ROZDZIAŁ 28 PŁYNY BIOLOGICZNE JAKO ŹRÓDŁO INFORMACJI O NARAŻENIU CZŁOWIEKA NA ŚRODOWISKOWE

CZYNNIKI CHEMICZNE

Żaneta Polkowska1 , Katarzyna Kozłowska1, Jacek Namieśnik1

1Katedra Chemii Analitycznej, Wydział Chemiczny Politechniki Gdańskiej, ul. Narutowicza 11/12, 80-952 Gdańsk,

STRESZCZENIE Organizm ludzki jest narażony na ekspozycję zanieczyszczeń z otaczającego go środowiska. Wiele związków chemicznych (m.in. lotne związki chlorowcoorganiczne, metale) ma szkodliwy wpływ na tkanki i narządy organizmu ludzkiego, wywołując niejednokrotnie nieodwracalne zmiany chorobowe. W celu określenia stopnia zagrożenia zawodowego coraz częściej wykonuje się pomiar stężeń substancji chemicznych lub ich metabolitów w płynach biologicznych tj. w moczu, krwi, rzadziej w mleku matki, żółci ślinie czy też spermie.

Jednak aby określić poziomy stężeń składników śladowych w płynach biologicznych takich, jak: mocz, krew, mleko, żółć, ślinę, czy spermę, pobrane próbki należy odpowiednio przygotować, ponieważ posiadają one bardzo skomplikowaną matrycę, która uniemożliwia bezpośrednie oznaczanie analitów za pomocą którejkolwiek z dostępnych metod analitycznych. W rozdziale przedstawiono dane literaturowe odnośnie: - technik izolacji i/lub wzbogacania analitów z próbek płynów biologicznych przed ich etapem ozna-

czeń końcowych; - technik oznaczeń końcowych szerokiego spektrum związków (zarówno organicznych jak i nieorga-

nicznych) oznaczanych w tychże próbkach. Informacje te dotyczą pierwotnej postaci zanieczyszczeń, które dostały się do organizmu człowieka w wyniku ekspozycji środowiskowej i zawodowej oraz produktów ich przemiany (metabolizmu) w organi-zmie.

1. WSTĘP Źródłem informacji o stanie środowiska mogą być zarówno wyniki badań próbek części nieożywionej środowiska (powietrze, woda, gleba), jak i próbek części biotycznej, w tym także tkanek i płynów ustrojowych człowieka, który jest nieustannie narażony na działanie szerokiego spektrum ksenobiotyków.

Badania próbek płynów ustrojowych człowieka stanowi dla analityka duże wy-zwanie. Aby możliwe było oznaczenie w takich próbkach metali, a przede wszystkim różnorodnych związków organicznych, należy je poddać praco- i czasochłonnym ope-racjom przygotowania do analizy. Próbki płynów fizjologicznych charakteryzują się bardzo złożonym składem matrycy i w zdecydowanej większości przypadków nie jest możliwe bezpośrednie oznaczenie analitów z wykorzystaniem znanych metodyk i tech-nik analitycznych. Od pewnego czasu w literaturze pojawia się coraz więcej informacji na temat: - nowych metodyk analitycznych przeznaczonych do badań płynów biologicznych,

głównie moczu i krwi ludzkiej; - zmierzonych poziomów stężeń dla szerokiego spektrum analitów w próbkach pły-

nów fizjologicznych;

Rozdział 28

580

- oceny wpływu narażenia środowiskowego i zawodowego na poziom stężeń różnych typów związków chemicznych wykrywanych w próbkach płynów biologicznych człowieka.

2. PŁYNY BIOLOGICZNE Ksenobiotyki wchłonięte do organizmu człowieka mogą bezpośrednio i/lub po odpo-wiednich przemianach krążyć po organizmie razem z płynami ustrojowymi, podlegać procesowi kumulacji w różnych tkankach i organach lub mogą zostać wydalone z orga-nizmu w formie niezmienionej lub jako polarne metabolity. Procesy te uzależnione są, zarówno od czynników fizjologicznych (stan zdrowia organizmu), jak i właściwości fizykochemicznych substancji wchłoniętej. Ksenobiotyki lub ich metabolity mogą znaj-dować się w płynie mózgowo-rdzeniowym, mleku, pocie, łzach, ślinie, nasieniu (sper-mie), płynie owodniowym, żółci, limfie (chłonce), krwi czy moczu. Oznaczenia sub-stancji toksycznych lub ich metabolitów wykonuje się głównie w próbkach krwi, moczu i w wydychanym powietrzu.

Ze względu na fakt, że etap przygotowania, izolacja i analiza próbek tych pły-nów nie jest zadaniem łatwym, największym przedmiotem zainteresowania toksykolo-gów, ekotoksykologów i analityków są dwa płyny biologiczne: krew (osocze) i mocz. Opracowano już wiele technik przygotowania tego rodzaju próbek oraz kompletnych metod analitycznych umożliwiających oznaczenie różnorodnych składników występu-jących tam na poziomie śladów i ultraśladów. Poniżej przedstawiono krótką charaktery-stykę wybranych płynów biologicznych.

Mocz Ze względu na swoje właściwości i sposób pobierania próbki – to właśnie mocz jest najczęściej wykorzystywany przy badaniach oceny narażenia środowiskowego i zawo-dowego. Mocz jest płynem wytwarzanym w nerkach w ilości ok. 1500 ml na dobę. Za-wiera on oprócz wody (95%) szkodliwe i zbędne produkty przemiany materii (głównie mocznik). Mocz jest materiałem niezwykle bogatym w niezbędne informacje na temat funkcjonowania organizmu człowieka i efektów narażenia go na szkodliwe substancje pochodzące z otaczającego środowiska. Strategia pobierania próbek moczu zależy od kinetyki wydalania badanych substancji.

Pobieranie i analiza próbek moczu nie jest związana z żadnym ryzykiem, a uzyskana wielkość próby może być stosunkowo duża (nawet do 800 cm3). Optymalną metodą jest pobieranie próbek moczu w określonych przedziałach czasowych i wyraża-nie wyników w formie szybkości wydalania w czasie, np. w mg/godz. W warunkach występujących w trakcie badań terenowych zwykle dostępne są jedynie jednorazowe próbki moczu. Ze względu na to, że stężenie wielu oznaczanych substancji jest zależne od wielkości diurezy, która może ulegać znacznym wahaniom, stosuje się metody stan-daryzacji. Najczęściej stosowanym sposobem jest przeliczanie wyników oznaczeń na względną gęstość moczu (równanie 1):

)(próbcebadanejwmoczugęstość

moczugęstośćśredniaCCst ×= (1)

gdzie: Cst – stężenie substancji w moczu po standaryzacji; C – oznaczone stężenie analitu.

Rozdział 28

581

Innym powszechnie stosowanym sposobem standaryzacji jest przeliczanie wyników na gram kreatyniny. Zastosowanie określonego sposobu korekty diurezy ma na celu uzy-skanie najlepszej korelacji pomiędzy wielkością ekspozycji a wydalaniem substancji lub jej metabolitu w moczu [1].

W przypadku analizy medycznej, podstawowe badania moczu obejmują pomiar ciężaru właściwego, barwy, przejrzystości, odczynu, ilości białka, cukru, ciał ketono-wych, barwników żółciowych. Bardziej rozszerzone badanie obejmuje określenie wła-ściwości osadu moczu, tzn. ilości nabłonków, krwinek białych i czerwonych, wałecz-ków i składników mineralnych. W ostatnich latach coraz częściej, oprócz typowych badań morfologicznych w pobieranych próbkach moczu, usiłuje się oznaczyć szerokie spektrum indywiduów chemicznych. W moczu mogą pojawić się określone związki chemiczne, ksenobiotyki lub ich metabolity (biomarkery), które normalnie nie powinny się w nim znajdować. Biomarkery są wskaźnikiem zmian, jakie mogą zachodzić w układach biologicznych w wyniku oddziaływania czynników szkodliwych o bardzo zróżnicowanej budowie i pochodzeniu. Biowskaźniki stanowiące podstawę do określe-nia stężenia kancerogenów (lub ich metabolitów) w materiale biologicznym można po-dzielić na dwie grupy [2]: - biomarkery selektywne (ten rodzaj jest wykorzystywany w praktyce analitycznej); - biomarkery nieselektywne. Badanie moczu pod takim kątem pomoże wskazać źródło problemu, jakim może być zanieczyszczone powietrze, woda czy żywność , która jest używana przez człowieka. Ogromny postęp medyczny, jaki dokonał się w ostatnich latach spowodował, że obecnie można oznaczać substancje chemiczne lub ich metabolity z wysoką precyzją i czuło-ścią. W tabeli 1 przedstawiono przykłady związków chemicznych i biomarkerów wy-krytych w moczu.

Tabela 1. Przykłady biomarkerów obecnych w moczu i wykorzystywanych przy ocenie narażenia człowieka na różnorodne ksenobiotyki.

SUBSTANCJA SZKODLI-WA

ŹRÓDŁA ZANIECZYSZCZE-NIA

BIOMARKER EKSPOZYCJI (METABOLIT)

WYKRYTY W MOCZU ZWIĄZKI NIEORGANICZNE [1, 3-27]

nikiel woda pitna, powietrze nikiel (II)

rtęć (0) powietrze(opary), żywność rtęć całkowita

platyna powietrze (opary), ruch uliczny platyna

bizmut leki kosmetyki bizmut

chromian magnezu (IV) chrom powietrze(opary) chrom (IV)

arsen powietrze, żywność, woda pitna As+3, As+5

metylowo pochodne kwasów arsenowych

kadm Powietrze, dym papierosowy kadm

cynk powietrze cynk

ołów i jego związki nieorga-niczne

powietrze

atmosfera

ołów kwas 5-aminolewulinowy

fluorki powietrze fluorki ZWIĄZKI ORGANICZNE [1, 28-49]

Rozdział 28

582

benzen fenol, katechol, hydrochinon, kwas mukonowy

wielopierścieniowe węglowo-dory aromatyczne 1-hydroksy-benzo(a)piren

etylobenzen kwas migdałowy fenol fenol

n-heksan 2,5-heksanodion

toluen toluen, kwas benzoesowy, o-

krezol, kwas hipurowy, kwas p-toluilomerkapturowy

styren kwas migdałowy ksylen kwas metylohipurowy

2-naftyloamina 2-naftyloamina benzydyna N,N’-diacetyloamina fenacetyna N-acetylo-p-aminofenol

akrylonitryl akrylonitryl izotiocyjaniany

alkohol metylowy alkohol metylowy alkohol metylowy, kwas mrów-

kowy 1,4-dioksan kwas beta-hydroksyetoksyoctowy

2-etylotoluen suma kwasów:

o-etylobenzoesowego, o-toluenooctowego

3-etylotoluen kwas m-etylobenzoesowy 4-etylotoluen

powietrze

kwas, p-etylobenzoesowy trimetylobenzeny

pseudokumen (1,2,4)

suma kwasów: 2,4-; 2.5- i 3.4-dimetylobenzoesowych

mezytylen (1,3,5) kwas 3,5- dimetylobenzoesowy

hemimeliten (1,2,3)

powietrze suma kwasów:

2,3- i 2.6 - dimetylobenzoeso-wych

halogenowęglowodory

chloroform powietrze, woda pitna, woda z basenu chloroform

1,1,1-trichloroetan trichloroetanol lub jego glukuronian

trichloroeten kwas trichlorooctowy, trichloro-

etanol lub jego glukuronian

tetrachloroeten

powietrze, woda pitna

kwas trichlorooctowy tetrachloroeten

Poważny problem stanowi fakt, że dla większości biomarkerów brak jest danych

na temat dopuszczalnych stężeń w płynach biologicznych. Powoduje to, że przy ich pomocy można stwierdzić występowanie ekspozycji na ksenobiotyk, ale bez możliwo-ści oceny wysokości ryzyka, jakie dana ekotoksyna wywołuje [41].

Krew Krew wraz z limfą, płynem międzykomórkowym oraz płynem mózgowo-rdzeniowym tworzy środowisko wewnętrzne ustroju. Morfologia krwi należy do podstawowych i najpowszechniej wykonywanych badań. Pozwala określić stan zdrowia badanego, wy-kryć zapalenia, zatrucia fizykochemiczne oraz wiele innych procesów chorobowych zachodzących w organizmie. Krew jest uniwersalnym łącznikiem pomiędzy wszystkimi komórkami organizmu.

Rozdział 28

583

Jak do tej pory, krew w mniejszym stopniu niż mocz jest wykorzystywana do badań jako materiał biologiczny. Wynika to z faktu, że pobieranie próbek krwi jest pro-cesem inwazyjnym, a objętość jaką można pobrać nie przekracza 20 ml. Ponadto nie-kiedy występują trudności z uzyskaniem zgody na pobranie próbek krwi do badań. Ana-lizę próbek krwi wykonuje się najczęściej w przypadku narażenia danego osobnika na substancje ulegające powolnej eliminacji z ustroju, np. ołów czy kadm. Wykonuje się również oznaczenia niezmienionych form rozpuszczalników- w okresie po ustaniu eks-pozycji- w celu określenia oceny narażenia zawodowego [50]. W tabeli 2 przedstawio-no przykłady ksenobiotyków oznaczanych w próbkach krwi.

Tabela 2. Przykłady substancji szkodliwych oznaczanych w próbkach krwi (w celu określenia stopnia narażenia).

SUBSTANCJA SZKODLIWA

ŹRÓDŁO NARAŻENIA

DAWCY PRÓBEK KRWI – RODZAJ EKSPOZYCJI

Endemiczna Zawodowa ZWIĄZKI NIEORGANICZNE [1,5,6,8-10,14,22,24,27]

chrom powietrze - - produkcja kotłów ze stali nierdzewnej, -montaż samolotów (spoiwa zawierające chromian magnezu (IV)

rtęć żywność

- spożywający ryby i owoce morza

- produkcja suchych ogniw elektrolityczna, - produkcja chloru, - ekstrakcja złota z koncentratów rudy, - naprawa termometrów, pomp próżnio-wych, transformatorów, lamp rtęciowych, barometrów i termostatów rtęciowych, - stomatolodzy (stosowanie amalgamatu do wypełnień zębów)

ołów powietrze -

- wytop ołowiu z rud lub złomu, - spawanie i cięcie konstrukcji metalowych malowanych farbami zawierającymi ołów, - odlew metali nieżelaznych, - produkcja akumulatorów, pigmentów, szkła kryształowego, - wypalanie ołowiu przy produkcji wyro-bów ceramicznych, - naprawa chłodnic samochodowych, - wydobywanie rud ołowiu

kadm powietrze -

- produkcji cynku, akumulatorów niklowo-kadmowych, stopów, pigmentów kadmo-wych - spawanie metali powleczonych antykoro-zyjną warstwą kadmu

tlenek węgla powietrze

- praca silników spalinowych (par-kingi podziemne, tunele, kryte lodowi-ska), - palenie tytoniu, - wnętrza mieszkalne o złej wentylacji (kuchnie)

-

ZWIĄZKI ORGANICZNE [1,45-47,51,52]

styren powietrze - - produkcja łodzi z włókien szklanych wzmacnianych żywicą

Rozdział 28

584

trihalogenome-tany

(THM) woda, powietrze

- pływacy uczestni-czący w zawodach na krytym basenie pływackim

-

tetrachloroeten powietrze - - proces czyszczenia „na sucho”

trimetylobenzen powietrze

- malowanie stolarki budowlanej, tynków wewnętrznych i zewnętrznych

-lakierowanie karoserii samochodu (pro-dukcja samochodów)

polichlorowane bifenyle (PCB) powietrze - - zanieczyszczone powietrze wewnątrz

pomieszczeń szkoły (nauczyciele) pestycydy fosfo-

roorganiczne powietrze uprawianie ziemi - rolnicy

Ślina Ślina jest płynem wydzielanym przez ślinianki przyuszne, podżuchwowe i podjęzykowe oraz inne mniejsze, umiejscowione w błonie śluzowej jamy ustnej. Ilość wydzielanej śliny i jej skład zmienia się w zależności od wieku, płci i rodzaju czynnika pobudzają-cego. Głównym składnikiem śliny jest woda, stanowi ona 99,5%, resztę stanowią sub-stancje stałe, z czego na składniki nieorganiczne przypada 0,2%, zaś na organiczne 0,3%. Ślina jest materiałem stosunkowo łatwo dostępnym do badań. Przed jej pobra-niem należy przepłukać usta ciepłą wodą , a następnie pozwolić na swobodne ściekanie 6-8 ml śliny. Pierwszą taką partię odrzuca się, a następne- pobiera do badań. Ze śliną częściowo wydalane są z organizmu liczne substancje organiczne i nieorganiczne, a także leki. Stężenie leku w ślinie jest odzwierciedleniem stężenia w surowicy części leku nie związanego z białkiem. Niestety, tylko kilka leków charakteryzuje się nie-zmienną wartością stałej podziału pomiędzy ślinę i surowicę. Jest to przyczyna nie-wielkiego, jak dotąd, zastosowania śliny jako materiału biologicznego w analizie toksy-kologicznej [53]. W tabeli 3 przedstawiono przykłady ksenobiotyków wydalanych ze śliną.

Tabela 3. Przykłady substancji szkodliwych oznaczanych w próbkach śliny (w celu określenia stopnia narażenia zawodowego).

DROGA WY-DALANIA RODZAJ WYDALANYCH KSENOBIOTYKÓW

ślina

leki (penicylina, streptomycyna, barbiturany, kwas salicylowy, chinidyna), etanol, nikotyna, pestycydy (karbaryl, kepone), metale (rtęć, kadm, ołów, stront)

Żółć Wątroba odgrywa rolę filtru chroniącego organizm przed działaniem wielu trucizn. Substancje wchłonięte w przewodzie pokarmowym, zanim trafią do krążenia ogólnego, przedostają się w całości poprzez żyłę wrotną do wątroby. W narządzie tym mogą wią-zać się z białkami, ulec biotransformacji lub zostać wydalone z żółcią w postaci nie zmienionej lub jako metabolity [53] Przy wydalaniu substancji obcych z żółcią dużą rolę odgrywa wielkość cząstki, mniejszą ich właściwości fizykochemiczne. Z żółcią wydalane są głównie związki wysokocząsteczkowe o masie cząsteczkowej powyżej 300-500 głównie w postaci polarnych produktów sprzęgania [53,54]. Tą drogą elimi-nowane są także insektycydy polichlorowane, wielopierścieniowe węglowodory aroma-

Rozdział 28

585

tyczne, leki, niektóre alkaloidy, metale, np. mangan, srebro, połączenia organiczne rtęci, miedź, ołów i cynk. Substancje wraz z żółcią przedostają się do jelit, skąd mogą być wydalone z kałem lub ponownie wchłonięte do krwi. Wchłanianiu zwrotnemu ulegają zwłaszcza substancje lipofilowe – trafiają one ponownie do wątroby [53]. Wydalanie substancji szkodliwych z organizmu innymi drogami Nieznaczne ilości substancji obcych wydalane są z organizmu wraz ze spermą, potem i mlekiem. Ksenobiotyki wydalane ze śliną zostają zazwyczaj połknięte i przedostają się do przewodu pokarmowego. W tabeli 4 zestawiono rodzaje wydalanych substancji ob-cych ze śliną, potem i mlekiem. Przenikające do mleka ksenobiotyki mogą spowodować u niemowląt zatrucia lub wywołać odczyny alergiczne [53].

Tabela 4. Rodzaje wydalanych substancji obcych ze śliną, potem i mlekiem [55-62]

DROGA WY-DALANIA RODZAJ WYDALANYCH KSENOBIOTYKÓW

sperma polichlorowane bifenyle (PCB), wielopierścieniowe węglowodory aroma-tyczne (WWA), styren

pot etanol, kwas salicylowy, kwas benzoesowy, fenazon, ołów, aresn, rtęć, żela-zo, jod, brom, fenol

mleko

leki (wziewne środki znieczulające ogólnie, barbiturany, tetracykliny, tiazy-dy, sole litu), etanol, nikotyna, insektycydy, chlorowane pestycydy, polichlorowane bi-fenyle, etery polibromowanych bifenyli, metylortęć, ołów, kadm, miedź, pierwiastki radioaktywne (90Sr, 131I)

3. PRZYGOTOWANIE PRÓBEK PŁYNÓW BIOLOGICZNYCH DO ANALI-

ZY Stężenia substancji toksycznych lub ich metabolitów w materiale biologicznym najczę-ściej nie są stałe, a ta zmienność zależy od rytmu narażenia i okresu biologicznego pół-trwania ksenobiotyku w organizmie. W związku z tym konieczne jest szczególnie w przypadku substancji o krótkim okresie biologicznego półtrwania rygorystyczne prze-strzeganie czasu pobierania próbek. Dodatkowo mocz, krew, ślina, żółć i sperma jako materiał biologiczny posiadają bardzo skomplikowaną, organiczną matrycę, która uniemożliwia ich bezpośrednią analizę. Przygotowanie próbek biologicznych do analizy jest zadaniem złożonym, a operacje i procesy wchodzące w skład tego etapu mogą być zarówno przyczyną straty analitów jak i źródłem dodatkowych zanieczyszczeń i błędów [63]. Na etapie przygotowania próbek do analizy można wyróżnić następujące etapy: 1. Pobieranie próbek. 2. Transport, konserwacja i przechowywanie próbek. 3. Obróbka fizyczna i chemiczna. 4. Izolacja i wzbogacanie analitów. 5. Oczyszczanie ekstraktów. 6. Rozdzielanie analitów. 7. Identyfikacja analitów. 8. Oznaczenia ilościowe. 9. Walidacja wykorzystywanych procedur analitycznych.

Rozdział 28

586

Poniżej zostaną przedstawione informacje na temat tych etapów, które mają klu-czowe znaczenie dla jakości wyników analitycznych. 3.1. Pobieranie próbek. Próbki moczu powinny być pobierane w czasie określonym w komentarzu załączonym do opisu stosowanej metodyki analitycznej. Należy odrzucić próbki nadmiernie roz-cieńczone lub wzbogacone i wybierać odpowiednią metodę korekty stopnia diurezy. Na stężenie substancji toksycznych w moczu może mieć wpływ szereg czynników fizjolo-gicznych. Stwierdzono pięciokrotne zwiększenie stężenia chromu w moczu po dwugo-dzinnym biegu. Uszkodzenie nerek może powodować zatrzymanie w organizmie związ-ków wydalanych głównie z moczem. Na stężenie substancji toksycznych we krwi wpływają także warunki, w których przebywa dawca. W pozycji stojącej zmniejsza się objętość osocza, co może powodo-wać wzrost o 10 % stężenia substancji nie ulegających dyfuzji. Spożywanie posiłków wpływa na zawartość w krwi trójglicerydów, co może spowodować zmiany rozmiesz-czenia związków organicznych dobrze rozpuszczalnych w tłuszczach. Wysiłek fizyczny powoduje zmiany osocza krwi, prawdopodobnie w wyniku wycieku składników we-wnątrzkomórkowych. Intensywny wysiłek fizyczny powoduje rozcieńczenie krwi i ob-niżenie stężeń substancji związanych z erytrocytami. W trakcie ciąży objętość osocza wzrasta o jedną trzecią, co powoduje zmiany stężeń wielu składników krwi. W związku z tym zalecana jest standaryzacja warunków pobierania próbek krwi. Na wyniki monitoringu biologicznego mogą także wpływać zaburzenia czynno-ści niektórych narządów. Schorzenia wątroby mogą wpływać na klirens metaboliczny substancji ulegających przemianom w tym narządzie lub ulegającym wydalaniu z żółcią [1]. 3.2. Transport, konserwacja i przechowywanie próbek. Na stabilność stężeń badanych substancji w próbkach płynów biologicznych może wpływać szereg czynników: odparowywanie, wytrącanie, adsorpcja, brak stabilności i redystrybucja. W trakcie przechowywania próbek moczu występuje tendencja do wytrącania się osadu. Pierwiastki śladowe mogą ulegać współstrącaniu lub osadzać się na po-wierzchni osadu. Zjawisko to występuje w różnym stopniu zależnie od pierwiastka i pH moczu (straty niklu wynosiły 1 % przy pH 1 i 6 % przy pH 6) [1]. W czasie przecho-wywania próbek zakwaszonego moczu przez dwa dni następował wzrost stężenia arse-nu, miedzi, antymonu, chromu, rtęci, selenu i cynku w wytrąconym osadzie. Natomiast mangan, kobalt, cez i rubid pozostawały w roztworze nad osadem (ang. supernatant). Nie stwierdzono strat chromu i niklu w zakwaszonych próbkach moczu, przechowywa-nych w naczyniach polietylenowych w temperaturze 6oC lub –20oC. Wyniki szeregu badań wskazują na brak strat ołowiu w próbkach krwi przechowywanych w naczyńkach z różnych tworzyw i szkła. Wytrącanie osadu nie ma istotnego znaczenia dla substancji organicznych. Brak jest jednak wyczerpujących danych na temat stabilności lotnych związków organicznych w próbkach materiału biologicznego. Wiele substancji orga-nicznych wykazuje brak stabilności w matrycy biologicznej ze względu na działanie enzymów lub bakterii obecnych w moczu. Stwierdzono brak stabilności kwasu fenylo-glioksalowego, hipurowego i metylohipurowego w moczu przechowywanym w lodów-ce lub w temperaturze pokojowej, natomiast kwas benzoesowy, metylobenzoesowy i migdałowy pozostawały stabilne przez kilka tygodni. Stężenie takich składników, jak fenol, trój-, cztero- i pięciochlorofenol nie uległo zmianie w próbkach moczu przecho-wywanych w lodówce [1].

Rozdział 28

587

W przypadku krwi i surowicy nie stwierdzono obniżenia stężeń chromu w prób-kach przechowywanych przez 4 dni w temperaturze pokojowej, trzy tygodnie w tempe-raturze –4oC i ponad 18 miesięcy w temperaturze –10oC w probówkach z tworzyw sztucznych [1]. Stwierdzono jednak szybki ubytek toluenu i etylobenzenu z próbek krwi przechowywanych w otwartych probówkach. Natomiast nie zaobserwowano zmian stę-żeń toluenu we krwi przechowywanej w szklanych probówkach, zamkniętych korkami z podkładką z folii aluminiowej lub teflonu [1]. 3.3. Obróbka fizyczna i chemiczna. Jednym ze sposobów przygotowania próbek moczu do oznaczeń metali ciężkich (np. chrom, kadm) jest rozcieńczenie za pomocą kwasu azotowego. Do próbek dodaje się też odpowiednich odczynników np. dwuchromianu potasowego lub kwasu siarkowego i nadtlenku wodoru. Z dodatkami próbki wygrzewa się w temperaturze 120 – 140 oC (np. arsen). Natomiast krew poddaje się odbiałczeniu roztworem kwasu azotowego [1]. Mocz zawierający metabolity toluenu, ksylenu i styrenu jest poddawany hydro-lizie alkalicznej, a anality przeprowadzane są w niepolarne pochodne w procesie silila-cji za pomocą czynnika sililującego (N,O-bis, (trimetylosililo)-trifluoroacetamid-BSTFA). W celu przygotowania próbek moczu oznaczeń fenolu poddaje się go hydroli-zie kwasowej a następnie ekstrahuje za pomocą eteru dietylowego [1]. 3.4. Izolacja i wzbogacanie analitów. Podstawowym elementem przygotowania próbki biologicznej do analizy jest etap izola-cji i/lub wzbogacania polegający na przeniesieniu analitów z matrycy pierwotnej (prób-ka oryginalna) do matrycy wtórnej z równoczesnym usunięciem substancji przeszkadza-jących (izolacja) i zwiększeniem stężenia analitów do poziomu powyżej granicy ozna-czalności stosowanego przyrządu kontrolno – pomiarowego (wzbogacanie). Jedną z częściej wykorzystywanych technik do izolacji i wzbogacania lotnych związków chlo-rowcoorganicznych (trihalogenometany - THM, tetrachloroetylen, trimetylobenzen) jest analiza fazy nadpowierzchniowej w układzie statycznym (HS) lub dynamicznym (TLHS) [49-50, 63-75]. 4. OZNACZANIE KSENOBIOTYKÓW W PRÓBKACH PŁYNÓW

BIOLOGICZNYCH Oznaczanie ksenobiotyków nieorganicznych Oznaczanie metali i innych pierwiastków w materiale biologicznym ma duże znaczenie nie tylko przy ocenie narażenia środowiskowego i zawodowego oraz w diagnostyce zatruć ostrych, ale również w diagnostyce chorób związanych z niedoborem metali istotnych dla życia. W zależności od potrzeby badaniom poddaje się różne materiały biologiczne, są to jednak najczęściej płyny ustrojowe – krew, surowica, mocz, a niekie-dy też włosy i paznokcie. Metody izolacji/wyodrębniania metali z płynów ustrojowych Wykrywanie śladowych ilości metali w moczu, krwi lub mleku często wymaga znisz-czenia substancji organicznych przez utlenienie – czyli mineralizację [76]. Proces ten związany jest z przeprowadzeniem ksenobiotyków metalicznych w postać jonową. Ist-nieją dwa warianty mineralizacji: „na sucho” i „na mokro”. Wybór jednego z wariantów uzależniony jest od oznaczanego pierwiastka oraz od wykorzystywanej techniki ozna-czeń końcowych. Ponadto w praktyce analitycznej mogą znaleźć zastosowanie następu-jące techniki mineralizacji:

Rozdział 28

588

- rozkład próbek z wykorzystaniem mikrofal (w systemie otwartym lub zamknię-tym);

- mineralizacja wspomagana promieniowaniem UV; - rozkład próbki w mieszaninach utleniających wspomagany ultradźwiękami. Tak przygotowaną próbkę można już poddać analizie z wykorzystaniem odpowiednich urządzeń kontrolno-pomiarowych. Często próbki moczu lub krwi poddaje się jedynie rozcieńczeniu na przykład przy użyciu rozcieńczonego kwasu azotowego. Oznaczenia końcowe metali W praktyce analitycznej do oznaczeń metali wykorzystuje się szerokie spektrum tech-nik analitycznych. Jako najważniejsze należy wymienić: - atomową spektrometrię absorpcyjną (w wariancie płomieniowym lub bezpłomienio-

wym; - spektrometrię emisji atomowej; - spektrometrię mas ze wzbudzeniem w indukowanej plazmie; - spektrometrię emisji atomowej ze wzbudzeniem w indukowanej plazmie; - woltamperometrię absorpcyjną; - neutronową analizę aktywacyjną.

Zastosowanie jednej z tych technik analizy uzależnione jest od rodzaju analizo-wanej próbki (efekty przeszkadzające matrycy), od ilości analitu w próbce oraz pożąda-nej dokładności oznaczenia. Przykłady stosowanych technik w celu oznaczenia wybra-nych pierwiastków próbkach płynów biologicznych człowieka przedstawiono w tabeli 5. Tabela 5. Wybrane informacje dotyczące technik oznaczania metali i ich metabolitów w próbkach moczu i krwi ludzkiej

TECHNIKA ROZ-DZIELANIA I/LUB OZNACZEŃ KOŃ-

COWYCH

PRZYGOTOWANIE PRÓBEK DO ANALIZY ANALIT

ŹRÓDŁO LITERATU-

ROWE

Próbki moczu przenoszono do probówek reakcyjnych zawierających 6M HCl, tabletkę środka przeciw pienieniu i wodę

As– jego metabolity: (metylowe pochodne kwa-su arsenowego (V)) [4]

Ewentualne rozcieńczanie prób-ki moczu (kwasem azotowym (V)) przed etapem oznaczeń końcowych

Cr, Cd,Fe, Co, Cu, Mn, Ni, Pb [5,14,15,77]

Współstrącanie przy użyciu wodorotlenku samaru

Cd, Fe, Ni, Co, Pb, Cr, Cu, Mn, [77]

Bi [26] Hg [8,9,78,79] Zn, Cd, Pb [10] Ni,Cd,Cu,Co,Pb [80]

ASA*

Mineralizacja „na mokro”

Pb [81] IC-ASA Próbki moczu rozcieńczano za

pomocą fazy ruchomej wyko-rzystywanej do chromatografii jonowej

As– jego metabolity: (metylowe pochodne kwa-su arsenowego (V)) [12]

Bez wstępnego przygotowania Cd, Ni [7,8] ETASA Mineralizacja „na mokro” z

zastosowaniem mikrofal Bi, Cd, Pb [27]

IC-ETASA Mineralizacja „ na mokro” Pb [82]

Rozdział 28

589

Bi [16] Mineralizacja „ na mokro” Ni [13]

ICP-MS Próbki moczu rozcieńczano wodą w stosunku1:9

Sc, V, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zn [10]

ICP-MS HPLC-MS Bez wstępnego przygotowania

As– jego metabolity: (metylowe pochodne kwa-su arsenowego (V))

[3]

Woltamerometria adsorpcyjna Mineralizacja UV Pt [11]

ASA* – spektrometria absorpcji atomowej; stosowana w wielu wariantach, m.in.: technika płomieniowa, bezpłomieniowa, zimnych par, generowania wodorków Istotną sprawą jest walidacja stosowanych metodyk i technik analitycznych. W przy-padku oznaczania składników nieorganicznych dostępne są odpowiednie materiały odniesienia, co oczywiście ułatwia przeprowadzenie tej operacji. (tabela 6). Tabela 6. Materiały odniesienia, które można wykorzystać w badaniach próbek moczu [1]. MATERIAŁ CERTYFIKOWANA ZAWARTOŚĆ

METALI PRODUCENT

Cu, Se - poziom normalny As, Cd, Cr, Cu, Pb, Hg, Se - poziom podwyższony Hg - poziom normalny F - poziom normalny i podwyższony

NIST SRM 2670 -72

As, Cu, Se, Be, Cd, Cr, Mn, Ni, Pb LGC 91 – 02 -03

Mocz

As, Cu, Se, Be, Cd, Cr, Cu, Mn, Ni, Pb NRCCRM; GBW 09102 - 103 Surowica Cd, Cr, Cu, ,Pb, V NIST 909

Oznaczanie ksenobiotyków organicznych Oznaczenie organicznych zanieczyszczeń w próbkach płynów biologicznych, jak np. w moczu, krwi, mleku czy spermie jest zadaniem trudnym i skomplikowanym ze względu zarówno na: - dużą różnorodność tych związków; - bardzo zróżnicowane poziomy zawartości; - skomplikowaną matrycę płynów biologicznych; - trudności z walidacją stosowanych metodyk (ze względu na brak odpowiednich ma-

teriałów odniesienia) – szczególnie w odniesieniu do składników organicznych. Jedyny dostępny materiał odniesienia dotyczy metabolitów styrenu – kwas migdałowy i kwas fenyloglioksalowy w moczu ludzkim [83]. Coraz większego znaczenia nabierają międzylaboratoryjne (nawet międzynarodowe), porównawcze badania jakości otrzy-mywanych wyników w poszczególnych laboratoriach [84].

Większość opracowanych procedur analitycznych opartych jest na wykorzysta-niu technik chromatograficznych na etapie rozdzielania mieszanin na poszczególne in-dywidua chemiczne. Prowadzenie procesu chromatograficznego wymaga zastosowania przed wprowadzeniem próbki do kolumny chromatografu gazowego, etapu izolacji i/lub wzbogacania odpowiedniej grupy związków z bardzo skomplikowanej matrycy.

Rozdział 28

590

Metody izolacji i/lub wzbogacania związków organicznych z płynów ustrojowych W literaturze można odnaleźć wiele publikacji zawierających informacje o coraz szer-szej gamie związków organicznych, obecnych w różnych elementach środowiska, a co za tym idzie, także w organizmie człowieka. Substancje te często wykazują właściwości toksyczne i – niestety- nie wszystkie zostały dotąd uwzględnione w odpowiednich nor-mach dotyczących jakości poszczególnych komponentów środowiska.

Próbki moczu, krwi, mleka czy spermy wymagają specjalnego przygotowania. Powodem tego jest zbyt złożony skład matrycy próbki płynu biologicznego, niskie po-ziomy stężeń oznaczanych związków oraz niezgodność matrycy próbki ze stosowaną techniką chromatograficzną. Dlatego też anality obecne w próbce przed ostateczną ana-lizą poddaje się procesowi izolacji i/lub wzbogacania. Korzystne jest przy tym, aby pro-ces ten przebiegał jednoetapowo.

Etap przygotowania próbki musi uwzględniać następujące czynniki: - charakter matrycy próbki płynu biologicznego, - sposób wprowadzenia próbki do kolumny chromatograficznej, - warunki prowadzenia procesu chromatograficznego, - charakterystykę wykorzystywanych detektorów (np. granicę oznaczalności). Zdarza się często, że możliwości wyboru określonej metody ograniczone są wielkością analizowanej próbki (krew, sperma, żółć). Jednak przy analizie próbek moczu lub mle-ka matki niedogodność ta zostaje wyeliminowana.

W przypadku analizowania lotnych i średniolotnych związków organicznych naj-lepszym rozwiązaniem jest jednoetapowy proces izolacji i/lub wzbogacania. Wymogi te spełniają techniki umożliwiające przeprowadzenie, zarówno izolacji analitów z matry-cy, jak i ich wzbogacenie w jednym etapie. W praktyce analitycznej najczęściej wyko-rzystuje się techniki izolacji i/lub wzbogacania do fazy gazowej, fazy ciekłej i fazy sta-łej (stacjonarnej), które nadają się w przypadku oznaczania lotnych, średniolotnych i trudnolotnych związków [65]. Przy pomocy żadnej z wymienionych technik nie można oznaczyć dowolnej grupy związków. Dokonując wyboru stosowanej techniki jednocze-śnie zawężeniu ulega zakres i liczba związków, które można oznaczyć. W tabeli 7 ze-stawiono najczęściej stosowane techniki izolacji i wzbogacania analitów z próbek mo-czu.

Rozdział 28

591

Tabela 7. Informacje dotyczące poszczególnych technik izolacji i/lub wzbogacania związków organicznych [63-72,85-86]. TECHNIKA EKSTRAKCJI OPIS

-oparte są na wykorzystaniu zjawiska podziału analitów pomiędzy fazę ciekłą i gazową. Zawartość analitu w próbce w postaci fazy skonden-sowanej określa się analizując fazę nadpowierzchniową – fazę gazową, która jest lub była w kontakcie z analizowaną próbką, najbardziej efektywne uwalnianie z fazy ciekłej jest możliwe dla lotnych, średniolotnych, niepolarnych lub słabo polarnych związków organicznych -obie stykające się ze sobą fazy – wodna (próbka) i gazowa (matryca odbierająca) są nieruchome, proces analizy jest dwuetapowy – badaną próbkę umieszcza się w zamkniętym naczyniu o stałej temperaturze i pobiera do analizy fazę nadpowierzchniową dopiero po osiągnięciu stanu równowagi termodynamicznej, próbkę do analizy pobiera się ręcznie lub automatycznie

Techniki Analizy Fazy Nadpo-wierzchniowej

w układzie statycznym

(HS)

w układzie dynamicznym (TLHS)

-gaz przepuszcza się w sposób ciągły przez próbkę albo nad próbką (współprądowo albo przeciwprądowo), a unoszone z nim anality są za-trzymywane w pułapce z sorbentem (np. woda), technikę tę łączy się często z techniką bezpośredniego nastrzyku próbki (DAI) na kolumnę chromatografu gazowego (GC) wyposażonego w detektor wychwytu elektronów (ECD)

Technika wypłukiwania i jedno-czesnego wychwytywania anali-

tów na stałym sorbencie (PT)

-strumień gazu jest przepuszczany przez analizowaną próbkę ciekłą w postaci drobnych pęcherzyków, wypłukane anality są następnie za-trzymywane na pułapce z której są uwalniane, najczęściej termicznie, do kolumny chromatograficznej, technika ta jest szeroko stosowana do oznaczania lotnych i średniolotnych związków organicznych w różnorodnych matrycach wodnych.

Ekst

rakc

ja

do fa

zy g

azow

ej

Techniki destylacyjne

-wykorzystywane są do izolacji lotnych, bardziej polarnych związków z matryc ciekłych, możliwa jest tu analiza analitów w próbkach o dużej zawartości związków nieorganicznych, wielkocząsteczkowych związków organicznych, które przy stosowaniu innych technik wyma-gają skomplikowanej operacji oczyszczania przed właściwą analizą chromatograficzną; podstawą rozdzielenia mieszaniny na składniki jest zróżnicowany podział poszczególnych składników między fazę ciekłą i pozostającą z nią w równowadze fazę gazową, składniki bardziej lotne ulegają wzbogaceniu w fazie gazowej, która po jej wykropleniu stanowi koncentrat tych składników – destylat

Ekst

rakc

ja

do fa

zy g

a-

Technika ekstrakcji do fazy cie-kłej (LLE)

-zasada izolacji oparta jest na wykorzystaniu zjawiska podziału analizowanych związków pomiędzy organiczny rozpuszczalnik, a fazę ciekłą, do ekstrakcji stosuje się rozpuszczalniki nie mieszające się z wodą (tworzące z nią układ dwufazowy), w których anality rozpuszczają się lepiej niż w wodzie, zastosowanie metody do związków średnio- i trudnolotnych

-polega na przeniesieniu analitów z ciekłej próbki do stałego sorbentu, a następnie ich uwolnieniu metodą ekstrakcji rozpuszczalnikiem o dużej sile elucyjnej lub rzadziej metodą desorpcji termicznej, duży wybór sorbentów stanowiących fazę stałą zapewnia uzyskanie odpowied-niego poziomu selektywności, optymalny stopień wzbogacenia wybranych zanieczyszczeń, typowe sorbenty stosowane do zatrzymania analiów to: grupy polimerów organicznych, w tym kopolimery styrenu i diwinylobenzenu; sorbenty węglowe; żele krzemionkowe z che-micznie związanymi fazami zawierającymi różne grupy funkcyjne, możliwość izolacji i wzbogacania analitów o szerokim spektrum lotności i polarności Ek

stra

kcja

do

fazy

stał

ej Technika ekstrakcji do fazy stałej

(SPE)

Technika mikroekstrakcji do fazy stacjonarnej

( SPME) -w tym przypadku medium sorpcyjne umieszczone jest w postaci cienkiej warstwy na pręciku z topionej krzemionki, zapewnia to transport analitu z próbki do sorbentu i upraszcza wprowadzenie analitów do kolumny chromatograficznej.

Każda z wymienionych technik ma swoje ograniczenia i wady i można ją wykorzystać jedynie w ściśle określonym zakresie. Informacje dotyczące poszczególnych technik zamieszczono również w tabeli 7.

Oznaczanie związków organicznych w próbkach płynów biologicznych Analiza otrzymanych ekstraktów/eluatów obejmuje identyfikację oraz oznaczenie ilo-ściowe poszczególnych składników i jest możliwa do przeprowadzenia gdy zastosuje się odpowiednią technikę chromatograficzną. Wśród szerokiej gamy technik chromato-graficznych do oznaczania organicznych składników płynów biologicznych stosuje się głównie chromatografię gazową (GC) z detektorem specyficznym dla określonej grupy analitów (np. MS, FID, ECD). Rzadziej znajduje zastosowanie wysokosprawna chroma-tografia cieczowa (HPLC) z detektorem fluorescencyjnym. Informacje na temat możli-wości zastosowania powyższych technik do oznaczenia organicznych ksenobiotyków w próbkach moczu i krwi zestawiono w tabeli 8.

Tabela 8. Wybrane informacje dotyczące technik oznaczania ksenobiotyków organicz-nych i ich metabolitów w próbkach moczu, krwi, mleku i spermy ludzkiej

TECHNIKA OZNACZEŃ

KOŃCO-WYCH

PRZYGOTOWANIE PRÓBEK DO ANALIZY ANALIT

ŹRÓDŁO LITERA-TUROWE

CHROMATOGRAFIA GAZOWA dodatek kropli środka przeciw pienie-niu, wysokotemperaturowe (90°C) wy-mywanie z jednoczesnym wychwy-tem analitów (PT)

eter metylowo-tert-butylowy (MTBE) - jego metabolit: alkohol tert-butylowy

[87]

trichloroeten - jego metabolity: kwas trichlorooctowy chloroform trihalometany (THM)

[45-50, 68-69,73] analiza fazy nadpowierzchniowej

(HS)

aldehyd akrylowy [88]

analiza fazy nadpowierzchniowej (HS), ekstrakcja do fazy stałej (SPME)

benzen, toluen, etyloben-zen,ksyleny [89]

hydroliza enzymatyczna, ekstrakcja do fazy stałej (SPE), acylowanie amin aromatycznych*

nitroareny aminy aromatyczne*

[90]

fenole [91

ekstrakcja do fazy stałej (SPE) polichlorowane dibenzodioksy-ny (PCDD), dibenzofurany (PCDF), polichlorowane bife-nyle (PCB)

[92]

polichlorowane bifenyle (PCB) [93] - kwas hipurowy [94] hydroliza kwaśna kwas tiodiglikolowy [95] hydroliza enzymatyczna, ekstrakcja do fazy stałej (SPE)

pochodne monohydroksyowe związków z grupy WWA [96]

mikroekstrakcja do fazy stałej (SPME) toluen (i jego metabolity) [35]

GC-MS

rozcieńczenie próbki, ekstrakcja ciecz-ciecz (LLE) fenol [32]

Rozdział 28

Rozdział 28

593

ekstrakcja ciecz-ciecz (LLE) kwasy merkapturowe [97]

ekstrakcja ciecz-ciecz (LLE) kwas S-p-toluilomerkapturowy o-krezol kwas hipurowy

[39]

hydroliza, ekstrakcja ciecz-ciecz (LLE), ekstrakcja do fazy stałej (SPE),

o-krezol 1-naftol 2-naftol

[98]

ekstrakcja ciecz-ciecz (LLE) sałe zanieczyszczenia organicz-ne (PCB, pestycydy)

[99]

ekstrakcja ciecz-ciecz (LLE), estryfikacja

kwas (2-metoksyetoksy)octowy (MEAA) [100]

hydroliza kwaśna, hydroliza zasadowa, analiza fazy nadpowierzchniowej (HS)

4 –heptanon trimetyloamina [101]

pułapka kriogeniczna toluen, trichloroetylen, n-heksan [102]

ekstrakcja do fazy stałej (SPE) polichlorowane bifenyle (PCB) [52,103] chlorowane pestycydy [62] - krezole [94]

hydroliza enzymatyczna etanol, aldehyd, aceton,2,3-butanodiol [104]

ekstrakcja ciecz-ciecz (LLE), ekstrakcja do fazy stałej (SPE)

pochodne chloro- i metylotio-triazyn [105]

derywatyzacja, hydroliza kwaśna, ekstrakcja ciecz-ciecz (LLE)

2,5-heksanedione [102]

trichloroetylen, trichloroetanol, kwas trichlorooctowy [106]

tetrachloroeten, kwas trichlo-rooctowy 107

GC-ECD

analiza fazy nadpowierzchniowej (HS)

tetrachloroeten, trichloroeten [108] metanol, kwas mrówkowy [37]

dichlorometan [44] alkohol etylowy [109]

toluen, ksyleny [94,110, 111]

toluen, heksan, ksyleny, etylobenzen, styren, metanol

[112]

trimetylobenzen, kwas dimetylobenzoesowy [113]

analiza fazy nadpowierzchniowej (HS)

benzen, etylobenzen, styren, toluen, m-ksylen, n-heksan hemimeliten, mezytylen, pseu-dokumen

[108]

GC-FID

wymywanie z jednoczesnym wy-chwytem analitów (PT)

styren (i jego metabolity) [52]

mikroekstrakcja do fazy stałej (SPME)

toluen [35]

GC-FMD hydroliza kwaśna ekstrakcja ciecz-ciecz (LLE) hydrochinon [114]

Rozdział 28

594

1-butanol 1,1,1 - trichloroetan kwas trichlorooctowy trichloroetanol metanol kwas mrówkowy toluen

[115]

toluen, heksan octan etylu [116]

toluen, styren metanol

[117-119,127]

analiza fazy nadpowierzchniowej (HS)

ksylen [120,121] - (o-, m-, p-)ksyleny [122]

o-krezol [123] - trichloroetanol, kwas trichloro-

octowy [102]

GC

hydroliza kwaśna, sililacja kwas m-metylohipurowy [121

CHROMATOGRAFIA CIECZOWA ekstrakcja ciecz-ciecz (LLE) diuretyki [124] LC-MS hydroliza kwaśna 1-hydroksypiren [125]

LC-MS/MS - hydrochinon katechol

LC-ES-MS/MS

- kwas S-metylomerkapturowy

kwas trans, trans-mukonowy

[30]

zakwaszenie próbki, ekstrakcja ciecz-ciecz (LLE)

kwas S-fenylomerkapturowy [38]

ekstrakcja do fazy stałej (SPE), wymiana jonowa

kwas trans, trans-mukonowy [38]

zakwaszenie, ekstrakcja ciecz-ciecz (LLE)

kwasy hipurowe (orto-, meta-, para-)

- kwasy metylohipurowe (orto-, meta-, para-)

[111]

ekstrakcja ciecz-ciecz (LLE) kwas migdałowy [97]

- kwasy metylohipurowe (orto-, meta-, para-) [126]

HPLC-UV

ekstrakcja do fazy stałej (SPE) kwas trans, trans-mukonowy [114]

- kwas migdałowy, kwas fenyloglioksalowy [83]

HPLC-UV-VIS

zakwaszenie, ekstrakcja ciecz-ciecz (LLE) kwas benzylomerkapturowy [127]

- hydroliza enzymatyczna, ekstrakcja do fazy stałej (SPE)

1-hydroksypiren [128-130]

hydroliza enzymatyczna [40]

hydroliza enzymatyczna ekstrakcja do fazy stałej (SPE)

suma związków z grupy WWA [96]

HPLC-FSD

ekstrakcja ciecz-ciecz (LLE) 17 lekarstw moczopędnych (diuretyków) [131]

HPLC-FID 1-hydroksypiren [132] kwas migdałowy [133]

kwas hipurowy, o-krezol [102,119,134] HPLC -

kwasy hipurowe (orto-, meta-, para-)

[122,123]

Rozdział 28

595

SPEKTROFOTOMETRIA Oznaczenie spektrofoto-metryczne

chromatografia cienkowarstwowa kwas metylohipurowy [98]

5. ZASADY INTERPRETACJI WYNIKÓW Zgodnie z definicją monitoring biologiczny jest to „systematyczny pomiar stężeń sub-stancji toksycznych lub ich metabolitów w tkankach, wydzielinach lub wydalinach, oddzielnie lub łącznie, mający na celu ocenę wielkości narażenia oraz ryzyka dla zdro-wia przy przyjęciu za podstawę odpowiednich danych interpretacyjnych”[1]. W tym przypadku wartościami umożliwiającymi interpretację wyników oznaczeń analitów są wartości dopuszczalnych stężeń w materiale biologicznym (DSB). W większości krajów stosowanie badań z zakresu monitoringu biologicznego posiada charakter fakultatywny. Monitoring biologiczny może być wykorzystywany do oceny narażenia, tak w warunkach ekspozycji komunalnej, jak i ekspozycji zawodowej. W związku z tym istnieją odpowiednie wartości referencyjne, które w populacji gene-ralnej mogą wykazywać istotne różnice w zależności od stopnia skażenia środowiska, diety, palenia papierosów. Systematyczne wykonywanie oznaczeń, np. ołowiu we krwi pozwala jednak na śledzenie trendów i wyciąganie wniosków na temat potencjalnego zagrożenia populacji na danym terenie oraz czynników, które te zagrożenia powodują. Dane na temat dopuszczalnych w warunkach ekspozycji przemysłowej stężeń substancji toksycznych lub produktów ich przemiany, a także wartości wczesnych, odwracalnych efektów działania, są publikowane w postaci zaleceń przez różne organizacje międzyna-rodowe oraz instytucje odpowiedzialne za bezpieczne warunki pracy w poszczególnych krajach. Powszechnie uznanymi organizacjami publikującymi listy wartości DSB oparte na dokumentacjach naukowych są American Conference of Governmental Industrial Hygienists oraz niemiecka Deutsche Forschungsgemeinschaft. Listy wartości DSB są przez te organizacje systematycznie uzupełniane i publikowane corocznie. Generalnie te wartości mogą być uzyskiwane na podstawie kryteriów zdrowotnych i umożliwiać bez-pośrednią ocenę ryzyka wystąpienia skutków narażenia na czynniki toksyczne lub jako odpowiedniki wartości najwyższych stężeń substancji toksycznych w powietrzu (NDS) [1]. LITERATURA [1.] Monitoring biologiczny narażenia na czynniki chemiczne w środowisku pracy, [red] Jakubowski

M., IMP, Łódź 1997 [2.] Dutkiewicz C., Andryszek C., Kończalik J., Murowaniecki Z., Rachański D., Rolecki R., Wasiela

T., Ocena zagrożeń środowiskowych i zdrowotnych w dużych obszarach geograficznych, IMP, Łódź 1997

[3.] Apostoli P., Bartoli D., Alessio L., Buchet J. P., Occup. Environ. Med., 56, 825 (1999) [4.] Ng J. C., Johnsona D., Imrayb P., Chiswell B., Moore M.R., Analyst, 123, 929 (1998) [5.] Gianello G., Masci O., Carelli G., Vinci F., Castellino N., Ind. Health, 36, 74 (1998) [6.] Mason H.J., Williams N., Armitage S., Morgan M., Green S., Perrin B., Morgan W.D., Occup.

Environ. Med., 56, 553 (1999) [7.] Odland J. Ø., Nieboer E., Romanova N., Thomassen Y., Norseth T., Lund E., J. Environ. Monit., 1,

153 (1999) [8.] Santa Rosa R.M.S., Müller R.C.S., Alves C.N., De S. Sarkis J.E., De S. Bentes M. H., Brabo E., De

Oliveira E. S., Sci. Total. Environ., 261, 169 (2000)

Rozdział 28

596

[9.] Barregård L., J. Work. Environ. Health; 19, 45 (1993) [10.] Karakaya A., Z Karaaslan., Y Duydu., Yücesoy B., Oflaz G., Köse K., Biomarkers, 6, 351 (2001) [11.] Schierl R., Microchem. J., 67, 245 (2000) [12.] Heinrich-Ramm R., Minut-Prüfert S., Szadkowski D., J. Hyg. Environ. Health, 203, 475 (2001) [13.] Wang J., Hansen E.H., Anal. Chim. Acta, 424, 223 (2000) [14.] Petersen R., Thomsen J.F., Jørgensen N. K., Mikkelsen S., Occup. Environ. Med., 57, 140 (2000) [15.] Elis A., Forom P., Ninio A., Cahana L., Liszner M., J. Occup. Environ. Health, 7, 206 (2001) [16.] Wang J., Hansen E. H., At. Spectrosc., 22, 312 (2001) [17.] Bárány E., Bergdahl I. A., Lundh T., Samuelson G., Schütz A., Skerfving S., Oskarsson A., Envi-

ron. Res. Sec. A., 89, 72 (2002) [18.] Wella Herr C. E., Jankofsky M., Angerer J., Küster W., N Stilianakis. I., Gieler U., Eikmann T., J.

Exp. Anal. Environ. Epidemiol., 13, 24 (2003) [19.] Le X. C., Arsenic speciation in the environment and humans in: Environmental Chemistry of Arse-

nic, M. Dekker, Inc, New York 2001, 95 [20.] Spěváčková V., Čejchanová M., Černá M., Spěváček V., Šmĭd J., Beneš B., J. Environ. Monit., 4,

796 (2002) [21.] Hinwood A.L., Sim M. R., De Klerk N., Drummer O., Gerostamoulos J., Bastone E. B., Environ.

Res. Sec. A., 88, 219 (2002) [22.] Vahter M., Åkesson A., Lind B., Björs U., Schütz A., Berglund M., Environ. Res. Sec. A., 84, 186

(2000) [23.] Sirivarasai J., Kaojaren S., Wananukul W., Srisomerang P., , Southeast Asian J. Trop. Med. Public

Health, 33, 180 (2002) [24.] Süzen H.S., Duydu Y., Aydın A., Isımer A., Vural N., Am. J. Ind. Med., 43, 165 (2003) [25.] Czarnowski W., Hać E., Krechniak J., Pol. J. Environ, Stud., 12, 357 (2003) [26.] Cadore S., Dos Anjos Aparecida P., Baccan N., Analyst, 123, 1717 (1998) [27.] Sung Y-H., Huang S-D., Anal. Chim. Acta, 495, 165 (2003) [28.] Qu Q., Melikian A. A., G. Li, Shore R., Chen L., Cohen B., Yin S., Kagan M. K., Li H., Meng M.,

Jin X., Winnik W., Y Li., Mu R., Li K., Am. J. Ind. Med., 37, 522 (2000) [29.] Perbellini L., Pasini F., Romani S, Princivalle A, Brugone F., J. Chromatogr. B, 778, 199 (2002) [30.] Melikian A.A., Qu Q., Shore R., Li G., Shore R., li G., Li H., Jin X., Cohen B., Chen L., Li Y.,

Yin S., Mu R., Zhang X., Wang Y., J. Chromatogr. B, 788, 211 (2002) [31.] Rothman N., Bechtold W. E., Yin S-N., Dosemeci M., Li G-L., Wang Y-Z., Griffith W. C., Smith

M. T., Hayes R. B., Occup. Environ. Med., 55, 705 (1998) [32.] Jacob J., Seidel A., J. Chromatogr. B, 788, 31 (2002) [33.] Viau C., Diakité A., Ruzgyté., Tuchweber B., Blais Ch., Buchard M., Vyskocil A., J. Chromatogr.

B, 788, 165 (2002) [34.] Fustinoni S., Buratti M., Giampiccolo R., Brambilla G., Foà V., Colombi A., Int. Arch. Occup.

Environ. Health, 73, 389 (2000) [35.] Passarelli M.M., Poalielo M.M.B., Matuo T., Turin C.A., Nascimento E.S., Sci. Total. Environ.,

243/244, 349 (1999) [36.] Berode M., Sethre T., Läubli T., Savolainen H., Arch. Occup. Environ. Health, 73, 410 (2000) [37.] Fang M. Z., Shin M. K., Park K. W., Kim Y. S., Lee J. W., Cho M. H., J. Work Environ Health, 26,

62 (2000) [38.] Angerer J., Schildbach M., Krämer A., Arch. Toxicol., 72,119 (1998) [39.] Hara K., Hanaoka T., Yamano Y., Pan G., Ichiba M. Y., Wang Y., Zhang J., Feng Y., Guan D.,

Gao G., Xu Z., Takahashi K., Itani T., Nagoya Med. J., 42,157 (1998) [40.] Carrer P., Maroni M., cavallo D., Visetin S., Cecchetti G., Mangani F., Piovano G., Iachetta R.,

Med. Lav., 92, 314 (2001) [41.] Indulski J., Lutz W., Krajewska B., Biomarkery zagrożeń zdrowotnych osób zamieszkujących ob-

szary o wysokim stopniu skażenia kancerogennymi substancjami chemicznycmi, IMP, Łódź 1996

Rozdział 28

597

[42.] Kostrzewski P., Gromiec J. P., Zalecenia metodyczne do oceny środowiska pracy w przypadku ekspozycji na rozpuszczalniki organiczne wchłaniane drogą inhalacyjną i przez skórę, IMP, Łódź 2000

[43.] Sakai T., Morita T., Wakui Ch., J. Chromatogr. B., 778, 245 (2002) [44.] Nakahama T., Fukuhara M., Inouye Y., J.J. Toxicol. Environ. Health, 43, 280 (1997) [45.] Imbriani M., Niu Q., Negri S., Ghittori S., Ind. Health, 2001, 39, 225-230 [46.] Aggazzotti G., Fantuzzi G., Righi E., Predieri G., J Chromatogr. A., 710, 181 (1995) [47.] Aggazzotti G., Fantuzzi G., Righi E., Predieri G., Sci. Total. Environ., 217, 155 (1998) [48.] Polkowska Ż., Górecki T., Namieśnik J., Occup. Environ. Hyg, 14, 240 (1999) [49.] Polkowska Ż., Górecki T., Namieśnik J., Am. Clin. Lab., 9, 38 (2001) [50.] Horański M., Badanie krwi, Żyjmy dłużej, 8, 4 (1999) [51.] Prieto M.J., Berenguer V, Marhuenda D., Cardona A., J. Chromatogr. B, 741, 301 (2000) [52.] Gabrio T., Piechotowski I., Wallenhorst T., Klett M., Cott L., Friebel P., Link B., Schwenk M.,

Chempsphere, 40 1051 (2000) [53.] Brandys J., Toksykologia, Wydawnictwo Uniwersytetu Jagiellońskiego, Kraków 1999 [54.] Bogdanik T., Toksykologia kliniczna, PZWL, Warszawa 1988 [55.] Norén K., Meironyté D., Chempsphere, 40 1111 (2000) [56.] Schecter A., Kassis I., Päpke O., Chempsphere, 37 1817 (1998) [57.] Thomsen C., Småstuen Haug L., Leknes H., Lundanes E., Becher G., Lindström G., Chempsphere,

46 641 (2002) [58.] Kabata – Pendias A., Pendias H., Pierwiastki śladowe w środowisku biologicznym, WG, Warszawa

1979 [59.] Pflieger-Bruss S., Hanf,V. Behnisch P., Hagenmaier H., Rune G.M., The Lancet, 346 1040 (1995) [60.] Gaspari L., Chang S-S., Santella R.M., Garte S., Pedotti P., Taioli E., Mut. Res/Genetic Toxicol.

Environ. Mutagenesis, 535 155 (2003) [61.] Naccarati A., Zanello A., Landi S., Consigli R., Migliore L., Mut. Res/Genetic Toxicol. Environ.

Mutagenesis, 537 131 (2003) [62.] Polder A., J. Odland Ø., Tkachev A., Føreid S., T. Savinova N., Skaare J. U., Sci. Tot. Environ.,

306 179 (2003) [63.] Namieśnik J.., Jamrógiewicz Z., Pilarczyk M., Torres L., Przygotowanie próbek środowiskowych

do analizy, WNT, Warszawa 2000 [64.] Zygmunt B., Zeszyty Naukowe Politechniki Gdańskiej, Chemia XXXVII, Gdańsk, 3 (1997) [65.] Staniszewska M., Opracowanie „bezrozpuszczalnikowych” metodyk jednoczesnego oznaczania

szerokiej gamy lotnych i średniolotnych związków organicznych w próbkach wody, Praca doktor-ska, Wydział Chemiczny Politechniki Gdańskiej, Gdańsk, 2000

[66.] Namieśnik J., Górecki T., Biziuk M., Anal. Chim. Acta, 1990, 237, 1-60 [67.] Kozłowski E., Sieńkowska-Zyskowska E., Biziuk M., Chem. Anal., 28: 817 (1983) [68.] Kozłowski E., Polkowska Ż., Chem. Anal., 41, 173 (1996) [69.] Polkowska Ż., Kozłowski E., Chem. Anal., 41, 183 (1996) [70.] Polkowska Ż., Namieśnik J., Czerwiński J., Zygmunt B., Int. J. Food Sci. Technol., 31, 387 (1996) [71.] Biziuk M., Zeszyty Naukowe Politechniki Gdańskiej, Chemia 31/513, Politechnika Gdańska,

Gdańsk 1994 [72.] Polkowska Ż., Oznaczanie śladów lotnych związków organicznych w próbkach ciekłych uwalnia-

nych i wzbogacanych techniką analizy fazy nadpowierzchniowej nad cienką warstwą cieczy, Roz-prawa doktorska, Wydział Chemiczny Politechniki Gdańskiej, Gdańsk 1996

[73.] Polkowska Ż., Kozłowska K., Górecki T., Namieśnik J., Chemosphere, 53, 899 (2003) [74.] Kozłowska K., Polkowska Ż., Namieśnik J., