RESISTÊNCIA AOS CARBAPENENS E SENSIBILIDADE ÀS ... · Professor Dr. Álvaro Nagib Atallah Coordenador do Curso de Pós-graduação: Professora Dra. Maria Lucia Oliveira de Souza

ELOIZA HELENA CAMPANA

RESISTÊNCIA AOS CARBAPENENS E SENSIBILIDADE ÀS

CEFALOSPORINAS DE AMPLO ESPECTRO EM ISOLADOS

CLÍNICOS DE Pseudomonas aeruginosa: ESTUDO DOS

MECANISMOS DE RESISTÊNCIA ENVOLVIDOS

Tese apresentada à Universidade Federal de

São Paulo - Escola Paulista de Medicina,

para obtenção do Título de Doutor em

Ciências.

São Paulo

2013

ii


RESISTÊNCIA AOS CARBAPENENS E SENSIBILIDADE ÀS CEFALOSPORINAS DE AMPLO

ESPECTRO EM ISOLADOS CLÍNICOS DE Pseudomonas aeruginosa: ESTUDO DOS


Tese apresentada à Universidade Federal de

São Paulo - Escola Paulista de Medicina,

para obtenção do Título de Doutor em

Ciências.

Orientadora: Profa. Dra. Ana Cristina Gales

Disciplina de Infectologia - Universidade Federal

de São Paulo - UNIFESP.

Coorientador: Dr. Danilo Elias Xavier

Disciplina de Infectologia - Universidade Federal

de São Paulo - UNIFESP.

São Paulo

2013

iii

CAMPANA, Eloiza Helena

Resistência aos Carbapenens e Sensibilidade às Cefalosporinas de Amplo

Espectro em Isolados Clínicos de Pseudomonas aeruginosa: Estudo dos

Mecanismos de Resistência Envolvidos. Eloiza Helena Campana - São Paulo,

2013. vi. 150f.

Tese (Doutorado) - Universidade Federal de São Paulo. Escola Paulista de

Medicina. Programa de Pós-graduação em Ciências Básicas em Infectologia.

Título em inglês: Carbapenen resistance and susceptible to broad spectrum

cephalosporins in Pseudomonas aeruginosa clinical isolates: Evaluation of

mechanisms of resistance involved.

1. Pseudomonas aeruginosa; 2. Carbapenens; 3. Cefalosporinas de amplo

espectro; 4. Sistemas de Bombas de Efluxo; 5. Proteína de membrana externa -

OprD.

iv

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO

ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA

DISCIPLINA DE INFECTOLOGIA

Chefe do Departamento:

Professor Dr. Álvaro Nagib Atallah

Coordenador do Curso de Pós-graduação:

Professora Dra. Maria Lucia Oliveira de Souza Formigoni

Chefe da Disciplina de Infectologia:

Prof. Dr. Celso Francisco Hernandes Granato

São Paulo

2013

http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4787779Z1

v


RESISTÊNCIA AOS CARBAPENENS E SENSIBILIDADE ÀS CEFALOSPORINAS DE AMPLO

ESPECTRO EM ISOLADOS CLÍNICOS DE Pseudomonas aeruginosa: ESTUDO DOS


Presidente da Banca

Profa. Dra. Ana Cristina Gales

Banca Examinadora

Prof. Dr. Antônio Carlos Campos Pignatari

Profa. Dra. Floristher Elaine Carrara Marroni

Dr. Guilherme Henrique Furtado

Profa. Dra. Maria Helena Matté

Suplentes

Profa. Dra. Elizabeth de Andrade Marques

Prof. Dr. Nilton Lincopan

São Paulo

2013

vi

Dedico este trabalho ao meu grande amor, meu

sobrinho João Guilherme. Que me fez aprender a

amar novamente e me ensina a cada dia a ser

uma pessoa melhor.

vii

AGRADECIMENTOS

Agradeço à minha orientadora Dra. Ana Cristina Gales, por ter me recebido há sete anos atrás

e sempre me dado a oportunidade de crescer. Obrigada pelo exemplo de dedicação, inteligência e

esforço que levarei comigo para o resto de minha vida.

Agradeço a minha família, José Argemiro Campana (in memorian), Gilda Campana e Mayla

Christina Campana pela paciência em esperar eu terminar minha pós-graduação. Obrigada por estarem

sempre ao meu lado, pela dedicação, auxílio e força na minha formação pessoal e profissional. E

principalmente, por sempre acreditarem no meu sucesso.

Ao meu padrinho Issac Ortega e a Márcia Eckert por todos os momentos de apoio e carinho.

Agradeço ao Professor Dr. Antonio Carlos Campos Pignatari pelo grande exemplo de vida.

Obrigada pelo grandioso convívio e pelo apoio sempre. Levarei para sempre os seus ensinamentos.

A Dra. Maria Rita Elmor de Araujo por, gentilmente, ter cedido às amostras de Pseudomonas

aeruginosa do Hospital do Coração e Hospital Beneficência Portuguesa para esse estudo.

Agradeço ao meu coorientador e verdadeiro amigo Danilo Elias Xavier, por todos os momentos

de ensinamento, amizade e companheirismo. Obrigada por me ensinar a muito do que sou hoje.

Agradeço a minha eterna veterana Renata Cristina Picão, minha colega de sonhos,

companheira de apartamento e acima de tudo amiga. Obrigada pelas broncas, pelas palavras de carinho,

pelos ensinamentos. São mais de 12 anos de uma amizade para a vida toda.

https://www.facebook.com/fran.eckert.12

viii

Agradeço especialmente a minha amiga e colega Fernanda Petrolini, pela dedicação, auxílio

nos experimentos e principalmente por ter me acolhido como uma irmã em sua família e na sua cidade

que eu tanto adoro.

Agradeço a Adriana G. Nicolleti, Lorena C. C. Fehlberg e Paula P. Barbosa amigas e colegas

de laboratório há tantos anos. Obrigada por toda o auxilio, por toda a paciência e por cada palavra amiga

quando eu mais precisei. Vocês estarão sempre presentes em minha vida.

Agradeço imensamente ao aluno de estagio probatório, colega e amigo Jhonatha Moura, pelo

auxílio nos experimentos, conversas e incentivo em todos os momentos.

Agradeço de todo o coração às palavras carinhosas que recebi diariamente da colega Ana

Carolina Ramos. Obrigada por me fazer ver que ser doce faz bem.

Agradeço as minhas queridas amigas Karen Bauab, Milene Quiles, Flavia Palomo e Juliana

Garcia por todo convívio, carinho, conversas, choros e amizade sincera. Vocês foram muito importantes

nessa etapa da minha vida e serão para sempre minhas verdadeiras companheiras.

Agradeço a Cecília Carvalhaes, amiga e colega. Por toda a paciência, conversas, auxilio e

amizade.

Agradeço aos meus colegas de Muay Thai, Jiu Jitsu e Treino, Mestre Reinaldo Dutra, Mestre

Edinaldo Dias, Carla Borges, Fernanda Tavares, Raul Alexandre Hanashiro, Joaquim Vicente

Alberico, Wallace Josef, Valéria Avila, Rodrigo Celebrone, Alexandre Nunes e Will Bonifacio por

me ensinarem que é preciso exercitar o corpo e não só a mente. Obrigada por fazerem meus fins de dia

mais felizes e alegres e também por deixarem minha vida mais leve.

https://www.facebook.com/edinaldo.dias1

https://www.facebook.com/raulalexandre.fermosellehanashiro?hc_location=timeline

https://www.facebook.com/valeria.avila.129

https://www.facebook.com/rcelebrone

https://www.facebook.com/acenuness

ix

Agradeço meus eternos amigos de faculdade André Goto, Beatriz Balducci, Camila Justino,

Francielli Vasconcellos, Rafael Ferreira e Sarita Rossato pela presença em minha vida há tantos

anos. Pela amizade, conselhos, conversas e torcida sempre.

As minhas amigas de colégio, minhas eternas lulus Amanda Andrade, Christiane Braghin,

Katiane Soares, Mayla Fietta, Nancy Guetti, Natalia Albuquerque e Thais Simone por todo apoio,

amizade, carinho, conversas. Nossa amizade é eterna.

Agradeço aos meus amigos Marcos Antonio Silva, Rafael Ferreira, Rafael Nascimento,

Rafael Azevedo e Thiago Rodrigues pela amizade, conversas, viagens.

Agradeço as minhas amigas do Laboratório de Microbiologia Básica da UNIFESP Cecília

Magalhães, Bruna Gil, Paola Rossi, Tavane Cambiaghi, e o amigo Fabiano Romão por todos os

cafés, conversas, conselhos, “Brain Storm” e acima de tudo pela amizade que vale uma vida com vocês.

Agradeço os pós-graduandos e colegas do Laboratório ALERTA Adriana Pereira, Anderson

Fernandes, Bruna Nonato, Dandara Corsi, Eliete Frigatto, Fernanda Rodrigues, Graziela Braun,

Juliana Provasi, Jéssica Werneck, Lucas Andrade, Lygia Schandert, Marina Visconde, Raquel

Girardello, Rafael Affini, Rodrigo Cayô, Talita Barone e Vitor Marguti pela agradável e divertida

convivência, pelos conhecimentos divididos e as experiências compartilhadas. Obrigado por todos os

momentos vividos nestes últimos sete anos.

Agradeço os pós-graduandos e colegas do Laboratório Especial de Microbiologia Clínica -

LEMC, pelo companheirismo em todos os momentos. Agradeço também a Rosana Capecce pela

amizade e auxílio em diversos momentos.

Aos docentes e funcionários da Disciplina de Infectologia (DIPA/UNIFESP/EPM).

https://www.facebook.com/tavane.davidcambiaghi?hc_location=timeline

x

"A ciência não pode prever o que vai

acontecer. Só pode prever a probabilidade

de algo acontecer."

(César Lattes)

xi

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ...................................................................................................................................... 01

2 OBJETIVOS .......................................................................................................................................... 03

2.1 Objetivo Principal ............................................................................................................................... 03

2.2 Objetivos Secundários ....................................................................................................................... 03

3 REVISÂO BIBLIOGRÀFICA ................................................................................................................... 04

3.1 Pseudomonas aeruginosa ................................................................................................................... 04

3.2 Epidemiologia das Infecções causadas por Pseudomonas aeruginosa .............................................. 05

3.3 Mecanismos de resistência em Pseudomonas aeruginosa ................................................................. 07

3.3.1 Produção de -Lactamases .............................................................................................................. 07

3.3.1.1 Serino--Lactamases – Classe A .................................................................................................. 08

3.3.1.2 Metallo-β-lactamases (MβL) – Classe B ........................................................................................ 10

3.3.1.3 -Lactamase cromossomal AmpC – Classe C .............................................................................. 11

3.3.1.4 Oxacilinases (OXA) – Classe D ..................................................................................................... 13

3.3.2 Hiperexpressão de Sistemas de Efluxo ............................................................................................ 15

3.3.3 Impermeabilidade de Membrana Externa ......................................................................................... 19

3.3.4 Alteração das Proteínas Ligadoras de Penicilinas (PBPs) .............................................................. 22

3.3.5 Resistência aos Aminoglicosídeos.................................................................................................... 22

3.3.6 Resistência às Fluoroquinolonas....................................................................................................... 24

3.4 Opções Terapêuticas para o Tratamento das Infecções por Pseudomonas aeruginosa..................... 25

4 MATERIAL E MÉTODOS ........................................................................................................................ 27

4.1 Amostras Bacterianas .......................................................................................................................... 27

4.1.1 Identificação dos isolados de P. aeruginosa por Matrix-assisted laser desorption ionization time-

of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) ........................................................................................... 28

4.2 Avaliação do Perfil de Sensibilidade in vitro aos antimicrobianos ....................................................... 29

4.3 Análise da similaridade genética por Pulsed-Field Gel Electrophoresis (PFGE) ................................. 31

4.3.1 Preparação dos blocos de gel de agarose ....................................................................................... 32

4.3.2 Digestão do DNA bacteriano ............................................................................................................ 33

4.3.3 Eletroforese em campo pulsátil ......................................................................................................... 33

xii

4.4 Focalização do ponto isoelétrico (pI) ................................................................................................... 34

4.5 Teste in vitro de Hidrólise aos Carbapenens ....................................................................................... 35

4.5.1 Teste de Hidrólise Enzimática por Espectrofotometria ..................................................................... 35

4.5.2 Teste de Hidrólise por Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry

(MALDI-TOF MS) ....................................................................................................................................... 36

4.6 Detecção de Genes Codificadores de β-lactamases ........................................................................... 36

4.6.1 Técnica da reação em cadeia da polimerase (PCR) ........................................................................ 36

4.6.2 Sequenciamento ..................................................................................................................................... 43

4.7 Avaliação fenotípica com inibidores de sistemas de efluxo e da β-lactamase cromossomal AmpC ... 43

4.7.1 Inibição da -lactamase cromossomal AmpC .................................................................................. 44

4.7.2 Inibição de Bombas de Efluxo .......................................................................................................... 44

4.8 Reação em Cadeia da Polimerase de Transcriptase Reversa em Tempo Real - qRT-PCR ............ 44

4.8.1 Extração de RNA Total ..................................................................................................................... 45

4.8.2 Síntese de cDNA .............................................................................................................................. 46

4.8.3 Quantificação relativa da transcrição gênica .................................................................................... 46

4.8.4 Análise da quantificação relativa da transcrição gênica ................................................................... 47

4.8.5 Análise da Amplificação dos genes dos sistemas de efluxo ............................................................. 48

4.9 Avaliação do perfil de proteínas de membrana externa por SDS-PAGE ............................................. 49

4.9.1 Extração de proteínas de membrana externa ................................................................................... 49

4.9.2 SDS-PAGE ....................................................................................................................................... 49

4.10 Pesquisa do Gene Codificador da Proteína de Membrana Externa – OprD ..................................... 50

4.10.1 Técnica da reação em cadeia da polimerase (PCR) ...................................................................... 50

4.11 Avaliação dos Mecanismos de Resistência às Fluoroquinolonas e aso aminoglicosídeos ........... 51


4.11.2 Sequenciamento ........................................................................................................................... 54

5 RESULTADOS ....................................................................................................................................... 55

5.1 Amostras Bacterianas .......................................................................................................................... 55

5.1.1 Identificação dos isolados de P. aeruginosa por Matrix-assisted laser desorption ionization time-

of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) ........................................................................................... 55

5.2 Avaliação do Perfil de Sensibilidade in vitro aos antimicrobianos ....................................................... 56

5.3 Análise da similaridade genética por Pulsed-Field Gel Electrophoresis (PFGE) ................................. 59

xiii

5.4 Focalização do ponto isoelétrico (pI) ................................................................................................... 62

5.5 Teste in vitro de Hidrólise aos Carbapenens ....................................................................................... 63

5.5.1 Teste de Hidrólise Enzimática por Espectrofotometria ..................................................................... 63

5.5.2 Teste de Hidrólise por Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry

(MALDI-TOF MS) ....................................................................................................................................... 63

5.6 Detecção de Genes Codificadores de β-lactamases ........................................................................... 64

5.6.1 Técnica da reação em cadeia da polimerase (PCR) ........................................................................ 64

5.6.2 Sequenciamento ...................................................................................................................................... 65

5.7 Avaliação Fenotípica com inibidores ................................................................................................... 66

5.7.1 Inibição da -lactamase cromossomal AmpC .................................................................................. 66

5.7.2 Inibição de Bombas de Efluxo .......................................................................................................... 67

5.8 Reação em Cadeia da Polimerase de Transcriptase Reversa em Tempo Real - qRT-PCR ............ 68

5.8.5 Análise da Amplificação dos genes dos sistemas de efluxo ............................................................. 74

5.9 Avaliação do perfil de proteínas de membrana externa por SDS-PAGE ............................................. 74

5.10 Avaliação da presença do Gene Codificador da Proteína de Membrana Externa – OprD ............... 75


5.11 Avaliação dos Mecanismos de Resistência às Fluoroquinolonas e aos Aminoglicosídeos ........... 75


5.11.2 Sequenciamento ............................................................................................................................. 76

6 DISCUSSÂO ........................................................................................................................................... 77

7 CONCLUSÂO ......................................................................................................................................... 92

8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÀFICAS ........................................................................................................ 94

ABSTRACT ................................................................................................................................................ 127

ANEXOS .................................................................................................................................................... 128

xiv

ÍNDICE DE TABELAS

Tabela 1. Isolados de P. aeruginosa selecionados para este estudo de acordo com o sítio de

Infecção e os Hospitais de isolamento .............................................................................................. 27

Tabela 2. Concentrações testadas na microdiluição em caldo dos antimicrobianos utilizados no

estudo ................................................................................................................................................ 30

Tabela 3. Pontos de cortes utilizados para a interpretação das CIMs de P. aeruginosa segundo o

CLSI 2013 .......................................................................................................................................... 31

Tabela 4. Oligonucleotídeos iniciadores utilizados para a amplificação dos genes codificadores

de β-lactamases pela técnica de PCR convencional e/ou multiplex neste estudo ............................ 38

Tabela 5. Oligonucleotídeos iniciadores utilizados para a amplificação dos genes codificadores

de β-lactamases tipo carbapenemase neste estudo pela técnica de PCR convencional e/ou

multiplex ............................................................................................................................................ 40

Tabela 6. Cepas controles utilizadas neste estudo para a detecção de genes codificadores das

-lactamases e carbapenemases, por meio da técnica de PCR convencional e/ou multiplex ....... 42

Tabela 7. Oligonucleotídeos iniciadores utilizados na reação de qRT-PCR para os genes alvos

mexB, mexD, mexF, mexY, oprD e ampC e para o gene de referência rpsL ................................... 47

Tabela 8. Oligonucleotídeos iniciadores utilizados na reação de PCR para a avaliação do gene

da oprD .............................................................................................................................................. 51

Tabela 9. Oligonucleotídeos iniciadores utilizados para a caracterização dos mecanismos de

resistência às fluoroquinolonas e aminoglicosídeos pela técnica de PCR convencional e multiplex

nos isolados resistentes a estes antimicrobianos ............................................................................. 52

Tabela 10. Distribuição da potência e perfil de sensibilidade aos antimicrobianos dos isolados

clínicos de P. aeruginosa estudados ................................................................................................. 56

Tabela 11. Teste de sensibilidade aos antimicrobianos para os isolados clínicos de P.

aeruginosa, realizado pela técnica de microdiluição em caldo, segundo as recomendações do

CLSI (2013) ....................................................................................................................................... 58

Tabela 12. Teste de inibição da β-lactamase cromossomal AmpC, na presença de cloxacilina

(200 μg/mL), aos antimicrobianos para os isolados clínicos de P. aeruginosa ................................. 67

Tabela 13. Teste de inibição de bomba de efluxo, na presença de PAβN (50 μg/mL), aos

antimicrobianos para os isolados clínicos de P. aeruginosa ............................................................. 68

Tabela 14. Média da expressão relativa dos genes estudados nos isolados clínicos de P.

aeruginosa em relação a cepa PAO1 ................................................................................................ 69

Tabela 15. Mutações no QRDR dos isolados de P. aeruginosa estudados ..................................... 76

xv

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Distribuição dos isolados clínicos estudados por sítio de isolamento ............................... 55

Figura 2. Porcentagem de sensibilidade aos diversos antimicrobianos dos isolados de P.

aeruginosa estudados ....................................................................................................................... 57

Figura 3. Avaliação da similaridade genética entre os isolados de P. aeruginosa do H1 e H2 pela

técnica de PFGE ............................................................................................................................... 59

Figura 4. Avaliação da similaridade genética entre os isolados de P. aeruginosa do H3 pela

técnica de PFGE ............................................................................................................................... 60

Figura 5. Dendrograma do perfil genotípico determinado pela técnica de PFGE dos isolados de

P. aeruginosa avaliados neste estudo ............................................................................................... 61

Figura 6. Curva de regressão linear da focalização das β-lactamases presentes nos isolados de

P. aeruginosa .................................................................................................................................... 62

Figura 7. Teste de Hidrólise Enzimática por Espectrofotometria ...................................................... 63

Figura 8. Teste de Hidrólise por Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass

spectrometry (MALDI-TOF MS) ......................................................................................................... 64

Figura 9. PCR convencional de todos os isolados de P. aeruginosa para a β-lactamase

cromossomal AmpC e OXA-50 ......................................................................................................... 65

Figura 10. Representação esquemática do integron In163 .............................................................. 65

Figura 11. Quantificação da transcrição relativa do gene mexB para os isolados de P. aeruginosa

e da ATCC de P. aeruginosa 27853 em relação a cepa PAO1 ........................................................ 70

Figura 12. Quantificação da transcrição relativa do gene mexD para os isolados de P. aeruginosa


Figura 13. Quantificação da transcrição relativa do gene mexF para os isolados de P. aeruginosa


Figura 14. Quantificação da transcrição relativa do gene mexY para os isolados de P. aeruginosa


Figura 15. Quantificação da transcrição relativa do gene ampC para os isolados de P.

aeruginosa e da ATCC de P. aeruginosa 27853 em relação a cepa PAO1 ...................................... 73

Figura 16. Quantificação da transcrição relativa do gene oprD para os isolados de P. aeruginosa


Figura 17. Perfil de proteínas de membrana externa por SDS-PAGE dos isolados de P.

aeruginosa ......................................................................................................................................... 74

Figura 18. PCR convencional do gene codificador da proteína de membrana externa oprD dos

isolados de P. aeruginosa ................................................................................................................. 75

xvi

ÍNDICE DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ABC - ATP-Binding Cassette

AIM - Australian Imipenemase

ATCC - American Type Culture Collection

CIM - Concentração Inibitória Mínima

CHDL - Carbapenem-Hydrolyzing Class D β-Lactamase

CLSI - Clinical Laboratory Standards Institute

CTX-M - Cefotaximase

DBL - DBL numbering system

DMT - Drug-Metabolite Transporter

DNA - Ácido desoxirribonucleico

EDTA - Ácido Etileno-Diamino-Tetracético

ESAC - Extended-Spectrum AmpC

ESL - Extended Spectrum -Lactamase

EUA - Estados Unidos da América

GES - Guiana Extended Spectrum

GIM - German Imipenemase

IMP - Imipenemase

IS - Insertion Sequence

KHM - Kyorin Hospital metalo-beta-lactamase

KPC - Klebsiella pneumoniae Carbapenemase

LEMC - Laboratório Especial de Microbiologia Clínica

MALDI-TOF MS - Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization - Time of Flight Mass

Spectrometry

MATE - Multidrug and Toxic Compound Extrusion

ML - Metalo--Lactamase

xvii

MDR - Multi-Drug Resistance

MFS - Major Facilitator Superfamily

OMP - Outer Membrane Protein

OXA - Oxacilinase

PAN - Phenyl-Arginine--Naphthylamide

PBP - Penicillin-Binding Protein

PCR - Polymerase Chain Reaction

PER - Pseudomonas Extended Resistant

PFGE - Pulsed Field Gel Electrophoresis

PI - Ponto Isoelétrico

qRT-PCR - Quantitative Real Time Polimerase Chain Reaction

RND - Resistance-Nodulation-Division

rRNA - RNA Ribossomal

SCOPE - Surveillance and Control of Pathogens of Epidemiological Importance

SDS-PAGE - Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis

SHV - Sulfhydryl-Variable -Lactamase

SIM - Seul Imipenemase

SME - Serratia marcescens enzyme

SMR - Small Multidrug Resistance

SPM - São Paulo Metallo--Lactamase

TEM - Temoniera -Lactamase

UNIFESP - Universidade Federal de São Paulo

UTI - Unidade de Terapia Intensiva

VEB - Vietnamese Extended-Spectrum -lactamase

VIM - Verona Imipenemase

xviii

RESUMO

Objetivo: Esse estudo teve como objetivo avaliar os mecanismos de resistência em

isolados clínicos de P. aeruginosa que apresentavam fenótipo de resistência aos

carbapenens e sensibilidade às cefalosporinas de amplo espectro. Material e

Métodos: Foram estudados 25 isolados de P. aeruginosa recuperadas de diferentes

sítios infecciosos em três distintos hospitais da cidade de São Paulo. Os isolados

foram submetidos ao teste de sensibilidade antimicrobiana por microdiluição em caldo

(CLSI-2013). A similaridade genética foi avaliada pela técnica de PFGE, e a atividade

enzimática das carbapenemases foi avaliada pelo método de hidrólise enzimática e

MALDI-TOF. A pesquisa de genes que codificam as β-Lactamases foi realizada pela

técnica da PCR, seguido por sequenciamento. A desrrepressão de ampC e a

hiperexpressão dos sistemas de efluxo foram avaliados fenotipicamente pela adição

de seus inibidores (cloxacilina e PAβN, respectivamente). A transcrição dos genes

mexB, mexD, mexF e mexY, da β-lactamase cromossomal ampC e da porina oprD foi

avaliada pela técnica de qRT-PCR. As proteínas de membrana externa foram

avaliadas pela técnica de SDS-PAGE e em seguida foi realizada a técnica da PCR. A

resistência aos aminoglicosídeos e ao ciprofloxacino foi avaliada pela a técnica da

PCR, seguida por sequenciamento dos respectivos genes responsáveis por conferirem

resistência a estes antimicrobianos. Resultados: O fenótipo de resistência a pelo

menos um dos carbapenens (imipenem e meropenem) e sensibilidade às

cefalosporinas de amplo espectro (cefepima e ceftazidima) foi confirmado em todos

isolados clínicos estudados. A resistência à ciprofloxacina e aos aminoglicosídeos foi

observada em cinco (20%) e dois (8%) desses isolados, respectivamente. A análise do

perfil eletroforético por PFGE permitiu o agrupamento dos isolados estudados em 17

padrões distintos sem a predominância de um perfil clonal. Nenhum isolado

apresentou atividade carbapenemase no teste de hidrólise, no entanto, no MALDI-TOF

quatro isolados apresentaram resultados duvidosos. Porém, a pesquisa de genes

codificadores de carbapenemases conhecidas foi negativa. Os genes cromossomais,

blaampC e blaOXA-50 foram amplificados entre as amostras estudadas e seu

sequenciamento revelou diversas mutações no gene blaOXA-50. O gene blaOXA-56 estava

presente em um isolado. A inibição in vitro da AmpC cromossomal e da expressão dos

sistemas de efluxo produziu uma variação de ≥ 2 diluições na CIMs dos

antimicrobianos testados para a maioria dos isolados testados. A média da expressão

relativa dos genes mexB, mexD, mexF e mexY nas 25 amostras de P. aeruginosa

foram 1,92; 2,69; 6,04 e 1,56, respectivamente, em relação à cepa referência PAO1. A

xix

β-lactamase AmpC estava hiperexpressa em 40% dos isolados de P. aeruginosa,

enquanto todos os isolados tiveram redução da expressão de OprD. Uma alteração

na banda de 46 kDa foi identificada pelo SDS-PAGE em todos isolados clínicos

estudados. Os cinco isolados resistentes à ciprofloxacina apresentaram mutação na

QRDR dos genes gyrA e parC e apenas um dos isolados resistentes aos

aminoglicosídeos carregava o gene de resistência rmtD. Conclusão: Nossos

resultados sugerem o envolvimento de múltiplos mecanismos cromossomais, como a

hiperexpressão da β-lactamase cromossomal AmpC e a redução da expressão de

OprD no fenótipo de resistência aos carbapenens e sensibilidade às cefalosporinas de

amplo espectro entre isolados clínicos de P. aeruginosa.

