซโทปท�ตดฉลากดวยชนดท�คลายกนจนถงสารประกอบเปาหมาย จะตองเลอกท�เหมาะสมท�สด อยางไรกตามเน�องจากไมมไอโซโทปท�ตดฉลากดวย Mitragynine ท�หาซ อได จงใช Ajmalicine ซ�งมโครงสรางทางเคมคลายกบ Mitragynine เปน Internal standard (IS) ใช Blank urine เปน matrix ทกคร งของวธการทดลองท�ไดพฒนาข นมาน การสกดโดยใชวธแบบของเหลว (Liquid extraction) ไดใส Mitragynine ลงไปเม�อทาการสกดเสรจแลว และใชตวทาลายหลายชนดเชน ethyl ether, ethyl acetate และ methyl t-butyl ether (MTBE) สาหรบการควบคมคณภาพ Quality control (QC) เปนส�งท�จาเปน ซ�งจากการทดลองน ไดแสดงใหเหนถงระบบของ background ท�ระดบต�า ความถกตองและความแมนยาสง ทาใหวธการทดลองท�ไดพฒนาข นน เปนทยอมรบตามหลกเกณฑมาตรฐาน

รป ท� (1 ก) โครงสรางทางเคมของ Mitragynine (9-methoxy-corynantheidine)

รป ท� (2 ก) ตนพชกระทอม

รปท� (2 ข) ลกษณะของใบกระทอมกานแดง รปท� (2 ค) ลกษณะของใบกระทอมกานขาว

รปท� (3 ก) ตวอยางพชกระทอมท�หาซอไดทาง Internet

รปท� (4 ก) ตวอยางเคร�อง High performance liquid chromatography coupled to an Electrospray tandem mass spectrometry (HPLC-ESI/MS/MS)

2. การทดลอง

2.1 สารเคม สารเคมท�ใชในการทดลอง 1. ใบกระทอมดบปน (15 x raw leaf extract) เพ�อใชเตรยมเปนสารมาตรฐาน Mitragynine

standard โดยหาซ อมาจากรานคาทางอนเทอรเนต 2. Ajmalicine (C21H24N2O3, purity 99%) 3. anhydrous di-sodium hydrogen orthophosphate 4. acetic acid 99.8% 5. ammonium acetate 99.99% 6. ammonium hydroxide A.C.S. จาก Aldrich Chemical Company Inc. (Milwaukee, WI, USA)

ตวทาละลายท งหมดท�ใชเปน HPLC เกรดหรอดกวา จาก Mallinckrodt Baker Inc. (Phillipsburg, NJ, USA)

7. SilicAR 60 A silicagel จาก Mallinckrodt Baker (Paris, KY, USA) 8. Purified water was เตรยมจากหองปฏบตการ ดวยระบบ Nanopure Diamond water system (Barnstead International Inc., Dubuque, IA, USA)

รปท� (5 ก) ลกษณะของใบกระทอมดบปน

2.2 เคร�องมอท�ใชในการตรวจวเคราะห (LC-MS/MS) HPLC-MS/MS ประกอบดวย

2.1.1 เคร�อง HPLC ของบรษท Agilent Technologies รน Agilent Technologies Series 1200

(Wilmington, DE, USA) อปกรณประกอบดวย - Vacuum degasser - Binary pump - Thermostatted column compartment - Autosampler

โดยเคร�อง HPLC จะเช�อมตอกบเคร�อง API-2000 triple quadrupole mass spectrometer 2.1.2 เคร�อง MS/MS ของบรษท Applied Biosystems/MDS SCIEX รน API-2000 triple quadrupole mass spectrometer (Applied Biosystems/MDS SCIEX, Toronto, Canada) อปกรณประกอบดวย

- Turbo electrospray ionization (ESI) source ทางานในระบบ positive mode ใช ไนโตรเจนแกสใน nebulizer - ต งคาแกส ESI sheath ไวท� 50 psi - ทางานโดยใช MS/MS พารามเตอร - Analyst software version 1.4.2 (Applied BioSystems/MDS SCIEX)

HPLC ทาการแยกสารในคอลมน silica-gel based Waters (Milford, MA, USA) มขนาด 50 mm

× 3.0mm (ความยาว × หนา) ซ�งภายในคอลมนเคลอบดวยพารตเค ลหนา 3 µm Atlantis HILIC column thermostatted ท� 40 ˚C ใช mobile phase A ประกอบดวย 5mM ammonium acetate และ mobile phase B ประกอบดวย methanol อตราการไหล (flow rate) ท� 0.25 ml/min ปรมาณของตวอยางท�ฉดคอ 10 µl การแยกสารใชโปรแกรม gradient คอ 0–3 นาท mobile phase B 90% ถง 100% จากน นนาทท� 3.1–7 นาท mobile phase B 90%

2.3 ขนตอนการทา Mitragynine บรสทธf สารมาตรฐาน Mitragynine ท�ใชในการศกษาคร งน ทาการสกดและทาใหบรสทธในหองปฏบตการn

