RESOLUCIÓ GUÍA PRÁCTICA PARA LA … sus procedimientos de validación, control de calidad interno y estimación de la incertidumbre de los métodos alternativos que aplican. 2

RESOLUCIÓN OENO 10/2005

Certificado conforme

Paris, 20 de julio de 2005 El Director General de la OIV

Secretario de la Asamblea general

Federico CASTELLUCCI

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GUÍA PRÁCTICA PARA LA VALIDACIÓN, EL CONTROL DE CALIDAD Y LA ESTIMACIÓN DE LA INCERTIDUMBRE DE UN MÉTODO DE ANÁLISIS ENOLÓGICO ALTERNATIVO LA ASAMBLEA GENERAL, Visto el artículo 2, párrafo 2 iv, del acuerdo del 3 de abril de 2001 relativo a la creación de la Organización Internacional de la Viña y el Vino A propuesta de la Subcomisión de métodos de análisis y de valoración de los vinos, DECIDE: introducir en el Anexo E del Compendio Internacional de Métodos de Análisis la siguiente Guía, que anula y remplaza la resolución Oeno 6/99 «Protocolo de validación de un método de análisis habitual respecto al método de referencia OIV»

Guía práctica para la validación, el control de calidad y la estimación de la incertidumbre de un método de análisis enológico alternativo

Índice

1. OBJETO....................................................................................................................................................................5

2. PREÁMBULO Y CAMPO DE APLICACIÓN .....................................................................................................5

3. TERMINOLOGÍA GENERAL...............................................................................................................................6

4. PRINCIPIOS GENERALES .................................................................................................................................10 4.1 METODOLOGÍA ...............................................................................................................................................10 4.2 DEFINICIÓN DEL ERROR DE MEDICIÓN ........................................................................................................11

5. VALIDACIÓN DE UN MÉTODO........................................................................................................................12 5.1 METODOLOGÍA ...............................................................................................................................................12 5.2 PRIMERA ETAPA: CAMPOS DE APLICACIÓN DEL MÉTODO.........................................................................13

5.2.1 Definición de las matrices analizables .....................................................................................................13 5.2.2 Límite de detección y de cuantificación....................................................................................................13

5.2.2.1 Definición normativa ............................................................................................................................................. 13 5.2.2.2 Documentación de referencia ................................................................................................................................ 14 5.2.2.3 Aplicación.............................................................................................................................................................. 14 5.2.2.4 Modo operatorio .................................................................................................................................................... 14

5.2.2.4.1 Determinación sobre blanco ............................................................................................................................ 14 5.2.2.4.1.1 Campos de aplicación............................................................................................................................... 14 5.2.2.4.1.2 Protocolo básico y cálculos ...................................................................................................................... 14

5.2.2.4.2 Procedimiento mediante el estudio de linealidad............................................................................................. 15 5.2.2.4.2.1 Campos de aplicación............................................................................................................................... 15 5.2.2.4.2.2 Protocolo básico y cálculos ...................................................................................................................... 16

5.2.2.4.3 Procedimiento gráfico derivado del ruido de fondo del registro...................................................................... 17 5.2.2.4.3.1 Campos de aplicación............................................................................................................................... 17 5.2.2.4.3.2 Protocolo básico y cálculo........................................................................................................................ 17

RESOLUCION OENO 10/2005





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5.2.2.4.4 Comprobación de un límite de cuantificación predeterminado ....................................................................... 17 5.2.2.4.4.1 Campos de aplicación............................................................................................................................... 17 5.2.2.4.4.2 Protocolo básico y cálculo........................................................................................................................ 18

5.2.3 Robustez....................................................................................................................................................19 5.2.3.1 Definición .............................................................................................................................................................. 19 5.2.3.2 Determinación ....................................................................................................................................................... 19

5.3 SEGUNDA PARTE: ESTUDIO DEL ERROR SISTEMÁTICO ..............................................................................19 5.3.1 Estudio de linealidad ................................................................................................................................19

5.3.1.1 Definición normativa ............................................................................................................................................. 19 5.3.1.2 Documentos de referencia ..................................................................................................................................... 20 5.3.1.3 Aplicación.............................................................................................................................................................. 20 5.3.1.4 Procedimiento tipo ISO 11095............................................................................................................................... 21

5.3.1.4.1 Protocolo básico .............................................................................................................................................. 21 5.3.1.4.2 Cálculos y resultados ....................................................................................................................................... 21

5.3.1.4.2.1 Definición del modelo de regresión ......................................................................................................... 21 5.3.1.4.2.2 Estimación de los parámetros................................................................................................................... 22 5.3.1.4.2.3 Representaciones gráficas ........................................................................................................................ 22 5.3.1.4.2.4 Test de la hipótesis de linealidad.............................................................................................................. 25

5.3.1.4.2.4.1 Definiciones de los errores ligados a la calibración .......................................................................... 25 5.3.1.4.2.4.2 Test de Fischer-Snedecor .................................................................................................................. 26

5.3.1.5 Procedimiento ISO 8466........................................................................................................................................ 27 5.3.1.5.1 Protocolo básico .............................................................................................................................................. 27 5.3.1.5.2 Cálculos y resultados ....................................................................................................................................... 27

5.3.1.5.2.1 Definición del modelo de regresión lineal................................................................................................ 27 5.3.1.5.2.2 Definición del modelo de regresión polinomial ....................................................................................... 27 5.3.1.5.2.3 Comparación de las desviaciones estándar residuales.............................................................................. 29

5.3.2 Especificidad.............................................................................................................................................30 5.3.2.1 Definición normativa ............................................................................................................................................. 30 5.3.2.2 Aplicación.............................................................................................................................................................. 30 5.3.2.3 Modos operatorios ................................................................................................................................................. 30

5.3.2.3.1 Test de adiciones dosificadas........................................................................................................................... 30 5.3.2.3.1.1 Campo de aplicación ................................................................................................................................ 30 5.3.2.3.1.2 Protocolo básico ....................................................................................................................................... 31 5.3.2.3.1.3 Cálculos y resultados................................................................................................................................ 31

5.3.2.3.1.3.1 Estudio de la recta de regresión r = a + b.v....................................................................................... 31 5.3.2.3.1.3.2 Explotación de los resultados............................................................................................................ 33 5.3.2.3.1.3.3 Representación gráfica de la recta de superposiciónt........................................................................ 33

5.3.2.3.2 Estudio de la influencia de otros compuestos en el resultado de la medición.................................................. 34 5.3.2.3.2.1 Campo de aplicación ................................................................................................................................ 34 5.3.2.3.2.2 Protocolo básico y cálculos ...................................................................................................................... 34 5.3.2.3.2.3 Interpretación ........................................................................................................................................... 35

5.3.3 Estudio de la veracidad del método..........................................................................................................36 5.3.3.1 Presentación de la etapa......................................................................................................................................... 36

5.3.3.1.1 Definición ........................................................................................................................................................ 36 5.3.3.1.2 Principios generales ......................................................................................................................................... 36 5.3.3.1.3 Documentos de referencia ............................................................................................................................... 37

5.3.3.2 Comparación del método alternativo con el método de referencia OIV ................................................................ 37 5.3.3.2.1 Campos de aplicación...................................................................................................................................... 37 5.3.3.2.2 Veracidad del método alternativo respecto al método de referencia................................................................ 37

5.3.3.2.2.1 Definición................................................................................................................................................. 37 5.3.3.2.2.2 Ámbito de aplicación ............................................................................................................................... 37 5.3.3.2.2.3 Protocolo básico y cálculos ...................................................................................................................... 38 5.3.3.2.2.4 Interpretación ........................................................................................................................................... 39

5.3.3.3 Comparación por ensayos interlaboratorio ............................................................................................................ 40 5.3.3.3.1 Ámbito de aplicación....................................................................................................................................... 40 5.3.3.3.2 Protocolo básico y cálculos ............................................................................................................................. 40 5.3.3.3.3 Interpretación................................................................................................................................................... 41






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5.3.3.4 Comparación con materiales de referencia ............................................................................................................ 41 5.3.3.4.1 Ámbito de aplicación....................................................................................................................................... 41 5.3.3.4.2 Protocolo básico y cálculos ............................................................................................................................. 42 5.3.3.4.3 Interpretación................................................................................................................................................... 43

5.4 TERCERA PARTE: ESTUDIO DEL ERROR ALEATORIO ..................................................................................43 5.4.1 Principio general ......................................................................................................................................43 5.4.2 Documentos de referencia ........................................................................................................................43 5.4.3 Fidelidad del método ................................................................................................................................44

5.4.3.1 Definición .............................................................................................................................................................. 44 5.4.3.2 Campos de aplicación ............................................................................................................................................ 44 5.4.3.3 Caso teórico general .............................................................................................................................................. 44

5.4.3.3.1 Protocolo básico y cálculos ............................................................................................................................. 44 5.4.3.3.1.1 Cálculos con varios materiales de ensayo ................................................................................................ 44 5.4.3.3.1.2 Cálculos con 1 material de ensayo ........................................................................................................... 46

5.4.3.4 Repetibilidad.......................................................................................................................................................... 47 5.4.3.4.1 Definiciones..................................................................................................................................................... 47 5.4.3.4.2 Campos de aplicación...................................................................................................................................... 47 5.4.3.4.3 Protocolo básico y cálculos ............................................................................................................................. 48

5.4.3.4.3.1 Caso general ............................................................................................................................................. 48 5.4.3.4.3.2 Caso particular aplicable a 1 sola repetición ............................................................................................ 48

5.4.3.4.4 Comparación de las repetibilidades ................................................................................................................. 49 5.4.3.4.4.1 Determinación de las repetibilidades de los dos métodos ........................................................................ 49 5.4.3.4.4.2 Test de Fischer-Snedecor ......................................................................................................................... 49

5.4.3.5 Reproducibilidad intralaboratorio.......................................................................................................................... 50 5.4.3.5.1 Definición ........................................................................................................................................................ 50 5.4.3.5.2 Campos de aplicación...................................................................................................................................... 50 5.4.3.5.3 Protocolo básico y cálculos ............................................................................................................................. 50

6. CONTROL DE CALIDAD DE LOS MÉTODOS DE ANÁLISIS (CIQ)..........................................................51 6.1 DOCUMENTOS DE REFERENCIA ....................................................................................................................51 6.2 PRINCIPIOS GENERALES.................................................................................................................................52 6.3 LOS MATERIALES DE REFERENCIA ...............................................................................................................52 6.4 CONTROL DE LAS SERIES ANALÍTICAS.........................................................................................................54

6.4.1 Definición .................................................................................................................................................54 6.4.2 Control de la veracidad a partir de materiales de referencia ..................................................................54 6.4.3 Fidelidad intraserie ..................................................................................................................................54 6.4.4 Calibre interno..........................................................................................................................................54

6.5 CONTROL DEL SISTEMA DE ANÁLISIS ..........................................................................................................55 6.5.1 Definición .................................................................................................................................................55 6.5.2 Diagrama de Shewhart .............................................................................................................................55

6.5.2.1 Obtención de los datos........................................................................................................................................... 55 6.5.2.2 Presentación de los resultados y definición de los límites ..................................................................................... 55 6.5.2.3 Explotación de la diagrama de Shewhart............................................................................................................... 56

6.5.3 Comparación interna de los sistemas de análisis.....................................................................................57 6.5.4 Comparación externa del sistema de análisis ..........................................................................................57

6.5.4.1 Cadena de análisis de comparación interlaboratorio.............................................................................................. 57 6.5.4.2 Comparación con materiales de referencia externos.............................................................................................. 57

6.5.4.2.1 Incertidumbre estándar del material de referencia ........................................................................................... 57 6.5.4.2.2 Definición de los límites de validez de una medición del material de referencia ............................................ 58

7. ESTIMACIÓN DE LA INCERTIDUMBRE DE MEDICIÓN ..........................................................................58 7.1 DEFINICIÓN .....................................................................................................................................................58 7.2 DOCUMENTOS DE REFERENCIA ....................................................................................................................59 7.3 ÁMBITO DE APLICACIÓN................................................................................................................................59 7.4 METODOLOGÍA ...............................................................................................................................................60






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7.4.1 Definición del mesurando y descripción del método de análisis cuantitativo..........................................60 7.4.2 Análisis crítico del proceso de medición ..................................................................................................60 7.4.3 Cálculos de estimación de la incertidumbre estándar (procedimiento intralaboratorio) ........................61

7.4.3.1 Principio ................................................................................................................................................................ 61 7.4.3.2 Cálculo de la desviación estándar de reproducibilidad intralaboratorio ................................................................ 63 7.4.3.3 Estimación de fuentes de errores sistemáticos típicos no tomadas en cuenta en las condiciones de reproducibilidad 63

7.4.3.3.1 Error de calibrado ............................................................................................................................................ 63 7.4.3.3.1.1 Modo operatorio....................................................................................................................................... 63 7.4.3.3.1.2 Cálculos y resultados................................................................................................................................ 63 7.4.3.3.1.3 Estimación de la incertidumbre estándar asociada a la recta de calibrado ............................................... 65

7.4.3.3.2 Error de sesgo .................................................................................................................................................. 65 7.4.3.3.2.1 Métodos ajustados con solo un material de referencia homologado ........................................................ 65 7.4.3.3.2.2 Métodos ajustados con varios materiales referentes (gamas de calibrados, etc.) ..................................... 66

7.4.3.3.3 Efecto de matriz............................................................................................................................................... 66 7.4.3.3.3.1 Definición................................................................................................................................................. 66

7.4.3.3.4 Efecto de muestras........................................................................................................................................... 67 7.4.4 Estimación de la incertidumbre estándar por ensayos interlaboratorio..................................................68

7.4.4.1 Principio ................................................................................................................................................................ 68 7.4.4.2 Utilización de la desviación estándar de reproducibilidad interlaboratorio e intramétodo SRinter(método)............ 68 7.4.4.3 Utilización de la desviación estándar de reproducibilidad interlaboratorio e intermétodo SRinter .......................... 69 7.4.4.4 Otros componentes del presupuesto de incertidumbre........................................................................................... 69

7.5 EXPRESIÓN DE LA INCERTIDUMBRE AMPLIADA.........................................................................................69






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1. Objeto La presente guía tiene como objetivo ayudar a los laboratorios de enología que practican análisis en serie en sus procedimientos de validación, control de calidad interno y estimación de la incertidumbre de los métodos alternativos que aplican.

2. Preámbulo y campo de aplicación La norma internacional ISO 17025, que define «las prescripciones generales relativas a la competencia de los laboratorios de calibración y ensayos», precisa que, al aplicar un método analítico alternativo, los laboratorios acreditados deben comprobar la calidad de los resultados obtenidos, para lo cual marca varias etapas. La primera consiste en definir las exigencias del cliente en cuanto al parámetro considerado, para determinar seguidamente si el método utilizado responde a las mismas. La segunda etapa integra, para los métodos no normalizados, modificados o desarrollados por el laboratorio, una validación inicial. Una vez aplicado el método, los laboratorios deben utilizar medios de control y ajuste que permitan supervisar la calidad de los resultados obtenidos. Finalmente, deben estimar la incertidumbre asociada a los resultados obtenidos. Para responder a esas exigencias, los laboratorios disponen de abundantes referencias en forma de guías y normas internacionales. Sin embargo, en la práctica, la aplicación de estos textos resulta delicada ya que, al ir dirigidos a todas las categorías de laboratorios de calibración y ensayos, son muy generalistas y suponen, por parte del lector, profundos conocimientos de las reglas matemáticas aplicables al tratamiento estadístico de los datos. La presente guía se ha redactado a partir de estas referencias internacionales, teniendo en cuenta las particularidades propias de los laboratorios de enología que practican alternativomente análisis de series de muestras de vino o de mosto. Delimitando así el campo de aplicación, se ha podido realizar una selección adaptada y pertinente, conservando únicamente las herramientas más adaptadas al mismo. Así, la guía, extraída de las referencias internacionales, se ajusta estrictamente a las mismas. El lector podrá profundizar en cualquier punto de la guía consultando las normas y guías internacionales, cuyas referencias se indican en cada capítulo. Los redactores han decidido agrupar las diferentes herramientas que permiten responder a las exigencias de la norma ISO 17025, ya que existe una evidente solución de continuidad en su aplicación, y los datos obtenidos por unas a menudo pueden ser utilizados para otras. Además, los medios matemáticos empelados son muchas veces parecidos. Los diferentes capítulos incluyen ejemplos de aplicaciones tomados en laboratorios de enología que emplean estas herramientas. Es importante precisar que esta guía no pretende ser exhaustiva, sino simplemente presentar, de la forma más clara y aplicable posible, el contenido de las exigencias de la norma ISO 17025 y de los medios básicos que pueden aplicarse habitualmente en un laboratorio normal para responder a las mismas. Cada laboratorio es libre de complementar estas herramientas o de sustituirlas por otras que considere más eficaces o mejor adaptadas.






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Finalmente, cabe señalar a los usuarios que las herramientas presentadas no constituyen un fin en sí mismas y que su utilización, así como la interpretación de los resultados a los que conducen, deben ser siempre objeto de un procedimiento crítico. Sólo en estas condiciones quedará garantizada su pertinencia y el laboratorio podrá utilizarlas como herramientas de mejora de la calidad de los análisis que realiza.

3. Terminología general A continuación se indican las definiciones de los términos utilizados en el presente documento, que han sido extraídas de las referencias normativas que aparecen en la bibliografía. Analito Objeto del método de análisis Blanco Ensayo realizado en ausencia de matriz (blanco reactivo) o sobre una matriz que no contiene el analito (blanco matriz). Sesgo Diferencia entre la esperanza de los resultados de un ensayo y un valor aceptado como referencia. Presupuesto de incertidumbre Lista de las fuentes de incertidumbre y de sus incertidumbres estándar asociadas, elaborada con el objetivo de evaluar la incertidumbre estándar compuesta asociada a un resultado de medición. Calibrado (de un instrumento de medición) (Gauging, en inglés) Posicionamiento material de cada referencia (en ciertos casos sólo algunas referencias principales) de un instrumento de medición en función del valor correspondiente del mesurando. NOTA No se debe confundir «calibrado» y «calibración» Condición de repetibilidad Condiciones en las que los resultados de ensayos independientes se obtienen por el mismo método sobre individuos de ensayo idénticos en el mismo laboratorio, por el mismo operario, utilizando el mismo equipo y durante un breve intervalo de tiempo. Condición de reproducibilidad (intralaboratorio) Condiciones en las que los resultados de ensayos se obtienen por el mismo método sobre individuos de ensayos idénticos, en el mismo laboratorio, con el mismo o diferentes operarios y utilizando calibrados distintos, en días diferentes. Desviación estándar experimental Para una serie de n mediciones del mismo mesurando, magnitud s que caracteriza la dispersión de los resultados, dada por la fórmula:

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2)(−=

∑ −=

n

is

n

ixx

siendo xi el resultado de la iª medición y x la media aritmética de los n resultados considerados.