Introdução

1

1. INTRODUÇÃO

Pseudomonas aeruginosa é um dos principais agentes de infecção relacionada

à assistência a saúde em todo o mundo e no Brasil, estando principalmente associada

a infecções em pacientes imunocomprometidos (Stover et al., 2000). Com base nos

dados publicados pelo programa SENTRY de vigilância de resistência aos

antimicrobianos, na América Latina, P. aeruginosa é o patógeno mais frequente

isolado em casos de pneumonia; o terceiro patógeno mais frequente em infecções de

pele e tecidos moles e o quinto em infecções de corrente sanguínea (Gales et al.,

2012). P. aeruginosa é o quinto patógeno isolado em infecções de corrente sanguínea

segundo dados do programa SCOPE no Brasil (Marra et al., 2011).

A alta prevalência de infecções causadas por esses patógenos e sua grande

importância clínica são atribuídas a sua versatilidade, a sua capacidade de adaptação

à condições ambientais adversas, a sua resistência inata a múltiplos antimicrobianos,

e a sua capacidade de adquirir múltiplos genes de resistência (Poole, 2001).

A resistência intrínseca a diversas classes de antimicrobianos utilizados na

clínica se dá pela produção induzível da β-lactamase cromossomal AmpC, pela perda

ou diminuição da expressão de porinas e pela hiperexpressão de sistemas de efluxos

(Livermore & Woodford, 2006; Lister et al., 2009). No entanto, além da resistência

intrínseca apresentada por P. aeruginosa, essa espécie apresenta uma capacidade

importante de aquisição de outros genes de resistência, principalmente aqueles que

codificam distintas β-lactamases. A produção de β-lactamases é o principal

mecanismo de resistência aos β-lactâmicos em bactérias Gram-negativas (Livermore,

1995). Frequentemente, esses mecanismos coexistem em uma mesma cepa

bacteriana, o que confere resistência combinada a vários antimicrobianos (McGowan,

2006).

Os β-lactâmicos constituem a principal opção terapêutica para o tratamento das

infecções causadas por P. aeruginosa (Poole, 2004). No entanto, há aumento

gradativo da resistência aos β-lactâmicos, incluindo os carbapenens durante a última

Introdução

2

década nos países da América Latina, com maior proeminência no Brasil (Gales et al.,

2001; Andrade et al., 2003; Andrade et al., 2008; Gales et al., 2012). Os carbapenens

constituem uma importante opção terapêutica para o tratamento de infecções

causadas por P. aeruginosa, devido a sua estabilidade frente a uma ampla variedade

de β-lactamases em comparação aos outros antimicrobianos da classe dos β-

lactâmicos. Por essa razão, os carbapenens apresentam um particular valor no

tratamento de infecções causadas por bactérias resistentes a múltiplos

antimicrobianos e produtoras de β-lactamases (Hawkey et al., 2001).

Nos últimos anos tem-se observado uma disseminação de P. aeruginosa

produtoras de MβL, GES-5 e ESβL no Brasil. Para estas últimas, muitas vezes os

carbapenens ainda podem ser utilizados para o tratamento das infecções (Martins et

al., 2007; Picão et al., 2009; Polotto et al., 2012). Entretanto, o fenótipo de resistência

aos carbapenens e sensibilidade as cefalosporinas de amplo espectro, assim como

sensibilidade a outras classes de antimicrobianos, tem se tornado cada vez mais

comum. Juntamente a este fenótipo, questionamentos e dúvidas a respeito do

tratamento mais eficaz a ser adotado contra as infecções por microrganismos que

exibem esse fenótipo têm sido feitos.

Embora existam muitos estudos sobre resistência aos antimicrobianos em

isolados clínicos de P. aeruginosa, não há até o momento a descrição deste fenótipo

de resistência entre isolados clínicos de P. aeruginosa. Dada a importância dos

carbapenens no tratamento de infecções causadas por P. aeruginosa, é essencial que

se conheça os mecanismos envolvidos neste fenótipo incomum, assim como a

prevalência dos mesmos. O conhecimento destes mecanismos é de suma

importância, pois altas taxas de resistência aos carbapenens têm sido observadas em

P. aeruginosa e o tratamento das infecções causadas por estes patógenos restringem-

se às polimixinas.

Objetivos

3

2. OBJETIVOS

2.1 Objetivo Principal

Determinar os mecanismos de resistência que pudessem justificar o

fenótipo incomum, resistência aos carbapenens e sensibilidade as cefalosporinas de

amplo espectro, em isolados clínicos de Pseudomonas aeruginosa.

2.2 Objetivos Secundários

Confirmar o perfil de sensibilidade aos antimicrobianos nos isolados de

P. aeruginosa;

Determinar a relação genética entre os isolados de P. aeruginosa pela

técnica de PFGE;

Detectar o ponto isoelétrico (pI) dos isolados de P. aeruginosa;

Detectar a atividade enzimática contra os carbapenens nos isolados de

P. aeruginosa;

Pesquisar os genes codificadores de β-lactamases nos isolados de P.

aeruginosa;

Avaliar fenotipicamente a expressão das bombas de efluxo e da β-

lactamase cromossomal AmpC nos isolados de P. aeruginosa;

Avaliar a transcrição gênica dos sistemas de efluxo MexAB-OprM,

MexCD-OprJ, MexEF-OprN e MexXY-OprM, da β-lactamase cromossomal AmpC e da

proteína de membrana externa OprD nos isolados clínicos de P. aeruginosa;

Determinar o perfil de proteínas de membrana externa e a presença do

gene codificador da proteína de membrana externa OprD;

Pesquisar os mecanismos de envolvidos na resistência às

fluoroquinolonas e aminoglicosídeos.

Revisão Bibliográfica

4

3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

3.1 Pseudomonas aeruginosa

O gênero Pseudomonas pertence à família Pseudomonadaceae e no ano de

1992, foi subdividida em outros gêneros, como Burkholderia, Stenotrophomonas,

Comamonas, Shewanella, Ralstonia, Methylobacterium, Sphingomonas, Acidovorax e

Brevundimonas. O gênero Pseudomonas compreende cerca de duas mil espécies já

descritas, dentre elas P. aeruginosa, a espécie mais importante e estudada, P.

fluorescens, P. putida, P. stutzeri, P. alcaligenes (Moore et al., 2006; Murray et al.,

2010).

P. aeruginosa são bacilos Gram-negativos não fermentadores da glicose, não

esporulados e ligeiramente curvados. Medem aproximadamente 0,5 a 1 μm de largura

por 1,5 a 5 μm de comprimento e usualmente são móveis, possuindo um ou vários

flagelos polares. Podem ser isolado do solo, da água, de plantas e de animais. São

capazes de utilizar uma grande variedade de substratos orgânicos como fontes de

carbono e são oxidase positiva. Isolados de P. aeruginosa são estritamente aeróbios e

são facilmente reconhecidos pela sua morfologia característica, brilho metálico,

pigmentação e pelo forte odor de uva da sua colônia bacteriana (Gillardi, 1980;

Pollack, 2000; Koneman et al., 2001; Blondel-Hill et al., 2007).

Esta espécie produz quatro pigmentos importantes, são eles: piocianina (azul),

piomelanina (marrom-escuro/preto), piorrubina (vermelho) e pioverdina (amarelo-

esverdiado/fluorescente). Dentre estes pigmentos, a piocianina é encontrada em

aproximadamente 80% dos isolados de P. aeruginosa, já a piomelanina e piorrubina

são produzidos por menos de 2% dos isolados clínicos de P. aeruginosa. A pioverdina

pode ser encontrada em outras espécies fluorescentes de Pseudomonas spp. (Visca

et al., 1992; Pollack, 1995).

Raramente, P. aeruginosa causa infecções em indivíduos saudáveis, no

entanto, sua baixa necessidade de nutrientes para o crescimento, sua tolerância a

uma série de condições físicas adversas e sua resistência intrínseca e adquirida a


5

diversas classes de agentes antimicrobianos fez desta espécie um importante

patógeno relacionado à etiologia de infecções relacionadas à assistência à saúde

(Blondel-Hill et al., 2007; Pappas et al., 2009; Strateva & Yordanov, 2009).

3.2 Epidemiologia das Infecções causadas por Pseudomonas aeruginosa

P. aeruginosa é um patógeno oportunista humano ubíquo de grande valor

clínico e representa uma das principais causas de infecções relacionadas à

assistência a saúde. Apresenta uma grande capacidade de adaptação ao ambiente

hospitalar, sendo isolado de diversas fontes, incluindo equipamentos de ventilação

mecânica e de diálise (Mandell et al., 2010; Murray et al., 2010).

Isolados de P. aeruginosa podem colonizar transitoriamente o trato respiratório,

gastrointestinal e áreas úmidas de pacientes hospitalizados e a grande maioria dos

casos de infecção estão relacionados ao uso de dispositivos invasivos, como

pneumonia associada à ventilação mecânica, bacteremia associada ao uso de cateter

vascular e infecção urinária relacionada ao uso de sonda vesical (Almirante et al.,

2012; Medell et al., 2013; Ortega et al., 2013). Também esta relacionada à meningite

pós-neurocirurgica, endocardite e infecção de sítio cirúrgico (Chang et al., 2010; Sousa

et al., 2012; Mackenzie et al., 2013). Também é um importante patógeno relacionado à

fibrose cística (Hoban et al., 2003; Gibson et al., 2003; Psoter et al., 2013).

Dados do National Nosocomial Infections Surveillance System – NNIS (agora

denominado como National Healthcare Safety Network - NHSN) mostram que esse

patógeno é o terceiro agente mais frequentemente associado à pneumonia ou sítio

cirúrgico, o quarto patógeno mais frequente em infecção do trato urinário e o quinto

mais comum em hemoculturas de pacientes com sepse (Richards et al., 2000).

Um estudo publicado por Gales e colaboradores, em 2001, na qual foram

avaliadas amostras de P. aeruginosa isoladas de cinco regiões geográficas (Ásia-

Pacífico, Canadá, Europa, América Latina e Estados Unidos da América) mostrou que

as taxas de resistências aos β-lactâmicos entre os isolados de P. aeruginosa,


6

provenientes da América Latina, eram mais elevadas em comparação àquelas

apresentadas por isolados provenientes de outras regiões geográficas. Neste mesmo

estudo, a distribuição dos isolados de P. aeruginosa por sítio corpóreo de infecção foi

o mesmo para todas as regiões: trato respiratório, seguido por pele e tecidos moles,

urina e corrente sanguínea.

Ainda na América Latina, segundo dados do Programa de Vigilância de

Resistência a Antimicrobianos - SENTRY, P. aeruginosa foi o terceiro patógeno mais

frequentemente isolado, precedido apenas por Staphylococcus aureus e Escherichia

coli. Ainda de acordo com este estudo, este patógeno foi a causa mais frequente de

infecções do trato respiratório inferior, a terceira causa mais frequente de infecções

urinárias e de pele e tecidos moles e o quinto patógeno mais comum em infecções de

corrente sanguínea, no período entre 1997 e 2001 (Sader et al., 2004).

Além disso, dados do Programa SENTRY no Brasil, revelaram que 30,2% das

amostras de P. aeruginosa coletadas em centros brasileiros, entre 1997 e 2001, eram

resistentes aos carbapenens, e quando foram analisados isolados de pacientes

internados em unidades de terapia intensiva, esta taxa aumentava para 40% (Sader et

al., 2001).

Mais recentemente, outro estudo de Gales e colaboradores (2012), demonstrou

que P. aeruginosa foi o patógeno mais frequentemente isolado em pacientes com

pneumonia hospitalar, o terceiro patógeno mais frequente em pele e tecidos moles e o

quinto patógeno mais comum em infecções da corrente sanguínea. A taxa de

resistência a imipenem no Brasil aumentou do período de 1997-1999 (34,1%) em

relação ao período de 2003-2005 (42,0%), no entanto se manteve estável em relação

ao período de 2008-2010 (42,1%).

P. aeruginosa é considerado o patógeno mais frequentemente associado a

infecções por pacientes hospitalizados em Unidades de Terapia Intensiva (UTIs).

Segundo estudo do MYSTIC no Brasil, P. aeruginosa foi o patógeno mais

frequentemente recuperado (30,3%) e estava relacionada a infecções da corrente


7

sanguínea, trato respiratório, trato urinário e pele e tecidos moles. Sendo a taxa de

resistência a imipenem de 36,6% nestes isolados (Kiffer et al., 2005).

Segundo dados do programa SCOPE Brasil (The Brazilian Surveillance and

Control of Pathogens of Epidemiologic Importance), P. aeruginosa foi recuperado em

3,9% dos casos das infecções de corrente sanguínea em pacientes pediátricos, sendo

a resistência aos carbapenens superior a 20%. A taxa de mortalidade foi de 14,3% nas

infecções por P. aeruginosa (Pereira et al., 2013). Um estudo anterior do programa

SCOPE em 16 hospitais brasileiros demonstrou que P. aeruginosa foi o quinto (8,9%)

patógeno mais frequentemente recuperado de infecção de corrente sanguínea. Sendo

que 33,9%, 36,6%, 42,9%, 36,8% e 35,8% dos isolados eram resistentes à

piperacilina-tazobactam, ceftazidima, cefepime, imipenem e meropenem,

respectivamente (Marra et al., 2011).

Na maioria das vezes, as infecções causadas por esse patógeno são difíceis

de serem tratadas devido à resistência natural dessa espécie, bem como a sua notável

capacidade em adquirir novos genes de resistência a diversos grupos de

antimicrobianos.

3.3 Mecanismos de resistência em Pseudomonas aeruginosa

P. aeruginosa pode apresentar resistência a uma grande variedade de

antimicrobianos, entre eles os β-lactâmicos, aminoglicosídeos, fluoroquinolonas,

tetraciclinas e cloranfenicol. Dentre os mecanismos envolvidos, os principais são:

alteração na permeabilidade da membrana externa, hiperexpressão dos sistemas de

efluxo, produção de β-lactamases, enzimas modificadoras de aminoglicosídeos e

alteração do alvo das fluoroquinolonas (Livermore & Woodford, 2006; Lister et al.,

2009).

3.3.1 Produção de -Lactamases

Em bactérias Gram negativas, a produção de β-lactamases é o principal

mecanismo de resistência aos β-lactâmicos (Bush, 2001). Essas enzimas agem


8

inativando, pela catalisação do anel β-lactâmico, os β-lactâmicos antes que eles se

liguem as proteínas ligadoras de penicilinas (PBPs), que se localizam na membrana

celular interna (Bush et al., 1995; Livermore & Woodford, 2006). Em bactérias Gram

negativas, as β-lactamases se concentram no espaço periplasmático, diferentemente

das bactérias Gram positivas. O gene para a codificação das β-lactamases pode estar

localizado no DNA cromossômico, ou em plasmídeos e transposons, sendo estes

genes inatos ou adquiridos (Livermore, 1995).

As β-lactamases apresentam uma grande diversidade estrutural e de espectro

de atividade, fazendo que com isso, seja difícil estabelecer um sistema de

classificação. Atualmente, duas classificações têm sido consideradas como de maior

importância, as classificações de Ambler e a de Bush, Jacoby e Medeiros (Ambler,

1980; Bush et al., 1995), sendo que a última classificação foi revista em 2010 (Bush &

Jacoby, 2010).

As Classes A, C e D agem por meio de um mecanismo serino-dependente,

enquanto a classe B ou metalo--lactamases (ML) utiliza o zinco como co-fator para

sua ação hidrolítica (Ambler, 1980; Livermore, 1995). Um número significativo de -

lactamases de todas as classes moleculares são encontrados em P. aeruginosa,

incluindo as ESLs das classes A, B e D (Zhao and Hu, 2010).

3.3.1.1 Serino--Lactamases – Classe A

As enzimas classificadas nos grupos 2b e 2c incluem as β-lactamases de

espectro limitado e que são inibidas pelos inibidores de serino-β-lactamases. Essas

enzimas apresentam potente atividade contra as penicilinas e as cefalosporinas de

primeira e segunda geração. Entre as enzimas pertencentes ao subgrupo 2b, TEM-1,

TEM-2, TEM-90, TEM-110 e SHV-1 já foram identificadas em isolados clínicos de P.

aeruginosa, enquanto que, entre as β-lactamases pertencentes ao grupo 2c, as

variantes PSE-1, PSE-4, CARB-3, CARB-4 e AER-1 também já foram descritas nessa

espécie (Strateva & Yordanov 2009; Zavascki et al., 2010).


9

As β-lactamases de Espectro Ampliado (ESβLs) estão incluídas no grupo de

enzimas da classe A (subclasse 2be), que apresentam atividade hidrolítica contra as

penicilinas, às cefalosporinas e o aztreonam. A maioria dessas enzimas é sensível à

ação dos inibidores de serino-β-lactamase (Paterson & Bonomo, 2005). ESβLs foram

descritas inicialmente em Klebsiella pneumoniae e Escherichia coli e, posteriormente,

se disseminaram para as demais espécies de enterobactérias. No entanto, no início da

década de 90, a produção de enzimas do tipo ESβL passou a ser observada também

entre isolados clínicos de P. aeruginosa (Weldhagen et al., 2003) e, atualmente, já

foram descritas os seguintes grupos de ESβL de classe A em P. aeruginosa: TEM,

SHV, PER, VEB, GES, BEL e CTX-M (Strateva & Yordanov, 2009). No Brasil já houve

relatos de GES-1 e CTX-M-2 em isolados de P. aeruginosa (Castanheira et al., 2004a;

Pellegrino et al., 2006a; da Fonseca et al., 2007; Picão et al., 2009a; Picão et al.,

2009b).

As β-lactamases do tipo GES foram inicialmente classificadas como ESβL, no

entanto, variantes com atividade carbapenemase já foram descritas. São elas: GES-2

em P. aeruginosa na África do Sul, GES-5 no Brasil, GES-13 na Grécia e a GES-18 na

Alemanha (Picão et al., 2009b; Poirel et al., 2001; Kotsakis et al., 2010; Bebrone et al.,

2013).

As serino-carbapenemases ou carbapenemases de classe A pertencem ao

grupo 2f de Bush (Bush & Jacoby, 2010) e a classe molecular A de Ambler (Ambler,

1980). Dentre todas as carbapenemases de classe A descritas, as mais importantes e

disseminadas são as enzimas do tipo KPC (Klebsiella pneumoniae carbapenemase).

Essas β-lactamases têm sido descritas com maior frequência tanto em isolados

clínicos de enterobactérias, como em P. aeruginosa e Acinetobacter spp. (Queenan &

Bush, 2007; Robledo et al., 2010). São normalmente codificadas por genes localizados

em plasmídeos e hidrolisam todos os agentes β-lactâmicos, incluindo penicilinas,

cefalosporinas, monobactâmicos e carbapenens (Queenan & Bush, 2007). Estas

enzimas são inibidas pelos inbidores das serino-β-lactamase, como o ácido


10

clavulânico, o tazobactam e o sulbactam. Elas também são inibidas pelo ácido

borônico e seus derivados. KPC-2 foi reportada pela primeira vez em P. aeruginosa na

Colômbia em 2007, seguido por relatos em Porto Rico, Trindade e Tobago e nos

Estados Unidos (Akpaka et al., 2009; Poirel et al., 2010c; Robledo et al., 2011). No

Brasil, o primeiro relato de KPC-2 em isolados clínicos de P. aeruginosa ocorreu em

Recife (Jácome et al., 2012).

3.3.1.2 Metallo-β-lactamases (MβL) – Classe B

As MβLs classificadas no grupo funcional 3 e classe molecular B e são notáveis

por seu amplo espectro de atividade, podendo degradar todas as classes de β-

lactâmicos. Diferem-se das outras β-lactamases por: (i) requerem íons Zn+2 ou outros

cátions divalentes como cofator no sítio ativo; (ii) são resistentes à ação dos inibidores

das serino-β-lactamases, embora sofram inibição por agentes quelantes como o

EDTA, derivados do tiol e ácido dipicolínico; e (iii) não hidrolisam o monobactâmico

aztreonam (Payne et al., 1997; Walsh et al., 2005). As MβLs se dividem em dois

grupos, as MβLs intrínsecas, e as adquiridas ou móveis (Laraki et al., 1999; Chen et

al., 2003; Bebrone, 2007).

O grupo das MβLs é representado por enzimas, como: IMP (imipenemase

metallo-β-lactamase), VIM (Verona imipenemase metallo-β-lactamase), SPM (São

Paulo metalo-β-lactamase), GIM (German imipenemase metallo-β-lactamase), SIM

(Seul imipenemase metallo-β-lactamase), NDM (New Delhi metallo-beta-lactamase),

AIM (Australian imipenemase metallo-β-lactamase), KHM-1 (Kyorin Health Science

metallo-β-lactamase), DIM-1 (Dutch Imipenemase metallo-β-lactamase), SMB-1

(Serratia metallo-β-lactamase), TMB-1 (Tripoli metallo-β-lactamase) e, mais

recentemente a FIM-1 (Florence imipenemase metallo-β-lactamase) (Osano et al.,

1994; Lauretti et al., 1999; Toleman et al., 2002; Castanheira et al., 2004b; Lee et al.,

2005a; Yong et al., 2009; Yong et al., 2012; Sekiguchi et al., 2008; Poirel et al., 2010b;

Wachino et al., 2011; El Salabi et al., 2012; Pollini et al., 2013).


11

As MβLs têm sido descritas em diversas espécies bacterianas, tais como:

Pseudomonas spp., Acinetobacter spp. e membros da família Enterobacteriaceae

(Poirel et al., 2000; Riccio et al., 2000; Yan et al., 2001). Estes genes estão inseridos,

quase sempre, em elementos genéticos móveis. Em isolados de Pseudomonas spp. já

foram descritas as MβLs IMP, VIM, SPM-1, GIM-1, AIM-1, TMB-1 e FIM-1, sendo que

no Brasil já foram descritas as variantes IMP-1, IMP-16, IMP-18, VIM-2 porém

isolados produtores de SPM-1 são os mais frequentes devido à disseminação de um

único clone no território brasileiro (Mendes et al., 2004; Mendes et al., 2007; Xavier et

al., 2006; Gales et al., 2003; Zavascki et al., 2005; Carvalho et al., 2006; Pellegrino et

al., 2006b; Cipriano et al., 2007).

3.3.1.3 -Lactamase cromossomal AmpC – Classe C

Assim como algumas espécies da família Enterobacteriaceae (Citrobacter

freundii, Enterobacter spp., Serratia marcescens, Providencia stuartii, e Morganella

morganii), P. aeruginosa, produz uma β-lactamase cromossomal AmpC induzida que

pertence ao grupo funcional 1 ou classe molecular C (Bush et al., 1995; Jacoby, 2009;

Philippon et al., 2002). A atividade da β-lactamase cromossomal AmpC não é inibida

por inibidores de β-lactamase utilizados na prática clínica.

A β-lactamase cromossomal AmpC ou cefalosporinase cromossomal

normalmente é produzida em pequenas quantidades e determina resistência apenas

às penicilinas, à maioria das cefalosporinas de primeiras gerações e às cefamicinas

(Langaee et al., 2000). Entretanto, na presença de um β-lactâmico indutor

(especialmente imipenem) a produção desta enzima pode aumentar de 100 a 1000

vezes (Bagge et al., 2002; Ni et al., 2005). Esse fenótipo é conhecido como

desreprimido e pode levar à resistência às cefalosporinas de quarta geração (Jacobs

et al., 1997; Schmidtke & Hanson, 2006; Jacoby, 2009).

Esta β-lactamase é codificada pelo gene ampC (Lodge et al., 1993) e três

genes, principalmente, estão envolvidos no mecanismo de indução: ampG, ampD e

ampR (Lodgee & Piddock, 1991; Jacobs et al., 1997). Os mecanismos de regulação da


12

β-lactamase cromossomal AmpC em P. aeruginosa é semelhante aquele descrito em

E. cloacae e está intimamente ligado a reciclagem do peptideoglicano (Jacobs et al.,

1994; Höltje et al., 1994; Normark, 1995).

O gene, ampG, codifica uma proteína transmembrana envolvida na

permeabilidade do tripeptídeo N-acetilglucosamina(GluNac)-1,6-anhMurNac, que é

convertido em uma molécula sinalizadora citoplasmática para indução da β-lactamase

cromossomal AmpC (Dietz, et al., 1996). Sem o gene ampG, nem a indução e nem os

altos níveis de expressão seriam possíveis (Korfmann & Sanders, 1989; Dietz, et al.,

1997). O segundo gene, ampD, codifica uma proteína citosólica, N-acetilmuramil-L-

alanina amidase, que hidrolisa o tripeptídeo 1,6-anhidro-N-acetilmuramico, atuando

como um repressor da expressão ampC (Höltje et al., 1994; Jacobs et al., 1994;

Jacobs et al., 1995). A inativação da proteína AmpD leva a uma hiperprodução semi-

constitutiva ou hiperinduzida de AmpC em P. aeruginosa PAO1 (Langaee et al., 2000).

A mutação no gene ampD que resulta na expressão de β-lactamases, mesmo na

ausência de um indutor, coincide com o acumulo do tripeptídeo 1,6-anhMurNac

(Jacobs et al., 1995). O terceiro gene envolvido, ampR, é adjacente à ampC,

entretanto é transcrito de forma oposta, e codifica um ativador transcricional, membro

da família LysR (AmpR). Este regulador é necessário para a indução da β-lactamase

(Lodge et al., 1993). Na ausência de um β-lactâmico indutor, AmpR reprime a síntese

de β-lactamase em 2,5 vezes, enquanto que a expressão e induzida de 10 a 200

vezes na presença do β-lactâmico indutor (Lindberg & Normark, 1987; Jacobs et al.,

1997). Recentemente foi demonstrado que P. aeruginosa tem três homólogos de

AmpD, a proteína AmpD, AmpDh2 e AmpDh3, que são responsáveis por um

mecanismo de regulação positiva levando a hiperexpressão constitutiva desta

cefalosporinase (Juan et al., 2006).

Um quarto gene, ampE, forma um operon ampDE e codifica uma proteína de

membrana citoplasmática, que atua como um molécula sensorial necessária para a

indução (Honore et al., 1989).


13

Estudos recentes mostram que outros genes podem estar envolvidos na

expressão da -lactamase cromossomal AmpC. O gene dacB codifica a proteína de

ligação à penicilina 4 (PBP-4) e a inactivação do gene dacB resulta em um alto nível

de resistência aos β-lactâmicos e a hiperprodução de AmpC (Moyá et al., 2009). O

gene nagZ codifica uma β-N-acetil-D-glucosaminidase, e inativação deste gene em P.

aeruginosa parece diminuir a resistência aos β-lactâmicos (Asgarali et al., 2009). A

inativação de nagZ em dacB ou ampD mutantes impede a hiperexpressão de ampC,

no entanto, a inativação deste gene não parece prejudicar a indução da AmpC

(Zamorano et al., 2010). Vários sistemas parecem estar envolvidos na expressão e

indução do gene ampC, e ainda não é totalmente compreendido o sistema de

regulação deste gene.

A resistência ou sensibilidade intermediária ao imipenem em isolados clínicos

de P. aeruginosa pode estar relacionado com a desrepressão da β-lactamase

cromossomal AmpC associada a modificação estrutural ou perda da OprD (Gutiérrez

et al., 2007). Em 2009, foram descritas as AmpCs de espectro ampliado (ESAC -

Extended-Spectrum AmpC). Neste estudo as CIMs para ceftazidima e imipenem

tiveram redução na presença de cloxacilina. O gene, ampC, apresentava uma

mutação ocasionando a substituição de um aminoácido específico (T105A) no sítio ativo

da enzima, resultando na ampliação do espectro hidrolítico da enzima, sendo,

portanto, capazes de hidrolisar cefepima e o imipenem (Rodriguez-Martinez et al.,

2009a).

3.3.1.4 Oxacilinases (OXA) – Classe D

As oxacilinases estão incluídas na classe D de Ambler e seu grupo funcional

apresentado pelas classificações 2d (oxacilinases de espctro restrito), 2de (β-

lactamases de espectro ampliado - ESβL) e 2df (Carbapenem- Hydrolyzing Class D β-

Lactamase - CHDLs). As OXAs receberam essa designação por apresentarem

atividade hidrolítica potente contra as penicilinas resistentes à ação das penicilinases

(oxacilinases, cloxacilina e meticilina). Uma característica importante deste grupo é de


14

ser fracamente inibida pelo ácido clavulânico e fortemente inibida pelo cloreto de sódio

(Poirel et al., 2010a).

As oxacilinases podem ser divididas em quatro subgrupos: OXA-1, OXA-2,

OXA-10 e outros (Poirel et al., 2010a). Sendo que o grupo da OXA-10 constitui as β-

lactamases do tipo OXA mais prevalentes entre isolados clínicos de P. aeruginosa. No

entanto, recentemente foi observado pela análise da similaridade das sequências de

nucleotídeos que as oxacilinases poderiam ser divididas em 10 grupos, sendo eles:

OXA-1, OXA-2, OXA-5, OXA-10, OXA-18, OXA-20, OXA-45, OXA-46, OXA-50 e OXA-

198 (Petrolini et al., 2013). A OXA-56, uma oxacilinase do grupo da OXA-10, foi

descrita em um isolado de P. aeruginosa produtor de SPM-1 no Brasil. Esta enzima

apresenta espectro hidrolítico restrito. Este gene esta relacionado com a disseminação

de SPM-1 e rmtD em P. aeruginosa no nosso país (Poirel et al., 2004a). As ESβLs do

tipo OXA hidrolisam muito bem a oxacilina e a cloxacilina e não apresentam

similaridade genética com as demais ESβLs e são mais frequentemente descritas em

P. aeruginosa (Poirel et al., 2010a).

Em P. aeruginosa, ocorre uma oxacilinase cromossômica e intrínseca,

denominada OXA-50, pertencente ao subgrupo 2df. Esta oxacilinase apresenta uma

diminuição na sensibilidade à ampicilina e ticarcilina e, curiosamente, a moxalactam e

meropenem. É uma oxacilinase de espectro restrito (Girlich et al., 2004). Já foram

descritas 10 variantes desta OXA, denominadas, OXA-50a a OXA-50j (Empel et al.,

2007; Seok et al., 2011).

Até o momento somente a variante de CHDLs, OXA-24/40, foi descrita em dois

isolados clínicos de P. aeruginosa na Espanha (Sevillano et al., 2009), sendo estas

CHDLs, mais frequentes em isolados de A. baumannii. No entanto, a OXA-198

descrita em um isolado de P. aeruginosa, é uma carbapenemase também pertencente

ao subgrupo 2df e que apresenta resistência à maioria dos β-lactâmicos, incluindo o

imipenem, mas apresentou uma sensibilidade intermediária ao meropenem. Contudo,

o isolado manteve-se sensível à ceftazidima e ao aztreonam (El Garch et al., 2011).


15

3.3.2 Hiperexpressão de Sistemas de Efluxo

A resistência inata em isolados de P. aeruginosa é em grande parte

determinada pela interação entre a baixa permeabilidade da membrana externa e o

efluxo ativo de antimicrobianos (Livermore, 2002). Sistemas de bombas de efluxo são

um importante mecanismo não enzimático de resistência aos β-lactâmicos em P.

aeruginosa. Esses sistemas contribuem também para o desenvolvimento da

resistência múltipla a todos antimicrobianos com ação frente à Pseudomonas spp..

Os sistemas de efluxo são classificados levando em consideração três critérios

básicos: (i) a fonte de energia utilizada pelo sistema, (ii) a relação filogenética com

outros sistemas de efluxo e (iii) a especificidade de substratos. São agrupados em

cinco famílias: ABC ("ATP binding cassette"), MFS ("major facilitator superfamily"),

SMR ("small multidrug resistance"), MATE ("multidrug and toxic compound extrusion")

e RND ("resistance-nodulation division"), distribuídos tanto em bactérias Gram

negativas, como também em Gram positivas (Piddock, 2006; Lister et al., 2009).

A família RND de sistemas de efluxo é a que possui especificidade a um maior

número de substratos e engloba antimicrobianos de relevância clínica. Desempenha

um importante papel na resistência intrínseca e adquirida em diversas bactérias Gram

negativas. Geralmente, os genes que codificam os sistemas de efluxo pertencentes a

essa família estão localizados no cromossomo bacteriano (Piddock, 2006).

A habilidade do sistema de efluxo em reconhecer um grande número de

compostos é, provavelmente, devido à hidrofobicidade, à aromaticidade e ao caráter

ionizável (Saier et al., 1998). A grande maioria dos antimicrobianos são anfifílicos

(possuem características hidrofílicas e hidrofóbicas), sendo assim, facilmente

reconhecidos por varias bombas de efluxo (Kaatz, 2002). No entanto, cada sistema de

bomba de efluxo tem afinidade preferencial por determinados antimicrobianos. As

fluoroquinolonas são substratos universais de todas as bombas do tipo Mex (Piddock,

2006).


16

Enquanto as outras famílias de efluxo são constituídas por um componente

simples, a família RND é baseada na abertura de um canal que atravessa as

membranas interna e externa bacteriana. Esse canal é um sistema de três

componentes. O primeiro componente é uma proteína, que é a bomba propriamente

dita, localizada na membrana citoplasmática, dependente de energia, e funciona como

elemento transportador (MexB, MexD, MexF, MexY); o segundo componente é uma

proteína de membrana externa, denominada porina (OprM, OprJ, OprN, OpmB,

OmpG, OmpI). A terceira proteína localiza-se no espaço periplasmático e liga os

outros dois componentes (MexA, MexC, MexE, MexY) (Livermore, 2002). Os genes

que codificam esses sistemas estão organizados em operons, nos quais o primeiro

codifica a proteína periplasmática, o segundo a proteína transportadora e o terceiro

gene codifica a proteína de membrana externa (Lister et al., 2009).

Dez desses sistemas foram caracterizados até o momento: MexAB-OprM

(ABM), MexCD-OprJ (CDJ), MexEF-OprN (EFN), MexXYOprM (XY), MexJK-OprM,

MexGHI-OpmD, MexVW-OprM, MexPQ-OpmE, MexMN-OprM e TriABC-OpmH (Lister

et al., 2009; Strateva & Yordanov 2009). Apenas os sistemas de efluxo ABM, CDJ,

EFN e XY têm sido relacionados à resistência intrínseca e adquirida a uma ampla

variedade de agentes antimicrobianos de importância clínica em P. aeruginosa.

MexAB-OprM

MexAB-OprM é o sistema de efluxo mais importante em P. aeruginosa. É

expresso constitutivamente e desempenha um importante papel na resistência

intrínseca e adquirida a múltiplos antimicrobianos (Masuda et al., 2000). Os substratos

preferenciais de ABM são variados e esta bomba ejeta: β-lactâmicos, os inibidores de

β-lactamases, fluoroquinolonas, macrolídeos, tetraciclinas, cloranfenicol entre outros

(Narita et al., 2003). Entre os β-lactâmicos ejetados estão os carbapenens, exceto o

imipenem, devido à diferença na sua estrutura química (Yoneyama et al., 2000;

Livermore, 2002; Strateva & Yordanov, 2009).


17

A hiperexpressão desse sistema pode ser observada em três tipos mutantes:

nalB, nalC e nalD. Os mutantes nalB apresentam alterações no gene mexR localizado

à montante do operon mexAB-oprM, que codifica uma proteína repressora da sua

transcrição (Saito et al., 1999; Saito et al., 2001). Os mutantes nalC apresentam o

gene mexR intacto, mas no entanto apresentam uma uma mutação no gene PA3721,

também chamado de nalC. A proteína codificada por este gene atua como um

repressor que aparentemente, possui a capacidade de inibir a atividade de MexR

(Srikumar et al., 2000; Cao et al., 2004). Mais recentemente, mutantes nalD foram

encontrados. Eles apresentam uma mutação no gene PA3574, qua atua ligando-se a

região promotora, aumentando a expressão do sistema ABM (Sobel et al., 2005).

MexCD-OprJ

O sistema CDJ não é expresso constitutivamente em P. aeruginosa, e assim

não contribui para a resistência intrínseca. Porém, a hiperexpressão do sistema

MexCD-OprJ pode ser observada entre isolados clínicos de P. aeruginosa com

mutações no gene nfxB, repressor da transcrição desse sistema de efluxo, localizado

na região à montante do operon MexCD-OprJ (Poole et al., 1996). Este sistema de

efluxo exportam predominantemente quinolonas, tetraciclinas, cloranfenicol,

acriflavina, entre outros (Masuda et al., 1996; Poole et al., 1996; Li et al., 2000).

Mesmo esse sistema não possuindo como substrato preferencial os agentes β-

lactâmicos, ele é capaz de extruir cefalosporinas, especialmente, as de quarta geração

(Strateva & Yordanov, 2009).

Mutantes nfxB podem apresentar sensibilidade à carbenicilina, à ceftazidima,

ao aztreonam e aos aminoglicosídeos, provavelmente pela diminuição da expressão

de ABM, decorrente do mecanismo de corregulação da expressão desses sistemas

(Poole et al., 1996; Lister et al., 2009, Masuda et al., 2000).

MexEF-OprN

A expressão de MexEF-OprN ocorre em cepas selvagens de P. aeruginosa em

baixos níveis. A transcrição deste sistema é dependente da presença de MexT, uma


18

proteína ativadora da sua transcrição, codificada por um gene localizado à montante

do operon MexEF-OprJ. A transcrição de mexT é suficiente para ativar a expressão

desse operon (Maseda et al., 2004). Este sistema é expresso em cepas denominadas

nfxC, que apresentam resistência a múltiplas drogas como às fluoroquinolonas, ao

cloranfenicol e ao trimetoprim, como consequência da ejeção direta, e indiretamente

ao imipenem (Hooper et al., 1992; Fukuda et al., 1995). Os mutantes nfxC,

apresentam aumento da sensibilidade aos β-lactâmicos e aos aminoglicosídeos, por

meio da diminuição da expressão de outros sistemas como ABM e XY (Okamoto et

al., 2002; Wolter et al., 2004a).

A resistência ao imipenem exibida pelos mutantes nfxC pode ser explicada pela

redução da expressão de OprD, já que acredita-se que MexT possui uma função

regulatória repressora, implicando na inibição pós-transcricional da expressão da

porina OprD (Kolayli et al., 2004; Wolter et al., 2004a; El AN et al., 2005). Em mutantes

nfxC, que hiperexpressam EFN foi observado o aumento da expressão de fatores de

virulência em P. aeruginosa (Maseda et al., 2004).

MexXY-OprM

O operon mexXY, diferentemente dos outros sistemas de efluxo em P.

aeruginosa, não possui o gene codificador de proteína de membrana externa. Para

esta função utiliza a OprM, que exerce o mesmo papel de canal ejetor como nos

outros sistemas de efluxo (Poole 2001). A deleção de mexXY aumenta a sensibilidade

aos aminoglicosídeos, à tetraciclina e à eritromicina, indicando que esse sistema é

responsável pela resistência intrínseca de P. aeruginosa a esses antimicrobianos

(Aires et al., 1999). Quando o sistema XY está hiperexpresso foi notada uma

diminuição na sensibilidade às fluoroquinolonas e, portanto, esra classe de

antimicrobianos constitui substrato para este sistema (Mine et al. 1999).

Mutações inativadoras no gene mexZ, localizado à montante do operon, levam

a hiperexpressão de XY, em decorrência da perda de sua atividade repressora. A

resistência aos β-lactâmicos, como a cefepima e a cefpiroma, está associada à


19

hiperexpressão desse sistema de efluxo, sendo o principal mecanismo responsável

pelo fenótipo de resistência à cefepima e sensibilidade à ceftazidima em isolados

clínicos de P. aeruginosa (Masuda et al., 2000; Hocquet et al., 2006).

MexJK-OprM

O sistema MexJK foi identificado como resultado da exposição ao triclosan,

uma droga com atividade antibacteriana, selecionando assim, a mutação do gene

mexL, cujo produto de sua expressão exerce a função regulatória do operon mexJK-

opmD (Chuanchuen et al., 2001; Chuanchuen et al., 2005b). Esse sistema,

diferentemente dos outros, utiliza diferentes proteínas de membrana externa,

dependendo do composto a ser ejetado. Para a ejeção de eritromicina e tetraciclina é

utilizada a OprM, enquanto que OmpH é utilizada para a extrusão de triclosan

(Chuanchuen et al., 2005a).

MexGHI-OpmD

O sistema MexGHI-OpmD contém além dos três componentes uma pequena

proteína, MexG, cuja função é desconhecida. Esse sistema confere resistência à

norfloxacina, brometo de etídio, acriflavina e rodamina 6G (Aendekerk et al., 2002).

MexVW-OprM

O MexVW foi o sistema de efluxo da família RND mais recentemente

caracterizado e confere resistência às fluoroquinolonas, à tetraciclina, ao cloranfenicol,

à eritromicina, ao brometo de etídio e à acriflavina (Li et al., 2003).

3.3.3 Impermeabilidade de Membrana Externa

As bactérias Gram negativas possuem em sua composição uma membrana

externa que fisiologicamente, caracteriza-se por ser a primeira linha de defesa contra

compostos tóxicos. Esta membrana é composta por fosfolipídeos, lipopolissacarídeos

e por proteínas de membrana externa (OMP, outer membrane protein) (Hancock &

Brinkman, 2002).

As OMPs, conhecidas como porinas, são responsáveis por controlar a

passagem, seletiva, de compostos, incluindo os antimicrobianos. Essas proteínas


20

formam canais constituídos de água no seu interior, permitindo a difusão passiva de

solutos hidrofílicos e a extrusão de produtos não utilizados pela célula bacteriana

(Nikaido, 1994). A perda das porinas ou até mesmo a diminuição da expressão dos

genes codificadores destas, acarretam a redução da entrada do antimicrobiano na

célula, diminuindo assim, a sua concentração interna e contribuindo para o mecanismo

de resistência aos β-lactâmicos (Quinn et al., 1988; Hancock & Brinkman, 2002).

As porinas das bactérias Gram negativas vem sendo classificadas segundo sua

atividade, estrutura funcional, regulação e expressão (Pagès et al., 2008). Em isolados

de P. aeruginosa diferentes porinas podem ser encontradas, como, OprC, OprD, OprE

e OprF (Fung-Tomc et al., 1995, Huang & Hancock, 1996, Livermore, 2001).

OprF é a porina mais abundante na membrana externa de P. aeruginosa,

sendo provavelmente a mais utilizada na difusão dos β-lactâmicos para o interior da

célula. Muitos estudos sugerem que a OprF se assemelha a OmpA de E. coli na

estrutura e também na função (Hancock & Brinkman, 2002). OprC e OprE são canais

inespecíficos (Vila & Marco, 2002).

A OprD (conhecida também por D2) é uma porina, de aproximadamente 46

kDa, substrato-específica que facilita a difusão de aminoácidos e antimicrobianos para

dentro da célula. A principal função fisiológica da OprD é permitir a passagem passiva

dos aminoácidos básicos através da membrana externa. Esta porina é capaz de

permitir a entrada de carbapenens, mas não de outros β-lactâmicos (Yoshihara et al.,

1996). A perda da OprD ou a expressão reduzida do gene oprD, tem contribuído para

a resistência ao imipenem (Livermore, 2001). Estudos revelaram que os loops 2 e 3 da

proteína OprD são a entrada e/ou sítio de ligação para o imipenem. Assim, qualquer

mutação ou deleção nesses loops, poderia resultar na resistência ao imipenem (Ochs

et al., 2000; Pirnay et al., 2002; Chevalier et al., 2007). Sua associação com à

hiperexpressão de sistemas de efluxo, acarreta na diminuição significativa da

sensibilidade de P. aeruginosa a essa classe de antimicrobianos, afetando mais o

imipenem que o meropenem (Lister et al., 2009; Köhler et al., 1999). Vários estudos


21

demonstraram a seleção de isolados com mutações na OprD durante o tratamento

com imipenem das infecções causadas por P. aeruginosa (Cometta et al., 1994;

Jaccard et al., 1998; Zanetti et al., 2003).

A afinidade e a capacidade de difusão do imipenem através desta porina são

quase setenta vezes mais elevadas que para o meropenem (Nikaido et al., 1991).

Enquanto a concentração inibitória mínima (CIM) de imipenem dos isolados oprD

mutantes variam na faixa de 8 - 32 μg/mL as CIMs para meropenem são 2 - 4 μg/mL

(Köhler et al., 1999,. Pai et at., 2001).

Um estudo, demonstrou a presença de 19 proteínas com similaridade à porina

OprD. Pela análise filogenética foi possível identificar dois grupos distintos, sendo um

grupo menor que possuía alta similaridade com a porina OprD e um outro grupo que

possuia maior semelhança com a porina Phak de P. putida. Seis proteínas descritas

em P. aeruginosa (OpdJ, OpdI, OpdR, OpdO, OpdD e OpdQ) parecem ter surgido a

partir de eventos de duplicação, apresentando funções exclusivas para P. aeruginosa.

Além disso, nenhuma dessas seis proteínas homólogas a porina OprD foram

relacionadas à resistência aos antimicrobianos até o momento (Tamber et al., 2006).

A resistência antimicrobiana mediada por OprD pode envolver mecanismos que

diminuem a transcrição do gene oprD e/ou mutações que podem interromper o

funcionamento da porina na membrana externa (Lister et al., 2009). Alguns desses

mecanismos já foram caracterizados, sendo: (i) interrupção da transcrição da porina,

por meio de inserções e deleções na região à montante do gene promotor oprD; (ii)

transcrição imatura do gene oprD; (iii) deficiência na função da porina causada por

mutações, inserções e/ou deleções do gene e a presença de “stop codons”; (iv) e

disrruptura estrutural do gene oprD pela adição de elementos de inserção. Assim

como, a diminuição da transcrição por corregulação com mecanismos que conferem

resistência a metais ou com o sistema de efluxo MexEF-OprN (Evans & Segal, 2007;

Wolter et al., 2004b; Perron et al., 2004; Caille et al., 2007; Lister et al., 2009).


22

A perda de porinas menos específicas, pode afetar o transporte de pequenos

agentes hidrofílicos, tais como os aminoglicosídeos, as tetraciclinas e o cloranfenicol

(Zavascki et al.,2010).

3.3.4 Alteração das Proteínas Ligadoras de Penicilinas (PBPs)

As proteínas ligadoras de penicilinas (PBPs) constituem o sítio de ação para a

classe de antimicrobianos dos β-lactâmicos. Essas enzimas estão envolvidas nas

etapas finais da síntese do peptideoglicano, sítio onde se ligam covalentemente aos β-

lactâmicos impedindo a formação da parede celular e levando à lise osmótica da

célula (Strateva & Yordanov, 2009).

O número de PBPs pode variar de acordo com cada espécie e são

denominadas numericamente de acordo com o peso molecular; quanto maior o peso

molecular, menor a numeração que recebem (Poole 2004; Zapun et al., 2008). Sete

PBPs diferentes já foram descritas em P. aeruginosa, são elas: 1a, 1b, 2, 3, 4, 6 e 7.

As PBP-1a, -1b, -2 e -3 desempenham funções essenciais e não essenciais para a

viabilidade da célula. Os carbapenens possuem afinididade pela PBP-2, enquanto as

cefalosporinas se ligam à PBP-3 (Poole, 2004; Strateva & Yordanov 2009; Zavascki et

al., 2010).

Apesar de relatos pouco frequentes, alterações nas PBPs já foram descritas

em isolados clínicos de P. aeruginosa. Alteração na PBP-4 em isolados de P.

aeruginosa após tratamento com imipenem e com piperacilina/tazobactam. E a

associação da produção da PBP-3 aumentada com a resistência aos β-lactâmicos

(Farra et al., 2008). Em 2012, Moyá e colaboradores notaram uma tendência para o

aumento da expressão da PBP-2 (imipenem) e da PBP-3 (ceftazidima e imipenem) em

isolados de P. aeruginosa apresentando resistência aos β-lactâmicos.

3.3.5 Resistência aos Aminoglicosídeos

A resistência aos aminoglicosídeos em P. aeruginosa está frequentemente

relacionada com a produção de enzimas modificadoras de aminoglicosídeos, seja pela

acetilação, fosforilação e/ou adenilação. Mas pode estar relacionada também a


23

alteração da permeabilidade de membrana, bombas de efluxo e, mais dificilmente, a

modificação do seu sítio de ação (Vakulenko & Mobashery, 2003; Poole, 2005; Magnet

& Blanchard, 2005).

Existem três classes de enzimas modificadoras de aminoglicosídeos (AMEs):

acetiltransferases (AAC), adeniltransferases (ANT), fosfostransferases (APH). Essas

enzimas são codificadas por genes localizados em plasmídeos, transposons ou

integrons (Poole, 2005). AMEs são comuns em isolados de P. aeruginosa,

especialmente AAC (6’)-I (resistência à tobramicina, netilmicina e amicacina); AAC

(6’)-II (resistência à gentamicina, netilmicina e tobramicina); AAC (3)-I (resistência à

gentamicina); AAC (3)-II (resistência à gentamicina, netilmicina e tobramicina); ANT

(2’)-I (resistência à gentamicina e tobramicina) e APH(3’)-II (resistência à canamicina e

neomicina (Vanhoof et al., 1993; Miller et al., 1997; Torres et al., 2000; Llano-Sotelo et

al., 2002).

A metilação do gene 16S rRNA surgiu recentemente como um novo

mecanismo de resistência aos aminoglicosídeos em bactérias Gram negativas (Doi &

Arakawa, 2007). Os genes das 16S rRNA metilases são geralmente localizados em

integrons, transposons e plasmídeos. Desde sua primeira descrição em 2003, 8 genes

de 16S rRNA metilase foram descritos: armA, rmtA, rmtB, rmtC, rmtD, rmtE, rmtF e

npmA, de varias regiões geográficas (Yokoyama et al., 2003; Wachino & Arakawa,

2012). As 16S rRNA metilases conferem elevado nível de resistência a todos os

aminoglicosídeos. Já sendo descritos em isolados de P. aeruginosa, RmtA (Yamane et

al., 2004; Jin et al., 2009), RmtB (Zhou et al., 2010), RmtD (Doi et al., 2007a; Doi et al.,

2007b; Lincopan et al., 2010), e ArmA (Gurung et al., 2010; Zhou et al., 2010). Sendo

que a RmtD está frequentemente relacionada com a coprodução de SPM-1 e ArmA

com a coprodução de IMP-1 (Doi et al., 2007a; Gurung et al., 2010).

Em 2007 El' Garch e colaboradores (2007) mostraram que o acúmulo de

mutações nos genes galU, nuoG, mexZ e rplY leva a um aumento progressivo na

resistência aos aminoglicosídeos. Mutações no gene galU levam a alterações no LPS


24

e, com isso, prejudicam a ligação dos aminoglicosídeos à superfície celular. A

ausência da expressão de nuoG inativa um complexo enzimático que contribui

significativamente para o gradiente eletroquímico da célula e, assim, prejudica a

absorção dos aminoglicosídeos. Os genes mexZ e rplY estão envolvidos na

hiperexpressão do sistema de efluxo MexXY-OprM ( El' Garch et al., 2007).

3.3.6 Resistência às Fluoroquinolonas

O alvo das fluoroquinolonas nas bactérias Gram negativas são as

topoisomerases tipo II (DNA-girase) e a topoisomerase IV. O principal mecanismo de

resistência de P. aeruginosa as fluoroquinolonas são as mutações nos genes que

codificam a DNA-girase. Essas mutações ocorrem nas regiões determinantes de

resistência às quinolonas (QRDRs) dos genes gyrA e parC. O alvo principal é a gyrA,

sendo as mutações no gene parC secundárias, mas geralmente associadas a níveis

mais altos de resistência. Ocorrem de maneira acumulativa através de mutações

simples no alvo primário da droga (Yonezawa et al., 1995; Zhao et al., 1997; Hawkey,

2003). Existem alguns relatos de sensibilidade reduzida devido a mutações no gene

gyrB (Le Thomas et al., 2001).

Sistemas de bombas de efluxo também estão envolvidos na resistência às

fluoroquinolonas em P. aeruginosa. Enquanto cada bomba de efluxo tem um conjunto

preferencial de substratos, as fluoroquinolonas são substratos para os quatro

principais sistemas de efluxo identificados em P. aeruginosa (Masuda et al., 2000).

Mutações nos genes reguladores mexR e nfxB, das bombas de efluxo MexAB-OprM e

MexCD-OprJ, respectivamente, estão relacionados a expressão aumentada destes

sistemas e envolvidos com a resistência às fluoroquinolonas (Higgins et al., 2003).

Um novo membro das bombas de efluxo da família RND, MexVW-OprM, foi

descrita em P. aeruginosa em 2003. Esta bomba confere resistência às

fluoroquinolonas, assim como, a outras classes de drogas (Li et al., 2003). A

resistência de alto nível às fluoroquinolonas em isolados de P. aeruginosa esta


25

atribuída à interação das mutações no QRDR e os sistemas de bomba de efluxo

(Nakajima et al., 2002; Wang et al., 2007).

Recentemente, a resistência às fluoroquinolonas mediada por plasmídeos foi

reportada em membros da família Enterobacteriaceae. O gene responsável por esta

resistência é chamado qnr (quinolone resistance), sendo já descrito os genes qnrA,

qnrS, qnrB, qnrC, qnrD e qnrVC (Ruiz et al., 2012). Em adição aos genes qnr, há

também, outro gene plasmidial, chamado aac(6’)-Ib-cr, capaz de inativar por

acetilação, antimicrobianos de duas classes diferentes, aminoglicosídeos e

fluoroquinolonas. Duas bombas de efluxo plasmidiais, QepA e OqxAB, que atuam por

um mecanismo seletivo, já foram descritas (Périchon et al., 2007; Hansen et al., 2004).

No entanto, até o momento não há nenhum relato desses genes plasmidiais em

isolados de P. aeruginosa (Luzzaro, 2008; Coban et al., 2011).

3.4 Opções Terapêuticas para o Tratamento das Infecções por Pseudomonas

aeruginosa

As opções terapêuticas para o tratamento de infecções causadas por P.

aeruginosa muitas vezes são limitadas devido ao fato deste patógeno ser

intrinsecamente resistente a diversos antimicrobianos. Além disso, este microrganismo

é altamente adaptável às condições adversas, podendo desenvolver resistência

durante a terapia antimicrobiana à maioria dos antibióticos (Carmeli et al., 1999;

Tenover, 2006). Juntamente com estes fatores, o desenvolvimento de novos

antimicrobianos não ocorre na mesma velocidade (World Health Organization, 2012).

Os antimicrobianos da classe dos β-lactâmicos que apresentam atividade

contra P. aeruginosa e podem ser utilizados clinicamente são: as penicilinas, ticarcilina

e piperacilina, e suas respectivas associações com inibidores de β-lactamase (ácido

clavulânico e o tazobactam); as cefalosporinas de amplo espectro como a ceftazidima,

a cefepima e a cefoperazona; o monobactam aztreonam; e os carbapenens imipenem,

meropenem e doripenem.


26

Dentre os antimicrobianos não β-lactâmicos, podem ser utilizadas as

fluoroquinolonas, entre eles, ciprofloxacina, levofloxacina e moxifloxacina e em

associação aos β-lactâmicos, os aminoglicosídeos, como, gentamicina, tobramicina e

amicacina, na tentativa de potencializar a atividade antimicrobiana e de evitar o

desenvolvimento de resistência (Giamarellou & Kanellakopoulou, 2008; Pappas et al.,

2009).

No entanto, no panorama atual de resistência em P. aeruginosa, o tratamento

se restringe muitas vezes a drogas com alta toxicidade, como as polimixinas B e E

(colistina) (Zavascki et al., 2010).

Material e Métodos

27

4. MATERIAL E MÉTODOS

4.1 Amostras Bacterianas

Foram avaliadas 25 (vinte e cinco) amostras clínicas de P. aeruginosa isoladas

de diferentes sítios de infecção (Tabela 1) de três diferentes hospitais da cidade de

São Paulo. Os isolados foram previamente triados como resistentes aos carbapenens

e sensíveis as cefalosporinas de amplo espectro, e assim, foram encaminhados ao

Laboratório ALERTA para caracterização dos mecanismos envolvidos neste fenótipo.

Tabela 1. Isolados de P. aeruginosa selecionados para este estudo de acordo com o sítio de

Infecção e os Hospitais de isolamento.

Isolados Número do

Banco

Iniciais do

Paciente

Data de

coleta Sítio de Infecção

Hospital de

Procedência

P1 P12070 J.A.N. 07.05.12 Secreção Traqueal H1

P2 P12119 J.A.O. 13.06.12 Secreção Traqueal H1

P3 P12255 J.D.T. 14.09.12 Urina H1

P4 P12249 A.E. 04.06.12 Secreção Traqueal H2

P5 P12713 A.C.C. 28.01.13 Ponta de Cateter H3


P7 P12715 M.R.V. 28.01.13 Urina H3

P8 P12716 C.S.S. 31.01.13 Hemocultura H3


P10 P12718 I.R. 07.02.13 Urina H3

P11 P12719 V.A.B. 08.02.13 Secreção Traqueal H3


P13 P12721 A.C.L. 09.02.13 Lavado Bronco-Alveolar H3


P15 P12723 D.G.O. 19.02.13 Secreção Traqueal H3

P16 P12724 B.S. 19.02.13 Secreção Traqueal H3

P17 P12725 B.S. 21.02.13 Lavado Bronco-Alveolar H3

P18 P12726 SN_M.F.O.S. 24.02.13 Urina H3

P19 P12727 A.R.P.G 24.02.13 Secreção Traqueal H3

P20 P12728 C.S.F. 25.02.13 Secreção Traqueal H3

P21 P12729 A.C.L. 01.03.13 Secreção Traqueal H3

P22 P12730 D.S.L. 01.03.13 Ponta de Cateter H3

P23 P12731 A.J. 02.03.13 Urina H3

P24 P12732 M.J.S. 11.03.13 Secreção Traqueal H3

P25 P12733 SN_M.F.O.S. 13.03.13 Hemocultura H3

Material e Métodos

28

As amostras clínicas de P. aeruginosa avaliadas neste estudo foram isoladas

em três hospitais terciários, que atendem casos de alta complexidade na cidade de

São Paulo. Os três hospitais situam-se na Zona Sul da cidade e estão contidos em um

raio de aproximadamente 4 Km.

As amostras foram posteriormente bancadas em Tryptic Soy Broth – TSB

(Oxoid, Basingstoke, Inglaterra) com 15% de glicerol a -70ºC, no banco de

microrganismos do Laboratório Especial de Microbiologia Clínica (LEMC) e

subcultivadas por duas vezes em ágar sangue antes da realização dos testes, para a

garantia da pureza e viabilidade das amostras.

4.1.1 Identificação dos isolados de P. aeruginosa por Matrix-assisted laser

desorption ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS)

A identificação dos isolados de P. aeruginosa foi confirmada pela técnica de

Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-

TOF MS) de acordo com o estabelecido por Claydon e colaboradores (1996), que

consiste em identificar o gênero e a espécie do microrganismo estudado através da

ionização de suas proteínas por tiros de raio laser.

A extração das proteínas foi feita de acordo com as normas do fabricante

(Bruker Daltonics, Bremen, Alemanha). Em um tubo de microcentrífuga, 20 colônias

foram diluídas em 300 µL de água destilada, agitada e em seguida foram adicionados

900 µL de etanol absoluto. A mistura foi submetida à agitação cuidadosa e

centrifugada a 13.000 rpm durante 2 minutos. O sobrenadante foi descartado e o

sedimento foi ressuspenso em 50 µL de ácido fórmico à 70% (v/v), com formação de

bolhas. Após, foi acrescentado a essa suspensão 50 µL de acetonitrila pura e a

mistura homegeneizada. Esta solução foi centrifugada a 13.000 rpm durante 2

minutos. Um volume de 1 µL do extrato de proteínas, em triplicata, de cada amostra foi

colocada em uma placa de aço inoxidável fornecida pelo fabricante e após a secagem

à temperatura ambiente, foi acrescentado 1 µL de matriz (ácido α-ciano-4-

hidroxicinâmico, HCCA - 10 mg/mL; Bruker Daltonics, Bremen, Alemanha) em todas

Material e Métodos

29

as amostras, incluindo o calibrante. Após secar a temperatura ambiente, a placa foi

colocada no aparelho Bruker Daltonics Microflex LT MALDI-TOF para a leitura (Bruker

Daltonics, Bremen, Alemanha).

Os espectros de massa gerados para cada amostra foram comparados com

uma série de espectros depositados no banco de dados do software Biotyper MALDI

2.0 (Bruker Daltonics, Bremen, Alemanha) para a determinação do gênero e da

espécie bacteriana. A interpretação dos critérios de identificação bacteriana utilizados

foram aqueles especificados pelo próprio fabricante, onde: scores ≥ 2.300 foram

considerados como identificação altamente confiável para a espécie (+++), entre 2.000

e 2.299 foram consideradas como indentificação confiavél para o gênero bacteriano e

provável para espécie bacteriana (++). Scores entre 1.700 e 1.999 foram considerados

como identificação confiável apenas para o gênero bacteriano (+), enquanto scores de

identificação abaixo de 1.699 foram considerados como não confiáveis (-), não sendo

possível realizar a identificação bacteriana.

4.2 Avaliação do Perfil de Sensibilidade in vitro aos antimicrobianos

O perfil de sensibilidade aos antimicrobianos foi determinado pela técnica de

microdiluição em caldo de acordo com as recomendações do Clinical and Laboratory

Standards Institute (CLSI). Os agentes antimicrobianos testados foram: amicacina

(Sigma-Aldrich, St. Louis, USA), aztreonam (Bristol-Myers Squibb, Nova York, EUA),

ceftazidima (Strides Arcolab, Bangalore, Índia), cefepima (Bristol-Myers Squibb, Nova

York, EUA), ciprofloxacino (Fresenius Robi, Alemanha), gentamicina (Sigma-Aldrich,

St. Louis, USA), imipenem (Merck Sharp, Nova Jersey, EUA), meropenem (Astra

Zeneca, Londres, Inglaterra), piperacilina/tazobactam (Novafarma, Goiás, Brasil) e

sulfato de polimixina B (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA). As concentrações testadas

para cada antimicrobiano podem ser vistas na Tabela 2.

Material e Métodos

30

Tabela 2. Concentrações testadas na microdiluição em caldo dos antimicrobianos utilizados no

estudo.

Classe Antimicrobianos Concentrações

(μg/mL)

Aminoglicosídeos Amicacina 0,125 -128

Gentamicina 0,06 – 64

Monobactâmico Aztreonam 0,03 – 32

Cefalosporinas Ceftazidima 0,03 – 32

Cefepima 0,03 – 32

Fluoroquinolonas Ciprofloxacino 0,03 – 32

Carbapenens Imipenem 0,03 – 64

Meropenem 0,03 – 64

Combinação β-lactâmico/Inibidor de β-lactamase Piperacilina/Tazobactam 0,125/4 – 128/4

Lipopeptídeos Polimixina B 0,03 – 64

Para o controle de qualidade, foram incluídas nos testes de sensibilidade, as

cepas da American Type Culture Collection (ATCC) de E. coli ATCC 25922, P.

aeruginosa ATCC 27853 e Staphylococcus aureus ATCC 29213.

A solução mãe de cada antimicrobiano foi preparada em água ultrapura, numa

concentração 200 vezes superior aquela desejada na placa de microdiluição, e diluída

1:10 em caldo Mueller-Hinton – MH (Oxoid, Basingstoke, Inglaterra) para obtenção da

maior concentração de cada antimicrobiano a ser testado. A partir dessa diluição,

foram realizadas diluições seriadas e 100 μL de cada diluição foi dispensado na placa

de microdiluição. As placas foram armazenadas em freezer -70°C até a realização dos

testes, exceto para os carbapenens (imipenem e meropenem) e polimixina B. Após o

crescimento bacteriano em placas de ágar sangue por 18 horas, 3 a 5 colônias

isoladas foram transferidas para tubos contendo 5 mL de caldo MH a uma turbidez

correspondente à escala 0,5 de McFarland (1.5 x 108 UFC/mL).

Um volume de 32 μL da suspensão bacteriana foi diluído em 968 μL de caldo

MH fresco. Posteriormente, 500 μL desta suspensão foi transferido para um tubo

contendo 4,5 mL de caldo MH, para obtenção de uma concentração bacteriana em

torno de 5 x 105 UFC/mL. Um volume de 100 µL desse inóculo bacteriano foi utilizado

para inocular a placa de microdiluição contendo 100 µL dos antimicrobianos a uma

concentração duas vezes maior que a concentração desejada, de modo que a

Material e Métodos

31

concentração final bacteriana foi de aproximadamente 2,5 x 105 UFC/mL. As placas

foram incubadas a 37 °C, em aerobiose por 16-20 horas. Após esse período a leitura

foi realizada por inspeção visual.

A concentração inibitória mínima (CIM) foi considerada como a menor

concentração capaz de inibir completamente o crescimento bacteriano. Após o

resultado final, as amostras foram classificadas como sensíveis (S), intermediárias (I)

ou resistentes (R) aos antimicrobianos testados de acordo com os critérios

estabelecidos pelo CLSI para P. aureginosa (CLSI, 2013) (Tabela 3).

Tabela 3. Pontos de cortes utilizados para a interpretação das CIMs de P.

aeruginosa segundo o CLSI 2013.

Antimicrobianos Breakpoints (μg/mL)

Sensível Intermediário Resistente

Amicacina ≤16 32 ≥64

Gentamicina ≤4 8 ≥16

Aztreonam ≤8 16 ≥32

Ceftazidima ≤8 16 ≥32

Cefepima ≤8 16 ≥32

Ciprofloxacino ≤1 2 ≥4

Imipenem ≤2 4 ≥8

Meropenem ≤2 4 ≥8

Piperacilina/tazobactam ≤16/4 32/4 – 64/4 ≥128/4

Polimixina B ≤2 4 ≥8

4.3 Análise da relação genética por Pulsed-Field Gel Electrophoresis

(PFGE)

Para avaliar a relação genética entre os isolados de P. aeruginosa avaliados

neste estudo foi utilizada a técnica de análise do DNA cromossômico por eletroforese

de campo pulsado Pulsed-Field Gel Electrophoresis – PFGE (Pfaller et al. 1992), com

o objetivo de verificar se a disseminação de um clone não poderia ser responsável

pelo perfil de resistência encontrado.

Material e Métodos

32

4.3.1 Preparação dos blocos de gel de agarose

As amostras foram incubadas por 18-24 horas em 10 mL de caldo Luria-Bertani

– LB (Oxoid, Basingstoke, Inglaterra) e, então, centrifugadas por 20 minutos a 3.000

rpm. O sobrenadante foi desprezado e o precipitado, contendo as células bacterianas,

diluído em 1 mL de solução salina 0,85% (m/v) , homogeneizado e transferido para

tubo de microcentrífuga previamente pesado.

Os tubos foram centrifugados por 5 minutos a 12.000 rpm e o sobrenadante

removido. O material centrifugado (sedimento bacteriano) foi diluído em solução

salina, na proporção 1:1 entre o volume do diluente e o peso do material obtido pela

centrifugação, calculado pela diferença de peso do microtubo previamente pesado e

do peso do mesmo contendo o pellet. Após minuciosa homogeneização, 40 L da

mistura foi transferido para outro tubo contendo 300 L de tampão TEN (Tris 100 mM

pH 7,5; EDTA 100 mM, NaCl 150 mM) e 340 L de agarose de baixo ponto de fusão

foi adicionado e aplicado em moldes para a formação de blocos de gel contendo as

células bacterianas.

Após solidificação a temperatura ambiente por alguns minutos, os blocos foram

incubados a 37 ºC, por no mínimo 4 horas em solução EC (Tris 6 mM pH 6,5, NaCl 1

M; EDTA 0,01 M, Brij 58 0,5%, Sarcosil 0,5% e Deoxiglicolato 0,2%). A solução EC foi

removida e substituída por 2 mL de solução ES (EDTA 0,4 M pH 9,3 e Sarcosil 10%)

contendo 1 mg/mL de proteinase K (USB Corporation, Cleveland, EUA). As amostras,

então, foram incubadas por 12 horas a 50ºC. Após o tratamento com proteinase K,

foram realizadas quatro lavagens com CHEF-TE (Tris 0,1 M pH 7,5, EDTA 0,1 M), de

30 a 60 minutos cada. Os blocos foram armazenados em CHEF-TE, a 5 oC, até o

momento da digestão do DNA bacteriano.

Material e Métodos

33

4.3.2 Digestão do DNA bacteriano

O DNA bacteriano contido nos blocos de agarose foi submetido à clivagem com

SpeI, a 37 ºC por 12-18 horas, de acordo com instruções do fabricante (New England

Biolabs, Ipswich, EUA).

4.3.3 Eletroforese em campo pulsátil

A eletroforese foi realizada em gel de agarose 1%, em TBE 0,5x (Tris 0,089 M,

ácido bórico 0,089 M e EDTA 0,002 M), no sistema CHEF-DR III (BioRad Laboratories,

Califórnia, EUA) à temperatura de 13oC e utilizando corrente elétrica de 200 Volts

(6V/cm). O gel foi corado com brometo de etídio 0,08 μL/mL e fotografado sob

iluminação ultravioleta em transiluminador (BioRad Laboratories, Califórnia, EUA).

O gel foi analisado utilizando os critérios de Tenover et al. (1995) e pelo

programa BioNumerics versão 5.0 (Applied Maths, Kortrijk, Belgium) para avaliar o

grau de similaridade genética entre os isolados avaliados.

Segundo Tenover e colaboradores (1995), as amostras foram consideradas

idênticas quando apresentaram perfil eletroforético idêntico (todas as bandas). As

amostras que apresentaram diferenças do perfil de até seis bandas foram

consideradas semelhantes (subtipos) e pertencentes a um mesmo clone. As amostras

que apresentaram sete ou mais bandas discordantes foram consideradas amostras

genotipicamente distintas. No programa BioNumerics, a definição de bandas foi

realizada automaticamente pelo programa e depois conferida individualmente, por

comparação visual. O coeficiente de similaridade que foi utilizado é o coeficiente de

Dice (Dice, 1945). O dendrograma foi construído utilizando o algoritmo de análise

filogenética UPGMA - Unweighted Pair-Groups Method using arithmetic averages

(Sneath & Sokal, 1973). Os valores de otimização e tolerância utilizados para o

conjunto de isolados foram de 0,8% e 1,0%, respectivamente. Amostras com

coeficiente de similaridade acima de 80% foram consideradas relacionadas e

pertencentes ao mesmo clone “cluster”.

Material e Métodos

34

4.4 Focalização do ponto isoelétrico (pI)

Para focalização do pI foram utilizados extratos proteicos dos isolados de P.

aeruginosa. As amostras bacterianas foram cultivadas em ágar sangue para

isolamento de colônias. Com o auxilio da alça de semeadura, 10 a 15 colônias foram

suspensas em 10 mL de TSB e incubadas por 18 horas a 37 °C. Apos a incubação, as

amostras foram centrifugadas por 15 minutos a 3.000 rpm e o centrifugado foi

ressuspenso em 1 mL de tampão (Tris HCl 1mM e ZnSO4 1mM). O inóculo foi ultra-

sonicado quatro vezes por 30 segundos, com amplitude de até 40% (Sonics Vibra

CellTM; Newtown, EUA), e centrifugado a 13.000 rpm por 15 minutos a 4 °C. O

sobrenadante foi transferido para um novo tubo e as amostras mantidas no gelo até o

momento do ensaio.

Um volume de 10 μL do extrato proteico bruto contendo as possíveis β-

lactamases foi misturado em placa de microdiluição com β-lactâmico cromogênio,

nitrocefin (Nitrocefin 0,5 mg/mL, pH 7.0). Um volume de 1 μL, 3 μL, 5μL, 7 μL e 10 μL

do extrato proteico foi pipetado gradativamente nas células que continham nitrocefin,

para a determinação do volume adequado a ser utilizado de cada amostra no gel de

pI.

A focalização foi realizada em géis de poliacrilamida com intervalo de pH entre

3,5 - 9,5 (Amersham Pharmacia Biotech, NJ, EUA), utilizando o sistema Multiphor II

Electrophoresis System (Pharmacia Biotech), seguindo os parâmetros de corrida

eletroforética adequados ao intervalo de pH presente no gel. O gel foi revelado com

500 mM de nitrocefin (Becton Dickinson Microbiology Systems, Cockeysville, MD). O

extrato proteico de bactérias sabidamente produtoras de β-lactamases com pontos

isoelétricos conhecidos foram utilizados como controles (TEM-1, pI = 5,4; FOX-5, pI =

7,2; SHV-5, pI =7,8), e o posicionamento das bandas foi utilizado para cálculo do pI

das β-lactamases presentes nas amostras testadas utilizando o teste de regressão

linear do pacote de análises estatísticas do programa Excel (Microsoft™, Washington,

EUA).

Material e Métodos

35

4.5 Teste in vitro de Hidrólise aos Carbapenens

A hidrólise dos carbapenens foi utilizada para a detecção da atividade

enzimática nos isolados de P. aeruginosa. Como controles positivos foram utilizadas

as cepas de K. pneumoniae produtora de KPC-2 e de A. baumannii produtora de OXA-

23. Foram utilizadas duas técnicas distintas: espectrofotometria e espectrometria de

massas.

4.5.1 Teste de Hidrólise Enzimática por Espectrofotometria

Após o isolamento da amostra em ágar MacConkey – MC (Oxoid, Basingstoke,

United Kingdom) 10 colônias foram inoculadas em 10 mL de caldo TSB contendo 0,5

µg/mL de imipenem, em estufa a 37 °C em agitação durante 12 horas. A suspensão

bacteriana foi centrifugada por 15 minutos a 6.000 rpm, e, em seguida, o sobrenadante

foi desprezado e o sedimento ressuspendido em 1 mL de tampão de amostra (Tris-

HCL 1mM e ZnSO4 1mM, pH 7,0). As amostras suspensas, então, foram

ultrasonicadas 30 segundos por 4 vezes, e o produto centrifugado a 13.000 rpm por 3

minutos a 4 ºC. O sobrenadante foi transferido para um novo tubo e as amostras

mantidas no gelo até o momento do ensaio.

Uma solução de imipenem e meropenem foi então preparada em tampão de

amostra de forma a se obter 1,5 a 2 unidades de absorbância a um comprimento de

onda de 299 nm. Para o teste, foi adicionado a uma cubeta de quartzo 940 μL de

tampão de amostra e 50 μL do extrato proteico. Esta mistura foi homogeneizada

através de inversão da cubeta e a leitura de absorbância foi zerada. A seguir, 10 μL da

solução do antimicrobiano foi adicionado a cubeta, e após nova homogeneização, o

monitoramento da absorbância da solução foi realizado no espectrofotômetro Biomate

5 UV Visible (Termo Spectronic, Cambridge, Inglaterra) por 5 minutos a 299 nm. A

diminuição gradativa da absorbância e valores negativos de variação de absorbância

(Δabs/min, calculada por meio da diferença entre o valor de absorbância final e

absorbância inicial após 5 minutos) foi considerada resultados positivos, isto é,

hidrólise do agente β-lactâmico por uma carbapenemase.

Material e Métodos

36

4.5.2 Teste de Hidrólise por Matrix-assisted laser desorption ionization

time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS)

Após o isolamento da amostra em ágar MH (Oxoid, Basingstoke, United

Kingdom), 25 colônias foram inoculadas em 1 mL de tampão de solução (Tris-HCl 20

mM, pH 6,8) contendo 1 mg/ml de imipenem e incubada por 2 horas, sob agitação. A

suspensão bacteriana foi centrifugada a 13.000 rpm por 5 minutos, e, em seguida, 1 µl

do sobrenadante, em triplicata, de cada amostra foi colocada em uma placa de aço

inoxidável fornecida pelo fabricante e após a secagem em temperatura ambiente,

acrescentado 1 µl de matriz (ácido α-ciano-4-hidroxicinâmico, HCCA - 10 mg/mL;

Bruker Daltonics, Bremen, Alemanha) sobre todas as amostras como recomendado

pelo fabricante. Após secar a temperatura ambiente, a placa foi colocada no aparelho

Bruker Daltonics Microflex LT MALDI-TOF para a leitura (Bruker Daltonics, Bremen,

Alemanha).

A hidrólise do imipenem foi considerada positiva se o pico de massa da

molécula intacta (300,4 m/z) desapareceu e nenhum pico adicional foi observado

(Sparbier et al., 2011)

4.6 Detecção de Genes Codificadores de β-lactamases

4.6.1 Técnica da reação em cadeia da polimerase (PCR)

A pesquisa dos genes de resistência aos antimicrobianos codificados por β-

lactamases e carbapenemases foi realizada pela técnica da reação em cadeia da

polimerase (PCR) convencional ou multiplex, de acordo com os genes pesquisados.

O DNA das amostras bacterianas foi extraído utilizando o kit QIAamp DNA Mini

Kit (Quiagen, Courtaboeuf, France) de acordo com as recomendações do fabricante.

Para cada reação foram utilizados 50 ƞg do DNA das amostras estudadas para as

reações de PCR. As reações de PCR foram preparadas em fluxo laminar, com volume

final igual a 50 µL, contendo: 25 µL de master-mix 2x (GoTaqR Green Master Mix,

Promega, Madison, EUA), 1.25 µM de cada oligonucleotídeo iniciador (Integrate DNA

Material e Métodos

37

Technologies, IDT, EUA); água estéril (Water, Molecular Biology Grade, Eppendorf

AG, Hamburg, Alemanha) q.s.p 50 µL. Foram pesquisados os genes codificadores de:

(a) cefalosporinases (blaAMPC); (b) serino-β-lactamases (blaTEM, blaSHV, blaGES, blaCTX-M,

blaBES, blaPER, blaKPC, blaSME); (c) oxacilinases (blaOXA-1, blaOXA-2, blaOXA-3, blaOXA-5, blaOXA-

7, blaOXA-18, blaOXA-45, blaOXA-46, blaOXA-50, blaOXA-23, blaOXA-24, blaOXA-51, blaOXA-58, blaOXA-20,

blaOXA-48, blaOXA-62, blaOXA-143, blaOXA-198); (d) metalo-β-lactamases (blaIMP, blaVIM, blaSPM,

blaGIM, blaSIM, blaNDM) e (e) integrons de classe 1. As condições de termociclagem do

DNA (Eppendorf, Hamburg, Alemanha) e os oligonucleotídeos iniciadores,

selecionados de acordo com os genes pesquisados, estão apresentados na Tabela 4

e 5.

A revelação dos produtos da PCR foi realizada por meio de eletroforese em gel

de agarose (UltrapureTM Agarose, Invitrogen, Carlsbad, EUA), sendo utilizada a

concentração de 2% para PCR multiplex e 1% para PCR convencional. As condições

de corrida foram: 110 V por 40 minutos em tampão TBE 0,5X (89 nM Tris-Borato e 2

mM EDTA pH 8.0). Como marcador de peso molecular, foi utilizado DNA ladder 100

pares de base (Invitrogen, Carlsbad, EUA). O gel foi corado com brometo de etídio

(2,5 μg/mL) e as bandas foram visualizadas sob luz ultravioleta - 320 nm (GelDoc

Quantity One; Bio-Rad Laboratories, EUA). As cepas controle utilizadas nas reações

de PCR estão listadas na Tabela 6.

Material e Métodos

38

Tabela 4. Oligonucleotídeos iniciadores utilizados para a amplificação dos genes codificadores de β-lactamases pela técnica de PCR convencional e/ou

multiplex neste estudo.

Tipo de reação

de PCR

Oligonucleotídeos

iniciadores Sequência (5’ – 3’) Gene alvo Amplicom (pb) Condições de termociclagem Referência

PC

R

con

ven

cio

nal

Am

pC

PreAmpC ATG CAG CCA ACG ACA AAG G

blaAMPC 1.243

Desnaturação: 95ºC - 10 min

Desnaturação: 95ºC - 30 s

Anelamento: 54ºC - 30 s

Extensão: 72ºC – 45s

30 ciclos

Extensão final: 72ºC - 10 min.

Rodríguez-Martínez et

al. 2009a

PostAmpC CGC CCT CGC GAG CGC GCT TC

PC

R m

ult

iple

x

Ser

ino

-β-l

acta

mas

es

MTEM F CCC TTA TTC CCT TTY TTG CGG blaTEM-like 650





30 ciclos


Este estudo

MTEM R AAC CAG CCA GCC WGA AGG

MSHV F CTT GAC CGC TGG GAA ACG G blaSHV-like 200

MSHV R AGC ACG GAG CGG ATC AAC GG

MGES F AGC AGC TCA GAT CGG TGT TG blaGES-like 750

MGES R CCG TGC TCA GGA TGA GTT G

MCTX-1 e 2 F ATG TGC AGY ACC AGT AA blaCTX-M-1 876

MCTX-1 e 2 R CGC TGC CGG TTT TAT CSC CC

MCTX-8 F AAC RCR CAG ACG CTC TAC blaCTX-M-8 512

MCTX-8 R TCG AGC CGG AAS GTG TYA T

MCTX-14 F GGT GAC AAA GAG ART GCA ACG GAT blaCTX-M-14 333

MCTX-14 R TTA CAG CCC TTC GGC GAT GA

PC

R c

on

ven

cio

nal

Ser

ino

-β-

lact

amas

es

BES-F GGC GCA ATA CAA CGA AGG

blaBES 227

Denaturação: 94ºC – 10 min

Denaturação: 94ºC – 30 seg

Anelamento: 53ºC – 1 min

Extensão: 72ºC – 1 min

35 ciclos

Este estudo BES-R ATC TTG CAG TAC CAG TCG

PER-F CGC TTC TGC TCT GCT GAT blaPER 500

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Rodr%C3%ADguez-Mart%C3%ADnez%20JM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19258272


Material e Métodos

39

PER-R GGCAGCTTCTTTAACGCC Extensão final: 72ºC – 10 min.

PC

R M

ult

iple

x O

xaci

linas

es

OXA-1_multi-F TAT CTA CAG CAG CGC CAG TG blaOXA-1-like 601




Extensão: 72ºC - 1 min

35 ciclos


Este estudo

OXA-1_multi-R TGC ACC AGT TTT CCC ATA CA

OXA-2_multi-F CGA TAG TTG TGG CAG ACG AA blaOXA-2-like 504

OXA-2_multi-R TCT TTG CAC GCA GTA TCC AG

OXA-5_multi-F TGG CAC AGA ATC AAG TCC TG blaOXA-5 146

OXA-5_multi-R TTG CCA TGA TTT TCG TTG AA

OXA-7_multi-F TTT TCA AAT GGG ACG GAA AG blaOXA-7-like 237

OXA-7_multi-R CCA CTT GAT TAA CTG CGG AAA

OXA-18_multi-F ATG CAA CGG AGC CTG TCC blaOXA-18 806

OXA-18_multi-R GGC AGG GTG TTG AGG AAC T

OXA-45_multi-F GCA GAT GCT CGA ATG CAC blaOXA-45 705

OXA-45_multi-R GGC AAT GCC TTG AGG AAG

OXA-46_multi-F GAT CAG CGA TGC GAA ATT CT blaOXA-46-like 318

OXA-46_multi-R ACC AGC CAA ACC TGC CTT C

PC

R

con

ven

cio

nal

Oxa

cilin

ase OXA-50_seq-F ATG CGC CYY CTC YTC TTS

blaOXA-50-like 789





35 ciclos


Este estudo

OXA-50_seq-R TCA GGG CAG YAY SCC SAG RG

PC

R c

on

ven

cio

nal

Co

nte

xto

gen

étic

o

IntI-1-F GCC TGT TCG GTT CGT AAG CT Intl1

-




Extensão: 72ºC - 2 min e 30 s

35 ciclos


Toleman et al., 2006

QAC-R CGG ATG TTG CGA TTA CTT CG QacE∆1

Material e Métodos

40

Tabela 5. Oligonucleotídeos iniciadores utilizados para a amplificação dos genes codificadores de β-lactamases tipo carbapenemase neste estudo pela

técnica de PCR convencional e/ou multiplex.

Tipo de reação

de PCR

Oligonucleotídeos


PC

R m

ult

iple

x

Met

allo

-β-l

acta

mas

es

IMP-F1 mult GAA TAG RRT GGC TTA AYT CTC blaIMP-like 188




Extensão: 72ºC – 45 s

35 ciclos


Mendes et al., 2007

IMP-R1 mult CCA AAC YAC TAS GTT ATC

SPM-F1 mult CTA AAT CGA GAG CCC TGC TTG blaSPM-1 382

SPM-R1 mult CCT TTT CCG CGA CCT TGA TC

SIM-F1 mult GTA CAA GGG ATT CGG CAT CG blaSIM-1 798

SIM-R1 mult TGG CCT GTT CCC ATG TGA G

VIM-F2 mult GTT TGG TCG CAT ATC GCA AC blaVIM-like 569

VIM-R2 mult AAT GCG CAG CAC CAG GAT AG

GIM-F1 mult TCA ATT AGC TCT TGG GCT GAC blaGIM-1 72

GIM-R1 mult CGG AAC GAC CAT TTG AAT GG

16S-8 F AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG Controle

Interno 1.000

16S-1493 R ACG GCT ACC TTG TTA CGA CTT

PC

R

con

ven

cio

nal

Met

allo

-β-

lact

amas

es

Pre-NDM-F GGC GTT AGA TTG GCT TAC ACC

blaNDM-like 1.146




Extensão: 72ºC – 1min 30 s

35 ciclos


Este estudo

Pre-NDM-R CTG GGT CGA GGT CAG GAT AG

PC

R c

on

ven

cio

nal

Ser

ino

-β-

lact

amas

es

KPC-F TCG CTA AAC TCG AAC AGG

blaKPC 762





35 ciclos

Extensão final: 72ºC – 10 min.

Este estudo

KPC-R TTA CTG CCC GTT GAC GCC CAA TCC

SME-F AAC GGC TTC ATT TTT GTT TAG

blaSME 830 SME-R GCT TCC GCA ATA GTT TTA TCA

Material e Métodos

41

PC

R M

ult

iple

x O

xaci

linas

es

OXA 23-F GAT CGC ATT GGA GAA CCA GA blaOXA-23 501



Anelamento: 52ºC – 40 seg

Extensão: 72ºC – 50 seg

35 ciclos


Woodford et al., 2006

OXA 23-R ATT TCT GAC CGC ATT TCC AT

OXA 24-F GGT TAG TTG GCC CCC TTA AA blaOXA-24 246

OXA 24-R AGT TGA GCG AAA AGG GGA TT

OXA 51-F TAA AGC TTT GAT CGC CCT TG blaOXA-51 353

OXA 51-R TGG ATT GCA CTT CAT CTT GG

OXA 58-F AAG TAT TGG GGC TTG TGC TG blaOXA-58 599

OXA 58-R CCC CTC TGC GCT CTA CAT AC

PC

R c

on

ven

cio

nal

Oxa

cilin

ases

OXA-20_seq-F TTG ATA ATC CGA TTT CTA GCA CTG blaOXA-20-like 801





35 ciclos


Este estudo OXA-20_seq-R CTA GTT GGG TGG CAA AGC AT

OXA-48-F TTGGTGGCATCGATTATCGG blaOXA-48 743 Poirel et al., 2004b

OXA-48-R GAGCACTTCTTTTGTGATGGC

OXA-62-F ACG CAC GCA AAC CTA TCA

blaOXA-62





35 ciclos


Schneider et al. 2006

OXA-62-R ATG TTG ATC GCG ACG CTG

PreOXA-143 A AGT TAA CTT TCA ATA ATT G blaOXA-143





35 ciclos


Higgins et al., 2009 PreOXA-143 B TTG GAA AAT TAT ATA ATC CC

OXA-198_seq-F ATG CAT AAA CAC ATG AGT AAG CTC blaOXA-198 789 Este estudo

OXA-198_seq-R TTA TTC GAT GAT CCC CTT TGC

Material e Métodos

42

Tabela 6. Cepas controles utilizadas neste estudo para a detecção de genes

codificadores das -lactamases e carbapenemases, por meio da técnica de PCR

convencional e/ou multiplex.

Cepa e Número do

Bancoa Tipo de β-lactamase

Classe Molecular de

Ambler (1980)

P.aeruginosa 238 AmpC C

E. coli 248 TEM-1 A

E. coli 282 SHV-5 A

P.aeruginosa 233 GES-5 A

K. pneumoniae 308 CTX-M-2 A

E. cloacae 452 CTX-M-8 A

E. coli 391 CTX-M-14 A

S. marcescens 256 BES A

P.aeruginosa 285 PER A

K. pneumoniae 393 OXA-1 D

P.aeruginosa 394 OXA-2 D

E. coli 392 OXA-10 D

P. aeruginosa 298 OXA-18 D


P.aeruginosa 131 IMP B

E. cloacae181 VIM-1 B

P.aeruginosa 396 SPM-1 B

P.aeruginosa 219 GIM-1 B

A. baumannii 218 SIM-1 B

K. pneumoniae 462 NDM B

K. pneumoniae 307 KPC-2 A

S. marcescens 274 SME A

A. baumannii 216 OXA-23 D




K. pneumoniae 283 OXA-48 D



a Número da amostra referente ao banco de microrganismos do Laboratório Alerta.

Material e Métodos

43

4.6.2 Sequenciamento

As reações de PCR positivas para a pesquisa de genes codificadores de β-

lactamases foram confirmadas por uma segunda reação de PCR e tiveram sua

sequencia determinada por sequenciamento. Oprodutos de PCR foram purificados a

partir do gel de agarose com o kit QIAquick Gel Extraction, conforme as instruções do

fabricante (Qiagen, Hilden, Alemanha). O DNA obtido foi quantificado utilizando o

espectrofotômetro digital NanoVue Plus Spectrophotometer (GE Healthcare, Canadá)

e, então, 70 ƞg de DNA foi submetido à reação de sequenciamento no ABI 3500

Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Perkin Elmer, EUA) utilizando o kit Big Dye

Terminator Cycle Sequencing (Applied Biosystems, Foster City, EUA).

As sequências de DNA obtidas e as sequências proteicas derivadas foram

analisadas utilizando o programa Lasergene Software Package (DNASTAR, Madison,

WI) e comparadas com as sequências depositadas e publicadas nos bancos de dados

disponíveis na Internet FASTA e BLAST (http://www.ebi.ac.uk/fasta33/ e

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/).

4.7 Avaliação fenotípica com inibidores de sistemas de efluxo e da β-

lactamase cromossomal AmpC

A fim de avaliar a influência dos mecanismos de resistências na CIM dos

carbapenens (imipenem e meropenem) foram realizados testes de microdiluição em

caldo na presença de inibidores da -lactamase cromossomal AmpC e de bombas de

efluxo.

Foram realizados testes iniciais que comprovaram o crescimento de todos os

isolados nas concentrações utilizadas para os dois inibidores usados, a fim de avaliar

se os mesmos não inibiriam o crescimento bacteriano.

http://www.ebi.ac.uk/fasta33/

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/

Material e Métodos

44

4.7.1 Inibição da -lactamase cromossomal AmpC

Para a avaliação fenotípica da desrepressão da -lactamase cromossomal

AmpC, as CIMs foram determinadas para os antimicrobianos imipenem, meropenem e

ceftazidima como descrito no item 4.2, na ausência e na presença do inibidor de

AmpC, cloxacilina (Sigma-Aldrich Corporation, St Louis, MO, EUA) em concentrações

fixas de 200 μg/mL.

A diminuição da CIM ≥ 2 diluições, para a associação do antimicrobiano com

cloxacilina em relação à CIM do antimicrobiano sozinho foi considerada indicativa da

hiperexpressão da -lactamase cromossomal AmpC.

4.7.2 Inibição de Bombas de Efluxo

O teste de inibição de bomba de efluxo foi realizado na presença de

fenilalamida arginina β-nafitilamida - PAβN (Sigma-Aldrich Corporation, St Louis, MO,

EUA), inibidor de sistemas de efluxo, em concentrações fixas de 50 μg/mL. As CIMs

foram determinadas para os antimicrobianos imipenem, meropenem e ciprofloxacino

como descrito no item 4.2, na ausência e na presença do inibidor.

A diminuição da CIM ≥ 2 diluições, para a associação do antimicrobiano com

PAβN em relação à CIM do antimicrobiano sozinho foi considerada indicativa da

hiperexpressão dos sistemas de bombas de efluxo.

4.8 Reação em Cadeia da Polimerase de Transcriptase Reversa em Tempo

Real - qRT-PCR

A técnica de qRT-PCR (reação de polimerase em cadeia em tempo real) foi

utilizada para detecção e quantificação da transcrição dos genes que codificam

componentes dos sistemas de efluxo de P. aeruginosa avaliados, mexB, mexD, mexF,

mexY. Além da determinação da expressão das proteínas dos sistemas de efluxo,

foram também mensuradas as expressões da proteína de membrana externa oprD e

da β-lactamase cromossomal AmpC. Os resultados foram comparados às respectivas

transcrições desses genes na cepa selvagem PA01. A expressão destes mesmos

Material e Métodos

45

genes na ATCC de P. aeruginosa 27853 foi comparada àquelas da cepa selvagem

PA01.

4.8.1 Extração de RNA Total

Os isolados foram previamente semeados em ágar sangue e incubados

durante 18 - 20 horas a 37 ºC. Após esse período, estes isolados foram cultivados em

20 mL de caldo LB na presença de 0,5 µg/mL de imipenem a 37 ºC, sob agitação, até

atingirem a fase logarítmica de crescimento, correspondente à de 1,5 a 2,0 unidades

de absorbância a um comprimento de onda de 600 nm (DO 600nm = 0,5 – 0,6) em

espectrofotômetro Biomate 5 UV Visible (Termo Spectronic, Cambridge, Inglaterra).

Quando essa absorbância foi atingida, 1 mL da cultura bacteriana foi ressuspenso em

1 mL de RNA ProtectTM Bacteria Reagent (Qiagen, Hilden, Alemanha)

homogeneizado por completo em vórtex e incubado por 5 minutos em temperatura

ambiente. Após esse período, as amostras foram centrifugadas a 12.000 rpm durante

10 minutos em temperatura ambiente (Eppendorf, Hamburg, Alemanha). Depois da

centrifugação, o sobrenadante foi aspirado em bomba a vácuo e o sedimento

ressuspenso em 100 μL de lisozima (Lysozyme from Chicken Egg White; Sigma,

Steinheim Alemanha), sob agitação moderada durante 5 minutos. A extração do RNA

bacteriano foi realizada com auxílio do Kit Rneasy Mini Kit conforme recomendações

do fabricante (Qiagen, Hilden, Alemanha). Para retirada de resíduos de DNA

bacteriano foi realizado um tratamento com RNAse Free-DNAse Set (Qiagen, Hilden,

Alemanha) durante a extração do RNA.

O RNA total foi quantificado utilizando-se o espectrofotômetro digital NanoVue

Plus Spectrophotometer (GE Healthcare, Canadá).

Adicionalmente, foi realizada, para cada amostra de RNA total, uma PCR

utilizando oligonucleotídeos iniciadores que amplificam uma sequência do DNA

ribossomal de eubactérias, com o intuito de confirmar a ausência de resíduos de DNA

bacteriano contaminante na solução de RNA. Os oligonucleotídeos iniciadores

Material e Métodos

46

utilizados e as condições de termociclagem (Eppendorf, Hamburg, Alemanha) estão

na Tabela 5.

4.8.2 Síntese de cDNA

A reação de transcriptase reversa foi realizada utilizando 30 ƞg de RNA de

cada amostra, com High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied

Biosystems, Warrington, United Kingdom), de acordo com as recomendações do

fabricante. A reação foi incubada por 10 minutos a 25 ºC, seguido por 120 minutos a

37 ºC, em termociclador (Eppendorf, Hamburg, Alemanha). O cDNA, produto da

reação de transcriptase reversa, foi armazenado em freezer -80 ºC até sua utilização.

4.8.3 Quantificação relativa da transcrição gênica

A quantificação relativa da expressão dos genes estudados foi realizada pela

técnica de qRT-PCR, cujo principio do método baseia-se na detecção da fluorescência

no tubo de reação à medida que a dupla fita DNA é gerada.

As reações de PCR em tempo real foram realizadas em triplicata utilizando

12,5 µL de Platinum SyBR Green qPCR com ROX (Invitrogen, Eragny, France),

adicionado de 0,25 µL de cada oligonucleotídeo iniciador (10 μM). À mistura, foi

adicionado 2 µL de cDNA para obtenção de um volume final de 25 µL. A reação de

PCR foi realizada no equipamento Real Time 7500 (Applied Biosystems, Warrington,

United Kingdom). As reações foram incubadas a 50 oC por 2 minutos, seguidos de

mais 2 minutos a 95 oC. As condições de termociclagem a seguir foram: 40 ciclos de

95 oC durante 15 segundos, 55 °C por 15 segundos e 60 oC por 30 segundos, de

acordo com as recomendações do fabricante. A curva de desnaturação (melting curve)

foi determinada no final da termociclagem para se certificar que havia a presença de

uma única sequencia de DNA, resultado da reação de amplificação. O gene

ribossomal rpsL foi utilizado como gene de referência para normalização da expressão

dos genes alvos.

As sequências de oligonucleotídeos iniciadores utilizados para a técnica de

qRT-PCR são apresentadas na Tabela 7.

Material e Métodos

47

Tabela 7. Oligonucleotídeos iniciadores utilizados na reação de qRT-PCR para os genes alvos

mexB, mexD, mexF, mexY, oprD e ampC e para o gene de referência rpsL.

Tipo de

reação de

PCR

Oligonucleotídeos

iniciadores Sequência (5’ – 3’) Gene alvo Referência

qR

T-P

CR

mexB-F GTG TTC GGC TCG CAG TAC TC mexB

Xavier et al.,

2010

mexB-R AAC CGT CGG GAT TGA CCT TG

mexD-F CGA GCG CTA TTC GCT GC mexD

mexD-R GGC AGT TGC ACG TCG A

mexF-F CGC CTG GTC ACC GAG GAA GAG T mexF

mexF-R TAG TCC ATG GCT TGC GGG AAG C

mexY-F CCG CTA CAA CGG CTA TCC CT mexY

mexY-R AGC GGG ATC GAC CAG CTT TC

oprD-F TCC GCA GGT AGC ACT CAG TTC oprD

oprD-R AAG CCG GAT TCA TAG GTG GTG

ampC-F CTG TTC GAG ATC GGC TC ampC

ampC-R CGG TAT AGG TCG CGA G

rpsL-F GCA AGC GCA TGG TCG ACA AGA rpsL

rpsL-R CGC TGT GCT CTT GCA GGT TGT GA

4.8.4 Análise da quantificação relativa da transcrição gênica

A análise da expressão foi feita utilizando o software SDS v 2.0 (Applied

Biosystems, Warrington, Reino Unido) pelo método Ct comparativo (ΔΔCt), onde a

expressão normalizada (EN) e calculada de acordo com a formula:

ΔCt = Ctgene alvo - CtrpsL

onde, CT (Ciclo Threshold) é o ciclo em que foi detectado fluorescência durante a

amplificação na reação de qRT-PCR, acima do limite basal de fluorescência

observada no inicio na reação. Para a correção do cálculo da RQ, a eficiência da

reação de cada gene foi calculada utilizando o modelo matemático descrito por Pfaffl

et al. (2001), utilizando o software SDS v 2.0.

A eficiência das reações de amplificação dos genes estudados foi determinada

de acordo com a fórmula:

E = (10-1/slope -1) x 100

Material e Métodos

48

onde slope representa a inclinação da reta no gráfico de regressão linear das médias

dos valores de CT observadas nas 3 reações de qRT-PCR para as diluições seriadas

do extrato da solução de cDNA da amostra de P. aeruginosa PAO1.

A transcrição relativa de cada gene alvo para os isolados clínicos de P.

aeruginosa foi calculada em relação à transcrição de cada gene na cepa de P.

aeruginosa PAO1, a partir da diferença entre o ΔCt de cada gene alvo na amostra

referência e o ΔCt de cada gene na amostra a ser testada. Dessa forma, o valor de

RQ indica quantas vezes um gene foi transcrito em uma amostra em relação à

expressão quantificada na amostra usada como referência, utilizando a fórmula:

RQ = 2-ΔΔCt.

Nas isolados clínicos avaliados, foram consideradas significativas alterações na

transcrição gênica relativa de, no mínimo, duas e quatro vezes para os os genes mexB

e mexY e mínimo de 100 vezes para mexD e mexF. Para o gene que codifica a β-

lactamase cromossomal ampC, foram consideradas significativas alterações na

transcrição gênica relativa de, no mínimo, dez vezes e para o gene da proteína de

membrana externa oprD, foram consideradas significativas a redução de 30% da

transcrição dos genes dessa proteína em comparação à cepa referência PAO1 (Quale

et al., 2006; Rodriguez-Martinez et al., 2009b).

4.8.5 Análise da Amplificação dos genes dos sistemas de efluxo

A amplificação dos genes que codificam os componentes dos sistemas de

efluxo de P. aeruginosa avaliados, mexB, mexD, mexF, mexY, além da proteína de

membrana externa oprD e da β-lactamase cromossomal AmpC, foi realizada através

da corrida eletroforética da reação de qRT-PCR das amostras estudadas.

A revelação dos produtos da qRT-PCR foi realizada por meio de eletroforese

em gel de agarose (UltrapureTM Agarose, Invitrogen, Carlsbad, EUA), sendo utilizada a

concentração de 1,5%. As condições de corrida foram: 110V por 40 minutos em

tampão TBE 0,5X (89 nM Tris-Borato e 2 mM EDTA pH 8.0). Como marcador de peso

Material e Métodos

49

molecular, foi utilizado DNA ladder 100 pares de base (Invitrogen, Carlsbad, EUA). O

gel foi corado com brometo de etídio (2,5 μg/mL) e as bandas foram visualizadas sob

luz ultravioleta - 320 nm (GelDoc Quantity One; Bio-Rad Laboratories, EUA).

4.9 Avaliação do perfil de proteínas de membrana externa por SDS-PAGE

4.9.1 Extração de proteínas de membrana externa

Os isolados de P. aeruginosa foram cultivados em 15 mL de caldo LB na

presença de de 1 µg/mL de imipenem a 37 ºC, sob agitação, por 18-20 horas. Em

seguida, foram centrifugados a 4.000 rpm, por 15 minutos, a 4 ºC. O sedimento

bacteriano foi então ressuspenso em 1 mL de TrisMg (Tris 10mM; MgCl2 5mM), pH 7,3

e sonicado por 5 ciclos de 30 segundos, com intervalo de um segundo a cada 5

segundos corridos. Durante esse processo as amostras foram mantidas em banho de

gelo.

Após essa etapa, foi realizada uma centrifugação a 8.000 rpm, por 5 minutos, a

4 ºC para a remoção dos restos celulares. O sobrenadante foi transferido para outro

tubo e centrifugado novamente a 17.000 rpm por 30 minutos a 4 ºC. O sobrenadante

então, foi descartado e adicionado 800 µL de Sarcosil 2% para precipitação das

proteínas de membrana externa (OMPs) por 30 minutos em temperatura ambiente. As

amostras foram novamente centrifugadas a 17.000 rpm por 30 minutos a 4ºC e o

sedimento foi lavado com TrisMg (Tris 10mM; MgCl2 5mM), pH 7,3 e centrifugado

novamente a 17.000 rpm por 30 minutos a 4 ºC. O sedimento, correspondente à

porção da membrana externa, foi ressuspenso em 40 µL de TrisMg (Tris 10mM; MgCl2

5mM), pH 7,3 e armazenado a uma temperatura de -80 ºC até sua utilização. Os

extratos proteicos foram quantificados com reagente de Bradford.

4.9.2 SDS-PAGE

Os extratos proteicos foram submetidos à análise do perfil de proteínas de

membrana externa pela técnica de SDS-PAGE. As concentrações dos extratos

proteicos foram igualadas com água estéril e depois adicionado 10 µL de tampão de

Material e Métodos

50

amostra Laemmi Sample Buffer (BioRad Laboratories, Hercules, CA, EUA), após esta

etapa, os extratos foram aquecidos a 99 ºC por 5 minutos.

Vinte microlitros das amostras e 6 µL do padrão de peso molecular, Precision

Plus Protein Standards – dual color (BioRad Laboratories, Hercules, CA, EUA) foram

aplicados no gel de dodecil sulfato de sódio (SDS), contendo 15% de acrilamida (SDS-

PAGE 15%). A eletroforese foi realizada a uma voltagem de 10 V por 20 minutos para

a inicial introdução do extrato proteico no gel, seguido por uma voltagem de 180 V por

1 hora no sistema V-16 Vertical Gel Electrophoresis System (Gibco BRL Life

Technologies, Rockville, MD, EUA). Após a corrida eletroforética, o gel foi corado

durante 15 minutos com coomassie blue R250 (Sigma-Aldrich Corp., St Louis, EUA).

Como descorante, foi utilizada solução de ácido acético a 10% e metanol a 45%. A

análise do perfil proteico das amostras foi realizada pela inspeção visual dos géis.

Como controle foi utilizada a amostra de P. aeruginosa PAO1 sensível a todos

os β-lactâmicos, aos aminoglicosídeos e às fluoroquinolonas testadas.

4.10 Pesquisa do Gene Codificador da Proteína de Membrana Externa –

OprD


A avaliação da presença do gene da oprD foi realizada pela técnica da reação

em cadeia da polimerase (PCR) convencional como descrito no item 4.4.1.

As condições de termociclagem (Eppendorf, Hamburg, Alemanha) foram:

desnaturação inicial a 95 ºC por 10 minutos, seguido por 35 ciclos de desnaturação a

95 ºC por 45 segundos, anelamento dos oligonucleotídeos a 51 ºC por 45 segundos e

extensão das fitas a 72 ºC por 3 minutos. Após os 35 ciclos, foi realizada uma

extensão final a 72 ºC por 10 minutos. Na Tabela 8 encontram-se descritos os

oligonucleotídeos iniciadores utilizados neste estudo.

Material e Métodos

51

Tabela 8. Oligonucleotídeos iniciadores utilizados na reação de PCR para a avaliação do gene

da oprD.

Tipo de

reação de

PCR

Oligonucleotídeos

iniciadores Sequência (5’ – 3’)

Gene

alvo

Amplicom

(pb) Referência

PC

R

con

ven

cio

n

al

OprD-F CGC CGA CAA GAA GAA CTA GC

oprD 1413 Este estudo

OprD-R GTC GAT TAC AGG ATC GAC AG

4.11 Avaliação dos Mecanismos de Resistência às Fluoroquinolonas e

aso aminoglicosídeos

Para avaliar os mecanismos de resistência às quinolonas foram estudadas as

mutações nas regiões determinantes de resistência às quinolonas (QRDR) nos genes

gyrA e parC e a presença dos genes qnr e qepA. A pesquisa de 16S rRNA metilase e

aac6b’ foi realizada para avaliar o mecanismo de resistência aos aminoglicosídeos.


Pela técnica da reação da polimerase em cadeia (PCR) convencional de

acordo com a técnica descrita no item 4.4.1, foi realizada a amplificação das QRDR

dos genes gyrA e parC, detecção dos genes codificadores de qnr, qepA e 16S rRNA

metilase. Foram avaliadas possíveis mutações nas regiões determinantes de

resistência às quinolonas (QRDR) nos genes gyrA e parC das amostras sensíveis às

quinolonas.

As condições de termociclagem do DNA (Eppendorf, Hamburg, Alemanha) e os

oligonucleotídeos iniciadores estão apresentados na Tabela 9.

Material e Métodos

52

Tabela 9. Oligonucleotídeos iniciadores utilizados para a caracterização dos mecanismos de resistência às fluoroquinolonas e aminoglicosídeos pela técnica

de PCR convencional e multiplex nos isolados resistentes a estes antimicrobianos.

Tipo de reação

de PCR

Oligonucleotídeos


PC

R c

on

ven

cio

nal

QR

DR

GyrA-F CGT GTC CTT TAT GCC ATG

gyrA 390

Desnaturação: 95ºC - 10 min Desnaturação: 95ºC - 30 s Anelamento: 50ºC - 30 s


35 ciclos Extensão final: 72ºC - 10 min.

Este estudo

GyrA-R GAT GTT GGT CGC CAT GC

ParC-F TGA GCC TGG AAG GGG TC

parC 305

Desnaturação: 95ºC - 10 min Desnaturação: 95ºC - 30 s Anelamento: 47ºC - 30 s


35 ciclos Extensão final: 72ºC - 10 min.

ParC-R GTC CAC CAG CGG ATA GC

PC

R m

ult

iple

x

qn

r

QnrA-F AGA GGA TTT CTC ACG CCA GG qnrA 580 Desnaturação: 95ºC - 10 min




35 ciclos


Cattoir et al., 2007

QnrA-R TGC CAG GCA CAG ATC TTG AC

QnrB-F GGM ATH GAA ATT CGC CAC TG qnrB 264

QnrB-R TTT GCY GYY CGC CAG TCG AA

QnrS-F GCA AGT TCA TTG AAC AGG GT qnrS 428

QnrS-R TCT AAA CCG TCG AGT TCG GCG

PC

R c

on

ven

cio

nal

qn

r

qnrC-F GGG TTG TAC ATT TAT TGA ATC qnrC 447



Anelamento: 50ºC – 45 seg


35 ciclos;


Este estudo

qnrC-R TCC ACT TTA CGA GGT TCT

qnrD-F CGA GAT CAA TTT ACG GGG AAT A qnrD 582

qnrD-R AAC AAG CTG AAG CGC CTG

qnrVC-F CTT CTC ACA TCA GGA CTT GC qnrVC

qnrVC-R GCT CCA GTA ACT GTT CCT GT


Material e Métodos

53

PC

R c

on

ven

cio

nal

qep

A

qepA F CTG CAG GTA CTG CGT CAT G

qepA 850

Desnaturação: 95ºC – 5 min




35 ciclos


Este estudo

qepA R CGT GTT GCT GGA GTT CTT C

PC

R M

ult

iple

x M

etila

ses

armA-F ATT CTG CCT ATC CTA ATT GG armA 315





35 ciclos


Berçot et al., 2011

armA-R ACC TAT ACT TTA TCG TCG TC

npmA-F GGA GGG CTA TCT AAT GTG GT npmA 386

npmA-R GCC CAA AGA GAA TTA AAC TG

rmtA-F CTA GCG TCC ATC CTT TCC TC rmtA 635

rmtA-R TTG CTT CCA TGC CCT TGC C

rmtB-F GCT TTC TGC GGG CGA TGT AA rmtB 173

rmtB-R ATG CAA TGC CGC GCT CGT AT

rmtC-F CGA AGA AGT AAC AGC CAA AG rmtC 711

rmtC-R ATC CCA ACA TCT CTC CCA CT

rmtD-F CGG CAC GCG ATT GGG AAG C rmtD 401

rmtD-R CGG AAA CGA TGC GAC GAT

PC

R c

on

ven

cio

nal

Met

ilase

s rmtD_tot_F GAG CGA ACT GAA GGA AAA AC

rmtD 730





35 ciclos


Castanheira et al.,

2008 rmtD_tot_R CAG CAC GTA AAA CAG CTC

Material e Métodos

54


Todas as amostras resistentes a ciprofloxacino e as amostras sensíveis

selecionadas, foram sequenciadas para avaliar as possíveis mutações presentes nas

QRDR, assim como a amostra de 16S rRNA metilase encontrada de acordo com o

descrito no item 4.4.2.

Resultados

55

5. RESULTADOS

5.1 Amostras Bacterianas

Foram estudados 25 isolados clínicos de P. aeruginosa. A maioria dos isolados

clínicos foi coletada de pacientes adultos, maiores de 18 anos de idade (92%) e do

sexo masculino (76%). A idade dos pacientes variou de 10 meses a 90 anos de idade.

Duas amostras clínicas apresentaram crescimento de dois isolados de P. aeruginosa

com diferentes características morfológicas, sendo todas incluídas no estudo. Os

isolados P5 e P6 foram recuperados da primeira amostra e P11 e P12 da segunda

amostra.

A Figura 1 ilustra a distribuição dos isolados de P. aeruginosa pelo seu sítio de

isolamento.

Figura 1. Distribuição (em porcentagem) dos isolados clínicos estudados por sítio de

isolamento.

5.1.1 Re-identificação dos isolados de P. aeruginosa por Matrix-assisted

laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS)

Todos os isolados estudados foram corretamente re-identificados pelo MALDI-

TOF MS como P. aeruginosa. Os scores de cada amostra variaram como pode ser

visto no Anexo 1.

Resultados

56

5.2 Avaliação do Perfil de Sensibilidade in vitro aos antimicrobianos

A sensibilidade dos isolados de P. aeruginosa aos diversos antimicrobianos foi

avaliada pela técnica de microdiluição em caldo. Na Tabela 10, podemos observar o

perfil de sensibilidade aos antimicrobianos testados de todas as amostras estudadas,

assim como, a menor concentração de cada antimicrobiano que inibiu o crescimento

de 50% e 90% das amostras (CIM50 e CIM90), respectivamente.

Tabela 10. Distribuição da potência e perfil de sensibilidade aos antimicrobianos dos isolados

clínicos de P. aeruginosa estudados.

Antimicrobianos CIM (μg/mL) Sensibilidade

S%

Intermediário

I%

Resistência

R% CIM50 CIM90

Amicacina 4 8 96 - 4

Gentamicina 2 4 92 - 8

Aztreonam 16 32 40 24 36

Ceftazidima 4 8 100 - -

Cefepima 8 8 92 8 -

Ciprofloxacino 0,5 16 80 - 20

Imipenem 8 16 - - 100

Meropenem 4 16 20 36 44

Piperacilina/tazobactam 16/4 32/4 76 20 4

Polimixina B 0,5 0,5 100 - -

O teste de sensibilidade aos antimicrobianos confirmou a resistência aos

carbapenens (imipenem e meropenem) para a maioria dos isolados clínicos de P.

aeruginosa, exceto para meropenem, onde 5 (20%) e 9 (36%) dos isolados foram

sensíveis e intermediários, respectivamente. Adicionalmente, todos os isolados

apresentaram sensibilidade à ceftazidima, no entanto 2 (8%) isolados apresentaram

resistência intermediária à cefepima (Figura 2).

Resultados

57

Figura 2. Porcentagem de sensibilidade aos diversos antimicrobianos dos isolados de P.

aeruginosa estudados.

Dentre as outras classes de antimicrobianos testados, 5 (20%) isolados

apresentaram resistência ao ciprofloxacino. A resistência aos aminoglicosídeos foi

encontrada em 2 isolados, sendo um deles resistente à amicacina e gentamicina e o

outro resistente apenas à gentamicina.

As CIMs de cada isolado de P. aeruginosa estudado frente aos antimicrobianos

testados estão apresentadas na Tabela 11.

Resultados

58

Tabela 11. Teste de sensibilidade aos antimicrobianos para os isolados clínicos de P. aeruginosa, realizado pela técnica de microdiluição em caldo, segundo

as recomendações do CLSI (2013).

Amostras

CIM (μg/mL)

Amicacina Gentamicina Aztreonam Ceftazidima Cefepima Ciprofloxacino Imipenem Meropenem Piperacilina/

Tazobactam Polimixina B

P1 2 1 2 2 2 0,125 8 2 4/4 0,25

P2 4 2 32 4 8 0,5 8 8 16/4 0,5

P3 8 4 8 2 8 32 8 2 8/4 0,125

P4 8 4 16 8 8 0,25 16 4 32/4 0,5

P5 4 2 16 8 8 0,25 8 4 16/4 0,25

P6 8 4 32 8 8 0,5 8 8 32/4 0,5

P7 4 2 32 8 8 0,5 8 4 16/4 0,5

P8 8 4 32 4 8 0,5 16 4 8/4 0,5

P9 4 2 16 2 4 0,25 16 8 16/4 0,5

P10 4 2 8 2 4 0,125 8 2 4/4 0,25

P11 2 2 8 1 2 0,125 8 8 8/4 0,25

P12 4 2 16 8 16 0,125 8 8 32/4 0,25

P13 1 0,5 8 4 2 0,5 8 4 16/4 0,25

P14 2 2 4 2 2 0,125 8 4 4/4 0,5

P15 8 4 4 1 8 16 8 1 4/4 0,5

P16 8 4 32 4 8 0,5 16 8 16/4 0,5

P17 8 4 32 4 16 1 8 8 16/4 0,5

P18 >128 >64 8 1 2 16 8 4 32/4 0,5

P19 2 16 16 4 8 16 16 4 >128/4 0,25

P20 8 4 4 2 8 0,5 8 2 4/4 0,5

P21 1 1 8 2 4 0,25 16 8 8/4 0,25

P22 4 2 32 8 8 0,5 16 16 16/4 0,125

P23 16 0,5 32 4 4 8 8 4 32/4 0,06

P24 4 1 16 4 8 0,5 16 16 16/4 0,5

P25 4 2 32 2 8 0,25 16 16 16/4 0,25

Resultados

59

5.3 Análise da similaridade genética por Pulsed-Field Gel Electrophoresis

(PFGE)

Para a análise da similaridade genética dos 25 isolados de P. aeruginosa foi

realizada a tipagem molecular pela técnica de PFGE. A análise do perfil eletroforético

não relevou a predominância de um perfil clonal predominante entre os isolados

estudados que foram agrupados em 17 padrões distintos de PFGE (A, B, C, D, E, F,

G, H, I, J, K, L, M, N, O, P e Q), segundo a interpretação de Tenover e colaboradores

(Tenover et al., 1995) (Figuras 3 e 4).

Figura 3. Avaliação da similaridade genética entre os isolados de

P. aeruginosa do H1 e H2 pela técnica de PFGE. λ. padrão de

peso molecular (Kb).

Resultados

60

Figura 4. Avaliação da similaridade genética entre os isolados de P. aeruginosa do H3 pela

técnica de PFGE. λ. padrão de peso molecular (Kb).

A análise do perfil eletroforético revelou a predominância do perfil F (5

amostras) e I (3 amostras) no H3. As amostras pertencentes ao grupo F foram

divididas em dois subtipos: F1 (2 isolados) e F2 (2 isolados), sendo os dois isolados

do subtipo F1 recuperados do mesmo paciente e os outros três isolados (P6, P22 e

P23) de diferentes pacientes. O grupo I foi dividido também, em dois subtipos: I1 (1

isolado) e I2 (1 isolado), sendo os três isolados recuperados do mesmo paciente. Os

isolados P5 e P6, recuperados da mesma amostra clínica apresentaram perfil clonal

diferente. No entanto, os isolados P11 e P12 foram agrupados como um subclone.

As 5 amostras de P. aeruginosa resistentes ao ciprofloxacino (P3, P15, P18,

P19 e P23) pertenciam a padrões diferentes de PFGE. Assim como as amostras de P.

aeruginosa resistentes aos aminoglicosídeos (P18 e P19).

Resultados

61

As duas amostras pertencentes ao padrão E foram recuperadas do mesmo

paciente em momentos diferentes. No entanto, as duas amostras (P21 e P22)

pertencentes ao padrão K não foram recuperadas do mesmo paciente.

A análise dos géis de PFGE, a partir do dendrograma obtido utilizando o

programa BioNumerics (coeficiente de DICE 1,0%), demonstrou a presença de 17

padrões, sendo que 5 padrões apresentaram amostras relacionadas (Figura 5).

P2

P3

P4

P18

P12

P14

P11

P20

P25

P21

P22

P8

P15

P7

P16

P17

P6

P23

P24

P13

P1

P5

P9

P10

P19

Figura 5. Dendrograma do perfil genotípico determinado pela técnica de

PFGE dos isolados de P. aeruginosa avaliados neste estudo.

Resultados

62

5.4 Focalização do ponto isoelétrico (pI)

Os valores de pI das bandas detectadas foram calculados a partir da curva de

regressão linear obtida com a focalização das β-lactamases presentes nos extratos

das amostras-controles, que apresentou coeficiente R2=0,9873 (Figura 6).

Apenas uma banda foi observada na focalização do pI dos extratos protéicos

dos isolados de P. aeruginosa estudados, que apresentou valor de pI igual a 8,2.

Outra banda de valor de pI igual a 6,5 foi visualizada na amostra P18.

Figura 6. Curva de regressão linear da focalização das β-lactamases presentes nos isolados de P.

aeruginosa.

Resultados

63

5.5. Teste in vitro de Hidrólise aos Carbapenens

5.5.1 Teste de Hidrólise Enzimática por Espectrofotometria

Entre as 25 amostras de P. aeruginosa estudadas, nenhuma apresentou

hidrólise enzimática frente aos carbapenens testados (Figura 7).

Figura 7. A. Isolado KPC-2 na presença de imipenem; B. Isolado KPC-2 na presença de meropenem;

C. Isolado de P. aeruginosa P2 na presença de imipenem; D. Isolado de P. aeruginosa P2 na

presença de meropenem.

5.5.2 Teste de Hidrolise por Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-

flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS)

A maioria dos isolados de P. aeruginosa não apresentou hidrólise enzimática

frente ao imipenem no MALDI-TOF MS, no entanto quatro isolados apresentaram

resultados duvidosos no teste (P11, P13, P15 e P16) (Figura 8).

Resultados

64

Figura 8. A. Imipenem puro; B. Isolado KPC-2 na presença de imipenem; C. Isolado de P. aeruginosa

P13 na presença de imipenem; D. Isolado de P. aeruginosa P15 na presença de imipenem.

5.6 Detecção de Genes Codificadores de β-lactamases


Não houve detecção de nenhum gene codificador das serino-β-lactamases

blaTEM, blaSHV, blaGES, blaCTX-M, blaBES, blaPER, blaKPC e blaSME; das oxacilinases blaOXA-1,

blaOXA-2, blaOXA-5, blaOXA-18, blaOXA-45 e blaOXA-46; das oxacilinases do tipo

carbapenemase blaOXA-23, blaOXA-24, blaOXA-48, blaOXA-51, blaOXA-58, blaOXA-20, blaOXA-48,

blaOXA-62, blaOXA-143 e blaOXA-198; das metalo-β-lactamases blaIMP, blaVIM, blaSPM, blaGIM,

blaSIM e blaNDM nos isolados de P. aeruginosa estudados. No entanto, foi detectado em

um isolado o gene blaOXA-7. Todos os isolados de P. aeruginosa apresentaram

amplificação para a β-lactamase cromossomal AmpC e para a oxacilinase blaOXA-50

(Figura 9).

Resultados

65

Figura 9. PCR convencional de todos os isolados de P. aeruginosa. A. β-lactamase

cromossomal AmpC (1.243pb); B. OXA-50 (789 pb); a. P. aeruginosa ATCC 27853; *. P.

aeruginosa PAO1; λ. padrão de peso molecular (Kb).


O sequenciamento dos amplicons obtidos por amplificação do gene codificador

das oxacilinases do grupo OXA-7 confirmou a presença do gene blaOXA-56 no isolado

P18. O sequenciamento das porções adjacentes ao gene blaOXA-56, demonstraram que

o mesmo encontra-se em um integron de classe 1 (Figura 10).

attI1

5´CS 3´CS

intI1 qacEΔ1/Sul1 blaOXA-56

59’-be

aacA4

Figura 10. Representação esquemática do integron In163, abrigando os dois determinantes de

resistência: aacA4, seguido pela blaOXA-56, que foram sequenciados. As flechas representam os

genes do integron e o sentido das flechas representa o sentido da transcrição dos genes.

Resultados

66

O sequenciamento dos amplicons obtidos por amplificação de blaOXA-50 revelou

uma grande variedade de mutações na maioria dos isolados de P. aeruginosa

estudados. No entanto, todos apresentaram a sequencia STYK, comum na OXA-50 e

nenhuma mutação nos 5 elementos estruturais da sequencia consenso das β-

lactamases da classe D (DBLs). Dentre os isolados avaliados, 12 apresentaram

mutações diferentes das já descritas.

5.7 Avaliação Fenotípica com inibidores

Todos os isolados de P. aeruginosa cresceram nas concentrações utilizadas de

PAβN (50 μg/mL) e Cloxacilina (200 μg/mL) nos testes para avaliação do crescimento

bacteriano.

5.7.1 Inibição da β-lactamase cromossomal AmpC

Na avaliação fenotípica da hiperexpressão β-lactamase cromossomal AmpC,

as CIMs variaram pouco para meropenem e ceftazidima, sendo que somente 4

isolados (16%) tiveram diminuição das suas CIMs ≥ 2 diluições para ceftazidima. No

entanto para o imipenem, podemos notar que 15 isolados (60%) tiveram uma

diminuição da CIM ≥ 2 diluições (Tabela 12).

Resultados

67

Tabela 12. Teste de inibição da β-lactamase cromossomal AmpC, na presença de cloxacilina

(200 μg/mL), aos antimicrobianos para os isolados clínicos de P. aeruginosa.

Amostras

CIM (μg/mL)

Imipenem

Imipenem

+

Cloxacilina

Meropenem

Meropenem

+

Cloxacilina

Ceftazidima

Ceftazidima

+

Cloxacilina

P1 8 2 2 2 2 1

P2 8 2 8 8 4 4

P3 8 4 2 2 2 2

P4 16 4 4 4 8 4

P5 8 4 4 2 8 2

P6 8 4 8 4 8 1

P7 8 2 4 4 8 1

P8 16 4 4 4 4 4

P9 16 4 8 8 2 2

P10 8 4 2 2 2 2

P11 8 4 8 8 1 1

P12 8 4 8 8 8 1

P13 8 4 4 4 4 2

P14 8 4 4 4 2 2

P15 8 2 1 1 1 1

P16 16 4 8 8 4 4

P17 8 4 8 4 4 2

P18 8 4 4 4 1 1

P19 16 4 4 4 4 2

P20 8 2 2 2 2 2

P21 16 4 8 8 2 2

P22 16 4 16 8 8 4

P23 8 2 4 2 4 2

P24 16 4 16 8 4 2

P25 16 4 16 8 2 2

5.7.2 Inibição de Bombas de Efluxo

A grande maioria dos isolados de P. aeruginosa (92%) apresentaram uma

diminuição da CIM ≥ 2 diluições para imipenem, no entanto para meropenem apenas

10 isolados (40%) apresentaram esta diminuição. Todos os isolados tiverem uma

diminuição da CIM ≥ 2 diluições para ciprofloxacino, inclusive os 5 isolados resistentes

a este antimicrobiano (Tabela 13).

Resultados

68

Tabela 13. Teste de inibição de bomba de efluxo, na presença de PAβN (50 μg/mL), aos

antimicrobianos para os isolados clínicos de P. aeruginosa.

Amostras

CIM (μg/mL)

Imipenem

Imipenem

+

PAβN

Meropenem

Meropenem

+

PAβN

Ciprofloxacino

Ciprofloxacino

+

PAβN

P1 8 2 2 2 0,125 0,03

P2 8 1 8 4 0,5 0,06

P3 8 0,5 2 0,5 32 2

P4 16 0,5 4 0,5 0,25 0,015

P5 8 1 4 4 0,25 0,015

P6 8 2 8 4 0,5 0,03

P7 8 2 4 4 0,5 0,06

P8 16 2 4 4 0,5 0,03

P9 16 1 8 1 0,25 0,015

P10 8 4 2 2 0,125 0,015

P11 8 4 8 4 0,125 0,03

P12 8 2 8 2 0,125 0,03

P13 8 1 4 4 0,5 0,06

P14 8 1 4 1 0,125 0,015

P15 8 2 1 1 16 4

P16 16 2 8 4 0,5 0,06

P17 8 1 8 2 1 0,06

P18 8 1 4 1 16 2

P19 16 2 4 2 16 4

P20 8 1 2 2 0,5 0,03

P21 16 2 8 4 0,25 0,03

P22 16 2 16 4 0,5 0,03

P23 8 2 4 2 8 0,06

P24 16 2 16 4 0,5 0,03

P25 16 2 16 4 0,25 0,015

5.8 Reação em Cadeia da Polimerase de Transcriptase Reversa em Tempo

Real - qRT-PCR

Os valores da média da expressão relativa dos genes estudados nas 25

amostras de P. aeruginosa estão apresentados na Tabela 14. Os valores da

expressão relativa dos genes avaliados de cada isolado clínico, da ATCC de P.

aeruginosa e da cepa referência PA01 estão apresentados no Anexo 2.

Resultados

69

Tabela 14. Média da expressão relativa dos genes estudados nos isolados

clínicos de P. aeruginosa em relação a cepa PAO1.

Gene Média Desvio Padrão Intervalo

mexB 1,92 1,11 0,64 - 4,61

mexD 2,69 0,85 1,68 - 4,61

mexF 6,04 2,03 3,23 - 10,45

mexY 1,56 1,57 0,12 - 5,12

ampC 9,21 4,97 2,59 - 19,37

oprD 0,20 0,16 0,01 - 0,50

Das 25 amostras clinicas de P. aeruginosa, 9 (36%) espressavam mexB, no

mínimo, duas vezes mais que a cepa referência PAO1 (Figura 11). Quando avaliamos

a expressão de mexD, 20 (80%) isolados, expressavam duas vezes mais que a cepa

referência PAO1. No entanto se utilizarmos os parâmetros estabelecidos para avaliar a

transcrição deste gene, nenhum isolado apresentou aumento da transcrição (Figura

12).

Onze (44%) amostras clinicas de P. aeruginosa, espressavam mexF, no

mínimo, seis vezes mais que a cepa referência PAO1 (Figura ). No entanto, quando

utilizarmos os parâmetros estabelecidos para avaliar a transcrição deste gene, todos

os isolados apresentaram transcrição basal (Figura 13).

Considerando o parâmetros estabelecido para identificar a transcrição de

mexY, apenas três (12%) isolados apresentaram um aumento na transcrição deste

gene. (Figura 14). No entanto, 13 (52%) apresentaram expressão menor que aquela

observada entre a cepa referência PAO1.

Resultados

70

Figura 11. Quantificação da transcrição relativa do gene mexB para os isolados de P.

aeruginosa e da ATCC de P. aeruginosa 27853 em relação a cepa PAO1.

Figura 12. Quantificação da transcrição relativa do gene mexD para os isolados de P.


Resultados

71

Figura 13. Quantificação da transcrição relativa do gene mexF para os isolados de P.


Figura 14. Quantificação da transcrição relativa do gene mexY para os isolados de P.


Resultados

72

Os cinco isolados sensíveis a meropenem (CIM, 2 μg/mL e 1 μg/mL)

expressavam 2 e 4 vezes mais, em relação a PAO1, os genes mexD e mexF,

respectivamente. Apenas um isolado, P3, apresentou expressão maior que duas

vezes do gene mexB. Nove isolados apresentaram resistência intermediária ao

meropenem (CIM, 4 μg/mL) e apenas dois (P7 e P8) hiperexpressavam o gene mexB.

Os dois isolados que apresentaram resistência intermediária à cefepima (CIM,

16 μg/mL) apresentaram expressão maior que duas vezes do gene mexD e mexY,

assim como de quatro vezes para o gene mexF.

Dentre os cincos isolados resistentes a ciprofloxacino, apenas um (P3)

apresentou expressão maior que duas vezes paro o gene mexB. No entanto, todos os

isolados apresentaram uma expressão, no mínimo, maior que três vezes para mexF.

Três destes isolados (P18, P19 e P23) tiveram uma expressão menor do que a cepa

referência PAO1 para o gene mexY.

Os dois isolados (P18 e P19) resistentes aos aminoglicosídeos testados,

apresentaram expressão similar para os genes mexB, mexF e mexY, no entanto para

o gene mexD, o isolado P18 expressou cerca de duas vezes mais este gene.

Dez (40%) isolados de P. aeruginosa tiveram a expressão de ampC,

aumentada em no mínimo 10 vezes; enquanto, 20 (80%) isolados tiveram a expressão

de ampC, aumentada em no mínimo 5 vezes, em relação a cepa referência PAO1

(Figura 15). Todos os isolados de P. aeruginosa estudados tiveram redução na

expressão de oprD em relação a cepa referência PAO1 (Figura 16).

Resultados

73

Figura 15. Quantificação da transcrição relativa do gene ampC para os isolados de P.


Figura 16. Quantificação da transcrição relativa do gene oprD para os isolados de P.


Resultados

74

5.8.5 Análise da Amplificação dos genes dos sistemas de efluxo

Todos os isolados de P. aeruginosa estudados apresentaram amplificação dos

genes que codificam os componentes dos sistemas de efluxo avaliados, mexB (244

pb), mexD (165 pb), mexF (255 pb), mexY (250 pb), além da β-lactamase

cromossomal AmpC (166 pb) e da proteína de membrana externa oprD (191 pb).

5.9 Avaliação do perfil de proteínas de membrana externa por SDS-PAGE

Todos os isolados de P. aeruginosa estudados apresentam a OprF (32 kDa)

sem nenhuma alteração, assim como a OprE (43 kDa). No entanto, na analise visual

do gel de SDS-PAGE podemos notar a ausência da banda de 46 kDa, equivalente a

OprD em todos os isolados. No entanto uma banda de aproximadamente 48 kDa pode

ser visualizada em todos os isolados clínicos de P. aeruginosa estudados (Figura 17).

Figura 17. Perfil de proteínas de membrana externa por SDS-PAGE dos isolados de P.

aeruginosa. a. P. aeruginosa ATCC 27853; *. P. aeruginosa PAO1; λ. padrão de peso

molecular (kDa).

Resultados

75

5.10 Avaliação da presença do Gene Codificador da Proteína de Membrana

Externa – OprD


A maioria dos isolados de P. aeruginosa estudados apresentaram um amplicon

de 1.400 pb, compatível com a oprD da cepa referência PAO1. No entanto, cinco

isolados (P5, P9, P13, P15 e P21) apresentaram um amplicon de aproximadamente

2.100 pb e dois isolados (P7 e P22) não apresentaram nenhum amplicon com os

oligonucleotídeos iniciadores utilizados (Figura 18). Todos estes isolados eram do H3.

Figura 18. PCR convencional do gene codificador da proteína de membrana

externa oprD dos isolados de P. aeruginosa. (1413pb); a. P. aeruginosa

ATCC 27853; *. P. aeruginosa PAO1; λ. padrão de peso molecular (Kb).

5.11 Avaliação dos Mecanismos de Resistência às Fluoroquinolonas e

aos Aminoglicosídeos

Entre os 25 isolados de P. aeruginosa estudados, 5 (20%) isolados

apresentaram resistência a ciprofloxacino e 2 (8%) apresentaram resistência aos

aminoglicosídeos e com isso foram realizadas as pesquisas de genes codificadores de

qnr, qepA e 16S rRNA metilase, assim como, a amplificação das QRDR dos genes

gyrA e parC.

Resultados

76


Todos os isolados resistentes a ciprofloxacino, assim como, as amostras

sensíveis selecionadas, tiveram os genes gyrA (390 pb) e parC (305 pb)

amplificados e sequenciados. Apenas um isolado, resistente à amicacina e à

gentamicina, amplificou para a 16S rRNA metilase rmtD.


No sequenciamento para avaliação das mutações no QRDR, pudemos

constatar que os cinco isolados apresentaram uma mutação no gene gyrA e uma

mutação no gene parC, como pode ser visto na Tabela 15. Os isolados sensíveis

selecionados para controle, não apresentaram nenhuma mutação no QRDR.

Tabela 15. Mutações no QRDR dos isolados de P. aeruginosa estudados.

No sequenciamento do gene codificador da 16S rRNA metilase, rmtD, no

isolado P18, constatou-se 100% de similaridade com o gene descrito previamente por

Doi e colaboradores (2007a).

Gene Isolados Códon Mutações Mudança de aminoácido

gyrA

P3 83 ACC - ATC Thr - Ile





parC

P3 87 TCG - TTG Ser - Leu





Discussão

77

6 DISCUSSÃO

P. aeruginosa é um patógeno humano oportunista e que apresenta alta

capacidade de adaptação ao meio hospitalar. Apresenta resistência intrínseca e uma

grande habilidade de desenvolver resistência à maioria dos antimicrobianos (Kiska &

Gillian, 2003; Strateva & Yordanov, 2009).

Hoje é um dos principais agentes etiológicos de infecções relacionadas à

assistência à saúde, principalmente no Brasil (Gales et al., 2012). Este patógeno está

relacionado a infecções nosocomiais graves, com elevada mortalidade, podendo esta

taxa variar de 18% a 39% (Safdar et al., 2004; Osmon et al., 2004; Suàrez et al.,

2009). Juntamente com o aumento na prevalência das infecções causadas por P.

aeruginosa, podemos constatar um aumento nas taxas de resistência aos

antimicrobianos utilizados no tratamento destas infecções (Diekema et al., 1999).

Destacando-se a diminuição de sensibilidade aos antibióticos de maior espectro de

ação para estes isolados, como as cefalosporinas de amplo espectro e os

carbapenens (Gales et al., 2012). Sendo a produção de β-lactamases, principalmente

as carbapenemases, o mecanismo de resistência mais importante descrito em P.

aeruginosa (Goldberg, 2000; Kiska & Gillian, 2003; Landman et al., 2007).

Outra característica preocupante relacionada à P. aeruginosa, é a resistência

cruzada aos antimicrobianos, resultante da presença de múltiplos mecanismos de

resistência num único isolado (Livermore, 2002; McGowan, 2006).

Para esta tese, foram estudados isolados clínicos de P. aeruginosa

recuperados de diversos sítios infecciosos de três hospitais localizados na cidade de

São Paulo durante o ano de 2012 e 2013. Foram recuperados 25 isolados que

apresentavam resistência aos carbapenens e sensibilidade às cefalosporinas de

amplo espetro. A maioria dos isolados de P. aeruginosa estudados foram recuperados

do trato respiratório inferior (56%) e de urina (20%). De um modo geral, estas são as

fontes de isolamento mais frequentes deste patógeno (de Freitas & Barth, 2002). A

grande maioria das amostras não é isolada de sítios estéreis, dificultando estabelecer

Discussão

78

o real papel patogênico destas cepas. Este estudo teve como objetivo caracterizar

microbiológicamente as cepas de P. aeruginosa, mas não o estudo epidemiológico,

incluindo o modo de aquisição destas cepas. De qualquer maneira, o quadro de

colonização geralmente precede o de infecção.

Todos os isolados de P. aeruginosa estudados apresentaram o fenótipo

incomum de resistência a pelo menos um dos carbapenens e sensibilidades às

cefalosporinas de amplo espectro. A taxa de resistência ao imipenem foi de 100%

(CIM50, 8 µg/mL), entretanto para meropenem (CIM50, 4 µg/mL), as taxas encontradas

foram menores, sendo que 20% e 36% do isolados apresentaram sensibilidade ou

resistência intermediaria, respectivamente. Entre as cefalosporinas de amplo espectro,

notamos uma maior sensibilidade para ceftazidima (100%; CIM50, 4 µg/mL) em relação

à cefepima (92%; CIM50, 8 µg/mL). Este fenótipo de resistência tem sido pouco

reportado, mas é cada vez mais comum o seu aparecimento na rotina dos laboratórios

de microbiologia do Brasil. A confirmação deste fenótipo reforça a dificuldade para a

seleção de antimicrobianos efetivos para o tratamento das infecções causadas por

esse patógeno.

Uma boa taxa de sensibilidade à piperacilina/tazobactam (76%; CIM50, 16/4

µg/mL) foi encontrada nos isolados clínicos de P. aeruginosa estudados. Em estudo

do Programa SENTRY com isolados clínicos de P. aeruginosa, procedentes dos cinco

continentes, demonstrou que as maiores taxas de sensibilidade encontradas para esse

antimicrobiano foram observadas na América do Norte (83%), enquanto a menor taxa

foi encontrada na América Latina (74,8%) (Jones et al., 2009). Esses resultados

sugerem que piperacilina/tazobactam poderia constituir uma boa opção terapêutica

contra infecções causadas por P. aeruginosa na maioria das regiões geográficas. No

entanto, em estudo mais recente do Programa SENTRY, avaliando isolados da

América Latina, esta taxa caiu para 55,6% (Gales et al., 2012). Em outro estudo

realizado na cidade de São Paulo, as taxas de sensibilidade a piperacilina/tazobactam

foram mais baixas (36,5%) que a encontrada neste estudo (Picão et al., 2009b).

Discussão

79

Provavelmente, as porcentagens de sensibilidade à piperacilina/tazobactam em nosso

estudo foram superiores as encontradas anteriormente, porque a produção de

carbapenemases conhecidas, como SPM-1 e GES-5, não foi encontrada em nenhum

isolado clínico de P. aeruginosa.

Apenas 5 isolados apresentaram resistência a ciprofloxacino (20%; CIM50, 0,5

µg/mL). Esse valor é discrepante daqueles descritos por Fehlberg e colaboradores

(2012), onde nos isolados recuperados de um centro norte americano as taxas de

resistência foram de 75% (CIM50, 4 µg/mL) e no centro brasileiro esta taxa chegou a

51,2% (CIM50, 4 µg/mL). O aumento da resistência à ciprofloxacino entre isolados

bacterianos hospitalares e comunitários pode ser decorrente da ampla utilização das

quinolonas para o tratamento de várias infecções, como as infecções do trato urinário

adquiridas na comunidade e doenças sexualmente transmissíveis causadas por

Neisseria gonorrhoeae e Chlamydia trachomatis. A ciprofloxacina é também,

frequentemente, utilizada no tratamento de infecções causadas por P. aeruginosa,

principalmente em pacientes com fibrose cística (Yao & Moellering, 2007).

Em estudo recente do programa SENTRY a resistência aos aminoglicosídeos

foi de 23,2% (CIM50, 4 µg/mL) e 35,2% (CIM50, ≤2 µg/mL) para amicacina e

gentamicina, respectivamente (Gales et al., 2012). No entanto, neste estudo

observamos uma taxa de resistência muito baixa para essa classe de antimicrobianos.

As polimixinas B e E (Colistina) apresentam atividade bactericida contra

isolados de P. aeruginosa, e as taxas de resistência tem se mantido relativamente

baixa, aproximadamente, 0,1% (Gales et al., 2011; Gales et al., 2012). Neste estudo

pudemos constatar que todos os isolados eram sensíveis a este antimicrobiano (CIM50

e CIM90, 0,5 µg/mL). No tratamento de infecções causadas por P. aeruginosa

multirresistentes, em muitos casos, as polimixinas são uma das únicas opções clínicas

disponíveis para tratamento.

A análise do padrão de similaridade genética dos 25 isolados de P. aeruginosa

deste estudo demonstra uma grande variabilidade genética em relação ao fenótipo

Discussão

80

estudado. Nossos resultados evidenciaram que vários clones vem circulando ao

mesmo tempo nos diferentes hospitais estudados, sugerindo que o uso de

antimicrobianos age na seleção para o surgimento de clones resistentes distintos. Não

havendo, portanto, evidência de uma transmissão intra-hospitalar de um único clone.

Apenas no Hospital 3, isolados clonalmente relacionados foram encontrados, o que

demonstra uma evolução distinta em cada instituição. As amostras que foram

recuperadas do mesmo material clínico apresentaram variação clonal, o que sugere

uma evolução destas cepas.

A focalização do ponto isoelétrico permite a identificação do número e tipos de

β-lactamases produzidas por um isolado bacteriano. No entanto, os valores de pI

obtidos não correspondem aos pI reais, mas sim àqueles calculados a partir de uma

curva de regressão linear. Com isso, os valores de pI obtidos não são exatos, e

pequenas variações devem ser consideradas. Assim como, nem todos os géis de pI

conseguem detectar perfeitamente pIs de β-lactamases próximas aos limites do gel

(3,5 e 9,0). Em todos os isolados de P. aeruginosa, foi observada uma banda de pI

com valor igual a 8,2. Esta banda poderia corresponder à β-lactamase cromossomal

AmpC, que apresenta uma variação de formas, com pI de 7,6, 8,2, 8,3, 8,7 e 9,1 em

isolados de P. aeruginosa (Walther-Rasmussen et al., 1999). Além disso, as bandas

obtidas poderiam corresponder à enzima OXA-50, pois o gene codificador desta

enzima é intrínseco às bactérias pertencentes a este gênero, e apresenta pI com valor

igual a 8,6 (Girlich et al., 2004). Poderiamos também, ter outra β-lactamase, não

conhecida, que tenha sido cofocalizada neste mesmo pH. Somente a amostra P18

apresentou uma outra banda, de pI aproximado de 6,5, correspondente a OXA-56

presente nesta amostra (Poirel et al., 2004a).

Os testes da hidrólise enzimática aos carbapenens empregados neste estudo

tiveram uma correlação maior que 80%, sendo que nenhum isolado de P. aeruginosa

apresentou hidrólise no teste de espectrofotometria e quatro isolados apresentaram

um resultado duvidoso no teste realizado no MALDI-TOF MS. Esse resultado

Discussão

81

discrepante pode ser em decorrência da diferença de sensibilidade dos testes, assim

como, da subjetividade da análise no teste realizado no MALDI-TOF MS já que foi

utilizado como substrato o imipenem, e neste caso, os picos da matriz se interpõem

com os picos de massa do imipenem. No entanto resultados excelentes com

carbapenemases conhecidas já foram descritas para este teste (Carvalhaes et al.,

2013).

A disseminação de genes codificadores de β-lactamases têm sido relatados em

diversas partes do mundo (Patzer et al., 2004; Nordmann & Poirel, 2002; Walsh et al.,

2003; Toleman et al., 2005), e a produção de β-lactamases adquiridas em P.

aeruginosa causa um impacto clínico significativo nos serviços de assistência à saúde

em todo o mundo e, em particular, no Brasil. Muitas vezes as infecções causadas por

microrganismos produtores de β-lactamases estão relacionadas com falhas

terapêuticas e, assim, elevam o tempo de hospitalização, os custos e as taxas de

mortalidade (Juan et al., 2009). Apesar da disseminação de isolados de P. aeruginosa

produtores de MβL, GES-5 e ESβL no Brasil (Martins et al., 2007; Picão et al., 2009a;

Picão et al., 2009b; Polotto et al., 2012), nenhuma β-lactamase adquirida ou

carbapenemase foi encontrada nos isolados estudados.

Apenas um isolado apresentou a oxacilinase de espectro restrito OXA-56. Essa

oxacilinase foi descrita pela primeira vez em 2004, em isolados clínicos de P.

aeruginosa, produtores de SPM-1, em um hospital de Recife (Poirel et al., 2004a). A

OXA-56, no sequenciamento, apresentava três substituições em relação à OXA-7

(oxacilinase de espectro restrito) e OXA-35 (oxacilinase do tipo EsβL). Esta enzima

não era inibida pelo ácido clavulânico (Poirel et al., 2004a). Em 2006, Carvalho e

colaboradores relataram a presença de OXA-56 em isolados de P. aeruginosa

produtores de SPM-1, no Rio de Janeiro. Nesse estudo, demonstraram que o gene

blaOXA-56 estava localizado em um integron de classe 1, nomeado como In163. Esse

integron era composto, além do gene codificador da OXA-56, de dois genes cassetes

que conferiam resistência aos aminoglicosídeos (aacA4 e aadA7). Doi e colaboradores

Discussão

82

(2008) descreveram o contexto genético de um isolado produtor de rmtD e

caracterizaram com isso, o integron completo da OXA-56, que estava localizado à

montante do gene da rmtD. Na amostra estudada P18, o gene blaOXA-56 estava

localizado à jusante do gene aacA4 e à montante do cassete gênico qacEΔ1/sul1,

demonstrando um arranjo igual aquele descrito previamente (Carvalho et al., 2006; Doi

et al., 2008). O fato de este isolado carrear o gene rmtD também reforça a estrutura

descrita por Doi e colaboradores (2008). Não houve a detecção da OXA-56 em

nenhum outro país até o momento e talvez a disseminação restrita do gene blaOXA-56

esteja relacionado a coprodução da SPM-1.

Apesar de todos os isolados apresentarem um baixo grau de resistência aos

carbapenens (MIC90, 16 µg/mL para imipenem e meropenem) o que desfavorece o

encontro de carbapenemases, dois relatos recentes em nosso país demonstrou a

presença de isolados produtores de MβLs em isolados sensíveis aos carbapenens. No

primeiro relato, Pellegrino e colaboradores (2009) isolaram uma P. aeruginosa

produtora de SPM-1, sensível aos carbapenens. Em 2012, Picão e colaboradores

descreveram dois isolados de P. aeruginosa produtores de IMP-16, com baixa

resistência a imipenem e sensíveis ao meropenem.

Como esperado, todos os isolados de P. aeruginosa carreavam as enzimas

cromossomais e intrínsecas desta espécie, OXA-50 e AmpC. Diversas variantes de

OXA-50 já foram descritas em isolados clínicos de P. aeruginosa de várias regiões

geográficas, sendo denominadas de OXA-50a a OXA-50j (Girlich et al., 2004; Empel et

al., 2007; Seok et al., 2011). Nos 25 isolados de P. aeruginosa estudados, pudemos

constatar uma grande diversidade de OXA-50, assim como, um grande número de

novos mutantes. Porém, estas mutações não estavam localizadas nos 5 elementos

estruturais conservados da sequência consenso das DBLs, este fato poderia estar

relacionado a uma alteração no perfil hidrolítico da enzima, no entanto mais estudos

são necessários para se comprovar tal fato (Girlich et al., 2004). Dos quatro isolados

que apresentaram hidrólise duvidosa na técnica de MALDI-TOF, três apresentaram

Discussão

83

novas mutações e apenas um isolado apresenta a OXA-50e. No entanto, maiores

esclarecimentos sobre o perfil hidrolítico destas enzimas nestas amostras se fazem

necessários.

Diversos trabalhos já demonstraram a utilização de cloxacilina, um β-lactâmico,

para inibir a atividade da β-lactamase cromossomal AmpC (Corvec et al., 2003; Poirel

et al., 2003; Jiang et al., 2006). Neste estudo notamos que a ceftazidima foi menos

influenciada pela ação de inibição da cloxacilina que o imipenem. Este resultado

poderia estar relacionado com alguma mutação no gene da β-lactamase cromossomal

AmpC ou até mesmo com alguma alteração no perfil hidrolítico da OXA-50. No estudo

de Rodríguez-Martínez e colaboradores (2009a) todos os isolados hiperprodutores de

AmpC tiveram as CIMs de ceftazidima reduzidas na presença de cloxacilina. O

inibidor, PAβN, foi o primeiro inibidor de bombas de efluxo de amplo espectro descrito

(Ueda et al., 2005). Este inibidor foi capaz de potencializar de 8 a 64 vezes a atividade

de levofloxacina contra cepas mutantes que hiperexpressavam o sistema MexAB-

OprM quanto comparadas às cepas selvagens de P. aeruginosa (Kaatz, 2005). Os

substratos, assim como, o inibidor foram escolhidos de acordo com estudos prévios

(Lomovskaya et al., 2001; Denny et al., 2005). Todos os isolados apresentaram

redução da CIM para cirpofloxacino na presença de PAβN, demonstrando o

envolvimento de sistemas de bombas de efluxo no aumento da CIM para este

antimicrobiano. Em um estudo recente de Sonnet e colaboradores (2012) foram

avaliados isolados de P. aeruginosa com resistência às fluoroquinolonas. A CIM50 de

ciprofloxacino reduziu três diluições (CIM50, de 16 µg/mL para 2 µg/mL) na presença

de PAβN, assim como foi observado que a sensibilidade foi recuperada em 22,2% dos

isolados estudados. Vários sistemas de bombas de efluxo estão envolvidos na

resistência ás fluoroquinolonas (Lister et al., 2009). Diversos estudos demonstram que

o PAβN é rotineiramente combinado com antibióticos da classe das fluoroquinolonas,

mas poucos estudos avaliaram a sua utilidade em combinação com antibióticos β-

lactâmicos. Ainda que de forma mais discreta, as CIMs para imipenem também

Discussão

84

diminuíram cerca de duas diluições. Lamers e colaboradores (2013) notaram que o

PAβN reduziu as CIMs de vários β-lactâmicos em isolados de P. aeruginosa, no

entanto, as alterações de sensibilidade não eram inteiramente devido à inibição de

bombas de efluxo. O PAβN permeabilizou a membrana externa de todos os isolados

de P. aeruginosa testados, aumentando a concentração da β-lactamase cromossomal

AmpC e permitindo a entrada de moléculas que normalmente não atravessam a

membrana externa de P. aeruginosa.

A resistência aos antimicrobianos em isolados clínicos de P. aeruginosa, pode

ser atribuída à associação de diferentes mecanismos de resistência, como, por

exemplo, o efluxo ativo e a redução da permeabilidade da membrana externa. Os

sistemas de bombas de efluxo expelem uma variedade de classes de antimicrobianos

utilizados para o tratamento de infecções causadas por esse patógeno, reduzindo a

concentração dos mesmos no interior celular. No entanto, pouco se conhece sobre o

impacto clínico que esses sistemas podem causar (Yoshihara et al., 2009). Não existe

um consenso que defina os limites de hiperexpressão dos sistemas de efluxo com a

elevação da CIM para os substratos destes sistemas, sendo estes por sua vez muito

arbitrários. No entanto, nesse estudo, utilizamos os critérios estabelecidos

anteriormente: aumento da transcrição de no mínimo duas e quatro vezes para os

genes mexB e mexY, mínimo de 100 vezes para mexD e mexF, mínimo de dez vezes

para a β-lactamase cromossomal ampC e redução de 30% da transcrição do gene

oprD em comparação com a cepa referência PA01 (Quale et al., 2006, Rodriguez-

Martinez et al., 2009b).

Neste estudo a média do aumento da transcrição dos genes que codificam os

sistemas de efluxo avaliados foi maior para o sistema EFN (6,04) nos isolados clínicos

de P. aeruginosa estudados, seguido pelo sistema CDJ (2,69).

O sistema MexAB-OprM é expresso constitutivamente em cepas selvagens de

P. aeruginosa e contribui significativamente para a resistência aos antimicrobianos.

Este sistema responsável, muitas vezes, pela resistência de P. aeruginosa aos β-

Discussão

85

lactâmicos, com exceção do imipenem, e a sua hiperexpressão pode comprometer

também a sensibilidade às fluoroquinolonas (Poole, 2007, Lister et al., 2009). O

aumento dos níveis transcricionais de mexB foi de 36% no isolados estudados e

diversos trabalhos no mundo todo já demonstraram a relação da hiperexpressão do

sistema ABM com a resistência aos agentes β-lactâmicos e com baixos níveis de

sensibilidade à ciprofloxacino (Ziha-Zarifi et al., 1999; Hocquet et al., 2007). Esses

achados podem explicar, parcialmente, os resultados obtidos na inibição com PAβN e

à ciprofloxacino.

Em nosso estudo, nenhum isolado de P. aeruginosa apresentou aumento da

transcrição para mexD e mexF de, no mínimo,100 vezes, em relação à cepa referência

PA01. No entanto, se utilizarmos o critério sugerido por Hocquet e colaboradores

(2006), 80% e 100% dos isolados hiperexpressaram os sistemas CDJ e EFN,

respectivamente. Cepas de P. aeruginosa que hiperexpressam o sistema MexCD-

OprJ, geralmente apresentam sensibilidade ao imipenem e aminoglicosideos (Wolter

et al., 2005). A hiperexpressão do sistema MexEF-OprN, geralmente está associada a

sensibilidade a maioria dos antimicrobianos, relacionando-se assim, com o fenótipo

dos isolados de P. aeruginosa estudados (Okamoto et al., 2002). Existem relatos

sobre a capacidade que o sistema MexEF-OprN tem em diminuir a expressão do

sistema MexAB-OprM, numa atividade corregulatória (Maseda et al., 2004).

O sistema XY é um dos principais responsáveis pela resistência intrínseca, em

cepas selvagens de P. aeruginosa, sendo as fluoroquinolonas e a cefepima substratos

preferenciais desse sistema de efluxo (Strateva & Yordanov, 2009). A hiperexpressão

do sistema de efluxo MexXY-OprM esta relacionada a isolados resistentes à cefepima,

porém, sensíveis à ceftazidima (Hocquet et al., 2006). A transcrição do gene mexY foi

menor do que o da cepa referência em 52% dos isolados estudados. Apesar do

sistema MexXY-OprM ser um dos principais mecanismo de resistência de P.

aeruginosa aos aminoglicosideos (Morita et al., 2006), os dois isolados resistentes aos

aminoglicosídeos não hiperexpressavam esse sistema de efluxo.

Discussão

86

Hocquet e colaboradores (2006) sugeriram que os sistemas de efluxo estão

hiperexpressos quando a sua expressão é duas vezes maior quando comparado com

a amostra referência. Evidenciamos, assim, a falta de critérios que definam os limites

adequados para a hiperexpressão dos sistemas de efluxo. Se considerarmos um

ponto de corte da expressão de três vezes mais em relação a PAO1, observamos que

20%, 28%, 100% e 20% dos isolados hiperexpressam os sistemas ABM, CDJ, EFN e

XY, respectivamente. Esses índices são menores ainda quando consideramos uma

expressão maior que quatro vezes em relação à PA01 (8% para ABM, 8% para CDJ,

40% EFN). Estudos adicionais são necessários para o estabelecimento de criterios

que possam detectar corretamente a presença de hiperexpressão de efluxo entre

isolados clínicos de P. aeruginosa.

Em 2010, o trabalho publicado por Xavier e colaboradores demonstrou que os

sistemas de efluxo MexAB-OprM e MexXY-OprM eram frequentemente mais

transcritos que os sistemas de efluxo MexEF-OprN e MexCD-OprJ (3,5%) em isolados

clínicos de P. aeruginosa em um hospital da cidade de São Paulo. Resultados

semelhantes foram reportados no estudo de Fehlberg e colaboradores (2012), no qual

se verificou que o sistema de efluxo mais expresso foi o MexXY-OprM (41,6%) no

centro Brasileiro. No entanto, quando foram avaliados os isolados do centro Norte

Americano o sistema de efluxo mais expresso foi o MexAB-OprM (26,4%). Ambos os

estudos avaliaram amostras do mesmo hospital de São Paulo, enquanto este estudo

avaliou, na sua maioria, amostras de outros dois hospitais demonstrando que padrões

de uso de antimicrobianos e políticas de controle de infecção hospitalar podem

influenciar na seleção de cepas com distintos padrões de resistência.

A hiperexpressão da β-lactamase cromossomal AmpC e a redução na

expressão de oprD representam importantes mecanismos de resistência aos β-

lactâmicos amostras clinicas de P. aeruginosa (Poole, 2004). A contribuição da β-

lactamase cromossomal AmpC para a resistência aos carbapenens parece ser mínima

(Poole et al., 1996). No entanto, já foram descritas variantes da β-lactamase

Discussão

87

cromossomal AmpC em P. aeruginosa cujo espectro hidrolítico inclui o imipenem,

essas enzimas foram denominadas ESAC. Três variantes, PDC-2, PDC-4 e PDC-8

apresentaram resistência a imipenem e sensibilidade à ceftazidima, no entanto todas

apresentaram resistência ou resistência intermediária à cefepime (Rodriguez-Martinez

et al., 2009a). Neste estudo, a caracterização hidrolítica da β-lactamase cromossomal

AmpC não foi realizada, não podendo assim, ser afirmado se esses isolados

apresentam uma ESAC. O aumento da transcrição do gene ampC associado à

redução da transcrição de oprD parece afetar, principalmente, o imipenem,

apresentando pouco efeito contra o meropenem (Livermore, 1992).

O gene ampC apresenta expressão basal em cepas selvagens de P.

aeruginosa, podendo a sua expressão ser induzida a altos níveis na presença de β-

lactâmicos indutores, como o imipenem. 40% dos isolados estudados tiveram um

aumento da transcrição desse gene, no entanto se utilizarmos um critério de

expressão quatro vezes maior que à cepa referência PAO1, 88% dos isolados tiveram

um aumento da transcrição desse gene. Isolados de P. aeruginosa que produzem

altos níveis da β-lactamse cromossomal AmpC estão, frequentemente, associados à

falha terapêutica, quando cefalosporinas de amplo espectro são utilizadas (Tam et al.,

2007). A expressão de OprD estava reduzida em todos os isolados e a média da

expressão da OprD foi de 0,2 nos isolados de P. aeruginosa estudados. A redução na

expressão de OprD, configurou-se assim, como o principal mecanismo de resistencia

ao imipenem. Estudos demonstram que a regulação do gene oprD por si só seria

suficiente para elevar as CIMs do imipenem (Livermore, 1992). Assim como, a perda

ou redução da transcrição do gene oprD, associado à hiperexpressão de diferentes

sistemas de efluxo, contribui significamente para o aumento das CIMs dos

carbapenens, especialmente do imipenem (Quale et al., 2006, Zavascki et al., 2010).

Um estudo espanhol avaliou a expressão da β-lactamase cromossomal AmpC,

MexB, MexD, MexF e mexY, e demonstrou que 39% dos isolados hiperexpressavam

pelo menos ums dos mecanismos, sendo a AmpC o mecanismo mais predominante.

Discussão

88

Assim como também, todos os isolados resistentes à imipenem apresentaram

mutações de inativação no gene oprD (Cabot et al., 2011).

As mudanças na expressão da porina da membrana externa OprD é um dos

principais mecanismos de resistência aos carbapenens em isolados de P. aeruginosa

(Yoneyama e Nakae, 1993). A perda da porina OprD têm sido associada, cada vez

mais, a resistência ao imipenem (Livermore, 2001; Tomás et al., 2010; Fournier et al.,

2013). Existem relatos na literatura científica que indicam que existem homólogos da

proteína OprD, o que pode gerar porinas de tamanhos diferenciados (Tamber et al.,

2006; Tamber & Hancock, 2006). Assim, a ausência de proteínas de 45 até 49 kDa

são relatados e relacionados com fenótipos de resistência a imipenem (Nikaido et al.,

1991; Müller-Premru & Lejko-Zupanc, 2002; Li et al., 2012). Todos os isolados de P.

aeruginosa estudados não apresentaram a porina de 46 kDa, mas apresentaram uma

porina de aproximadamente 48 kDa, no gel de SDS-PAGE, fato este que sugere que

nenhum isolado perdeu a OprD. Entretanto, a presença desta banda não garante que

esta seja a OprD, sendo necessários experimentos de Western-blot para a

confirmação dos resultados.

A resistência ao imipenem está associada a alterações na OprD que podem

ser: alterações na transcrição do gene ou em genes reguladores da transcrição,

mutações no gene estrutural e sequencias de inserção (Pirnay et al., 2002; Wolter et

al., 2004b). Cinco isolados de P. aeruginosa apresentaram uma banda de

aproximadamente 2.100 pb, sugerindo a presença de sequencias de inserção no gene

codificador da OprD, como já descrito previamente (Evans & Segal, 2007). Dois

isolados não tiveram amplificação com os oligonucleotideos iniciadores utilizados, fato

este que sugere a presença de sequencias de inserção ou mutações na região de

anelamento. No entanto, não podemos garantir que os isolados que apresentaram

uma banda de 1.400 pb estejam codificando uma proteína funcionalmente ativa.

Em um estudo avaliando seis isolados de P. aeruginosa pan-resistentes foi

constatado a deficiência da OprD, devido a uma supressão parcial do gene oprD,

Discussão

89

mutações pontuais levando a um stop códon prematuro, ou a falta de expressão de

OprD na ausência de mutações do gene (Moyá et al., 2012). No entanto, um estudo

realizado na Espanha demonstrou que a inativação por mutações na OprD em

isolados clínicos de P. aeruginosa não se restringe apenas a isolados resistentes aos

carbapenens, mas também aqueles sensíveis (CIMs para imipenem ou meropenem -

CIMs 0,06 a 4 µg/ml) (Ocampo-Sosa et al., 2012). No entanto, estudos mais

aprofundados ainda devem ser feitos para a caracterização molecular do gene oprD e

com isso podermos explicar a variabilidade de bandas no gel de SDS-PAGE e nas

bandas obtidas pela amplificação do gene oprD, evidenciando se estes isolados

apresentam a OprD mutada ou expressam outra porina.

O fato dos cinco isolados que apresentaram elevado grau de resistência à

ciprofloxacina, não terem suas CIMs reduzidas para serem categorizadas como

sensíveis à ciprofloxacino na presença de PAβN sugere, que além da influência das

bombas de elfuxo, exista a presença de mutações nas regiões de determinantes de

resistência às quinolonas dos genes gyrA e parC. Mutações nos genes das

topoisomerases II e IV é o principal mecanismo de resistência às fluoroquinolonas em

diversas espécies bacterianas. Outros mecanismos de resistência como a

hiperexpressão dos sistemas de efluxo ou alterações das proteínas da membrana

externa, podem estar relacionados com a resistência a ciprofloxacino (Nakano, 1997;

Poole, 2000). Um estudo com isolados de P. aeruginosa recuperados de diferentes

sítios corpóreos de pacientes com fibrose cística em um hospital dinamarquês,

demonstrou que a coexpressão dos sistemas CDJ e EFN estava associada a isolados

recuperados de infecções pulmonares, enquanto as mutações nos genes gyrA e parC

foram encontradas em isolados clínicos recuperados do trato urinário e de feridas

(Jalal et al., 2000). No nosso estudo, dos cinco isolados que apresentaram mutações

no QRDR dos genes gyrA e parC, três foram isolados de urina.

O sequenciamento da QRDR do gene gyrA e parC apresentaram uma mutação

no códon 83 e 80 em todos os isolados resistentes a ciprofloxacino, respectivamente.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Ocampo-Sosa%20AA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22290967

Discussão

90

Estes resultados são consistentes com aqueles reportados em estudos prévios com

cepas clínicas de P. aeruginosa resistentes a essa classe. No, nosso estudo, como

nos outros o ponto de mutação na posição 83 de gyrA sempre conduz à substituição

de uma treonina para uma isoleucina (Thr83Ile) e na posição 80 de parC leva à

substituição de uma serina para uma leucina (Ser80Leu). Estes resultados reforçam a

hipótese de que estes aminoácidos podem ter um papel importante na formação de

um sítio de ligação da DNA girase com as fluoroquinolonas (Mouneimné, 1999;

Yonezawa, 1995; Akasaka et al., 2001; Oh et al., 2003; Lee et al., 2005b; Hansen,

2006).

Os aminoglicosídeos, geralmente, são utilizados em esquemas terapêuticos

combinados com β-lactâmicos em infecções graves por P. aeruginosa, minimizando

assim, os riscos de falha terapêutica e a seleção de cepas resistentes (Safdar et al.,

2004). No entanto, nos últimos anos a resistência à amicacina e gentamicina vem

aumentando no mundo e no Brasil. As 16S RNA metilases vem sendo cada vez mais

descritas como um importante mecanismo de resistência aos aminoglicosideos em

patógenos Gram negativos, incluindo P. aeruginosa isoladas no Brasil (Doi & Arakawa,

2007; Doi et al., 2007a; Doi et al., 2007b; Castanheira et al., 2008; Lincopan et al.,

2010). No presente estudo, apenas o isolado resistente a ambos os aminoglicosídeos,

carreava o gene rmtD. Este gene foi descrito pela primeira vez em um isolado de P.

aeruginosa produtor de SPM-1 no Brasil (Doi et al., 2007a). Existem diversos relatos

de isolados coprodutores de ESβLs ou MβLs com 16S RNA metilases, contribuindo

assim, para o aparecimento de isolados multirresistentes. Coincidentemente, o isolado

P18, que carregava o gene blaOXA-56 e rmtD apresenta perfil clonal fortemente

relacionado ao clone produtor de SPM-1 disseminado no nosso país desde 2001

(Toleman et al., 2002), mas não apresentava o gene blaSPM-1. Este fato pode indicar

que o clone endêmico pode ter adquirido o gene blaSPM-1, ou que o isolado estudado

perdeu o gene que carreava esta MβL.

Discussão

91

Os resultados encontrados neste estudo sugerem o envolvimento de múltiplos

mecanismos cromossomais no fenótipo incomum de resistência aos carbapenens e

sensibilidade às cefalosporinas de amplo espectro dos isolados clínicos de P.

aeruginosa. Refletindo a complexidade dos mecanismos em sua maioria, intrínsecos e

reforçando a dificuldade da compreensão do papel individual que estes mecanismos

cromossomais de resistência possam estar exercendo em isolados clínicos de P.

aeruginosa. Este fenótipo incomum entre estes isolados clínicos de P. aeruginosa

alerta para uma adaptação à pressão seletiva exercida por antimicrobianos e

desenvolvimento de resistência às drogas. Com isso favorecendo a sobrevivência de

isolados de P. aeruginosa, aumentando, assim, a chance de adquirir outros

determinantes de resistência no ambiente hospitalar e contribuindo para o surgimento

de cepas altamente resistentes a varias classes de antimicrobianos.

Devido à importância crescente de P. aeruginosa como agente de infecções

relacionadas à assistência a saúde e ao surgimento constante de amostras

multirresistentes e com fenótipos incomuns, que tornam, muitas vezes, inviável

qualquer esquema terapêutico antimicrobiano, é de grande relevância a vigilância

constante para detectar precocemente o aparecimento e disseminação destes

isolados.

Conclusões

92

7 CONCLUSÕES

Todos os isolados clínicos de P. aeruginosa tiveram o fenótipo de resistência a

pelo menos um dos carbapenens e sensibilidade as cefalosporinas de amplo

espectro confirmado pelo método de referência.

A polimixina B foi o antimicrobiano mais ativo frente aos isolados de P.

aeruginosa.

Uma alta diversidade de padrões de PFGE foi verificada nos isolados clínicos

de P. aeruginosa.

Todos os isolados apresentaram as β-lactamases cromossomais e intrínsecas

desta espécie, OXA-50 e β-lactamase cromossomal AmpC.

A produção da OXA-56 foi observada em apenas um isolado clinico de P.

aeruginosa.

Dentre as bombas de efluxo avaliadas nesse estudo, a hiperexpressão do

sistema MexEF-OprN apresentou maior frequência, seguida pela hiperexpressão

do sistema MexCD-OprJ.

A hiperexpressão da β-lactamase cromossomal AmpC parece desempenhar

um papel importante na resistência ao imipenem.

A redução da transcrição do gene oprD foi o mecanismo mais frequente entre

os isolados de P. aeruginosa estudados e pode desempenhar um importante

papel na resistência ao imipenem.

Nos cinco isolados de P. aeruginosa resistentes à ciprofloxacino, mutações na

QRDR dos genes gyrA e parC foram detectados, parecendo ser o principal

mecanismo de resistência relacionado. No entanto, o envolvimento dos sistemas

de bombas de efluxo também foi evidenciado através da redução das CIMs na

presença de PAβN.

Conclusões

93

A presença do gene rmtD foi confirmada em um único isolado resistente aos

aminoglicosídeos testados. Este isolado era produtor da OXA-56 e fortemente

relacionado ao clone produtor de SPM-1 disseminado em nosso país.

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127

ABSTRACT

Objective: The aim of this study was to evaluate the resistance mechanisms in clinical

isolates of P. aeruginosa, which showed resistance to carbapenems but susceptibility

to broad spectrum cephalosporins. Methods: A total of 25 isolates of P. aeruginosa

recovered from different sites of infection in three different hospitals in the city of São

Paulo was evaluated. The antimicrobial susceptibility profile was confirmed by broth

microdilution (CLSI, 2012). Genetic relationship was assessed by PFGE technique,

and carbapenem hydrolysis was carried out by spectrophotometer and MALDI-TOF

assays. The presence of β-lactamase-encoding genes was investigated by PCR

followed by DNA sequencing. Derepression of AmpC β-lactamase and efflux pump

overexpression was phenotypically evaluated by inhibition with cloxacillin and PaβN,

respectively. The transcription of genes mexB, mexD, mexF and mexY, AmpC

chromosomal β-lactamase and porin oprD was assessed by qRTPCR. The profile of

outer membrane proteins was performed by SDS-PAGE and PCR technique.The

resistance to aminoglycosides and ciprofloxacin was evaluated by PCR followed by

sequencing. Results: The phenotype of resistance to at least one of the carbapenems

(imipenem and meropenem) and susceptibility to broad spectrum cephalosporin

(cefepime and ceftazidime) was confirmed in all clinical isolates studied. The resistance

to ciprofloxacin, and aminoglycosides was observed in five (20%) and two (8%) of

these isolates, respectively. The isolates were clustered into 17 genotypes without

predominance of a specific pattern. Carbapenem hydrolysis was not detected by

spectrophotometer, however, by MALDI-TOF, four isolates showed equivocal findings

but search for carbapenemases known encoding genes was negative. Chromosomal

blaOXA-50 and blaampC genes were amplified and blaOXA-50 sequencing revealed multiple

mutations. One of these isolates carried blaOXA-56. MICs varied ≥ 2 dilutions of the

antimicrobials for the majority of the isolates tested in the presence of cloxacillin and

PaβN. The average relative expression of genes mexB, mexD, mexF and mexY were

1.92, 2.69, 6.04 and 1.56, respectively. The AmpC β-lactamase was hyperexpressed in

40% of the isolates of P. aeruginosa, while all isolates had a decrease in the OprD

expression. The SDS-PAGE assay suggested a change in the 46 kDa porin in all

clinical isolates studied. Ciprofloxacin-resistant isolates presented QRDR mutations in

gyrA and parC genes and only one isolate resistant to the aminoglycoside carried rmtD

gene. Conclusion: Our results suggest the involvement of multiple chromosomal

mechanisms, overexpression of the AmpC chromosomal β-lactamase and reduced

expression of OprD in the phenotype of resistance to carbapenems and sensitivity to

extended-spectrum cephalosporins among clinical isolates of P. aeruginosa.

128

ANEXOS

Anexo 1. Scores da identificação bacteriana pela técnica de MALDI-TOF MS.

Isolados Score MALDI-TOF MS Gênero e Espécie

P1 2.303

(+++)

2.253

(++)

2.428

(+++) Pseudomonas aeruginosa

P2 2.263

(++)

2.218

(++)

2.182

(++) Pseudomonas aeruginosa

P3 2.263

(++)

2.218

(++)

2.182


P4 2.411

(+++)

2.525

(+++)

2.363


P5 2.047

(++)

2.253

(++)

1.860

(+) Pseudomonas aeruginosa

P6 2.200

(++)

2.133

(++)

1.968


P7 2.039

(++)

1.941

(+)

2.064


P8 1.982

(+)

2.021

(++)

1.948


P9 1.982

(+)

2.021

(++)

1.948


P10 1.897

(+)

2.035

(++)

1.882


P11 2.129

(++)

2.052

(++)

2.038


P12 2.070

(++)

1.954

(+)

2.036


P13 2.130

(++)

2.035

(++)

2.098


P14 1.736

(+)

2.114

(++)

2.012


P15 2.009

(++)

2.048

(++)

1.943


P16 2.074

(++)

2.164

(++)

2.316


P17 1.896

(+)

1.935

(+)

2.003


P18 2.323

(+++)

1.957

(+)

2.194


P19 1.959

(+)

1.894

(++)

2.186


P20 1.716

(+)

1.894

(+)

2.256


P21 2.189

(++)

2.348

(+++)

2.047


P22 2.006

(++)

2.005

(++)

2.306


P23 2.071

(++)

2.088

(++)

2.207


P24 1.838

(+)

2.057

(++)

1.945


P25 2.103

(++)

1.932

(+)

2.301


129

Anexo 2. Expressão relativa dos genes avaliados neste estudo para os 25 isolados clínicos de

P. aeruginosa e da ATCC de P. aeruginosa 27853 em comparação à cepa referência PA01.

Isolados Genes

mexB mexD mexF mexY ampC oprD

P1 1,55 2,94 5,51 2,63 5,61 0,50

P2 3,24 2,46 6,43 1,61 6,29 0,43

P3 2,09 2,34 4,44 3,20 10,09 0,41

P4 1,48 4,61 9,77 4,50 6,10 0,10

P5 1,29 2,17 7,61 2,17 2,59 0,01

P6 2,10 2,17 5,50 0,49 10,35 0,18

P7 2,46 2,54 5,60 0,43 8,02 0,02

P8 4,61 1,80 3,98 0,12 4,35 0,25

P9 1,41 2,67 8,73 3,54 3,94 0,07

P10 1,29 2,06 5,38 0,13 7,37 0,37

P11 1,23 3,82 6,04 1,16 9,71 0,19

P12 1,09 3,27 7,12 2,61 14,67 0,07

P13 0,64 1,84 10,45 0,20 17,93 0,19

P14 0,86 2,84 7,42 0,55 18,76 0,08

P15 0,73 2,71 5,66 5,12 12,18 0,01

P16 3,16 2,02 3,92 1,13 5,83 0,14

P17 1,41 2,14 4,98 2,33 5,27 0,13

P18 1,33 3,85 4,50 0,24 13,75 0,26

P19 1,28 1,68 3,23 0,36 19,37 0,50

P20 1,30 4,55 9,64 4,38 13,01 0,13

P21 4,57 3,18 6,08 0,32 4,95 0,25

P22 3,40 3,58 3,52 0,27 6,06 0,10

P23 1,11 2,24 7,34 0,37 2,68 0,01

P24 2,66 1,96 4,40 0,95 8,25 0,14

P25 1,70 1,80 3,77 0,15 13,18 0,47

ATCC PSA 1,13 0,38 12,04 0,24 0,51 0,52

PAO1 1 1 1 1 1 1

130

Anexo 3. Curva de amplificação dos isolados de P. aeruginosa, ATCC de P. aeruginosa 27853

e cepa referência PAO1 para os genes mexB, mexD, mexF, mexY, ampC e oprD.

A B C

D E F

G H I

131

Anexo 4. Curva de melting dos isolados de P. aeruginosa, ATCC de P. aeruginosa 27853 e

cepa referência PAO1 para os genes mexB, mexD, mexF, mexY, ampC e oprD.

A B C

D E F

G H I

132

Anexo 5. Dendograma dos isolados de P. aeruginosa estudados, relacionados por padrão de PFGE, hospital, fenótipos, PCR e qRT-PCR.

* Espectrof. – Teste de Hidrólise Enzimática por Espectrofotometria; Neg –Negativo; Duv – Duvidoso; AMI – Amicacina; GEN – Gentamicina; CAZ – Ceftazidima; CEP – Cefepima; IMI – Imipenem; MER – Meropenem; CIP – Ciprofloxacino; CLOX – Cloxacilina.

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RESISTÊNCIA AOS CARBAPENENS E SENSIBILIDADE ÀS ... · Professor Dr. Álvaro Nagib Atallah Coordenador do Curso de Pós-graduação: Professora Dra. Maria Lucia Oliveira de Souza