โดยใชใบกระทอมดบ เน�องจากไมม สารมาตรฐาน Mitragynine ท�สามารถหาซ อได กระบวนการของการแยก และทาให Mitragynine บรสทธ ซ�งไดอธบายไวโดย n (Houghton et al., 1991, Ponglux et al., 1994, and Janchawee et al., 2007) สรปไดดงน aqueous suspension จากการสกดใบกระทอมดบ (5 g ใน 100 ml 10% acetic acid) นามากรองโดยผานกระดาษกรอง และสกดดวย n-hexane 100 ml นาสารละลายท�ไดมาปรบคา pH ใหเปน pH 9 ดวย 25% aqueous ammonium hydroxide และทาการสกดอกคร งดวย n-hexaneและตามดวย dichloromethane สวนท�สกดออกมาไดน นนามาลางดวยน าปราศจากไอออน และทาใหแหงดวย sodium sulfate anhydrous ขจดเอาตวทาละลายออกโดยการป�นจนกระท�งแหง ไดสวนท�เหลอ (aliquot of residue) 1 g ใน dichloromethane นาไปผาน silica-gel column chromatography สองคร ง และลางดวย 10% methanol ใน chloroform เม�อลางเสรจแลวกทาการระเหยจนแหง และทาการตกผลกดวย methanol และchloroform กจะไดอลคาลอยดหลกท�สาคญปรมาณ 0.1 g ซ�งเกดข นเม�อ spot ลงบน silica ในการตรวจวเคราะหดวยวธ Thin layer chromatography (TLC) ทาการวเคราะหโดยใช ethyl acetate/methanol (4/1,v/v) เปน mobile phase โดยในท�วไป 10 g ของใบกระทอม

ดบสกด (15 × kratom raw leaf extract) ให Mitragynine บรสทธ n 0.5 g (ประมาณ 5% based on the crude extract weight) Mitragynine บรสทธ พบวากอใหเกดพคของโครมาโตแกรมอนเดยวท�เดนข นมา ในการวเคราะหn

ดวย Agilent 6972/5972 gas chromatography-mass spectrometry (GCMS) (Agilent Technologies Inc., Wilmington, DE, USA) ทาใน electron impact (EI) ดวยสแกนโหมด (100–500 m/z) ใช Chem- Station Version A 3.00 software (Agilent Technologies Inc.) สเปคตรมของ Mitragynine บรสทธ n

(C23H30N2O4, exact molecular mass = 398.2207) ไดรบการยนยนโดยเปรยบเทยบกบ NIST 98 แมสสเปคตราไลบราร (mass spectral library) Mitragynine ท�ไดมาจากกระบวนน มความบรสทธn

ประมาณ 95% ใชเปนพ นฐาน (based on) ในการเทยบเคยงกบพ นท�พคของ Mitragynine ไปจนถงสารอ�นท�มความไมบรสทธ จากการตรวจn วเคราะหโดยวธ GC-MS และใชวเคราะหสารมาตรฐานทกคร ง โดยตลอดของวธการทดลองท�ไดพฒนาข นมาน

2.4 การเตรยมสารละลายมาตรฐาน เตรยม Stock solutions Mitragynine 500 µg/ml และ Ajmalicine (IS)100 µg/ml ทาการเตรยมโดยละลายสารมาตรฐานผสมรวมกนใน 100% methanol เจอจาง Stock solutions ดวย methanol เพ�อเตรยมเปน working standard solutions ท�ความเขมขนลดลง สารละลายท งหมดเกบไวท�อณหภม - 20 ˚C และนามาละลาย และใช vortex mixed ท�อณหภมหองกอนนาไปใช Stock solutions คงตวอยไดในระหวางการศกษาเปนระยะเวลา 60 วน 2.5 การสกดตวอยางตรวจ Pooled blank และตวอยางปสสาวะของคนไขถกเกบไวท�อณหภม - 80 ˚C จนกระท�งทาการวเคราะห ตวอยางปสสาวะถกนามาละลาย และใชตวอยางปรมาณ 2.0 ml นามาใสในหลอดแกวใสขนาด 10 ml ท�มฝาปด และใส 20 µl ของ 100 ng/ml IS working solution ลงไป จากน นเตม Na2HPO4 ลงไป500 µl ซ�งเปนบพเฟอร (0.5M aqueous ไดถกปรบคา pH ใหเปน pH 11 ดวย 25% aqueous sodium hydroxide) ใสลงไปในตวอยางปสสาวะ และผสมกนโดยใช vortex เปนเวลา 30 วนาท เตม MTBE 3 ml ลงไปในทกตวอยาง จากน นนาไปเขยาแรงๆ ดวยเคร�อง Eberbach 6000 reciprocating shaker (Ann Arbor, MI, USA) เปนเวลา 20 นาท และนาไปป�นดวยเคร�อง Eppendorf 5804 centrifuge (Hamburg,

Germany) ท� 1000 × g เปนเวลา 10 นาท นาสวนใสท�ได ใสลงไปในหลอดเปลาท�สะอาดอกหลอดหน�ง และทาใหระเหยจนแหง ภายใต gentle nitrogen stream ท� 45 ˚C โดยใช Zymark Turbovap LV concentrator (Hopkinton, MA, USA)เม�อทาการสกดเสรจแลว เตม methanol ลงไป 1ml และนาไปใส ลงใน vial เพ�อทาการตรวจวเคราะหดวยเคร�อง HPLC-MS/MS ตอไป 2.6 การทา Calibration

การหาปรมาณของ Mitragynine ทาการ calibrated โดยใชเทคนค IS ใชโปรแกรมในการวเคราะห สาหรบ calibration curve สรางโดย plot อตราสวนของพ นท�พคของ Mitragynine และ IS แลวทายอนกลบ ระหวางอตราสวนของความเขมขนของ Mitragynine และ IS วเคราะห Regression ดวย weighting factor ของ 1/x ทาใหไดคา calibration equation และ correlation coefficient (r) คา Linearity ทาการประเมนโดยเตรยมสารมาตรฐาน Mitragynine 7 ระดบความเขมขน ในตวอยาง blank urine ท�ความเขมขน 0.01, 0.025, 0.05, 0.2, 1, 2.5 และ 5.0 ng/ml เตม IS ลงไปและทา calibration ตวอยางดงในวธการสกดตวอยางตรวจซ�งไดอธบายไวแลวในขอ 2.5 กอนนาไป ทาการตรวจวเคราะหดวยเคร�อง HPLC-MS/MS ตอไป ไดพสจนทาใหเปนท�ยอมรบถงขดจากดสาหรบ calibration curve ของ Mitragynine ท� ±

20% สาหรบคา Relative standard deviation (RSD) ในสวนปจจยของการตอบสนองท งหมดและ Correlation coefficient เปน 0.99 หรอมากกวา 2.7. การพฒนาวธการทดลองและการควบคมคณภาพ การพฒนาวธการทดลองปฏบตตามขอแนะนาของ Guidance for Industry: Bioanalytical Method Validation โดย Pooled blank urine ซ�งไมม Mitragynine ไดถกผสมและกรองโดยผานกระดาษกรองเกรด 3 ของ (Whatman International Ltd., Springfield Mill, UK) และใชตวอยาง matrix ตลอด วธการทดลองท�ไดพฒนาข นมาน การควบคมคณภาพตวอยาง ประกอบดวย 3 matrix samples ซ�งไดใส Mitragynine ท�ความเขมขน 0.1, 1.0 และ 5.0 ng/ml และ 1 matrix ท�เปน blank สาหรบ matrix ท�ใสตวอยาง เกบไวท�อณหภม - 80 ˚C จนกระท�งนามาใช

ความแมนยาไดจากคา Relative standard deviation (RSD) และ recoveries (quantified value/spiked value) ประเมนไดจากคาการตรวจวเคราะหภายในวนเดยวกน โดยการตดสนจากปรมาณรวมท งหมดของ Mitragynine ใน 3 ระดบท�ใสเขาไปเปนการอางอง สวนความแมนยาในแตละวน ตดสนโดยการวเคราะหในแตละวนของตวอยางตรวจท� 4 ชวงเวลา เร�มการวเคราะหเม�อใหมๆ หลงจาก 1 วน 7 วน และ 28 วน โดยเกบไวท� - 80 ˚C ความถกตองซ�งยอมรบไดเม�อคา %recovery อยภายใน ± 30% ของ nominal concentration การยอมรบตามหลกเกณฑของความแมนยา คา RSD อยภายใน ± 20%

ขอจากดของวธการตรวจ Method detection limit (MDL) ต งไวท� 3 คร ง สวน standard deviation คานวณไดจากคาความเขมขนท�เกนจากคาความเขมขนเฉล�ย ตดสนจากการทาการทดลองซ าถง 7 คร ง โดยใส Mitragynine ลงใน matrix ท�ระดบความเขมขน 0.025 ng/ml ซ�ง Lower limit of quantification (LLOQ) ของ Mitragynine ต งไวท� 5 คร งของ MDL

3. ผลการทดลองและการอภปราย

3.1 MS/MS optimization การทางานของพารามเตอรตางๆ สาหรบ ESI source เม�อเลอกใชใหเหมาะสมจะได แมสสเปคตรมท�ดท�สดท ง Mitragynine และ Ajmalicine โมเลกลไอออนและ product ions ของ Mitragynine และ Ajmalicine สงเกตไดจากการไหลเขาโดยตลอดอยางตอเน�องของแตละสารผสมท�ความเขมขน 1 µg/ml ใน methanol ดวยการทางานของ ESI source ท งในโหมด positive และ negative เม�อทาการสแกนโดย Full-scan mass spectra ไดบนทกจาก 35 ถง 450 amu เพ�อประเมนการทางานของสญญาณในแตละโหมด สญญาณท�หนาแนนไดมาจากโหมด positive พบวามความสงมากกวา โหมด negative ท ง Mitragynine และ Ajmalicine สวน Full-scan daughter mass spectra ทาการประเมนดวยเชนกน พรอมดวยการไหลเขาอยางตอเน�องใน product-ion สแกนโหมด สวน abundant product ion ปรมาณมากท�สด ของแตละสารผสมถกคดเลอกเพ�อแสดงถงปรมาณโดย MS/MS Full-scan mass spectrum ของ Mitragynine แสดงถงสญญาณท�เดนชดของไอออนท�มมวลตอประจเทากบ 399 สอดคลองกบ protonated molecular ion [M+H]+ ดงรป (1A)

มไอออนจานวนเลกนอยท�แตกตวออกมาสงเกตไดจากใน full-scan mass spectrum ของ Mitragynine บงช วา โมเลกลไอออนมความเสถยรมาก สวน product ion spectrum ของ Mitragynine แสดง abundant daughter ions ท� m/z = 174, 226 และ 238 เกดท� collision energy (CE) of 40 eV ดงรป

(1B)แนะนาวา precursor ion m/z = 399 เปล�ยนแปลงอยางรวดเรวให product ions m/z = 174, 226 และ 238 ภายใตสภาวะ collisionally activated dissociation (CAD) หลาย mass ของ Mitragynine product ions (daughter ions) ท�ตรวจวดไดเหมอนกนกบ Empirical formula จากการคานวณโดยใช โปรแกรมวเคราะห Analyst software, version 1.4.2 (Applied BioSystem/MDS Sciex) รปแบบการแตกตวของ Mitragynine ภายใตสภาวะ(CAD)ไดแสดงไวในดงรปท�(2)

ปรมาณมากท�สดของ abundant daughter ion ท� m/z 174 เปน candidate ท�ด ท�ตดตามการเปล�ยนของปรมาณของ m/z 399 > 174 ในระหวางการเกดปฏกรยา CAD โดยใช MRM ทดสอบ ถงแมวา multiple second transitions ของ m/z 399 > 226 และ m/z 399 > 238 กสามารถใชในการยนยนไอออน ซ�งเปนลกษณะเฉพาะของ Mitragynine

Full-scan และ product-ion scan mode spectra ของ Ajmalicineแสดงใหเหนถง precursor ion ท� m/z 353 สอดคลองกบสารผสม protonated molecular ion [M+H]+ ดงรป (3A) และไอออนท� m/z 144 มปรมาณมากท�สดของ abundant daughter ion ไดจาก collision energy of 30 eV ดงในรป 3B และ รปท� (4) ส�งอ�นท�มการแตกตวไมมความสาคญ ดวยเหตน transition ของ m/z 353 > 144 ถกเลอกสาหรบการหาปรมาณของ Ajmalicine ใน MS/MS ของการทดลองน

หลายพารามเตอรของ MS/MS รวมถง ionization energies, temperature และ voltages ท�ใชใน ESI source ใหผลดท�สดในโหมด MRM ท ง Mitragynine และ Ajmalicine ฉดเขาท�ปรมาณ 1 µg/ml ใน อตราสวน 90:10 ของ methanol:ammonium acetate (5mM) ท� 0.25 ml/min โดยใช flow injection analysis (FIA) เพ�อใหไดผลดท�สด ดงตารางท� 1

สาหรบสภาวะท�ดทสดของ ความแมนยา MS/MS จะตองสแกนอยางนอยท�สด 20 สแกนพคตลอดตามแนวนอน เพ�อใหไดผลท�ด อตราการไหลของ nebulizing gas, auxiliary gasและ curtain gas โดยใช FIA ทาใหไดความไวสงสดของสญญาณ MRM สาหรบ Mitragynine และ Ajmalicine การวเคราะหหาปรมาณ Mitragynine ทาในโหมด MRM พรอมดวย 3 mass transitions ของ m/z 399 > 174, 399 > 226, และ 399 > 238 ทาใหเพ�มความไวของสญญาณ ขณะท� transition m/z 353 > 144 เทาน นท�ถกใชสาหรบ Ajmalicine สวน dwell time ต งคาไวท� 800 ms สาหรบท ง Mitragynine และ Ajmalicine 3.2 การวเคราะหดวย LC ในสวนของ HPLC ทาการแยก Mitragynine และ Ajmalicine ในคอลมน ซ�งการแยกในข นตนน จะ

ใช Agilent Zorbax Extend-C18 column (4.6mm ×150mm i.d.×length; 3.5 µm particle size) ใช methanol และ 5mM ammonium acetate ในการแยกโดยการละลายลาง สวนระบบปฏบตการของ MS/MS พารามเตอร ในโหมด MRM ไดอธบายไวแลวในกอนหนาน ซ�งไดถกนามาประยกตใชในการวเคราะหหาปรมาณของ Mitragynine และ Ajmalicine ดงไดกลาวไวในรายงานของ (Janchawee et al., 2007) Mitragynine ไมละลายในน า แตละลายไดดใน methanol จากการศกษาคร งน พบวา Mitragynine และ Ajmalicine ละลายไดอยางรวดเรวใน methanol และ 5mM ammonium acetate ในอตราสวน 90:10อยางไรกตาม เน�องจากเปน strong hydrophobicity การแยกโดยวธ LC ในการแยกของ 2 สาร ยงไม สามารถแยกกนไดอยางสมบรณดวยการใชคอลมน C18 เม�อใช methanol ในอตราสวนท�ลดลงพคของ Mitragynine จะ shape ในทางตรงกนขาม เม�อใช methanol ในอตราสวนท�สงข นพคของ Mitragynine กลายเปนพค broader และมความเขมลดต�าลง ซ�งท ง 2 สารเกอบจะถกชะลางออกมาหมด ในอกทาง

หน�ง ใช LC ในการแยก Mitragynine และ Ajmalicine กเชนเดยวกนซ�งข นอยกบคา pH ของ eluent การสญเสยของ Mitragynine สามารถเกดข นไดเน�องจากกระบวนการ hydrolysis ของสารประกอบท� pH สง

ในการศกษาคร งน ใช polar silica-gel เปน stationary phase สาหรบการแยก Mitragynine และ

Ajmalicine เปนผลสาเรจดวยการใช Waters Atlantis HILIC column (50mm×3.0mm length×i.d.; 3 µm particle size) ชะลางดวย methanol และ 5mM ammonium acetate ในอตราสวน 90:10 สาหรบ matrix standard ซ�งประกอบดวยท ง Mitragynine และ Ajmalicine ใน blank urine ทาการทดสอบภายใตสภาวะเง�อนไขท�เหมอนกน เพ�อแสดงใหเหนถงผลกระทบของ matrix และส�งรบกวนซ�งอาจเกดข นได ตวอยางโครมาโตแกรมของ matrix standard ไดแสดงไวดงรป (5A) และ (5B) จากการสงเกตพบวาไมมส�งรบกวนในการตรวจวเคราะห หรอ IS retention windows สวน retention times ของ Mitragynine และ Ajmalicine อย 2.4 และ 1.2 นาท ตามลาดบ ในการแยก Mitragynine และ Ajmalicine ใน HILIC column ไดทาการทดลองท�อณหภมแตกตางกนไปถง 3 คา คอ 30, 40 และ 50 ˚C พบวาไมมความสาคญในการศกษาคร งน เน�องจากในระบบการวเคราะห คอลมนเปนแบบ thermostatted ท� 40 ˚C ระบบจะส�งการลดระดบลงเม�อ LC ป�มความดนกลบคนมา

3.3 การประเมนคาของการสกดดวย Liquid

สารเสพตดเม�อเสพเขาสรางกายแลวจะตกคางอยในปสสาวะไดนาน เพราะวาความเขมขนของสารในรปท�แตกตวแลว (metabolites) และ/หรอ สารในรปเดม (parent drugs) โดยปกตจะพบวามอยสง ใน matrix มากกวาใน biological matrices อ�นๆ ดงเชน ในเลอด น าลาย และจะตองมอยในปรมาณท�มาก ตองทาการเกบตวอยางในทนท (Concheiro et at.,2007) การสกดโดยวธ Liquid–liquid extraction ใชกนอยางกวางขวาง สาหรบการขจดเอาสารออก(clean-up) จากตวอยางตรวจ ในการศกษาคร งน ไดหาปรมาณของ Mitragynine โดยใชการสกดดวยวธ Liquid–liquid extraction ซ�งใชสารละลาย 3 ชนดดวยกนคอ ethyl acetate, ethyl ether และ MTBE สวนคา % Recovery หาไดจากอตราสวนระหวาง คาปรมาณท�ตรวจไดและคาของสารควบคมท�ไดใสลงไป กาหนดใหทาซ า 4 คร ง ในตวอยาง pooled urine ซ�งไดใสลงไปในตวอยางตรวจ Mitragynine และ Ajmalicine ดวยเชนกน ปรมาณ 1 ng/ml และวธการดงในตวอยาง ตวอยางตรวจในการสกดท�ใชเปน control คอ blank urine เตมดวย Mitragynine และ Ajmalicine standard กอนท�จะนาไปฉด

% Recovery ของ Mitragynine ในการสกดดวย ethyl acetate, ethyl Ether และ MTBE คอ 49, 82 และ 81% ตามลาดบ ดงในตารางท� (2) ดงน น ethyl ether และ MTBE ใหคา % Recovery ท�ด ท งใน Mitragynine และ Ajmalicine อยางไรกดการใช ethyl ether สามารถใหคาความเบ�ยงเบน (deviation) กวางกวา สาหรบ % Recovery ของ Mitragynine ในระหวางกระบวนการสกด สาเหตจากสารละลายน สามารถระเหยการเปนไอไดสง (high volatility) ดงน น MTBE จงถกเลอกใหเปนสารละลายสาหรบการสกดของ Mitragynine ดวยวธการทดลองท�ไดพฒนาข นมาน

3.4. การควบคมคณภาพและ method validation ในการทาการตรวจวเคราะหคร งน ตวอยางปสสาวะเม�อทาการสกดเสรจแลว จงไดใส Mitragynine ลงไปท�ความเขมขน 7 ระดบ ในชวงต งแต 0.01 ถง 5 ng/ml และวธการไดอธบายไวในขอ (2.6) ไดใส Mitragynine ลงไปในปรมาณท�เทากน แลวทาการตรวจซ า 3 คร ง คา linear regression ไดจากอตราสวนของพ นท� (analyte/IS) เปรยบเทยบกบอตราสวนความเขมขนของสารผสมดวย

weighting factor ของ 1/x (เม�อ x คอความเขมขน) แสดงวามความถกตองถง 90–115% และ ใหผลคา correlation factor r > 0.995 สาหรบการควบคมคณภาพไดทาการวเคราะหในตวอยางตรวจท� 3 คา คอ 0.1, 1 และ 5 ng/ml แสดงใหเหนถงระดบต�า กลาง และสงท�ไดใสสารลงไป ซ�งไดถกนามาใชสาหรบวธการทดสอบ method validation ในชวงของความเขมขนน เหมาะสมกบท งในเร�องของ ความไวของเคร�องมอ และการสกดดวย liquid–liquid ของ Mitragynine ในตวอยางปสสาวะของคน ถาในตวอยางม Mitragynine ท�ความเขมขนมาก เกนชวงของ calibrated linear range ถาเปนเชนน นจาเปนตองทาการเจอจางกอนนามาสกด ไดศกษาถงผลของ Matrix โดยเปรยบเทยบกบ retention times และพ นท�พคของ Mitragynine ใน สารละลายท�ไมไดผสม โดยใสลงไปกอนการสกด และหลงจากการสกดเสรจแลวจงใสลงไป ในความเขมขนต งแต 0.025 ถง 2.5 ng/ml พบวา retention times ไมเปล�ยน และการสกด Mitragynine ยงนาผลท�ไดกลบมาใชไดอก โดยไมมการปรบเปล�ยน IS ชวงจาก 53 ถง 88% พ นท�พคของสารละลายท�ไมไดผสม และหลงจากการสกดเสรจแลวจงใสลงไป กเปนแบบเดยวกน (ขอมลไมไดแสดงไว) เพราะฉะน น matrix ไมมผลตอการตรวจวเคราะหโดยวธน ระบบ background ท�ต�า ของ Mitragynine ในตวอยาง blank urine ไดแสดงไวดงรปท� (5A) % Recovery ของ Mitragynine ท งหมด พบไดตลอดระหวาง 80 และ 110% จากการใสลงไปท� 3 ระดบคอ 0.1, 1 และ 5 ng/ml และไดศกษาท งการตรวจวเคราะหภายในวนเดยวกนและตางวนกน การตรวจวเคราะหภายในวนเดยวกน มคาความแมนยา(RSD) เปน 12 และ 16% ตามลาดบ สาหรบ matrix ท�ใสลงไปคอ ปรมาณ 1 และ 5 ng/ml สวนการใสลงไปในปรมาณระดบต�าๆ ท� 0.1 ng/ml ใหผลคา % RSD เปน 22% ดงในตารางท� (3) สาหรบความถกตองของวธการทดลองน ไดตกลงยอมรบรวมกนวาควรใสสารลงไปท�ความเขมขนตางๆ และทาการตรวจวดคา

คามากท�สดของการตรวจวเคราะหตางวนกน มคาความแมนยา(RSD) เปน 33, 16 และ 16% ซ�งไดจากความเขมขนท� 0.1, 1.0 และ 5.0 ng/ml ตามลาดบ ดงในตารางท� (4) จากการศกษาคร งน สงเกตพบวาไมมความแตกตางกน ระหวางการตรวจวเคราะหภายในวนเดยวกนและตางวนกน ท งผลลพธท�ไดอยภายในชวงท�ยอมรบไดตามเกณฑ

สาหรบคา Minimum detectable level (MDL) ไดกาหนดใหทาการตรวจซ าถง 7 คร ง สาหรบ Mitragynine ในปสสาวะคอ 0.02 ng/ml (RSD = 21%) สวนคา Lower limit of quantification (LLOQ) ของ Mitragynine ในปสสาวะคอ 0.1 ng/ml คา MDL และ LLOQ จากการศกษาในคร งน พบวามคาต�า มากกวาท�ไดมการรายงานไวในกอนหนาน โดย (Janchawee et al., 2007) ซ�งไดใช HPLC-UV ในการตรวจวเคราะห 3.5 Application ตวอยางท�ใชในการศกษา ไดมาจากผ ท�ถกกลาวหาวาใชกระทอม จดเตรยมไวใหโดย Upstate New York Poison Control Center และ SUNY Upstate Medical University ถกเกบรกษาไวท�อณหภม - 80 ˚C จนกระท�งนามาตรวจวเคราะห ในการตรวจวเคราะหเบ องตนของการสกดปสสาวะแสดงถงระดบของ Mitragynine โดยสวนมากเกนชวงของ calibration range ดงน นจงตองเจอจางตวอยาง 20 เทาดวย methanol และตรวจวเคราะหซ า 3 คร ง ทาใหไดคาความแมนยาจากการคานวณถง 95% ของคาระดบความเช�อม�น ปรมาณของ Mitragynine ท�ตกคาง พบในตวอยางถง 167 ±15 ng/ml ซ�งเปนผลท�ไดจากการตรวจวเคราะหโดยวธ HPLC-MS/MS ดงรปท� (5C) จากการวเคราะหดวย MS/MS transitions ของ m/z 399 > 174, 399 > 226 และ 339 > 238 เปนลกษณะเฉพาะของโมเลกล Mitragynine ซ�งยนยนใหเหนถงสารประกอบน ไดจากการสกดในปสสาวะ

4. สรป

กระทอมสามารถเขาหาไดงาย จดเปนสารเสพตดท�ผดกฏหมาย มเพ�มมากข นโดยทางอนเทอรเนต จนกระท�งในขณะน ยงไมมวธการตรวจ หรอการเปดเผยถงการตรวจยนยนสารเสพตด ดงเชนท�ไดทามาท งหมด และการรกษาคนไขสงเกตวามความสมพนธกนกบผ ท�ถกสงสยวามการใชสารโดยท งส น การบรโภคกระทอมสามารถนาไปสการตรวจพบปรมาณของ Mitragynine ท�ตกคางอย และ metabolite ในปสสาวะ Mitragynine ท�ตกคางอยในปสสาวะ ทาการสกดออกมาโดยใชสารละลาย Methyl t-butyl ether (MTBE) และแยกวเคราะหสารผสมออกจากกนโดยใชคอลมน HILIC รวมกบ Tandem mass spectrometry ในงานวจยน พบวา Ajmalicine เหมาะสมท�สด ท�ใชเปน Internal Standard (IS) ท งสาหรบการสกด และการตรวจวเคราะห Mitragynine โดยวธ HPLC-MS/MS ซ�งมความถกตอง ความแมนยาสงและมความไวสง แสดงใหเหนไดจากการตรวจวเคราะห Mitragynine ในปสสาวะ matrix ดวยวธ HPLC-MS/MS โดยมคาขดจากดของการตรวจวดถง 0.02 และ 0.1 ng/ml ตามลาดบ ควรใชสารมาตรฐาน Mitragynine ท�ไดรบการรบรองแลว จะทาใหการตรวจวเคราะหทาไดงายข น และเฝาตดตามการศกษาตอไป

วธการทดลองท�ไดพฒนาข นมาน จะชวยทาใหการรกษา ตดตามผลทางคลนคกาวหนาตอไป และในอนาคตเปนไปไดวาจะมงานวจยท�มความสมพนธกบความเปนพษอยางรนแรงในคนไข การศกษา metabolites ของ Mitragynine และการสกดโดยใช solid phase extraction (SPE) จะมการพฒนาข นในอนาคตอนใกลน

ขอเสนอแนะ

ในประเทศไทย กระทอมจดเปนยาเสพตดใหโทษประเภท 5 ตามประกาศกระทรวงสาธารณสข ฉบบท� 135 (พ.ศ. 2539) เร�องระบช�อและประเภทยาเสพตดใหโทษ ตามพระราชบญญตยาเสพตดใหโทษ พ.ศ. 2522 สาหรบทางการแพทย แบงสารเสพตดใหโทษเปน 7 ประเภท ตามการออกฤทธ ซ�งกระทอมจดn

อยในประเภท ยากระตนประสาท (Stimulants) ถงแมวาปจจบนพชกระทอมยงคงมสถานะเปนยาเสพตดประเภท 5 คณสมบตในดานท�เปนโทษและคณสมบตท�ใหประโยชนยงตองการ การพสจนดวยวทยาการท�ชดเจนอย แตกมผ ท�ใชใบกระทอมอยท�วประเทศ โดยอาศยความเช�อจากคาบอกเลาตอกนมา ถงประโยชนนานาประการท�ใบกระทอมมอย ในระหวางท�ฝายหน�งมความเหนวาพชกระทอมควรอนญาตใหมการใชอยางถกตองตามกฎหมาย แตอกฝายหน�งยงเหนวาการใชกระทอมอาจมโทษ ทาใหเกดอาการตดใบกระทอมได ดงน นประเดนการแกพระราชบญญตยาเสพตดใหนาพชกระทอม ออกจากยาเสพตดประเภท 5 กยงคงอยในระหวางการดาเนนการอยในปจจบน ดวยเหตผลท�วาไมมหลกฐานทางการวจยมาสนบสนนวาแทจรงแลวพชกระทอมเปนส�งเสพตดและใหโทษตอรางกายหรอไม ซ�งนกวจยหลายสาขาไดรวมกนเพ�อพยายามพสจนถงฤทธทางเภสชวทยาของพชกระทอม รวมไปถงการศกษาดานสงคมศาสตรดวย และn

แมวางานวจยท งในและตางประเทศจะมอยเปนจานวนมาก กไดแตหวงวาขอเทจจรงของพชกระทอมท�เร�มปรากฏออกสสาธารณชน นาจะสามารถนามาซ�งความเปล�ยนแปลงท�จะเกดข นในอนาคต ซ�งอาจหมายถง การเปล�ยนแปลงกฎหมายยาเสพตด พ.ศ. 2522 หรอไมเปล�นกเปนไปได ในประเทศไทยการศกษาวจยทางดานวธการตรวจวเคราะหหาปรมาณของ Mitragynine และสารอลคาลอยดอ�นๆ ท งในดานการตรวจเบ องตนและการตรวจยนยน สาหรบการนามาใชในงานประจาวนทางหองปฏบตการยงมนอยมาก สวนเคร�องมอท�จะใชสาหรบการตรวจวเคราะหยนยนมราคาแพงและปจจบนน สารมาตรฐาน Mitragynine ยงไมมจาหนาย อยางไรกตาม จากวธการวเคราะหหาปรมาณ Mitragynine ในปสสาวะของผ ท�ใชใบกระทอมโดยวธ High performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry เปนวธท�นาสนใจอกวธหน�ง ท�จะไดนาไปศกษาทดลองเพ�อประยกตใชในการ พฒนางานตรวจวเคราะหประจาวนทางหองปฏบตการตอไป จากงานวจยน ในรปท� (5 C) พบวาพคของปสสาวะท�สกดมาจากผ ท�ใชกระทอม พคของ Mitragynine ยงทบซอนกนอย อยางไรกตาม สามารถยนยนไดวาเปน Mitragynine โดยไดจากการวเคราะหดวย MS/MS ดงรปท� (1) และจานวนของตวอยางท�ใชในการทดลอง ควรมจานวนมากกวาน

เอกสารอางอง 1. Shijun Lua, Buu N. Trana, Jamie L. Nelsenb, Kenneth M. Aldousa. Journal of Chromatography B, 877 (2009) 2499–2505 2. E. Shellard, Bull. Narc. 26 (1974) 41. 3. S. Thongpradichote, K. Matsumoto, M. Tohda, H. Takayama, N. Aimi, S. Sakai, H.Watanabe, Life Sci. 62 (1998) 1371. 4. K.M. Babu, C.R. McCurdy, E.W. Boyer, Clin. Toxicol. (Phila.) 46 (2008)146. 5. H. Takayama, Chem. Pharm. Bull. (Tokyo) 52 (2004) 359. 6. D.E. Zacharias, R.D. Rosenstein, G.A. Jeffrey, Acta Cryst. 18 (1965) 1039. 7.H. Takayama,M.Maeda, S. Ohbayashi, M. Kitajima, S. Sakai, N. Aimi, Tetrahedron Lett. 36 (1995) 9337. 8.K. Matsumoto, M. Mizowaki, T. Suchitra, H. Takayama, S. Sakai, N. Aimi, H.Watanabe, Life Sci. 59 (1996) 1149. 9.L.T. Yamamoto, S. Horie, H. Takayama, N. Aimi, S. Sakai, S. Yano, J. Shan, P.K. Pang, D. Ponglux, K.Watanabe, Gen. Pharmacol. 33 (1999) 73. 10. H. Takayama, H. Ishikawa, M. Kitajima, N. Aimi, J. Med. Chem. 45 (2002) 1949. 11. K.Watanabe, S. Yano, S. Horie, L.T. Yamamoto, Life Sci. 60 (1997) 933. 12. S. Tsuchiya, S. Miyashita, M. Yamamoto, S. Horie, S.I. Sakai, N. Aimi, H. Takayama, K.Watanabe, Euro. J. Pharmacol. 443 (2002) 185. 13. K. Matsumoto, S. Horie, H. Takayama, H. Ishikawa, N. Aimi, D. Ponglux, T.Murayama, K.Watanabe, Life Sci. 78 (2005) 187. 14.S. Assanangkornchai, A. Muekthong, N. Sam-Angsri, U. Pattanasattayawong,Subst. Use Misuse 45 (2007) 2145. 15. P.J. Houghton, A.L. Ikram, M. Saidb, Phytochemistry 30 (1991) 347. 16. D. Ponglux, S. Wongseripipatana, H. Takayama, M. Kikuchi, M. Kurihara, M.Kitajima, N. Aimi, S. Sakai, Planta Med. 60 (1994) 580. 17. B. Janchawee, N. Keawpradub, S. Chittrakarn, S. Prasettho, P.Wararatananurak, K. Sawangjareon, Biomed. Chromatogr. 21 (2007) 176. 18. สาวตร อษณางคกรชย และอาภา ศรวงศ ณ อยธยา.(2548). พชกระทอมในสงคมไทย. กรงเทพฯ : พมพท� หจก.บางกอกบลอก. 19. www.wikipedia.com