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Desviación estándar de repetibilidad Desviación estándar de numerosas repeticiones obtenidas en un solo laboratorio por un mismo operario sobre un mismo instrumento, esto es, en condiciones de repetibilidad. Desviación estándar de reproducibilidad interna (o variabilidad intralaboratorio total) Desviación estándar de repeticiones obtenidas en un solo laboratorio con el mismo método, haciendo intervenir a varios operarios o instrumentos y, en particular, efectuando las mediciones en fechas diferentes, esto es, en condiciones de reproducibilidad. Error aleatorio Resultado de una medición menos la media de un número infinito de mediciones del mismo mesurando, efectuadas en las condiciones de repetibilidad. Error de medición Resultado de una medición menos un valor verdadero del mesurando. Error sistemático Media resultante de un número infinito de mediciones del mismo mesurando, efectuadas en condiciones de repetibilidad, menos un valor verdadero del mesurando. NOTA La noción de error es una noción teórica en la medida en que recurre a magnitudes que no son accesibles en la práctica, en especial los valores verdaderos de los mesurandos. Por principio, el error es una incógnita. Esperanza matemática Para una serie de n mediciones del mismo mesurando, si n tiende al infinito, la media x tiende hacia la esperanza E(x).

→ n

xnxE

n

ii∑

=∞= 1lim)(

Calibración (Calibration, en inglés) Conjunto de operaciones que en condiciones determinadas establecen la relación entre los valores de la magnitud indicada por un aparato o sistema de medición, o los valores representados por una medición materializada, o por un material de referencia, y los valores correspondientes de la magnitud obtenidos por calibres. Evaluación intralaboratorio de un método de análisis Acción de someter un método de análisis a un estudio estadístico intralaboratorio, sobre la base de un protocolo normalizado y/o reconocido y aportando la prueba de que, en su ámbito de aplicación, el método de análisis satisface los criterios de eficacia preestablecidos. En el marco del presente documento, la evaluación de un método se basa en un estudio intralaboratorio que incluye la comparación con un método de referencia. Fidelidad Proximidad entre los resultados de ensayos independientes obtenidos en las condiciones estipuladas NOTA 1 La fidelidad depende únicamente de la distribución de los errores aleatorios y no guarda ninguna relación con el valor verdadero o especificado. NOTA 2 La medición de la fidelidad se expresa a partir de la desviación estándar de los resultados de los ensayos. NOTA 3 El término "resultados de ensayos independientes" significa resultados obtenidos de una forma no influenciada por un resultado anterior sobre el mismo material de ensayo o similar. Las mediciones cuantitativas de la fidelidad dependen de forma crítica






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de las condiciones estipuladas. Las condiciones de repetibilidad y de reproducibilidad son conjuntos particulares de condiciones extremas. Magnitud (medible) Atributo de un fenómeno, de un cuerpo o de una sustancia susceptible de ser distinguido cualitativamente y determinado cuantitativamente. Incertidumbre de medición Parámetro asociado al resultado de una medición, que caracteriza la dispersión de los valores que razonablemente podrían atribuirse al mesurando. Incertidumbre estándar (u(xi)) Incertidumbre del resultado de una medición expresada en forma de una desviación estándar. Veracidad Proximidad entre el valor medio obtenido a partir de una larga serie de resultados de ensayos y un valor de referencia aceptado. NOTA La medición de la veracidad suele expresarse en términos de sesgo. Límite de detección Cantidad más pequeña de un analito a examinar en un material de ensayo y que puede ser detectada y considerada como diferente al valor del blanco (con una probabilidad determinada), pero no necesariamente cuantificada. De hecho, se deben tener en cuenta dos riesgos:

- el riesgo α de considerar la sustancia presente en el material de ensayo siendo nula su magnitud; - el riesgo β de considerar ausente una sustancia siendo su magnitud no nula.

Límite de cuantificación Cantidad más pequeña de un analito a examinar en un material de ensayo y que puede ser determinada cuantitativamente en las condiciones experimentales descritas en el método con una variabilidad definida (coeficiente de variación determinado). Linealidad Capacidad de un método de análisis, dentro de un determinado intervalo, para ofrecer un valor de información o resultados proporcionales a la cantidad de analito a dosificar en el material de ensayo para laboratorio. Esta proporcionalidad se expresa mediante una expresión matemática definida a priori. Los límites de linealidad son los límites experimentales de magnitudes entre los cuales el modelo de calibración lineal puede aplicarse con un nivel de confianza conocido (generalmente, igual a 1 %). Material de ensayo Material o sustancia al cual puede aplicarse una medición con el método de análisis considerado. Material de referencia Material o sustancia cuya(s) propiedad(es) presentan uno o varios valores que son suficientemente homogéneos y bien definidos para permitir utilizarlo para la calibración del aparato, la evaluación de un método de medición o la atribución de valores a los materiales.






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Material de referencia homologado Material de referencia, acompañado de un certificado, cuya(s) propiedad(es) presentan uno o varios valores que tienen una realización exacta de la unidad en la que están expresados los valores de propiedad y para el cual cada valor homologado viene acompañado de una incertidumbre a un nivel de confianza indicado. Matriz Conjunto de los constituyentes del material de ensayo aparte del analito. Método de análisis Procedimiento escrito que describe el conjunto de los medios y modos operatorios necesarios para efectuar el análisis del analito, esto es: ámbito de aplicación, principio y/o reacciones, definiciones, reactivos, aparatos, modos operatorios, expresión de los resultados, fidelidad, informe de ensayo. ADVERTENCIA Las expresiones "método de dosificación" y "método de determinación" se emplean en ocasiones como sinónimos de la expresión "método de análisis". Estas dos expresiones no deben ser empleadas en este sentido. Método de análisis cuantitativo Método de análisis que permite medir la cantidad de analito presente en el material de ensayo para laboratorio. Método de análisis de referencia (método de tipo I o II) Método que da como resultado el valor de referencia aceptado de la cantidad de analito a medir. Método de análisis alternativo (no clasificado) Método de análisis habitual utilizado por el laboratorio y no considerado como método de referencia. NOTA Un método de análisis alternativo puede consistir en una simplificación del método de referencia. Medición Conjunto de operaciones que tienen como objetivo determinar un valor de una magnitud. NOTA El desarrollo de las operaciones puede ser automático. Mesurando Magnitud particular sometida a medición. Media Para una serie de n mediciones del mismo mesurando, el valor medio viene dado por la fórmula:

n

xx

n

ii∑

== 1

siendo xi el resultado del iª medición. Resultado de una medición Valor atribuido a un mesurando, obtenido por medición. Sensibilidad Relación entre la variación del valor de información del método de análisis y la variación de la cantidad de analito. La variación de la cantidad de analito suele obtenerse preparando diferentes soluciones de calibración o añadiendo analito en una matriz.






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NOTA 1 Se debe evitar definir, por extensión, la sensibilidad de un método como su capacidad para detectar bajas magnitudes. NOTA 2 Un método se denomina «sensible» si una baja variación de la magnitud o de la cantidad de analito implica una variación importante del valor de información. Señal de medición Magnitud que representa el mesurando y que está funcionalmente relacionada con el mismo. Especificidad Propiedad de un método de análisis para adecuarse exclusivamente a la determinación de la cantidad del analito considerado, con la garantía de que la señal medida procede únicamente del analito. Tolerancia Desviación respecto al valor de referencia, definida por el laboratorio para un nivel dado, en el cual se aceptará un valor medido de un material de referencia. Valor de una magnitud Expresión cuantitativa de una magnitud particular, en general en forma de una unidad de medición multiplicada por un número. Valor verdadero de una magnitud Valor compatible con la definición de una magnitud particular determinada. NOTA 1 Es el valor que se obtendría mediante una medición perfecta NOTA 2 Cualquier valor verdadero es, por naturaleza, indeterminado Valor de referencia aceptado Valor que sirve de referencia, aceptado para una comparación y que resulta: a) de un valor teórico o establecido, basado en los principios científicos; b) de un valor asignado u homologado, basado en los trabajos experimentales de una organización nacional o internacional; c) de un valor de consenso u homologado, basado en un trabajo experimental colaborativo y realizado bajo los auspicios de un grupo científico o técnico; En el marco particular del presente documento, el valor de referencia aceptado (o valor convencionalmente verdadero) del material de ensayo se obtiene por la media aritmética de los valores de mediciones repetidas según el método de referencia. Varianza Cuadrado de la desviación estándar.

4. Principios generales

4.1 Metodología Al crear un nuevo método alternativo, el laboratorio aplica un protocolo formado de varias etapas. La primera etapa, aplicada una sola vez al principio, o de forma periódica, es la validación del método. Le sigue un control de calidad permanente. El conjunto de los datos obtenidos durante estas dos etapas permiten evaluar la calidad del método. Los datos obtenidos durante estas dos etapas se utilizan para estimar la incertidumbre de medición. Ésta, evaluada regularmente, constituye un indicador de la calidad de los resultados obtenidos por el método en cuestión.






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Todas estas etapas están relacionadas y constituyen un procedimiento global que permite evaluar y controlar los errores de medición.

4.2 Definición del error de medición Cualquier medición realizada mediante el método estudiado da un resultado. Éste tiene inevitablemente asociado un error de medición, definido como la diferencia entre el resultado obtenido y el valor verdadero del mesurando. En la práctica, el valor verdadero del mesurando es inaccesible, lo que obliga a utilizar un valor convencionalmente aceptado como tal. El error de medición está formado por dos componentes:

Valor verdadero = Resultado del análisis + Error sistemático + Error aleatorio El error sistemático se traduce en la práctica por un sesgo respecto al valor verdadero; el error aleatorio es el conjunto de los errores que acompañan la aplicación del método. Estos errores pueden representarse gráficamente de la forma siguiente:

Desarrollo o adopción de un método

Etapa de validación inicial

Establecimiento y aplicación del sistema de control de calidad

Estimación de la incertidumbre

Error de medición






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Las herramientas de validación y de control de calidad permiten evaluar los errores sistemáticos y los errores aleatorios, y seguir sus evoluciones en el tiempo.

5. Validación de un método

5.1 Metodología La validación pasa por 3 etapas, cada una de las cuales persigue unos objetivos. Para alcanzar estos objetivos, el laboratorio dispone de herramientas de validación. En ocasiones, estas herramientas son múltiples para un objetivo determinado y están adaptadas a diferentes situaciones. Es responsabilidad del laboratorio elegir las herramientas pertinentes mejor adaptadas al método a validar.

Valor verdadero Media de un número infinito de

resultados

Resultado de un análisis

Fidelidad

Error

Error sistemático Error aleatorio

Dispersión gausiana de los resultados






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Etapas Objetivos Herramientas de validación Campos de aplicación

-Definir las matrices analizables -Definir la gama analizable Límite de detección y de cuantificación Estudio de robustez

Error sistemático

o sesgo -Respuesta lineal en la escala de valores analizables Estudio de linealidad -Especificidad del método Estudio de especificidad -Veracidad del método Comparación con un método de referencia Comparación con materiales de referencia Comparación interlaboratorio

Error aleatorio -Fidelidad del método Estudio de repetibilidad Estudio de reproducibilidad intralaboratorio

5.2 Primera etapa: campos de aplicación del método 5.2.1 Definición de las matrices analizables La matriz es el conjunto de los constituyentes del material de ensayo aparte del analito. Si estos constituyentes pueden influir en el resultado de una medición, conviene que el laboratorio defina las matrices sobre las cuales el método es aplicable. Por ejemplo, en enología, el dosificación de algunos parámetros puede verse influida por las diversas matrices posibles (vinos, mostos, vinos licorosos…). En caso de duda sobre un efecto de matriz, podrán realizarse estudios más profundos en el marco del estudio de especificidad. 5.2.2 Límite de detección y de cuantificación Esta etapa no es aplicable ni necesaria para los métodos cuyo límite base no tiende hacia 0; por ejemplo, el grado alcohólico volumétrico en los vinos, la acidez total en los vinos, el pH… 5.2.2.1 Definición normativa El límite de detección es la cantidad más pequeña de compuesto a dosificar que puede ser detectada, pero no necesariamente cuantificada como exacta. El límite de detección es un parámetro de los ensayos de límites. El límite de cuantificación es la cantidad más pequeña de compuesto que se puede dosificar con el método.






14

5.2.2.2 Documentación de referencia

- Norma NF V03-110, Procedimiento de validación intralaboratorio de un método alternativo respecto a un método de referencia.

- Compendio internacional de métodos de análisis – OIV, Estimación del límite de detección y de cuantificación de un método de análisis (Resolución Oeno 7/2000).

5.2.2.3 Aplicación En la práctica, el límite de cuantificación es casi siempre más pertinente que el límite de detección, siendo este último, por convención, 1/3 del primero. Existen varios procedimientos que permiten estimar los límites de detección y de cuantificación: - Determinación sobre blanco - Procedimiento mediante el estudio de linealidad - Procedimiento gráfico Estos métodos se adaptan a diversas situaciones, pero en todos los casos se trata de procedimientos matemáticos que ofrecen resultados de mero valor informativo. Cuando es posible, resulta interesante introducir una comprobación del valor obtenido mediante uno de estos procedimientos, o estimado empíricamente, utilizando el protocolo de comprobación de un límite de cuantificación predeterminada. 5.2.2.4 Modo operatorio 5.2.2.4.1 Determinación sobre blanco 5.2.2.4.1.1 Campos de aplicación Este método puede aplicarse cuando el análisis de blancos da resultados que presentan una desviación estándar no nula. El operario podrá valorar la conveniencia de utilizar blancos reactivos o blancos matriz. Si el blanco no puede medirse o no ofrece una variación registrable (desviación estándar = 0) por motivos relacionados con un pretratamiento no controlado de la señal, el procedimiento puede efectuarse sobre una concentración de analito muy baja, próxima al blanco. 5.2.2.4.1.2 Protocolo básico y cálculos Se procede al análisis de n materiales de ensayo asimilados a blancos, siendo n superior o igual a 10. - Se calcula la media de los resultados xi obtenidos:

n

xx

n

ii

blanco

∑== 1

- Se calcula la desviación estándar de los resultados xi obtenidos:






15

11

2)(−

=∑ −

=

n

blancoiS

n

iblanco

xx

- A partir de estos resultados se define convencionalmente el límite de detección según la fórmula:

).3( blancoblancod SxL +=

- A partir de estos resultados se define convencionalmente el límite de cuantificación según la fórmula: ).10( blancoblancoq SxL +=

Ejemplo: la tabla siguiente muestra algunos resultados obtenidos durante la determinación del límite de detección para la dosificación habitual del dióxido de azufre libre.

N° del material

de ensayo X

(en mg/l) 1 0 2 1 3 0 4 1,5 5 0 6 1 7 0,5 8 0 9 0

10 0,5 11 0 12 0

Los valores calculados son los siguientes:

q = 12

Mblanco = 0,375

Sblanco = 0,528 mg/l

LD = 1,96 mg/l

LQ = 5,65 mg/l

5.2.2.4.2 Procedimiento mediante el estudio de linealidad 5.2.2.4.2.1 Campos de aplicación Este método puede aplicarse en todos los casos y es obligatorio cuando el método de análisis no presenta ruido de fondo. Utiliza los datos calculados en el estudio de linealidad. NOTA Este procedimiento estadístico puede estar sesgado y dar resultados pesimistas si la linealidad se calcula sobre una escala

muy amplia de valores de materiales de referencia, los resultados de cuyas mediciones presentan desviaciones estándar variables. En tal caso, un estudio de linealidad restringido a una escala de valores básicos, próximos a 0 y de dispersión más homogénea, permitirá una estimación más pertinente.






16

5.2.2.4.2.2 Protocolo básico y cálculos Utilice los resultados obtenidos en el estudio de linealidad que han permitido calcular los parámetros de la función de calibración y = a+ b.x Los datos a recuperar del estudio de linealidad son (véase capítulo 5.3.1, Estudio de linealidad):

- pendiente de la recta de regresión:

∑ −

∑

=

=−−

= n

i

n

iyixi

xi

MyMxb

Mx1

21

)(

))((

- desviación estándar residual:

2

,,1 1

2)ˆ(−=

∑∑ −= =

pn

jijiS

n

i

p

jres

yy

- desviación estándar sobre la ordenada en el origen (a calcular):

+=∑ −

=

n

i

resa

xipx

npSSMx

M

1

2

2

)(1

Las estimaciones del límite de detección LD y del límite de cuantificación LQ se calculan según las fórmulas siguientes:

LD bSa×=3

Límite de detección estimado

LQ bSa×=10

Límite de cuantificación estimado

Ejemplo: estimación de los límites de detección y de cuantificación de la dosificación del ácido sórbico por electroforesis capilar a partir de datos de linealidad obtenidos sobre una gama de 1 a 20 mg.l-1.

X (ref) Y1 Y2 Y3 Y4 1 1,9 0,8 0,5 1,5 2 2,4 2 2,5 2,1 3 4 2,8 3,5 4 4 5,3 4,5 4,7 4,5 5 5,3 5,3 5,2 5,3

10 11,6 10,88 12,1 10,5 15 16 15,2 15,5 16,1 20 19,7 20,4 19,5 20,1






17

Número de materiales de referencia n = 8

Número de réplicas p = 4

Recta (y = a + b*x)

b = 0,9972

a = 0,51102 Desviación estándar residual:

Sres = 0,588 Desviación estándar sobre la

ordenada en el origen Sa = 0,1597

El límite de detección estimado es LD = 0,48 mg.L-1 El límite de cuantificación estimado es LQ = 1,6 mg.L-1

5.2.2.4.3 Procedimiento gráfico derivado del ruido de fondo del registro 5.2.2.4.3.1 Campos de aplicación Este procedimiento puede aplicarse a los métodos de análisis que ofrecen un registro gráfico (cromatografía…) que presenta un ruido de fondo. Los límites se estiman a partir de un estudio del ruido de fondo. 5.2.2.4.3.2 Protocolo básico y cálculo Realice el registro de blancos reactivos procediendo por 3 series de 3 inyecciones con varios días de intervalo. Determine los valores siguientes:

• hmax: desviación de amplitud en ordenadas más grande de la señal observada entre dos puntos de adquisición, salvo desviación, sobre una distancia igual a veinte veces la anchura a media altura del pico correspondiente a la sustancia buscada, centrada sobre el tiempo de retención del compuesto estudiado.

• R: factor de respuesta cantidad / señal, expresado en altura. El límite de detección LD y el límite de cuantificación LQ se calculan según las fórmulas siguientes:

LD = 3 hmax R LQ = 10 hmax R 5.2.2.4.4 Comprobación de un límite de cuantificación predeterminado Este procedimiento permite validar un valor de cuantificación obtenido mediante un procedimiento estadístico o, eventualmente, empíricamente. 5.2.2.4.4.1 Campos de aplicación Este método permite comprobar que un límite de cuantificación determinado a priori es aceptable. Es aplicable cuando el laboratorio puede disponer de al menos 10 materiales de ensayo con cantidades de analito conocidas, situadas en el nivel del límite de cuantificación estimado.






18

En el caso de métodos con una señal específica y no sensibles a los efectos matriz, estos materiales pueden ser soluciones sintéticas cuyo valor de referencia se obtiene por formulación. En los demás casos, deben utilizarse vinos (o mostos) cuyo mesurando presente un valor, obtenido por el método de referencia, que sea igual al límite a estudiar. Lógicamente, en este caso el límite de cuantificación del método de referencia debe ser inferior a ese valor. 5.2.2.4.4.2 Protocolo básico y cálculo Se analizan n materiales de ensayo independientes cuyo valor aceptado es igual al límite de cuantificación a comprobar, debiendo ser n al menos igual a 10.

- Se calcula la media de las n mediciones: n

xx

n

ii

LQ

∑== 1

- Se calcula la desviación estándar de las n mediciones:

11

2)(−=

∑ −=

n

LQiS

n

iLQ

xx

con ix resultados de la medición del ier material de ensayo.

Deben respetarse las condiciones siguientes: a) Se debe comprobar que la cantidad media medida LQx no sea diferente al límite de cuantificación

predeterminado LQ:

Si

n

xLQ

S LQ

LQ− < 10, el límite de cuantificación LQ se considera válido.

NOTA Como criterio del LQ, 10 es un valor puramente convencional.

b) Se debe comprobar que el límite de cuantificación sea diferente de 0:

Si 5 LQs < LQ, el límite de cuantificación es diferente de 0.

El valor 5 corresponde a un valor aproximado de ampliación de la desviación estándar teniendo en cuenta el riesgo α y el riesgo β para garantizar que el LQ es diferente de 0. Ello equivale a comprobar que el coeficiente de variación para LQ es inferior al 20%. NOTA1 Recuerde que el límite de detección se obtiene dividiendo el límite de cuantificación por 3. NOTA2 Conviene comprobar que el valor de SLQ no sea demasiado grande (produciría un test artificialmente positivo) y que corresponda efectivamente a una desviación estándar razonable de la variabilidad de los resultado al nivel considerado. El laboratorio es el responsable último de determinar este valor de SLQ.






19

Ejemplo: comprobación del límite de cuantificación de la dosificación del ácido málico por el método enzimático. Límite de cuantificación estimado: 0,1 g.L-1

Vino Valores 1 0,1 2 0,1 3 0,09 4 0,1 5 0,09 6 0,08 7 0,08 8 0,09 9 0,09

10 0,08

Media:0,090 Desviación estándar:0,008

Primera condición: 1087.3 <=−

n

xLQ

S LQ

LQ El límite de cuantificación de 0,1 se considera válido.

Segunda condición: 1.004.0.5 <=LQS El límite de cuantificación se considera significativamente diferente de 0.

5.2.3 Robustez 5.2.3.1 Definición La robustez es la capacidad de un método para ofrecer resultados próximos en presencia de pequeños cambios en las condiciones experimentales susceptibles de producirse al utilizar el procedimiento. 5.2.3.2 Determinación Si existe una duda sobre la influencia de la variación de los parámetros operatorios, el laboratorio realizará experimentos científicos que permitan hacer jugar estos parámetros operatorios críticos en el campo de variación susceptible de producirse en la práctica. La realización práctica de estos tests supone un duro trabajo.

5.3 Segunda parte: estudio del error sistemático 5.3.1 Estudio de linealidad 5.3.1.1 Definición normativa La linealidad de un método es su capacidad, dentro de un determinado intervalo, de ofrecer un valor de información o resultados proporcionales a la cantidad de analito a dosificar en el material de ensayo.






20

5.3.1.2 Documentos de referencia


- Norma ISO 11095, Calibración lineal utilizando materiales de referencia. - Norma ISO 8466-1 Calidad del agua – Calibración y evaluación de los métodos de análisis y

estimación de los caracteres de rendimiento 5.3.1.3 Aplicación El estudio de linealidad permite definir un ámbito de linealidad y validarlo. Este estudio es posible cuando el laboratorio puede disponer de materiales de referencia estables cuyos valores aceptados se han obtenido con certeza (en teoría, estos valores deberían tener una incertidumbre igual a 0). Así, podrá tratarse de materiales de referencia internos dosificados con material calibrado, de vinos o de mostos, cuyo valor viene dado por la media de al menos 3 repeticiones del método de referencia, de materiales de referencia externos o de materiales de referencia externos homologados. En este último caso, y únicamente en este caso, este estudio también permite el acoplamiento del método. El experimento realizado en este caso podrá considerarse una calibración. En todos los casos, conviene asegurarse de que la matriz del material de referencia sea compatible con el método. Finalmente, los cálculos deben realizarse con el resultado final de la medición y no con el valor de la señal. Se proponen dos procedimientos:

- Procedimiento tipo ISO 11095, cuyo principio consiste en comparar el error residual con el error experimental mediante un test de Fischer. Este procedimiento es sobre todo válido para gamas de trabajo relativamente estrechas (donde el mesurando no varía más que un factor 10). Por otra parte, en condiciones experimentales que generan un error de reproducibilidad bajo, el test será demasiado severo. Al contrario, en caso de condiciones experimentales mediocres, el test será fácilmente positivo y perderá igualmente su pertinencia. Este procedimiento requiere una buena homogeneidad del número de mediciones en toda la gama estudiada.

- Procedimiento tipo ISO 8466, cuyo principio consiste en comparar el error residual producido

por la regresión lineal con el error residual producido por una regresión polinomial (de orden 2, por ejemplo) realizada a partir de los mismos datos. Si el modelo polinomial da un error residual significativamente más bajo, se podrá deducir la no linealidad. Este procedimiento está especialmente indicado si existe un riesgo de gran dispersión experimental en uno de los dos extremos del ámbito. Por tanto, está naturalmente bien adaptado a los métodos de análisis de las trazas. No es útil trabajar con un número de mediciones homogéneo en toda la gama de trabajo, e incluso se recomienda reforzar el número de mediciones en los extremos del ámbito.






21

5.3.1.4 Procedimiento tipo ISO 11095 5.3.1.4.1 Protocolo básico Conviene utilizar un número n de materiales de referencia. Este número será superior a 3, aunque no es preciso que sea mucho mayor que 10. Los materiales de referencia se medirán p veces en condiciones de reproducibilidad, siendo p superior a 3 (se aconseja un número igual a 5 ). Los valores aceptados de materiales de referencia deberán repartirse de forma regular sobre la escala de valores estudiada. El número de mediciones debe ser el mismo para todos los materiales de referencia. NOTA Es importante que las condiciones de reproducibilidad hagan intervenir el máximo de fuentes potenciales de variabilidad, a riesgo de que el test concluya una no linealidad de forma excesiva. Los resultados se indican en una tabla como la siguiente:

Valores medidos Materiales de referencia

Valor aceptado del material de referencia Réplica 1 … Réplica j … Réplica p

1 x1 y11 … y1j … y1p

… … … … … … … i xi yi1 … yij … yip

… … … … … … …

n xn yn1 … ynj … ynp

5.3.1.4.2 Cálculos y resultados 5.3.1.4.2.1 Definición del modelo de regresión El modelo a calcular y a probar es el siguiente:

ijiij xbay ε++= . donde

ijy es la jª réplica del ier material de referencia.

ix es el valor aceptado del ier material de referencia. b es la pendiente de la recta de regresión. a es la ordenada en el origen de la recta de regresión.

ixba .+ representa la esperanza del valor de la medición del ier material de referencia.

ijε es la desviación entre yij y la esperanza del valor de la medición del ier material de referencia.






22

5.3.1.4.2.2 Estimación de los parámetros Los parámetros de la recta de regresión se obtienen a partir de las fórmulas siguientes:

- media de las p mediciones del ier material de referencia ∑=

=p

jijypyi

1

1

- media de todos los valores aceptados de los n materiales de referencia ∑=

=n

iix xnM

1

1

- media de todas las mediciones ∑=

=n

iiynMy

1

1

- estimación pendiente b

∑ −

∑

=

=−−

= n

i

n

iyixi

xi

MyMxb

Mx1

21

)(

))((

- estimación ordenada en el origen a xy MbMa ×−=

- valor de regresión asociada al ier material de referencia iy ii xbay ×+=ˆ

- residuo eij iijij yye ˆ−=

5.3.1.4.2.3 Representaciones gráficas Los resultados pueden presentarse y analizarse de forma gráfica. Se utilizan dos tipos de representaciones gráficas. -El primer tipo de gráfico es la representación de los valores medidos en función de los valores aceptados de materiales de referencia. También se representa la recta de superposición calculada.






23

Recta de recouvrement

0,00

2,00

4,00

6,00

8,00

10,00

0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00

Valores aceptados de los materiales de referencia

Valo

res

med

ido

y=x

yi^(régression)

replique 1

replique2

replique3

replique4

Légendes : régression regresión replique réplica - El segundo gráfico realizado es la representación de los valores residuales en función de los valores estimados de los materiales de referencia ( y ) mediante la recta de superposición. Este gráfico es un buen indicador de la desviación respecto a la hipótesis de linealidad: el ámbito de linealidad es válido si los valores residuales están equitativamente repartidos entre los valores positivos y los valores negativos.






24

Valores residuales respecto a los valores ajustados:caso de un método lineal

-0,2

-0,15

-0,1

-0,05

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0 2 4 6 8 10 12

Valores ajustados y^

Valo

res

resi

dual

es

replique 1

replique2

replique3

replique4

Valores residuales respecto a los valores ajustados:caso de un método no lineal

-0,4

-0,3

-0,2

-0,1

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0 2 4 6 8 10 12

Valores ajustados y^

Valo

res

resi

dual

es

replique 1

replique2

replique3

replique4

Légendes : régression regresión replique réplica En caso de duda sobre la linealidad de la regresión, puede realizarse un test de Fischer-Snedecor para probar la hipótesis: «el ámbito de linealidad no es válido», además del análisis gráfico.






25

5.3.1.4.2.4 Test de la hipótesis de linealidad En primer lugar, se recomienda definir varios valores de errores ligados a la calibración, que se podrán estimar a partir de los datos obtenidos durante el experimento. A partir de estos resultados se realiza un test estadístico que permite probar la hipótesis de no validez del ámbito de linealidad: se trata del test de Fischer-Snedecor.

5.3.1.4.2.4.1 Definiciones de los errores ligados a la calibración Estos errores se indican en forma de una desviación estándar, formada por la raíz cuadrada de un producto entre una suma del cuadrado y un grado de libertad. Error residual El error residual corresponde al error entre los valores medidos y el valor determinado por la recta de regresión. La suma de los cuadrados del error residual es la siguiente: ∑∑ −

= =

=n

i

p

jres iijQ yy

1 1

2)ˆ(

El número de grados de libertad es np-2. La desviación estándar residual se calcula según la fórmula:

2

1 1

2)ˆ(−=

∑∑ −= =

np

iijS

n

i

p

jres

yy

Error experimental El error experimental corresponde a la desviación estándar de reproducibilidad del experimento. La suma de los cuadrados del error experimental es la siguiente:

∑∑ −= =

=n

i

p

jiijQ yy

1 1

2exp )(

El número de grados de libertad es np-n. La desviación estándar experimental (reproducibilidad) se calcula según la fórmula:

nnp

iijS

n

i

p

jyy

−=∑∑ −

= =1 1

2

exp

)(

NOTA Esta magnitud se representa en ocasiones como SR.






26

Defecto de ajuste El error del defecto de ajuste es el error residual menos el error experimental. La suma de los cuadrados del defecto de ajuste es:

expQQQ resdef −= o también

∑∑ −∑∑ −= == =

−=n

i

p

j

n

i

p

jdef iijiijQ yyyy

1 1

2

1 1

2 )()ˆ(

El número de grados de libertad es n-2 La desviación estándar del defecto de ajuste se calcula según la fórmula:

2exp

−−= n

QQS resdef

o también

21 1

2

1 1

2 )()ˆ(−

−=

∑∑ −∑∑ −= == =

n

iijiijS

n

i

p

j

n

i

p

jdef

yyyy

5.3.1.4.2.4.2 Test de Fischer-Snedecor

El producto exp

2

2

SSdefFobs = sigue la ley de Fischer-Snedecor con los grados de libertad n-2, np-n.

El valor experimental calculado Fobs se compara con el valor límite: F1-α(n-2,np-n), extraído de la tabla de la ley de Snedecor. El valor de α habitualmente utilizado en la práctica es 5%. Si Fobs ≥ F1-α , se acepta la hipótesis de no validez del ámbito de linealidad (con un riesgo de error α del 5%). Si Fobs < F1-α , se rechaza la hipótesis de no validez del ámbito de linealidad.

Ejemplo: estudio de linealidad de la dosificación del ácido tártrico por electroforesis capilar. Se emplean 9 materiales de referencia (se trata de soluciones sintéticas de ácido tártrico, graduadas a partir de una balanza conectada a masas de calibración).

Material ref. Ti (ref) Y1 Y2 Y3 Y4 1 0,38 041 0,37 0,4 0,41 2 1,15 1,15 1,12 1,16 1,17 3 1,72 1,72 1,63 1,76 1,71 4 2,41 2,45 2,37 2,45 2,45 5 2,91 2,95 2,83 2,99 2,95 6 3,91 4,09 3,86 4,04 4,04 7 5,91 6,07 5,95 6,04 6,04 8 7,91 8,12 8,01 8,05 7,9 9 9,91 10,2 10 10,09 9,87






27

Recta de regresión Recta (y = a + b*x)

b = 1,01565 a = - 0,00798

Errores ligados a la calibración

Desviación estándar residual Sres= 0,07161 Desviación estándar reproducibilidad experimental Sexp = 0,07536

Desviación estándar del defecto de ajuste Sdef = 0,0548

Interpretación, test de Fischer-Snedecor Fobs = 0,53 < F1-α = 2,37

Se rechaza la hipótesis de no validez del ámbito de linealidad 5.3.1.5 Procedimiento ISO 8466 5.3.1.5.1 Protocolo básico Conviene utilizar un número n de materiales de referencia. Este número será superior a 3, aunque no es preciso que sea mayor que 10. Los materiales de referencia se medirán varias veces en condiciones de reproducibilidad, y el número de mediciones podrá ser bajo en el centro del ámbito de estudio (mínimo = 2) y más elevado en los extremos del ámbito, donde se aconseja un mínimo de 4. Los valores aceptados de materiales de referencia deberán repartirse de forma regular sobre la escala de valores estudiada. NOTA Es importante que las condiciones de reproducibilidad hagan intervenir el máximo de fuentes potenciales de variabilidad. Los resultados se indican en una tabla con la forma siguiente:


Valor aceptado del material de referencia Réplica 1 Réplica 2 Réplica j … Réplica p

1 x1 y11 y12 y1j … y1p

… … … … … … i xi yi1 yi2

… … … … … … n xn yn1 … ynj … ynp

5.3.1.5.2 Cálculos y resultados 5.3.1.5.2.1 Definición del modelo de regresión lineal Se calcula el modelo de regresión lineal según los cálculos antes detallados. A continuación se debe calcular la desviación estándar de error residual del modelo lineal Sres, según los cálculos indicados en § 5.3.1.4.2.4.1 5.3.1.5.2.2 Definición del modelo de regresión polinomial Aquí se indica el cálculo del modelo polinomial de orden 2.






28

Se recomienda determinar los parámetros del modelo de regresión polinomial de orden 2 aplicable a los datos del plan de experimento.

cbay xx ++= 2

Se trata de determinar los parámetros a, b y c. Esta determinación suele poderse hacer automáticamente mediante hojas de cálculo y programas de estadísticas. Las fórmulas de estimación de estos parámetros son las siguientes:

∑ ∑ ∑

∑∑ ∑ ∑∑

∑∑∑

∑ ∑ ∑ ∑∑∑ ∑ ∑∑

∑∑∑

−+

−−

−

−+

−−

−

=

i i iiii

i i iii

iii

ii

ii

i i i iii

iiiii

i i iii

iiii

ii

iii

iiN

iN

Ni

N

a

xxxxxxxxxixx

xyxyxxyxyxxxixyx

22

32233

2

24

223

2

22

∑ ∑ ∑

∑∑ ∑ ∑∑

∑∑∑

∑ ∑ ∑ ∑∑∑ ∑ ∑∑∑∑∑∑

−+

−−

−

−+

−−

−

=

i i iiii

i i iii

iii

ii

ii

i i i iii

iiii

i i iii

iiii

ii

ii

iii

ii

iiN

iN

iNNb

xxxxxxxxxixx

xyxxyxxxxyxyxyxx

22

32233

2

24

2322324

∑ ∑ ∑

∑∑ ∑ ∑∑

∑∑∑

∑ ∑

∑∑∑ ∑ ∑∑ ∑∑∑∑∑∑

−+

−−

−

−+

−−

−

=

i i iiii

i i iii

iii

ii

ii

i i iiiii

i i iiii

i iiii

iii

ii

ii

ii

ii

iiN

iN

ii

c

xxxxxxxxxixx

xxxyxyxxyxxyxxyxx

2

2

2

32233

2

24

2

3223324

Una vez establecido el modelo, se debe calcular los valores siguientes:

- valor de regresión asociado al ier material de referencia iy′ˆ cbay xxi ++=′ 2ˆ

- residuo eij iijij yye ′−=′ ˆ La desviación estándar residual del modelo polinomial

2

1 1

2)ˆ(−

=∑∑ ′−

′ = =

np

iijn

i

p

jres

yyS






29

5.3.1.5.2.3 Comparación de las desviaciones estándar residuales Se calcula

SSDS resres NN ′−−−= 222 )3()2( Y, seguidamente

SDS

res

PG′

= 2

2

El valor PG se compara con el valor límite F1-α determinado por la tabla de Fischer-Snedecor para un nivel de confianza 1-α y para un grado de libertad 1 y (N-3). NOTA En general, el riesgo α utilizado es del 5%. En algunos casos el test puede ser optimista y un riesgo del 10 % puede resultar más realista. Si PG ≤ F1-α: la función de calibración no lineal no ofrece un ajuste mejorado; por ejemplo, la función de calibración es lineal. Si PG > F1-α: la extensión de trabajo debe reducirse al máximo para obtener una función de calibración lineal: de lo contrario, los valores de información procedentes de las muestras analizadas deben evaluarse utilizando una función de calibración no lineal.

Ejemplo: Caso teórico.

Ti (ref) Y1 Y2 Y3 Y4

1 35 22,6 19,6 21,6 18,4 2 62 49,6 49,8 53 3 90 105,2 103,5 4 130 149 149,8 5 205 203,1 202,5 197,3 6 330 297,5 298,6 307,1 294,2






30

Regresión lineal

y = 1,48.x – 0,0015 Sres = 13,625

Regresión polinomial

y= - 0,0015x² + 1,485x - 27,2701 S'res=7,407

Test de Fischer

PG=10,534 > F(5%)=10,128 PG>F no puede aceptarse la función de calibración lineal

5.3.2 Especificidad 5.3.2.1 Definición normativa La especificidad de un método es su capacidad para medir únicamente el compuesto buscado. 5.3.2.2 Aplicación Si existe una duda sobre la especificidad del método sometido a test, el laboratorio podrá realizar experimentos para comprobar la especificidad. A continuación se proponen dos tipos de experimentos complementarios, que podrán ser útiles en un gran número de casos encontrados en enología. -El primer test es el test de adición estándar. Permite comprobar que el método mide la totalidad del analito. -El segundo test permite comprobar la influencia de otros compuestos sobre el resultado de la medición. 5.3.2.3 Modos operatorios 5.3.2.3.1 Test de adiciones dosificadas 5.3.2.3.1.1 Campo de aplicación Este test permite comprobar que el método mide la totalidad del analito.

Modelo lineal y modelo polinomial, método: caso teórico

0

5

10

15

20

25

30

35

0 5 10 15 20 25 30 35

Valores aceptados de los materiales de referencia

Med

ia v

alor

es m

edid

os

y=yi^(reg yi'^(reg poli) yi (media






31

El experimento se basa en la adición estándar del compuesto buscado. Sólo puede aplicarse a métodos no sensibles a los efectos de matriz. 5.3.2.3.1.2 Protocolo básico Se trata de hallar de forma significativa las cantidades añadidas a los materiales de ensayo analizados antes y después de las adiciones. Se deben efectuar adiciones estándar variables sobre n materiales de ensayo. La concentración inicial de analito de los materiales de ensayo y las adiciones dosificadas se elegirán de manera que cubran el ámbito de aplicación del método. Estos materiales de ensayo deben estar formados por los tipos de matrices que deberán ser analizados de forma habitual. Se recomienda utilizar un mínimo de 10 materiales de ensayo. Los resultados se indican en una tabla con la forma siguiente:

Material de ensayo

Cantidad antes adición

(x)

Cantidad añadida

(v)

Cantidad después adición

(w)

Cantidad hallada

(r)

1 x1 v1 w1 r1 = w1 – x1 ... ... ... ... ... i xi vi wi ri = wi – xi

... ... ... ... ... n Xn Vn wn rp = wn – xn

NOTA 1 Una adición se realiza con una solución de calibración pura. Se recomienda que esta adición sea del mismo orden que

la cantidad de material de ensayo sobre el cual se efectúa. Por este motivo, los materiales de ensayo más concentrados deben diluirse para mantenerlos en el ámbito de aplicación del método.

NOTA 2 Se recomienda preparar las adiciones a partir de soluciones de calibración independientes para evitar cualquier error sistemático.

NOTA 3 La calidad de los valores x y w puede mejorarse utilizando varias repeticiones.

5.3.2.3.1.3 Cálculos y resultados El principio de la medición de la especificidad consiste en estudiar la recta de regresión r = a + b.v y comprobar que la pendiente b es equivalente a 1 y que la ordenada en el origen a es equivalente a 0.

5.3.2.3.1.3.1 Estudio de la recta de regresión r = a + b.v Los parámetros de la recta de regresión se obtienen a partir de las fórmulas siguientes:

- media de las cantidades añadidas v n

vv

n

ii∑

== 1






32

- media de las cantidades halladas r n

rr

n

ii∑

== 1


∑ −

∑

=

=−−

= n

i

n

iii

vvi

rrvvb

1

21

)(

))((

- estimación ordenada en el origen a vbra .−=

- valor de regresión asociada al ier material de referencia iy ii vbar ×+=ˆ - desviación estándar residual

( )2

ˆ1

2

−

−=

∑=

n

rrS

n

iii

res

- desviación estándar en la pendiente

−=

∑=

n

ii

resb

vvSS

12)(

1

- desviación estándar en la ordenada en el origen

−+=∑

=

n

ii

resa

vvv

nSS

12

2

)(1






33

5.3.2.3.1.3.2 Explotación de los resultados El objetivo es hallar una ausencia de interferencias y con una especificidad aceptable, lo cual es cierto si la recta de superposición r = a + bv es equivalente a la recta y=x. Para ello, se realizan dos tests: -Test de la hipótesis de la pendiente b de la recta de superposición equivalente a 1. -Test de la hipótesis de la ordenada en el origen a equivalente a 0. Estas hipótesis se demuestran mediante un test de Student asociado a un riesgo de error del 1% en general. Un riesgo del 5 % puede ser más realista en algunos casos.

Sea Tcrítica, bilateral [ddl; 1%] correspondiente a una variable bilateral de Student asociada al riesgo de error del 1% para un número ddl de grados de libertad.

Etapa 1: cálculos

Cálculo del criterio de comparación sobre la pendiente a 1 b

obs Sb

T1−

=

Cálculo del criterio de comparación sobre la ordenada en el origen a 0 a

obs Sa

T ='

Cálculo del valor crítico de Student: Tcrítica, bilateral[ p-2 ; 1%]

Etapa 2: interpretación

Si Tobs es inferior a Tcrítica, la pendiente de la recta de regresión es equivalente a 1 Si T’obs es inferior a Tcrítica, la ordenada en el origen de la recta de regresión es equivalente a 0. Si se comprueban las dos condiciones, la recta de superposición es equivalente = y=x y el

método se considera específico. NOTA 1 A partir de estos resultados podrá calcularse un nivel de superposición medio, que permite cuantificar la especificidad. En ningún caso podrá emplearse para "corregir" los resultados. Si encontramos un sesgo significativo, el método alternativo no puede ser validado respecto a un rendimiento del 100%. NOTA 2 Dado que el principio del test consiste en calcular una recta, es importante tomar al menos tres niveles de adición y elegir correctamente su valor para obtener una dispersión óptima de los puntos.

5.3.2.3.1.3.3 Representación gráfica de la recta de superposición






34

Ejemplo de especificidad

Se acepta la especificidad

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9X: contenido añadido

Y: c

onte

nido

hal

lado

Y = X

Relación estimada entre el contenido añadido y el

contenido hallado

No se acepta la especificidad

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9X: contenido añadido

Y: c

onte

nido

hal

lado

Y = X

Relación estimada entre el contenido añadido y el contenido hallado

5.3.2.3.2 Estudio de la influencia de otros compuestos en el resultado de la medición 5.3.2.3.2.1 Campo de aplicación Si el laboratorio sospecha de una interacción de compuestos distintos al analizado, podrá realizarse un experimento para demostrar la influencia de diferentes compuestos. El experimento que se presenta a continuación permite descubrir la influencia de compuestos definidos a priori: por su conocimiento del proceso analítico y su competencia, el laboratorio debe ser capaz de definir un cierto número de compuestos susceptibles de ser hallados en el vino y que pueden influir en el resultado analítico. 5.3.2.3.2.2 Protocolo básico y cálculos Se analizan n vinos por duplicado, antes y después de la adición del compuesto sospechoso de influir en el resultado analítico, siendo n al menos igual a 10. Se calculan los valores medios Mxi de las 2 mediciones xi y x’i efectuadas antes de la adición y los valores medios Myi de las 2 mediciones yi y y’i efectuadas después de la adición, y seguidamente la diferencia di entres los valores Mxi y Myi. Los resultados del experimento podrán indicarse en la siguiente tabla:

x: antes adición. y: después adición. Medias Diferencia Muestras Rep1 Rep2 Rep1 Rep2 x y d

1 x1 x’1 y1 y’1 Mx1 My1 d1=Mx1-My1 … … … … … … … … i xi x’i yi y’i Mxi Myi di=Mxi-Myi

… … … … … … … … n xn x’n yn y’n Mxn Myn dn= Mxn-Myn






35

La media de los resultados antes de la adición Mx ∑=

=n

iix MxnM

1

1

La media de los resultados después de la adición My ∑=

=n

iiy MynM

1

1

Se calcula la media de las diferencias Md

MxMyndM

n

i

id −==∑=1

Se calcula la desviación estándar de las diferencias

Sd 11

2)(−=

∑ −=

n

diS

n

id

Md

Se calcula el Z-score d

dscore S

MZ =

5.3.2.3.2.3 Interpretación

Si Zscore es inferior o igual a 2, se puede considerar con un riesgo del 5% que la influencia del compuesto añadido es despreciable para el resultado del análisis.

Si Zscore es superior a 2, se puede considerar con un riesgo del 5% que el compuesto añadido tiene

una influencia sobre el resultado del análisis.

NOTA El Zscore puede interpretarse sobre la base de la hipótesis de que las desviaciones siguen una ley normal con un 95% de confianza.






36

Ejemplo: estudio de la interacción de compuestos susceptibles de hallarse en las muestras sobre la dosificación de la glucosa fructosa en los vinos mediante un calibrado de infrarrojos por transformada de Fourier (IRTF).

Antes adición + 250 mg.L-1 sorbato de

potasio

+ 1 g.L-1 ácido salicílico Diferencias

vino rep1 rep2 rep1 rep2 rep1 rep2 dif sorbato dif salicílico

1 6,2 6,2 6,5 6,3 5,3 5,5 0,2 -0,8 2 1,2 1,2 1,3 1,2 0,5 0,6 0,05 -0,65 3 0,5 0,6 0,5 0,5 0,2 0,3 -0,05 -0,3 4 4,3 4,2 4,1 4,3 3,8 3,9 -0,05 -0,4 5 12,5 12,6 12,5 12,7 11,5 11,4 0,05 -1,1 6 5,3 5,3 5,4 5,3 4,2 4,3 0,05 -1,05 7 2,5 2,5 2,6 2,5 1,5 1,4 0,05 -1,05 8 1,2 1,3 1,2 1,1 0,5 0,4 -0,1 -0,8 9 0,8 0,8 0,9 0,8 0,2 0,3 0,05 -0,55

10 0,6 0,6 0,5 0,6 0,1 0 -0,05 -0,55

Sorbato de potasio Md = 0,02 Sd = 0,086 Zscore = 0,23<2

Ácido salicílico Md = -0,725 Sd = 0,282 Zscore = 2,57>2

En conclusión, se puede decir que el sorbato de potasio no influye en la dosificación de la glucosa fructosa mediante el calibrado IRTF aquí estudiado. Por el contrario, el ácido salicílico presenta una influencia y se debe procurar que las muestras no contengan ácido salicílico para mantenernos en el marco de la validez del calibrado estudiado.

5.3.3 Estudio de la veracidad del método 5.3.3.1 Presentación de la etapa 5.3.3.1.1 Definición Proximidad entre el valor medio obtenido a partir de una amplia serie de resultados de ensayos y un valor de referencia aceptado. 5.3.3.1.2 Principios generales Cuando el valor de referencia se obtiene mediante un sistema homologado, el estudio de veracidad podrá considerarse como un acoplamiento. Eso ocurre en especial en dos casos precisos: -Acoplamiento con materiales de referencia homologados: en este caso, este estudio de veracidad podrá ser realizado conjuntamente con el estudio de linealidad y de calibración, utilizando el experimento descrito para este último estudio. -Acoplamiento con una cadena homologada de análisis de comparación interlaboratorio.






37

Los demás casos que utilizan referencias no procedentes de sistemas homologados son los más habituales en los laboratorios normales de enología. En estos casos deberán realizarse comparaciones: -Comparación con un método de referencia -Comparación con los resultados de una cadena no homologada de análisis de comparación interlaboratorio. -Comparación con materiales de referencia internos, o externos no homologados 5.3.3.1.3 Documentos de referencia


- Norma NF V03-115, Guía para la utilización de los materiales de referencia. - Norma ISO 11095, Calibración lineal utilizando materiales de referencia. - Norma ISO 8466-1, Calidad del agua – Calibración y evaluación de los métodos de análisis y

estimación de los caracteres de rendimiento - Norma ISO 57025, Exactitud de los resultados y métodos de medición

5.3.3.2 Comparación del método alternativo con el método de referencia OIV 5.3.3.2.1 Campos de aplicación Este método se aplica si el laboratorio practica el método de referencia OIV o, eventualmente, un método acoplado, validado y con una calidad de su rendimiento conocida y acorde a las necesidades de los clientes del laboratorio. Para estudiar la veracidad entre los dos métodos, previamente se debe comprobar la calidad de la repetibilidad del método a validar y compararlo con el método de referencia. La metodología para realizar la comparación de la repetibilidad se describe en el capítulo que trata de la repetibilidad. 5.3.3.2.2 Veracidad del método alternativo respecto al método de referencia 5.3.3.2.2.1 Definición La veracidad se define como la proximidad entre los valores obtenidos por el método de referencia y la obtenida por el método alternativo, con independencia de los errores de fidelidad de los dos métodos. 5.3.3.2.2.2 Ámbito de aplicación La veracidad del método alternativo respecto al método de referencia se establece sobre un ámbito de aplicación donde las repetibilidades de los dos métodos son constantes. En la práctica, a menudo se deberá dividir la gama de valores analizable en varios tramos o «niveles de gama» (de 2 a 5), en los cuales se podrá estimar razonablemente que las repetibilidades de los métodos son asimilables a una constante.






38

5.3.3.2.2.3 Protocolo básico y cálculos En cada nivel de gama, la veracidad se determinará a partir de una serie de n materiales de ensayo que presentan valores de concentración de analito que cubren el nivel de gama considerado. Se precisa un número mínimo de 10 materiales de ensayo para obtener resultados significativos. Todos los materiales de ensayo se analizarán por duplicado mediante los dos métodos en condiciones de repetibilidad. Se calcularán los valores medios Mxi de las 2 mediciones xi y x’i efectuadas por el método alternativo y los valores medios Myi de las 2 mediciones yi e y’i efectuadas por el método de referencia, y seguidamente la diferencia di entre los valores Mxi y Myi. Los resultados del experimento podrán indicarse en la tabla siguiente:

x: Método alternativo y: Método de referencia

Medias Diferencia Material de

ensayo Rep1 Rep2 Rep1 Rep2 x y d 1 x1 x’1 y1 y’1 Mx1 My1 d1=Mx1 - My1 … … … … … … … … i xi x’i yi y’i Mxi Myi di=Mxi - Myi

… … … … … … … … n xn x’n yn y’n Mxn Myn dn= Mxn - Myn

Deberán realizarse los cálculos siguientes

- La media de los resultados del método alternativo Mx ∑=

=n

iix MxnM

1

1

- La media de los resultados del método de referencia My ∑=

=n

iiy MynM

1

1

- Se calcula la media de las diferencias Md MyMxndM

n

i

id −==∑=1

- Se calcula la desviación estándar de las diferencias Sd

11

2)(−=

∑ −=

n

diS

n

id

Md

- Se calcula el Zscore d

dscore S

MZ =






39

5.3.3.2.2.4 Interpretación - Si Zscore es inferior o igual a 2,0, se puede concluir que la veracidad de un método respecto al otro es satisfactoria, en el nivel de gama considerado, con un riesgo de error α = 5%. - Si Zscore es superior a 2,0, se puede concluir que el método alternativo no es exacto respecto al método de referencia, en el nivel de gama considerado, con un riesgo de error α = 5%. NOTA El Zscore puede interpretarse sobre la base de la hipótesis de que las desviaciones siguen una ley normal con un 95% de confianza.

Ejemplo: estudio de la veracidad de un calibrado IRTF para la dosificación del glucosa y fructosa respecto al método enzimático. El primer nivel de gama cubre la escala de 0 a 5 g.L-1 y el segundo nivel de gama cubre una escala de 5 a 20 g.L-1.

Vino IRTF 1 IRTF2 Enz 1 Enz 2 di 1 0 0,3 0,3 0,2 -0,1 2 0,2 0,3 0,1 0,1 0,2 3 0,6 0,9 0,0 0,0 0,7 4 0,7 1 0,8 0,7 0,1 5 1,2 1,6 1,1 1,3 0,2 6 1,3 1,4 1,3 1,3 0,0 7 2,1 2 1,9 2,1 0,0 8 2,4 0 1,1 1,2 0,1 9 2,8 2,5 2,0 2,6 0,3

10 3,5 4,2 3,7 3,8 0,1 11 4,4 4,1 4,1 4,4 0,0 12 4,8 5,4 5,5 5,0 -0,2

Md 0,13 Sd 0,23

Zscore 0,55 < 2

Vino IRTF 1 IRTF2 Enz 1 Enz 2 di 1 5,1 5,4 5,1 5,1 0,1 2 5,3 5,7 5,3 6,0 -0,2 3 7,7 7,6 7,2 7,0 0,6 4 8,6 8,6 8,3 8,5 0,2 5 9,8 9,9 9,1 9,3 0,6 6 9,9 9,8 9,8 10,2 -0,1 7 11,5 11,9 13,3 13,0 -1,4 8 11,9 12,1 11,2 11,4 0,7 9 12,4 12,5 11,4 12,1 0,7

10 16 15,8 15,1 15,7 0,5 11 17,7 18,1 17,9 18,3 -0,2 12 20,5 20,1 20,0 19,1 0,7

Md = 0,19 Sd = 0,63

Zscore = 0,30 < 2 Para los dos niveles de gama, el Zscore es inferior a 2. El calibrado IRTF para la dosificación de la glucosa fructosa aquí estudiada puede considerarse exacto respecto al método enzimático.






40

5.3.3.3 Comparación por ensayos interlaboratorio 5.3.3.3.1 Ámbito de aplicación Los ensayos interlaboratorio son de dos tipos:

1. Los estudios colaborativos relativos a una solo método. Estos estudios se realizan para la validación inicial de un nuevo método con objeto de definir principalmente su desviación estándar de reproducibilidad interlaboratorio SRinter(método). También podrá determinarse la media m.

2. Las cadenas de comparación interlaboratorio, o ensayos de aptitud. Estos ensayos se realizan

para la validación de un método adoptado por el laboratorio y el control de calidad periódico (véase § 5.3.3.3). El valor obtenido es la media interlaboratorio m, así como la desviación estándar de reproducibilidad interlaboratorio e intermétodo SRinter.

En el marco de su participación en una cadena de análisis, o en un estudio colaborativo, el laboratorio puede explotar los resultados para estudiar la veracidad de un método con objeto de garantizar inicialmente su validación y su control de calidad periódicos. Si los ensayos interlaboratorio se realizan en el marco de una organización homologada, este trabajo de comparación podrá permitir el acoplamiento del método. 5.3.3.3.2 Protocolo básico y cálculos Para obtener una comparación suficiente, conviene utilizar un número mínimo de 5 materiales de ensayo durante el período. Para cada material de ensayo se obtienen dos resultados: -La media de todos los laboratorios que han obtenido resultados significativos m -La desviación estándar de reproducibilidad interlaboratorio SR-inter El laboratorio analiza los materiales de ensayo con p réplicas, siendo realizadas dichas réplicas en condiciones de repetibilidad. p debe ser al menos igual a 2. Por otra parte, el laboratorio podrá comprobar que la variabilidad intralaboratorio (reproducibilidad intralaboratorio) sea inferior a la variabilidad interlaboratorio (reproducibilidad interlaboratorio) determinada por la cadena de análisis. Para cada material de ensayo, el laboratorio calcula el Zscore, obtenido por la fórmula siguiente:

erR

labscore S

mmZ

int−

−=






41

Los resultados podrán indicarse en la tabla siguiente:

Material de

ensayo Rep1 … Rep j … Rep p Media labo Media

cadena Desviación estándar Zscore

1 x11 … x1j … x1p p

xm

p

jj

lab

∑== 1

1

1 m1 SR-inter(1) )1(int

11

1erR

labscore S

mmZ

−

−=

… … … … … … … … … …

i xi1 … xij … xip p

xm

p

jij

labi

∑== 1 mi SR-inter(i)

)(int ierR

ilabscore S

mmZ

i

i−

−=

… … … … … … … … … …

n xn1 … xnj … xnp p

xm

p

jnj

labn

∑== 1 mn SR-inte(n)

)(int nerR

nlabscore S

mmZ

n

n−

−=

5.3.3.3.3 Interpretación Si todos los Zscore son inferiores a 2, los resultados del método estudiado podrán considerarse idénticos a los obtenidos por los laboratorios que hayan logrado resultados significativos. NOTA El Zscore puede interpretarse sobre la base de la hipótesis de que las desviaciones siguen una ley normal con un 95% de confianza.

Ejemplo: una cadena de análisis interlaboratorio ofrece los resultados siguientes para el parámetro dióxido de azufre libre a partir de dos muestras.

Muestras x1 x2 x3 x4 Media labo Media cadena

Desviación estándar Zscore

1 34 34 33 34 33,75 32 6 0,29 <2 2 26 27 26 26 26,25 24 4 0,56 <2

Se puede concluir que sobre estas dos muestras, la comparación con la cadena de análisis es satisfactoria.

5.3.3.4 Comparación con materiales de referencia 5.3.3.4.1 Ámbito de aplicación En situaciones en que no existe un método de referencia (ni otros métodos) para un parámetro determinado y que este parámetro no es tratado por las cadenas de análisis, la única posibilidad que queda es la comparación de los resultados del método a validar con los valores aceptados de materiales de referencia internos o externos. Los materiales de referencia podrán ser, por ejemplo, soluciones sintéticas establecidas con vidrio de clase A, y/o material de metrología calibrado.






42

En el caso de los materiales de referencia homologados, la comparación tendrá valor de acoplamiento y podrá ser realizada junto con el estudio de calibración y de linealidad. 5.3.3.4.2 Protocolo básico y cálculos Conviene disponer de n materiales de referencia para un nivel de gama determinado, en el cual podrá estimarse razonablemente que la repetibilidad es asimilable a una constante; n debe ser al menos igual a 10. Se debe analizar por duplicado cada material de referencia. Se calculan los valores medios Mxi de las 2 mediciones xi y x’i efectuadas por el método alternativo. Se define Ti como el valor aceptado del ier material de referencia. Los resultados podrán indicarse en la tabla siguiente:

x: método alternativo Diferencia Material de referencia

Rep1 Rep2 Media x T: valor aceptado

del material de referencia

d

1 x1 x’1 Mx1 T1 d1=Mx1-T1 … … … … i xi x’i Mxi Ti di=Mxi-Ti

… … … … n xn x’n Mxn Tn dn= Mxn-Tn

La media de los resultados del método alternativo Mx ∑=

=n

iix MxnM

1

1

La media de los valores aceptados de los materiales de referencia MT ∑=

=n

iiT TnM

1

1

Se calcula la media de las diferencias Md

Tn

i

id MMxndM −==∑

=1

Se calcula la desviación estándar de las diferencias Sd

11

2)(−=

∑ −=

n

diS

n

id

Md

Se calcula el Z-score d

dscore S

MZ =






43

5.3.3.4.3 Interpretación - Si Zscore es inferior o igual a 2,0, se puede concluir que la veracidad del método alternativo respecto a los valores aceptados del material de referencia es buena en el nivel de gama considerado. - Si Zscore es superior a 2,0, se puede concluir que el método alternativo no es exacto respecto a los valores aceptados de los materiales de referencia en el nivel de gama considerado. NOTA El Zscore puede interpretarse sobre la base de la hipótesis de que las desviaciones siguen una ley normal con un 95% de confianza.

Ejemplo: no existe ningún método de referencia para comparar los resultados del análisis del Etil-4 Fenol (4-EF) por cromatografía en fase gaseosa unida a la espectrometría de masas (GC-MS). Los resultados se comparan con los valores aceptados de materiales de referencia formados por soluciones sintéticas formuladas mediante material acoplado.

Material de ensayo Ti (ref) Y1 Y2 Y3 Y4 My di

1 4,62 6,2 6,56 4,9 5,7 5,8 1,2 2 12,3 15,1 10,94 12,3 11,6 12,5 0,2 3 24,6 24,5 18 25,7 27,8 24,0 -0,6 4 46,2 48,2 52,95 46,8 35 45,7 -0,5 5 77 80,72 81,36 83,2 74,5 79,9 2,9 6 92,4 97,6 89 94,5 99,5 95,2 2,8 7 123,2 126,6 129,9 119,6 126,9 125,8 2,6 8 246,4 254,1 250,9 243,9 240,4 247,3 0,9 9 385 375,8 366,9 380,4 386,9 377,5 -7,5

10 462 467,5 454,5 433,3 457,3 453,2 -8,9

Md = -0,7 Sd =. 4,16 Zscore = 0,16 A la vista de estos resultados, los valores obtenidos por el método de análisis del 4-EF por GC-MS pueden considerarse exactos respecto a los valores aceptados de los materiales de referencia.

5.4 Tercera parte: estudio del error aleatorio 5.4.1 Principio general El error aleatorio se valora a partir de los estudios de fidelidad. La fidelidad se calcula según una metodología que puede aplicarse en diversas condiciones experimentales, incluidas las de repetibilidad y de reproducibilidad, que constituyen las condiciones extremas de su medición. El estudio de fidelidad es uno de los elementos indispensable para el estudio de la incertidumbre de medición. 5.4.2 Documentos de referencia

- Norma ISO 5725, Exactitud de los resultados y métodos de medición - Norma NF V03-110, Procedimiento de validación intralaboratorio de un método alternativo

respecto a un método de referencia.






44

5.4.3 Fidelidad del método 5.4.3.1 Definición Proximidad entre de los resultados de ensayo independientes obtenidos en las condiciones estipuladas. NOTA 1 La fidelidad depende únicamente de la distribución de los errores aleatorios y no guarda relación alguna con el valor verdadero o especificado. NOTA 2 La medición de la fidelidad se expresa a partir de la desviación estándar de los resultados de los ensayos. NOTA 3 Le término "resultados de ensayos independientes" indica los resultados obtenidos de una forma no influenciada por un resultado anterior sobre el mismo material de ensayo o similar. Las mediciones cuantitativas de la fidelidad dependen de forma crítica de las condiciones estipuladas. Las condiciones de repetibilidad y de reproducibilidad son conjuntos particulares de condiciones extremas. En la práctica se habla de fidelidad para todas las condiciones experimentales comprendidas entre las condiciones de repetibilidad y de reproducibilidad. 5.4.3.2 Campos de aplicación A continuación se detallan los protocolos y los cálculos desde el caso teórico general hasta los casos particulares de repetibilidad y reproducibilidad. Este procedimiento exhaustivo debe permitir aplicar el estudio de fidelidad a la gran mayoría de situaciones de los laboratorios. A priori, el estudio de fidelidad puede aplicarse sin dificultad a todos los métodos cuantitativos. En numerosos casos, la fidelidad no es constante sobre toda la gama de validez del método. En tales casos, conviene definir varios tramos o «niveles de gama», en los cuales podrá considerarse razonablemente que la fidelidad es asimilable a una constante. El cálculo de fidelidad se repetirá para cada nivel de gama. 5.4.3.3 Caso teórico general 5.4.3.3.1 Protocolo básico y cálculos 5.4.3.3.1.1 Cálculos con varios materiales de ensayo Se analizan n materiales de ensayo en un período de tiempo bastante largo con varias réplicas, siendo pi el número de réplicas del ier material de ensayo. Los materiales de ensayo deben conservar propiedades constantes durante el período considerado. En cada réplica, la medición puede realizarse con k repeticiones (no se considera en este documento el caso en que el número de repeticiones k puede ser variable de un material de ensayo a otro, lo cual complicaría todavía más los cálculos). El número total de réplicas deberá ser superior a 10, repartidas entre el conjunto de los materiales de ensayo. Los resultados podrán indicarse en el tabla siguiente, (caso donde k = 2)






45

Réplicas Materiales de ensayo

1 … j p1 pi pn

1 x11 x’11

… … x1j x’1jx1p

1 x’1p

1

… i xi1 x’i1 … … xij x’ij … … xipi

x’ipi

… n xn1

x’n1

… … xnj x’nj … … … … xnp

n x’np

n En esta situación, la desviación estándar de variabilidad total (o desviación estándar de fidelidad Sv) viene dada por la expresión general:

)()11()( repetVark

xVarS ijv −+=

con:

)( ijxVar varianza de la media de las repeticiones de las réplicas de todos los materiales de ensayo.

)(répetVar varianza de la repetibilidad de todas las repeticiones.

- si los materiales de ensayo se han analizado por duplicado en cada réplica (k = 2), la expresión se convierte en:

2)()( repetVarxVarS ijv +=

- si se ha realizado una sola medición del material de ensayo en cada réplica (k = 1), la varianza de repetibilidad es nula y la expresión se convierte en:

)( ijv xVarS =

- Cálculo de )( ijxVar

La media de las dos réplicas xij y x’ij es: 2'ijij

ijxxx +=






46

Para cada material de ensayo, se calcula la media de las n réplicas: i

p

jij

i p

xMx

i

∑== 1

El número de mediciones diferentes N es la suma de las pi ∑=

=n

iipN

1

La varianza )( ijxVar viene dada por la ecuación siguiente nN

ixijxVar

n

i

p

jij

i

Mx−=

∑∑ −= =1 1

2)()(

NOTA Esta varianza también puede calcularse a partir de las varianzas de variabilidad de cada uno de los materiales de ensayo: Vari(xj). En tal caso, se emplea la relación siguiente, que es estrictamente equivalente a la relación anterior:

nN

xVarpxVar

n

ijii

ij−

−=∑

=1)().1(

)(

-Cálculo de )(repetVar

La varianza de repetibilidad se calcula como una repetibilidad clásica con N materiales de ensayo por duplicado. Según el cálculo de repetibilidad expuesto en el capítulo «Repetibilidad», para k = 2 la varianza de repetibilidad es:

N

ijrépetVar

p

i

n

j

i

w2)( 1 1

2∑∑= == con ijijij xxw '−=

La fidelidad v se calculada según la fórmula:

vv SSv .8.2.22 == El valor de fidelidad v significa que en el 95% de los casos, la desviación entre dos valores obtenidos por el método, en las condiciones definidas, será inferior o igual a v. NOTA 1 El uso y la interpretación de estos resultados es posible sobre la base de la hipótesis de que las desviaciones siguen una ley normal con un 95% de confianza. NOTA 2 También se puede definir una fidelidad del 99 % con vv SSv .65.3.258.2 == 5.4.3.3.1.2 Cálculos con 1 material de ensayo En esta situación, los cálculos se simplifican. Conviene realizar p réplicas de medición del material de ensayo, eventualmente con una repetición de la medición en cada réplica. p debe ser al menos igual a 10.






47

En los cálculos siguientes, se considera que la medición se realiza por duplicado en cada réplica. - La varianza )( ijxVar viene dada por la ecuación siguiente:

1)( 1

2)(−=

∑ −=

p

xixVar

p

iij

Mx

con:

ix media de las dos repeticiones de la réplica i p número de réplicas Mx media de todas las réplicas - La varianza )(répetVar viene dada por la ecuación siguiente:

p

wrépetVar

p

ii

2)( 1

2∑==

con iw : diferencia entre las dos repeticiones de la réplica i 5.4.3.4 Repetibilidad 5.4.3.4.1 Definiciones La repetibilidad es la proximidad entre los resultados de análisis independientes entre sí obtenidos con el método considerado sobre un mismo vino, en el mismo laboratorio, por el mismo operario, utilizando el mismo material y en un breve intervalo de tiempo. Estas condiciones experimentales se denominarán "condiciones de repetibilidad". El valor de repetibilidad r es el valor por debajo del cual se puede estimar que se sitúa la diferencia absoluta entre dos resultados de un análisis único, obtenidos en las condiciones de repetibilidad definidas anteriormente, y con un nivel de confianza del 95 %. La desviación estándar de la repetibilidad Sr es la desviación estándar de los resultados obtenidos en las condiciones de la repetibilidad. Es un parámetro de la dispersión de los resultados, obtenido en las condiciones de la repetibilidad. 5.4.3.4.2 Campos de aplicación A priori, el estudio de repetibilidad puede aplicarse sin dificultad a todos los métodos cuantitativos, en la medida en que puedan respetarse las condiciones de repetibilidad. En muchos casos la repetibilidad no es constante en toda la gama de validez del método. En tales casos, se recomienda definir varios tramos o «niveles de gama», en los cuales se podrá considerar razonablemente que la repetibilidad es asimilable a una constante. El cálculo de la repetibilidad deberá repetirse para cada nivel de gama.






48

5.4.3.4.3 Protocolo básico y cálculos 5.4.3.4.3.1 Caso general El número de materiales de ensayo podrá ser variable en función del número de repeticiones. En la práctica se considera que el número de mediciones del conjunto de materiales de ensayo debe ser superior a 20. No es preciso que las condiciones de repetibilidad se mantengan de un material de ensayo al otro, pero todas las réplicas realizadas de un mismo material de ensayo deberán realizarse en estas condiciones de repetibilidad.

La repetibilidad es un caso particular del cálculo de la fidelidad 2

)()( repetVarxVarS ijv += . La parte

)(repetVar es, naturalmente, igual a 0 (una sola medición en cada réplica) y el cálculo se resume por

el cálculo de )( ijxVar

nNixij

xVarS

n

i

p

jijr

i

Mx−==

∑∑ −= =1 1

2)()(

El valor r indica que en el 95% de los casos la desviación entre dos valores obtenidos en condiciones de repetibilidad será inferior o igual a r. 5.4.3.4.3.2 Caso particular aplicable a 1 sola repetición En la práctica, la situación más habitual para los sistemas automatizados es el análisis de materiales de ensayo con una sola repetición. Se recomienda utilizar al menos 10 materiales para obtener las 20 mediciones necesarias. Las dos réplicas de medición de un mismo material de ensayo deberán ser realizadas en condiciones de repetibilidad. En este caso preciso, el cálculo de Sr se simplifica y se convierte en la fórmula:

p

wS

q

ii

r 21

2∑==

en la cual: Sr = desviación estándar de repetibilidad p = número de materiales de ensayo analizados por duplicado wi = diferencias absolutas entre duplicados La repetibilidad r se calcula según la fórmula:

r = 2,8 Sr






49

Ejemplo: para el método alternativo de dosificación del dióxido de azufre libre considerado y para una gama de medición de 0 a 50 mg/l, el operario buscará al menos 10 muestras que presenten concentraciones comprendidas entre estos valores y regularmente repartidas.

N° de la muestra

xi (en mg/l)

x’i (en mg/l)

Wi (valor

absoluto) 1 14 14 0 2 25 24 1 3 10 10 0 4 2 3 1 5 35 35 0 6 19 19 0 7 23 23 0 8 27 27 0 9 44 45 1

10 30 30 0 11 8 8 0 12 48 46 2

Ejemplo: tomando los valores indicados en el tabla anterior se obtienen los siguientes resultados: q = 12 Sr = 0,54 mg/l r = 1,5 mg/l Este resultado permite afirmar que, con una probabilidad del 95%, los resultados obtenidos por el método estudiado tendrán una repetibilidad inferior a 1,5 mg/l.

5.4.3.4.4 Comparación de las repetibilidades 5.4.3.4.4.1 Determinación de las repetibilidades de los dos métodos Para estimar el rendimiento de un método, puede ser útil comparar su repetibilidad con la de un método de referencia. Sea Sr-alt la desviación estándar de la repetibilidad del método alternativo y Sr-ref la desviación estándar de la repetibilidad del método de referencia. La comparación es directa. Si el valor de la repetibilidad del método alternativo es inferior o igual a la del método de referencia, el resultado es favorable. Si es más alta, el laboratorio deberá asegurarse de que este resultado cumpla con las especificaciones del pliego de condiciones que ha aceptado para el método en cuestión. En este último caso, también podrá aplicar un test de Fischer-Snedecor para saber si el valor hallado para el método alternativo es significativamente superior al del método de referencia. 5.4.3.4.4.2 Test de Fischer-Snedecor Se calcula la relación:

refraltrF

SS

obs 2

2

=

Se utilizará el valor crítico de Snedecor con un riesgo α igual a 0,05 correspondiente a la variable de Fischer con un nivel de confianza 1- α, con ν1=N(x)-n y ν2=N(z)-m grados de libertad: F(N(x)-n, N(y)-m, 1- α). En el caso de una repetibilidad calculada con una sola repetición sobre p materiales de ensayo para el método






50

alternativo y q materiales de ensayo para el método de referencia, la variable de Fischer tendrá como grado de libertad ν1=p y ν2=q, es decir: F(p, q, 1- α). Interpretación del test: 1/ Fobs > F1- α, el valor de la repetibilidad del método alternativo es significativamente superior al del método de referencia. 2/ Fobs < F1- α, no se puede afirmar que el valor de la repetibilidad del método alternativo sea significativamente superior al del método de referencia.

Ejemplo: el valor de la desviación estándar de la repetibilidad hallado para el método de dosificación del dióxido de azufre libre es:

Sr = 0,54 mg/l

El laboratorio ha efectuado la dosificación sobre los mismos materiales de ensayo por el método de referencia OIV. El valor de la desviación estándar de la repetibilidad hallado en este caso es:

Sref = 0,39 mg/l

93,115,029,0

39.054.0

2

2

===obsF

ν 2 = 12 ν 1 = 12 F1-α = 2,69 > 1,93 El valor Fobs obtenido es inferior al valor F1-α ; no se puede afirmar que el valor de la repetibilidad del método alternativo sea significativamente superior al del método de referencia.

5.4.3.5 Reproducibilidad intralaboratorio 5.4.3.5.1 Definición La reproducibilidad intralaboratorio es la proximidad entre los resultados de análisis obtenidos con el método considerado sobre un mismo vino, en el mismo laboratorio, por el mismo operario u operarios diferentes, utilizando curvas de calibrado distintas, en días diferentes. 5.4.3.5.2 Campos de aplicación Los estudios de reproducibilidad pueden aplicarse a los métodos cuantitativos si el tiempo de análisis es razonablemente limitado y si se posee al menos un material de ensayo estable en el tiempo. En muchos casos, la reproducibilidad no es constante en toda la gama de validez del método. En tal caso, se recomienda definir varios tramos o «niveles de gama», en los cuales se podrá considerar razonablemente que la reproducibilidad es asimilable a una constante. El cálculo de reproducibilidad deberá repetirse para cada nivel de gama. 5.4.3.5.3 Protocolo básico y cálculos El laboratorio debe elegir uno o varios materiales de ensayos estables. Aplicará el método regularmente durante un período al menos de un mes y conservará los resultados obtenidos (Xij, material i, réplica j). Se






51

recomienda un mínimo de 5 réplicas para cada material de ensayo, con un número total mínimo de 10 réplicas. Las réplicas podrán analizarse por duplicado. El cálculo de la fidelidad se aplica íntegramente para el cálculo de la reproducibilidad, incluyendo

)(répetVar si las mediciones se han realizado por duplicado. La reproducibilidad R se calcula según la fórmula: R = 2,8 SR El valor R significa que en el 95% de los casos la desviación entre dos valores obtenidos en condiciones de reproducibilidad será inferior o igual a R.

Ejemplo: estudio de reproducibilidad de la dosificación del ácido sórbico en los vinos por destilación por arrastre de vapor y lectura por absorción a 256 nm. Se han conservado dos vinos con sorbato diferentes durante un período de 3 meses. La dosificación del ácido sórbico se ha realizado a intervalos regulares durante dicho período, con una repetición en cada medición.

Material de ensayo 1

Material de ensayo 2

Réplicas x1 x2 x1 x2 1 122 125 140 139 2 123 120 138 137 3 132 130 139 141 4 121 115 143 142 5 130 135 139 139 6 135 142 135 138 7 137 135 139 139 8 130 125 145 145 9 123 130 138 137

10 112 115 135 134 11 131 128 146 146 12 137 138 13 146 147 14 145 148 15 130 128

n = 2 p1 = 11 p2 = 15 N = 26

8.37)( =ijxVar 01.5)( =repetVar

SR = 6,35 R = 17,8

6. Control de calidad de los métodos de análisis (CIQ)

6.1 Documentos de referencia

- Resolución OIV Œno 19/2002: Recomendaciones armonizadas para el control interno de calidad en los laboratorios de análisis. - CITAC / EURACHEM: Guía de calidad en la química analítica, Edición 2002 - Norma NF V03-115, Guía para la utilización de los materiales de referencia






52

6.2 Principios generales Recordamos que los resultados de análisis pueden sufrir dos tipos de errores: el error sistemático, traducido en términos de sesgo, y el error aleatorio. Para los análisis en series, puede definirse otro tipo de error, que puede contener a la vez errores sistemáticos y errores aleatorios: se trata del efecto de serie, ilustrado, por ejemplo, por la desviación del sistema de medición a lo largo de una serie. El CIQ tratará de identificar y controlar estos tres errores.

6.3 Los materiales de referencia El CIQ se basa esencialmente en la explotación de los resultados de medición de materiales de referencia. Su elección y su constitución son, pues, etapas esenciales que se recomienda dominar para ofrecer una base eficaz al sistema. Un material de referencia se define por dos parámetros: -Su matriz -La asignación de su valor de referencia Existen varios casos posibles; los casos hallados en enología aparecen agrupados en la siguiente tabla de doble entrada:






53

Vino

trat

ado

con

aditi

vos

Un

vino

tra

tado

con

adi

tivos

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un v

ino

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54

6.4 Control de las series analíticas 6.4.1 Definición Una serie analítica es un conjunto de mediciones realizadas en condiciones de repetibilidad. Los laboratorios que utilizan mayoritariamente el modo de análisis por serie analítica deben comprobar el correcto ajuste instantáneo del instrumento de medición y su estabilidad a lo largo de la serie analítica. Pueden utilizarse dos procedimientos complementarios: - el uso de materiales de referencia (a menudo llamados por extensión «materiales de control») - el uso de un calibre interno, en especial para los métodos separativos. 6.4.2 Control de la veracidad a partir de materiales de referencia El error sistemático se controlará introduciendo materiales de referencia cuyo valor de referencia haya sido asignado a partir de medios externos al método controlado. El valor medido del material de referencia se asociada a una tolerancia, dentro de la cual se acepta como válido el valor medido. El laboratorio define valores de tolerancia para cada parámetro y para cada sistema analítico. Estos valores son propios del laboratorio. Los materiales de control deberán elegirse de manera que sus valores de referencia correspondan a los niveles de valores habitualmente hallados para un parámetro determinado. Si la escala de medición es amplia y la incertidumbre de medición no es constante a lo largo de la escala, se recomienda utilizar varios materiales de control para cubrir los diferentes niveles de gama. 6.4.3 Fidelidad intraserie Si las series analíticas son bastante largas, existe un riesgo de desviación del sistema analítico. En tal caso se recomienda controlar la fidelidad intraserie utilizando un mismo material de referencia posicionado a intervalos regulares en la serie. Podrán emplearse los mismos materiales de control que se utilizan para la veracidad. Conviene que la desviación de los valores medidos del mismo material de referencia durante la serie sea inferior al valor de repetibilidad r calculado para un nivel de confianza del 95%. NOTA Para un nivel de confianza del 99% se puede utilizar como valor 3,65.Sr. 6.4.4 Calibre interno Algunos métodos separativos permiten introducir un calibre interno en el producto a analizar. En este caso, se recomienda proceder a la introducción de un calibre interno con material calibrado de incertidumbre de medición conocida. El calibre interno permite realizar a la vez un control de la veracidad y un control de la fidelidad intraserie. Cabe recordar que una desviación afecta en proporciones iguales a las señales del analito y del calibre interno, pero si se calcula el valor del analito con el valor de la señal del calibre interno, el efecto de la desviación queda anulado. La serie quedará validada si los calibres internos están dentro de las tolerancias definidas.






55

6.5 Control del sistema de análisis 6.5.1 Definición Se trata de un control complementario al control de las series. Se diferencia de este último en el hecho de que se compilan valores obtenidos en escalas de tiempo largas y/o con valores procedentes de otros sistemas de análisis. Desarrollaremos dos aplicaciones: - Diagramas de Shewhart para el seguimiento de la estabilidad del sistema de análisis - Comparación interna y externa del sistema de análisis 6.5.2 Diagrama de Shewhart Los diagramas de Shewhart son herramientas estadísticas gráficas que permiten controlar las desviaciones de los sistemas de medición mediante el análisis periódico en la práctica y en condiciones de reproducibilidad de materiales de referencia estables. 6.5.2.1 Obtención de los datos Un material de referencia estable se mide durante una período suficientemente largo, a intervalos regulares definidos. Estas mediciones se registran y se representan en gráficos de control. Se realizan en condiciones de reproducibilidad y pueden utilizarse para calcular la reproducibilidad, e incluso para estimar la incertidumbre de medición. Los valores de los parámetros analíticos de los materiales de referencia elegidos deben situarse dentro de los de las gamas de medición válidas. Los materiales de referencia se analizan durante una serie analítica, si es posible periódica, con una posición variable en la serie en cada análisis. En la práctica, es perfectamente posible utilizar las mediciones de los materiales de control de las series para elaborar los gráficos de control. 6.5.2.2 Presentación de los resultados y definición de los límites Los resultados individuales se comparan con el valor aceptado del material de referencia y la desviación estándar de reproducibilidad del parámetro considerado, en el nivel de gama considerado. Se definen dos tipos de límites en los diagramas de Shewhart: los límites asociados a los resultados individuales y los límites asociados a la media. Los límites definidos para los resultados individuales suelen basarse en los valores de desviación estándar de reproducibilidad intralaboratorio para el nivel de gama considerado; son de dos tipos:

- El límite de alerta: RS.2/−+ . -El límite de acción: RS.3/−+ .






56

El límite definido para la media acumulada es más pequeño cuanto mayor es el número de mediciones realizadas.

- Este límite es un límite de acción: nSR.3/−+ . Siendo n el número de mediciones indicadas en el gráfico.

NOTA Por problemas de legibilidad, el límite de alerta de la media acumulada figura pocas veces en el gráfico de control. Tendría

como valor nSR.2/−+ .

Diagrama de Shewhart

0,23

0,25

0,27

0,29

0,31

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

résultats indivuduels

Moyenne cumulée

Limite sup d'action moyenne

Limité inf d'action moyenne

Limite sup d'alerte indiv

Limite inf d'alerte indiv

Limite sup d'action indiv

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Légendes : résultats individuels Resultados individuales Moyenne cumulée Media acumulada Limite sup d’action moyenne Límite sup. de acción media Limite inf d’action moyenne Límite inf. de acción media Limite sup d’alerte indiv Límite sup. de alerta indiv. Limite inf d’alerte indiv Límite inf. de alerta indiv. Limite sup d’action indiv Límite sup. de acción indiv. Limite inf d’action indiv Límite inf. de acción indiv. 6.5.2.3 Explotación del diagrama de Shewhart A continuación mencionamos los criterios de explotación que se utilizan con más frecuencia. Los laboratorios tienen la responsabilidad de definir con más precisión los criterios que aplican.

Se emprenderá una acción correctiva sobre el método (o el aparato): a) si un resultado individual se encuentra fuera de los límites de acción de los resultados individuales. b) si dos resultados individuales consecutivos se encuentran fuera de los límites de alerta de los resultados individuales. c) si, además, el análisis a posteriori de los gráficos de control revela desviaciones del método en tres casos: - nueve puntos de resultados individuales consecutivos se encuentran del mismo lado de la recta de los valores de referencia. - seis puntos de resultados individuales sucesivos suben o descienden. - dos de cada tres puntos sucesivos se encuentran entre el límite de alerta y el límite de acción. d) si la media aritmética de los n resultados registrados supera uno de los límites de acción de la media acumulada (lo que demuestra una desviación sistemática de los resultados). NOTA El gráfico de control debe reiniciarse a n=1 si se aplica una acción correctiva en el método.






57

6.5.3 Comparación interna de los sistemas de análisis Para un laboratorio que dispone de varios métodos de análisis para un parámetro determinado, es interesante realizar mediciones de los mismos materiales de ensayo para comparar los resultados. La similitud de los resultados se considera satisfactoria entre los dos métodos si su desviación es inferior a 2 veces la desviación estándar de diferencia calculada en la validación, y con un nivel de confianza del 95%. NOTA Esta interpretación es posible si se supone que las desviaciones siguen una ley normal con un 95% de confianza. 6.5.4 Comparación externa del sistema de análisis 6.5.4.1 Cadena de análisis de comparación interlaboratorio La organización de los ensayos y de los cálculos se explica en el capítulo «Comparación con una cadena de análisis interlaboratorio». Más allá de la comprobación de la veracidad mediante el Zscore, los resultados se pueden analizar de forma más precisa, sobre todo en lo relativo a la posición de los valores del laboratorio respecto a la media. Si están sistemáticamente de un mismo lado de la media para varias cadenas de análisis sucesivas, esto puede justificar que el laboratorio aplique acciones correctivas, aunque el Zscore siga siendo inferior al valor crítico. NOTA La interpretación del Zscore es posible si se supone que las desviaciones siguen una ley normal con un 95% de confianza. Si la cadena de intercomparación está homologada, este trabajo de comparación tendrá valor de acoplamiento. 6.5.4.2 Comparación con materiales de referencia externos La medición a intervalos regulares de materiales de referencia externos también permite controlar la aparición de un error sistemático (sesgo). El principio es proceder a la medición de materiales de referencia externos y aceptar o rechazar el valor en función de límites de tolerancia. Estos límites se definen a partir de la combinación de las incertidumbres del método controlado y el valor de referencia del material de referencia. 6.5.4.2.1 Incertidumbre estándar del material de referencia Los valores de referencia de estos materiales van acompañados de intervalos de confianza. El laboratorio debe determinar la naturaleza de este dato y extraer el valor de la incertidumbre estándar del valor de referencia Sref ; se presentan distintos casos que cabe distinguir: - Caso en que la incertidumbre a viene dada en forma de un intervalo de confianza del 95% (incertidumbre ampliada). Esto significa que nos situamos en el marco de una ley normal. a constituye, pues, una «incertidumbre ampliada» y corresponde a 2 veces la desviación estándar Sref de la incertidumbre estándar de los valores de referencia de los materiales facilitados.

2aSref =






58

- Caso de homologación, u otra especificación, que ofrece unos límites +/- a sin especificar el nivel de confianza. Nos situamos aquí en el marco de una dispersión rectangular, pudiendo el valor de la medición X tomar cualquier valor en el intervalo ref+/- a.

3aSref =

- Caso particular de un vidrio que ofrece unos límites +/- a. Nos situamos aquí en el marco de una dispersión triangular.

6aSref =

6.5.4.2.2 Definición de los límites de validez de una medición del material de referencia A la incertidumbre estándar Sref del valor del material de referencia externa se añade la incertidumbre estándar del método del laboratorio a controlar, Smétodo. Estas dos fuentes de variabilidad deben tenerse en cuenta en la determinación de los límites. Smétodo se calcula a partir de la incertidumbre ampliada del método del laboratorio de la forma siguiente:

2breincertidumSmétodo =

El límite de validez del resultado (con un nivel de confianza del 95%) =

valor de referencia métodoref SS 22.2/ +−+

Ejemplo: se utiliza una solución tampón pH 7 para el control de un pH-metro. El intervalo de confianza dado por la solución pH es +/- 0,01 y se indica que este intervalo de confianza corresponde a la incertidumbre ampliada con un nivel de confianza del 95%. Por otra parte, la incertidumbre ampliada del pH-metro es de 0,024.

Los límites serán )2024.0()2

01.0(22

2/ +−+

sea +/- 0,026 respecto al valor de referencia y con un nivel de confianza del 95%.

7. Estimación de la Incertidumbre de medición

7.1 Definición Parámetro asociado al resultado de una medición que caracteriza la dispersión de los valores que podrían atribuirse razonablemente al mesurando. En la práctica, la incertidumbre se expresa en forma de una desviación estándar llamada incertidumbre estándar u(x), o en una forma ampliada (con k=2, generalmente) U =+/- k.u






59

7.2 Documentos de referencia - Norma AFNOR ENV 13005: 1999 – Guía para la expresión de la incertidumbre de medición - EURACHEM, 2000, Quantifying Uncertainty in Analytical Measurment, EURACHEM second edition 2000 - Norma ISO 5725:1994 – Exactitud (veracidad y fidelidad) de métodos de medición y resultados - Norma ISO 21748:2004 – Directrices relativas a la utilización de la estimación de la repetibilidad, de la reproducibilidad y de la exactitud en la evaluación de la incertidumbre de medición - Perruchet C. y Priel M., Estimer l’incertitude, Editions AFNOR, 2000

7.3 Ámbito de aplicación La incertidumbre aporta dos tipos de información.

- Por una parte, la dirigida a los clientes del laboratorio indicando las desviaciones potenciales a tener en cuenta para interpretar un resultado de análisis. Se recomienda precisar que esta información no puede utilizarse como medio de evaluación externa del laboratorio.

- Por otra parte, constituye una herramienta interna dinámica de evaluación de la calidad de los

resultados de análisis del laboratorio. Si su medición o su evaluación es regular y se efectúa a partir de una metodología fija y bien definida, permite saber si las desviaciones que presenta un método evolucionan favorable o desfavorablemente (exclusivamente en el caso de la estimación a partir de datos intralaboratorio).

La presente guía se limita a aportar una metodología práctica en el marco de laboratorios de enología que tratan análisis en serie. Estos laboratorios disponen de una gran cantidad de datos que les confieren una dimensión estadística significativa. Así, la estimación de las incertidumbres puede realizarse en la mayoría de casos a partir de los datos obtenidos en el marco de los trabajos de validación y de control de calidad (en particular con los datos de los diagramas de Shewhart). Estos datos se podrán completar con experimentos, sobre todo para determinar los errores sistemáticos. Los manuales describen dos grandes procedimientos para la determinación de la incertidumbre: el procedimiento intralaboratorio y el procedimiento interlaboratorio. Cada uno ofrece resultados natural y significativamente diferentes. Su significación y su interpretación no pueden ser idénticas.

- el procedimiento intralaboratorio ofrece un resultado propio al método considerado, en el laboratorio considerado. La incertidumbre resultante es un indicador del rendimiento del laboratorio para el método considerado. Responde a la pregunta siguiente del cliente: «¿qué dispersión de resultado puedo esperar del laboratorio que practica el método?».

- el procedimiento interlaboratorio utiliza resultados procedentes de ensayos

interlaboratorio, que aportan una información del rendimiento global relativo al método. Los laboratorios pueden utilizar los dos procedimientos conjuntamente. En tal caso, será interesante comprobar que los resultados obtenidos en el procedimiento intralaboratorio den valores inferiores a los valores del procedimiento interlaboratorio.






60

7.4 Metodología El trabajo de estimación de la incertidumbre se desarrolla en 3 etapas fundamentales. - Definición del mesurando y descripción del método de análisis cuantitativo - Análisis crítico del proceso de medición - Estimación de la incertidumbre. 7.4.1 Definición del mesurando y descripción del método de análisis cuantitativo En un primer momento se debe: - Precisar claramente el objeto de la medición - Definir la magnitud medida - Si el mesurando se obtiene por un cálculo a partir de magnitudes medidas, si es posible debe indicarse la relación matemática que los une. - Indicar todas las condiciones operatorias. Estos elementos figuran, en principio, en los procedimientos del sistema calidad del laboratorio. La expresión de la relación matemática entre el mesurando y las magnitudes puede ser en algunos casos (métodos físicos, etc.) muy compleja y no es siempre pertinente ni posible detallarla íntegramente. 7.4.2 Análisis crítico del proceso de medición Se recomienda enumerar las fuentes de error que influyen en el resultado final para formar el presupuesto de incertidumbre. Se podrá estimar la importancia de cada fuente, para eliminar aquéllas que tienen una influencia menor despreciable. Esto se realiza estimando: - el nivel de gravedad de la desviación generada por un mal dominio del factor en cuestión - la frecuencia de los problemas potenciales - su detectabilidad. Este análisis crítico puede realizarse, por ejemplo, según el método de las 5M. Mano de obra; Efecto operario Materia: Efecto muestra (estabilidad, homogeneidad, efectos de matriz) y consumibles (reactivos, productos, soluciones, materiales de referencia, etc.)… Material: Efecto equipo (respuesta, sensibilidad, modos de integración, etc.) y material de laboratorio (balanza, vidrio, etc.)… Método: Efecto aplicación del modo operatorio (condiciones operatorias, sucesión de las operaciones, etc.)… Medio: Condiciones ambientales (temperatura, presión, iluminación, vibraciones, radiación, humedad, etc.)…






61

7.4.3 Cálculos de estimación de la incertidumbre estándar (procedimiento intralaboratorio) 7.4.3.1 Principio En el caso de laboratorios que trabajan con series importantes de muestras y con un número de métodos limitado, el procedimiento más adaptado puede ser un procedimiento estadístico basado en la reproducibilidad intralaboratorio, complementada con el cálculo de fuentes de errores no tomadas en cuenta en condiciones de reproducibilidad intralaboratorio. Un resultado de análisis se desvía del valor verdadero bajo el efecto de dos fuentes de error: los errores sistemáticos y los errores aleatorios.

Resultado del análisis = Valor verdadero + Error sistemático + Error aleatorio

La incertidumbre caracteriza la dispersión del resultado del análisis. Esto se traduce en forma de una desviación estándar. Variabilidad (resultado de análisis) = incertidumbre Variabilidad (valor verdadero) = 0

Variabilidad (Error sistemático) = ∑S sistemátierrores

2

cos_

Variabilidad (Error aleatorio) = SR (Desviación estándar de reproducibilidad intralaboratorio) Las desviaciones estándar se suman al cuadrado, tomando la estimación de la incertidumbre estándar u(x) la forma siguiente:

∑ += Su Rsistémátierroresxu 22

cos)_()(

Las fuentes de errores no integrables en las condiciones de reproducibilidad intralaboratorio, esto es, los errores sistemáticos, deben determinarse en forma de desviación estándar para ser combinadas entre sí y con la desviación estándar de reproducibilidad. El laboratorio podrá actuar de manera que las condiciones de reproducibilidad aplicadas permitan englobar el máximo de fuentes de errores. Esto se logra constituyendo materiales de ensayo estables sobre un período suficientemente largo, durante el cual el laboratorio procurará hacer variar todos los factores experimentales posibles. Así, SR debe cubrir el máximo número de fuentes posibles de errores (aleatorios), minimizando el trabajo de estimación de los errores sistemáticos, a menudo más complejo de realizar. Cabe señalar aquí que la guía EURACHEM/CITAC «Cuantificar la incertidumbre en las mediciones analíticas» recuerda que «En general, la Guía ISO exige que se apliquen las correcciones a todos los efectos sistemáticos identificados y significativos». En un método «bajo control», los errores sistemáticos deberían pues constituir una parte menor de la incertidumbre. La siguiente tabla, no exhaustiva, ofrece ejemplos de fuentes de errores estándar y propone un procedimiento de estimación para cada una de ellas, utilizando cuando es posible la integración en las condiciones de reproducibilidad.






62

Fuente de error

Tipo de error Comentario Método de estimación

Muestreo (constitución de la muestra)

Aleatorio El muestreo es uno de los «oficios» definido en la norma ISO 17025. Los laboratorios que declaran no realizar muestreos no incluyen esta fuente de error en la estimación de la incertidumbre.

Posibilidad de incluir en la reproducibilidad intralaboratorio, añadiendo el muestreo en la manipulación.

Sub-muestreo (extracción de una cantidad de muestra para la realización del ensayo)

Aleatorio Es significativo si la muestra no es homogénea. Esta fuente de error es menor para el vino.

Incluido en las condiciones de reproducibilidad intralaboratorio si el material de ensayo utilizado es similar a los materiales de ensayo habituales.

Estabilidad de la muestra

Aleatorio Depende de las condiciones de conservación de la muestra. En los vinos, los laboratorios deben prestar una atención especial a las fugas de dióxido de azufre y de etanol.

Los eventuales cambios en la muestra pueden integrarse en las condiciones de reproducibilidad. En tal caso, esta fuente de incertidumbre se evaluará globalmente.

Calibración de los aparatos

Sistemático / Aleatorio Este error es sistemático si se establece la calibración para una duración larga y se vuelve aleatorio si la calibración se realiza periódicamente en una escala de tiempo integrada en las condiciones de reproducibilidad

Fuente de error a tener en cuenta en los métodos absolutos.

Error de recta de calibración § 7.4.2.4.1 Tomado en cuenta en las condiciones de reproducibilidad si la calibración se revisa periódicamente.

Efecto de contaminación o de memoria

Aleatorio Este efecto se minimiza con un buen diseño de los instrumentos de medición y de las operaciones de lavado adaptadas.

Las condiciones de reproducibilidad tienen en cuenta este efecto, a condición de intercalar los materiales de referencia en diferentes posiciones en las series de análisis.

Fidelidad de los autómatas

Aleatorio Se trata sobre todo de posibles desviaciones intraserie, que pueden controlarse mediante el uso de materiales de control en el marco del CQI

Las condiciones de reproducibilidad tienen en cuenta este efecto a condición de intercalar los materiales de referencia en diferentes posiciones en las series de análisis.

Pureza de los reactivos

Aleatorio La pureza de los reactivos tiene muy pocos efectos sobre los métodos relativos si el calibrado y los análisis se realizan con los mismos lotes de reactivos. Este efecto debe tenerse en cuenta en los métodos absolutos.

A integrar en las condiciones de reproducibilidad utilizando diferentes lotes de reactivos.

Condiciones de medición

Aleatorio Efectos de la temperatura, la humedad, etc.

Suele tenerse en cuenta en las condiciones de reproducibilidad

Efecto de matriz Aleatorio de una muestra a otra, sistemático en una misma muestra

Estos efectos deben tenerse en cuenta en los métodos cuya señal medida no es perfectamente específica.

Si este efecto se considera significativo, puede realizarse un experimento específico para estimar la incertidumbre debida a este efecto. § 7.4.2.4.3 Este efecto no está integrado en las condiciones de reproducibilidad.

Efecto de calibrado Sistemático con calibrado constante Aleatorio si el calibrado se renueva periódicamente

Tomado en cuenta en las condiciones de reproducibilidad si el calibrado se renueva periódicamente. Si el calibrado utilizado no varía (en la escala de los períodos considerados en el marco de las condiciones de reproducibilidad), se recomienda realizar un experimento para estimar el error de la recta de calibración § 7.4.2.4.1

Efecto de operario Aleatorio A tener en cuenta en las condiciones de reproducibilidad procurando hacer intervenir a todos los operarios habilitados.

Sesgo Sistemático Debe ser minimizado mediante el trabajo de control de calidad del laboratorio.

Efecto sistemático que puede estimarse a partir de referencias homologadas.






63

7.4.3.2 Cálculo de la desviación estándar de reproducibilidad intralaboratorio La desviación estándar de reproducibilidad SR se calcula según el protocolo descrito en el capítulo «Reproducibilidad intralaboratorio» (cf. § 5.4.3.5). Este cálculo puede realizarse a partir de varios materiales de ensayo. En el caso particular en que SR es proporcional a la magnitud del mesurando, no es aconsejable combinar los datos obtenidos sobre varios materiales de ensayo de magnitudes diferentes; en tal caso SR se expresará como valor relativo (%). 7.4.3.3 Estimación de fuentes de errores sistemáticos típicos no tomadas en cuenta en las condiciones de reproducibilidad 7.4.3.3.1 Error de calibrado Si el calibrado de un instrumento (o la calibración de un método absoluto) no se repite de forma periódica, no puede integrarse en la reproducibilidad. Debe realizarse un experimento para su estimación mediante el error residual de la regresión. 7.4.3.3.1.1 Modo operatorio El procedimiento es similar al realizado en el estudio de linealidad del método. Se recomienda utilizar un número n de materiales de referencia superior a 3, aunque no es preciso que sea superior a 10. Los materiales de referencia se miden p veces en condiciones de fidelidad intralaboratorio, siendo p superior a 3 (en general se recomienda realizar 5 mediciones). Los valores aceptados de materiales de referencia deberán repartirse de forma regular sobre la escala de valores estudiada. El número de mediciones debe ser el mismo para todos los materiales de referencia. Los resultados se indican en un tabla de la forma siguiente:


Valor aceptado del material de referencia Réplica 1 … Réplica j … Réplica p

1 x1 y11 … y1j … y1p

… … … … … … … i xi yi1 … yij … yip

… … … … … … …

n xn yn1 … ynj … ynp

7.4.3.3.1.2 Cálculos y resultados Se calcula el modelo de regresión lineal.

ijiij xbay ε++= .






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donde ijy es la jª réplica del ier material de referencia.

ix es el valor aceptada del ier material de referencia.

b es la pendiente de la recta de regresión. a es la ordenada en el origen de la recta de regresión.

ixba .+ representa la esperanza del valor de la medición del iier material de referencia.

ijε es la desviación entre yij y la esperanza del valor de la medición del iier material de referencia. Los parámetros de la recta de regresión se obtienen a partir de las fórmulas siguientes:

- media de las p mediciones del ier material de referencia ∑=

=p

jijypyi

1

1

- media de todos los valores aceptados de los n materiales de referencia ∑=

=n

iix xnM

1

1

- media de todas las mediciones ∑=

=n

iiynMy

1

1


∑ −

∑

=

=−−

= n

i

n

iyixi

xi

MyMxb

Mx1

21

)(

))((

- estimación ordenada en el origen a xy MbMa ×−=

- valor de regresión asociado al ier material de referencia iy ii xbay ×+=ˆ

- residuo eij iijij yye ˆ−=






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7.4.3.3.1.3 Estimación de la incertidumbre estándar asociada a la recta de calibrado Si los errores debidos a la recta de regresión son constantes en el conjunto del ámbito, la incertidumbre estándar se estima de forma global y única mediante la desviación estándar residual global.

2

1 1

2

)(

)ˆ(−

==∑∑ −

= =

np

iijSu

n

i

p

jrescalibrage

yy

Si los errores debidos a la recta de regresión no son constantes en el conjunto del ámbito, la incertidumbre estándar se estima para un nivel determinado mediante la desviación estándar residual de ese nivel.

1

1

2

,),(

)ˆ(−

==∑ −

=

p

iijSu

p

jiresicalibrage

yy

NOTA Estas estimaciones de desviaciones estándar pueden explotarse si el modelo de regresión lineal y el ámbito de calibrado (o calibración) están validados (véase § 5.3.1). 7.4.3.3.2 Error de sesgo Según la guía EURACHEM, «Cuantificar la incertidumbre en las mediciones analíticas», se recuerda que la guía ISO exige, en general, que se apliquen correcciones a todos los efectos sistemáticos significativos identificados. Lo mismo puede aplicarse a los sesgos de métodos para los cuales el laboratorio utiliza su sistema de control de calidad (véase §6) y que tienden hacia 0 para métodos «bajo control». En la práctica, pueden distinguirse dos casos: 7.4.3.3.2.1 Métodos ajustados con solo un material de referencia homologado El sesgo se ajusta siempre con un mismo material de referencia. El material de referencia homologado (MRH) garantiza el acoplamiento metrológico del método. Se asigna un valor de referencia al MRH, acompañado de su incertidumbre estándar uref. Esta incertidumbre estándar del MRH se combina con la incertidumbre compuesta del método, ucomp, para determinar la incertidumbre estándar global del método del laboratorio u(x). La incertidumbre estándar global del método ajustado con el MRH considerado es:

comprefxu uu 22)( +=

NOTA 1 La metodología es idéntica en el caso de métodos ajustados con los resultados de una cadena de comparación interlaboratorio. NOTA 2 Se recomienda diferenciar entre un MRH utilizado para ajustar el sesgo de un método y cuya incertidumbre del valor de referencia se combina con la del método y un MRH utilizado para controlar un método ajustado para otra cosa (cf. § 6.5.4.2). En el segundo caso, la incertidumbre del MRH no debe utilizarse para estimar la incertidumbre del método.






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7.4.3.3.2.2 Métodos ajustados con varios materiales referentes (gamas de calibrados, etc.) No se realiza un ajuste particular del sesgo a parte del trabajo de calibrado. Ya sabemos que cada calibrante aporta una incertidumbre de sesgo. Por tanto, existe una incertidumbre teórica global de sesgo que combina las incertidumbres de los calibrantes. Esta incertidumbre es muy delicada de estimar, pero en general es suficientemente baja para ser despreciada, en especial si el laboratorio vela por la calidad de sus calibrantes y la incertidumbre de sus valores de referencia. Salvo casos particulares, en el presente documento omitiremos la incertidumbre del sesgo. 7.4.3.3.3 Efecto de matriz 7.4.3.3.3.1 Definición El efecto de matriz produce una fuente de error repetible para una muestra determinada, pero aleatoria de una muestra a otra. Este error está ligado a la interacción de los compuestos presentes en el producto a analizar sobre la medición del analito buscado. El efecto de matriz se manifiesta en los métodos que presentan una señal no específica. El efecto de matriz constituye una parte a menudo baja de incertidumbre, en particular en los métodos separativos. Pero en algunos métodos (por ejemplo, las técnicas por infrarrojos), es un componente importante de la incertidumbre.

Ejemplo: estimación del efecto de matriz sobre IRTF

La señal del IRTF (espectro infrarrojo) no es una señal específica de cada uno de los compuestos que se miden por esta técnica. El modelo estadístico de calibrado permite tratar la información espectral no específica y con ruido, en una estimación suficientemente exacta del valor del mesurando. Este modelo incluye influencias de los otros compuestos del vino, que varían de un vino a otro e introducen un error en el resultado. Antes de realizar el trabajo de análisis de rutina, los desarrolladores de calibrado deben realizar un trabajo particular para minimizar este efecto de matriz y fortalecer los calibrados, esto es, que sean capaces de integrar estas variaciones sin repercutir en el resultado. No obstante, el efecto de matriz siempre está presente y constituye una fuente de error de origen de una parte importante de la incertidumbre de un método IRTF. En absoluto rigor, este error de efecto de matriz puede estimarse comparando, por una parte, las medias de un gran número de réplicas de mediciones IRTF, obtenidas sobre varios materiales de referencia (al menos 10), en condiciones de reproducibilidad, y, por otra, los valores verdaderos de los materiales de referencia que presentan una matriz de vino natural. La desviación estándar de las diferencias indica esta variabilidad de calibración (a condición de que la calibración haya sido previamente ajustada (sesgo = 0)). Este procedimiento teórico no es realizable en la práctica dado que los valores verdaderos nunca se conocen, pero es experimentalmente posible hacer una aproximación:

- Previamente, la calibración IRTF debe ser ajustada estadísticamente (sesgo = 0) respecto a un método de referencia a partir de al menos 30 muestras. Esto permite eliminar los efectos de sesgo en las mediciones siguientes. - Los materiales de referencia deben ser vinos naturales. Se recomienda utilizar al menos 10 materiales de referencia diferentes y cuyos valores se sitúen dentro de un nivel de gama donde la incertidumbre pueda considerase como constante. - Se obtiene un valor de referencia aceptable a partir de la media de varias mediciones por el método de referencia, efectuadas en condiciones de reproducibilidad. Esto permite reducir la incertidumbre del valor de referencia: si para el método de referencia utilizado todas las fuentes de incertidumbre importantes se incluyen en las condiciones de reproducibilidad, la multiplicación del






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número p de mediciones realizadas en las condiciones de reproducibilidad permite dividir la incertidumbre asociada a su media por p . La media obtenida a partir de un número suficiente de mediciones tendrá entonces una incertidumbre baja, incluso despreciable, respecto a la incertidumbre del método alternativo; y, por tanto, podrá utilizarse como valor de referencia. p debe ser al menos igual a 5. - Los materiales de referencia se analizan por el método IRTF, con varias réplicas obtenidas en condiciones de reproducibilidad. El hecho de multiplicar el número de mediciones q en condiciones de reproducibilidad sobre el método IRTF permite reducir la variabilidad ligada a la fidelidad del método (error aleatorio). El valor medio de estas mediciones tendrá una desviación estándar de variabilidad dividida por q. Este error aleatorio puede pasar a ser despreciable respecto a la variabilidad ligada a la calibración (efecto de matriz) que tratamos de estimar aquí. q debe ser al menos igual a 5.

El ejemplo siguiente se aplica a la dosificación del ácido acético mediante una calibración IRTF. Los valores de referencia se ofrecen para 5 mediciones en condiciones de reproducibilidad sobre 7 materiales de ensayo estables. El número de 7 materiales es en principio insuficiente, pero los datos tienen aquí un mero valor de ejemplo.

Método de referencia IRTF

Materiales 1 2 3 4 5 Med. Ref. 1 2 3 4 5 Med.

IRTF Dif

1 0,30 0,32 0,31 0,30 0,31 0,308 0,30 0,31 0,31 0,30 0,30 0,305 -0,0042 0,31 0,32 0,32 0,32 0,31 0,316 0,31 0,32 0,30 0,31 0,31 0,315 -0,006 3 0,38 0,39 0,39 0,38 0,38 0,384 0,37 0,37 0,37 0,37 0,36 0,37 -0,016 4 0,25 0,25 0,25 0,24 0,25 0,248 0,26 0,26 0,26 0,25 0,26 0,26 0,01 5 0,39 0,39 0,40 0,40 0,39 0,394 0,43 0,42 0,43 0,42 0,42 0,425 0,03 6 0,27 0,26 0,26 0,26 0,26 0,262 0,25 0,26 0,25 0,25 0,26 0,255 -0,008 7 0,37 0,37 0,37 0,37 0,36 0,368 0,37 0,36 0,36 0,35 0,36 0,365 -0,008

Cálculo de las diferencias: dif = Med IRTF – Med Ref. Se comprueba que la media de las diferencias Md = 0,000 (ajuste correcto del IRTF respecto al método de referencia) La desviación estándar de las diferencias es Sd = 0,015. Esta desviación estándar permite estimar la variabilidad generada por la calibración, de modo que podemos decir que:

Uf = 0,015 NOTA Cabe recordar que el valor de Uf puede sobreestimarse mediante este procedimiento. Si el laboratorio considera que el valor es significativamente excesivo en las condiciones operatorias definidas aquí, podrá aumentar el número de mediciones sobre el método de referencia y/o sobre el método IRTF. Las condiciones de reproducibilidad engloban todas las otras fuentes significativas de error. Por otra parte, se ha calculado SR = 0,017 La incertidumbre de la dosificación del ácido acético por esta aplicación IRTF es:

017,0015,0 22*2/ +−+ sea +/- 0,045 g.L-1

7.4.3.3.4 Efecto de muestras En algunos casos, los experimentos para la estimación de la incertidumbre se realizan a partir de materiales de ensayo sintéticos. En tal situación, la estimación no cubre el efecto la muestra (homogeneidad). Los laboratorios deberán estimar este efecto.






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Cabe recordar que este efecto suele ser despreciable en los laboratorios de enología que utilizan muestras homogéneas de pequeño tamaño. 7.4.4 Estimación de la incertidumbre estándar por ensayos interlaboratorio 7.4.4.1 Principio El procedimiento interlaboratorio emplea los datos procedentes de ensayos interlaboratorio a partir de los cuales se calcula una desviación estándar de reproducibilidad interlaboratorio, según los principios indicados en §5.4.3. Los estadísticos encargados del cálculo de los resultados de los ensayos interlaboratorio pueden identificar resultados o laboratorios «aberrantes» aplicando las pruebas descritas en la norma ISO 5725 (test de Cochran). La separación de estos resultados podrá realizarse previo acuerdo entre los estadísticos y los analistas. Para la estimación de la incertidumbre por procedimiento interlaboratorio, los principios básicos enunciados en la norma ISO 21748 son los siguientes:

1. La desviación estándar de reproducibilidad (interlaboratorio) obtenida en un estudio colaborativo es una base válida para evaluar la incertidumbre de medición.

2. Los efectos no observados en el marco del estudio colaborativo deben ser manifiestamente

despreciables o deben tenerse en cuenta explícitamente. Los ensayos interlaboratorio son de dos tipos:

1. Les estudios colaborativos relativos a un solo método. Estos estudios se realizan para la validación inicial de un nuevo método para definir su desviación estándar de reproducibilidad interlaboratorio SRinter(método).

2. Las cadenas de comparación interlaboratorio, o ensayos de aptitud. Estos ensayos se realizan

para la validación de un método adoptado por el laboratorio y el control de calidad habitual (véase § 5,3,3,3). Los datos se tratan globalmente e integran todos los métodos de análisis empleados por los laboratorios participantes. Los resultados son la media interlaboratorio m y la desviación estándar de reproducibilidad interlaboratorio e intermétodo SRinter.

7.4.4.2 Utilización de la desviación estándar de reproducibilidad interlaboratorio e intramétodo SRinter(método) La desviación estándar de reproducibilidad intralaboratorio SRinter(método) tiene en cuenta las variabilidades intralaboratorio y la variabilidad interlaboratorio total ligadas al método. A continuación, se recomienda tener en cuenta el hecho de que el método de análisis puede producir un sesgo sistemático respecto al valor verdadero. En el marco de un estudio colaborativo y si es posible, el error producido por este sesgo podrá ser estimado utilizando materiales de referencia homologados, en las mismas condiciones que las descritas en el § 7.4.3.3.2 y añadidas a SRinter(método)






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7.4.4.3 Utilización de la desviación estándar de reproducibilidad interlaboratorio e intermétodo SRinter La desviación estándar de reproducibilidad intralaboratorio SRinter tiene en cuenta las variabilidades intralaboratorio y la variabilidad interlaboratorio para el parámetro estudiado. El laboratorio debe comprobar su veracidad respecto a estos resultados (véase § 5.3.3). No cabe añadir componentes asociados a la veracidad del método al presupuesto de incertidumbre ya que en los ensayos de aptitud multi-método se puede considerar que los errores de veracidad se tienen en cuenta en SRinter 7.4.4.4 Otros componentes del presupuesto de incertidumbre Si los materiales de ensayos utilizados para los ensayos interlaboratorio son representativos de las muestras clásicas analizadas por los laboratorios y siguen el conjunto del procedimiento analítico (sub-muestreo, extracción, concentración, dilución, destilación…), SR-inter representa la incertidumbre estándar u(x) del método, en el sentido interlaboratorio. Deben estudiarse los errores no tomados en cuenta en los ensayos interlaboratorio para estimar su incertidumbre estándar compuesta, que se combinará con la incertidumbre estándar compuesta de los ensayos interlaboratorio.

7.5 Expresión de la incertidumbre ampliada La incertidumbre se expresa en la práctica en su forma ampliada, que viene dada de forma absoluta para los métodos en los cuales la incertidumbre es estable en el ámbito de trabajo, o de forma relativa cuando la incertidumbre varía proporcionalmente a la magnitud del mesurando: Incertidumbre absoluta: )(.2/ xuU −+=

Incertidumbre relativa (en %): 100.)(.2/x

xuU −+= con

x media de los resultados de reproducibilidad. NOTA Esta expresión de la incertidumbre es posible si se supone que las desviaciones siguen una ley normal con un 95% de confianza. Estas expresiones inducen un valor de incertidumbre determinado, con un nivel de confianza del 95%






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REFERENCIAS

(1) OIV Compendio de métodos internacionales de análisis de los vinos y los mostos; OIV Ed., París. (2) OIV, 2002 – Recomendaciones armonizadas para el control interno de calidad en los laboratorios de análisis; OIV resolución œno 19/2002, París. (3) Norma ISO 5725: 1994 – Exactitud (veracidad y precisión) de métodos de medición y resultados, índice de clasificación X 06-041-1 (4) IUPAC, 2002 – Harmonized guidelines for single-laboratory validation of methods of analysis (Directrices armonizadas para la valoración de métodos de análisis en un solo laboratorio);Pure Apl. Chem., Vol. 74; N°5, p. 835-855. (5) Norma ISO 11095: 1996 – Calibración lineal usando materiales de referencia, Número de referencia ISO 11095:1996 (6) Norma ISO 21748: 2004 – Directrices relativas a la utilización de la estimación de la repetibilidad, de la reproducibilidad y de la veracidad en la evaluación de la incertidumbre de medición, Número de referencia ISO ISO/TS 21748: 2004 (7) Norma AFNOR V03-110: 1998 – Procedimiento de validación intralaboratorio de un método alternativo respecto a un método de referencia, índice de clasificación V03-110 (8) Norma AFNOR V03-115: 1996 – Guía para la utilización de los materiales de referencia, índice de clasificación V03-115 (9) Norma AFNOR X 07-001: 1994 – Vocabulario internacional de los términos fundamentales y generales de metrología, índice de clasificación X07-001 (10) Norma AFNOR ENV 13005: 1999 – Guía para la expresión de la incertidumbre de medición (11) AFNOR, 2003, - Metrología en la empresa, herramienta de la calidad 2ª edición, Edición AFNOR 2003 (12) EURACHEM, 2000, - Cuantifying Uncertainty in Analytical Measurment, EURACHEM second edition 2000 (13) CITAC / EURACHEM, 2000 - Guía para la calidad en química analítica, EURACHEM edición 2002 (14) Bouvier J.C., 2002 - Calcul de l’incertitude de mesure – Guide pratique pour les laboratoires d’analyse œnologique (Cálculo de la incertidumbre de medición – Guía práctica para los laboratorios de análisis enológico), Revue Française d’œnologie n°197, nov.-dic. 2002, pp : 16-21 (15) Snakkers G. y Cantagrel R., 2004 - Utilisation des données des circuits de comparaison interlaboratoires pour apprécier l’exactitude des résultats d’un laboratoire. Estimation d’une incertitude de mesure (Utilización de los datos de los circuitos de comparación interlaboratorio para apreciar la exactitud de los resultados de un laboratorio. Estimación de una incertidumbre de medición) - Bull OIV, Vol. 77 857-876, ene.-feb. 2004, pp : 48-83 (16) Perruchet C. et Priel M, 2000 - Estimer l’incertitude, Editions AFNOR (17) Neuilly (M.) et CETAMA, 1993 - Modélisation et estimation des erreurs de mesures, Lavoisier Ed, París






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Anexo N°1 Tabla A - Ley de SNEDECOR

La tabla muestra los valores de F en función de ν1 y ν2 para un riesgo α de 0,05

P=0,950

ν1 ν2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 ν1

ν2

1 161,4 199,5 215,7 224,6 230,2 234,0 236,8 238,9 240,5 241,9 1 2 18,51 19,00 19,16 19,25 19,30 19,33 19,35 19,37 19,38 19,40 2 3 10,13 9,55 9,28 9,12 9,01 8,94 8,89 8,85 8,81 8,79 3 4 7,71 6,94 6,59 6,39 6,26 6,16 6,09 6,04 6,00 5,96 4 5 6,61 5,79 5,41 5,19 5,05 4,95 4,88 4,82 4,77 4,74 5 6 5,99 5,14 4,76 4,53 4,39 4,28 4,21 4,15 4,10 4,06 6 7 5,59 4,74 4,35 4,12 3,97 3,87 3,79 3,73 3,68 3,64 7 8 5,32 4,46 4,07 3,84 3,69 3,58 3,50 3,44 3,39 3,35 8 9 5,12 4,26 3,86 3,63 3,48 3,37 3,29 3,23 3,18 3,14 9 10 4,96 4,10 3,71 3,48 3,33 3,22 3,14 3,07 3,02 2,98 10 11 4,84 3,98 3,59 3,36 3,20 3,09 3,01 2,95 2,90 2,85 11 12 4,75 3,89 3,49 3,26 3,11 3,00 2,91 2,85 2,80 2,75 12 13 4,67 3,81 3,41 3,18 3,03 2,92 2,83 2,77 2,71 2,67 13 14 4,60 3,74 3,34 3,11 2,96 2,85 2,76 2,70 2,65 2,60 14 15 4,54 3,68 3,29 3,06 2,90 2,79 2,71 2,64 2,59 2,54 15 16 4,49 3,63 3,24 3,01 2,85 2,74 2,66 2,59 2,54 2,49 16 17 4,45 3,59 3,20 2,96 2,81 2,70 2,61 2,55 2,49 2,45 17 18 4,41 3,55 3,16 2,93 2,77 2,66 2,58 2,51 2,46 2,41 18 19 4,38 3,52 3,13 2,90 2,74 2,63 2,54 2,48 2,42 2,38 19 20 4,35 3,49 3,10 2,87 2,71 2,60 2,51 2,45 2,39 2,35 20 21 4,32 3,47 3,07 2,84 2,68 2,57 2,49 2,42 2,37 2,32 21 22 4,30 3,44 3,05 2,82 2,66 2,55 2,46 2,40 2,34 2,30 22 23 4,28 3,42 3,03 2,80 2,64 2,53 2,44 2,37 2,32 2,27 23 24 4,26 3,40 3,01 2,78 2,62 2,51 2,42 2,36 2,30 2,25 24 25 4,24 3,39 2,99 2,76 2,60 2,49 2,40 2,34 2,28 2,24 25 26 4,23 3,37 2,98 2,74 2,59 2,47 2,39 2,32 2,27 2,22 26 27 4,21 3,35 2,96 2,73 2,57 2,46 2,37 2,31 2,25 2,20 27 28 4,20 3,34 2,95 2,71 2,56 2,45 2,36 2,29 2,24 2,19 28 29 4,18 3,33 2,93 2,70 2,55 2,43 2,35 2,28 2,22 2,18 29 30 4,17 3,32 2,92 2,69 2,53 2,42 2,33 2,27 2,21 2,16 30 40 4,08 3,23 2,84 2,61 2,45 2,34 2,25 2,18 2,12 2,08 40 60 4,00 3,15 2,76 2,53 2,37 2,25 2,17 2,10 2,04 1,99 60

120 3,92 3,07 2,68 2,45 2,29 2,17 2,09 2,02 1,96 1,91 120

∞ 3,84 3,00 2,60 2,37 2,21 2,10 2,01 1,94 1,88 1,83 ∞

ν2 ν1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 ν2

ν1






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Anexo N°2 Tabla B - Ley de STUDENT

La tabla ofrece los valores de t en función de P y de ν.

7.5.1.1.ν

0,55 0,60 0,65 0,70 0,75 0,80 0,85 0,90 0,95 0,975 0,990 0,995 0,9995 P ν

1 0,158 0,325 0,510 0,727 1,000 1,376 1,963 3,078 6,314 12,706 31,821 63,657

636,619 1 2 0,142 0,289 0,445 0,617 0,816 1,061 1,386 1,886 2,920 4,303 6,965 9,925 31,59

8 2 3 0,137 0,277 0,424 0,584 0,765 0,978 1,250 1,638 2,353 3,182 4,541 5,841 12,92

9 3

4 0,134 0,271 0,414 0,569 0,741 0,941 1,190 1,533 2,132 2,776 3,747 4,604 8,610 4 5 0,132 0,267 0,408 0,559 0,727 0,920 1,156 1,476 2,015 2,571 3,365 4,032 6,869 5 6 0,131 0,265 0,404 0,553 0,718 0,906 1,134 1,440 1,943 2,447 3,143 3,707 5,959 6 7 0,130 0,263 0,402 0,549 0,711 0,896 1,119 1,415 1,895 2,365 2,998 3,499 5,408 7 8 0,130 0,262 0,399 0,546 0,706 0,889 1,108 1,397 1,860 2,306 2,896 3,355 5,041 8 9 0,129 0,261 0,398 0,543 0,703 0,883 1,100 1,383 1,833 2,262 2,821 3,250 4,781 9

10 0,129 0,260 0,397 0,542 0,700 0,879 1,093 1,372 1,812 2,228 2,764 3,169 4,587 10 11 0,129 0,260 0,396 0,540 0,697 0,876 1,088 1,363 1,796 2,201 2,718 3,106 4,437 11 12 0,128 0,259 0,395 0,539 0,695 0,873 1,083 1,356 1,782 2,179 2,681 3,055 4,318 12 13 0,128 0,259 0,394 0,538 0,694 0,870 1,079 1,350 1,771 2,160 2,650 3,012 4,221 13 14 0,128 0,258 0,393 0,537 0,692 0,868 1,076 1,345 1,761 2,145 2,624 2,977 4,140 14 15 0,128 0,258 0,393 0,536 0,691 0,866 1,074 1,341 1,753 2,131 2,602 2,947 4,073 15 16 0,128 0,258 0,392 0,535 0,690 0,865 1,071 1,337 1,746 2,120 2,583 2,921 4,015 16 17 0,128 0,257 0,392 0,534 0,689 0,863 1,069 1,333 1,740 2,110 2,567 2,898 3,965 17 18 0,127 0,257 0,392 0,534 0,688 0,862 1,067 1,330 1,734 2,101 2,552 2,878 3,922 18 19 0,127 0,257 0,391 0,533 0,688 0,861 1,066 1,328 1,729 2,093 2,539 2,861 3,883 19

20 0,127 0,257 0,391 0,533 0,687 0,860 1,064 1,325 1,725 2,086 2,528 2,845 3,850 20

21 0,127 0,257 0,391 0,532 0,686 0,859 1,063 1,323 1,721 2,080 2,518 2,831 3,819 21 22 0,127 0,256 0,390 0,532 0,686 0,858 1,061 1,321 1,717 2,074 2,508 2,819 3,792 22 23 0,127 0,256 0,390 0,532 0,685 0,858 1,060 1,319 1,714 2,069 2,500 2,807 3,767 23 24 0,127 0,256 0,390 0,531 0,685 0,857 1,059 1,318 1,711 2,064 2,492 2,797 3,745 24 25 0,127 0,256 0,390 0,531 0,684 0,856 1,058 1,316 1,708 2,060 2,485 2,787 3,725 25 26 0,127 0,256 0,390 0,531 0,884 0,856 1,058 1,315 1,706 2,056 2,479 2,779 3,707 26 27 0,127 0,256 0,389 0,531 0,684 0,855 1,057 1,314 1,703 2,052 2,473 2,771 3,690 27 28 0,127 0,256 0,389 0,530 0,683 0,855 1,056 1,313 1,701 2,048 2,467 2,763 3,674 28 29 0,127 0,256 0,389 0,530 0,683 0,854 1,055 1,311 1,699 2,045 2,462 2,756 3,659 29 30 0,127 0,256 0,389 0,530 0,683 0,854 1,055 1,310 1,697 2,042 2,457 2,750 3,646 30 40 0,126 0,255 0,388 0,529 0,681 0,851 1,050 1,303 1,684 2,021 2,423 2,704 3,551 40 60 0,126 0,254 0,387 0,527 0,679 0,848 1,046 1,296 1,671 2,000 2,390 2,660 3,460 60 120 0,126 0,254 0,386 0,526 0,677 0,845 1,041 1,289 1,658 1,980 2,358 2,617 3,373 120

∞ 0,126 0,253 0,385 0,524 0,674 0,842 1,036 1,282 1,645 1,960 2,326 2,576 3,291 ∞

ν

P 0,55 0,60 0,65 0,70 0,75 0,80 0,85 0,90 0,95 0,975 0,990 0,995 0,9995 ν

P

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RESOLUCIÓ GUÍA PRÁCTICA PARA LA … sus procedimientos de validación, control de calidad interno y estimación de la incertidumbre de los métodos alternativos que aplican. 2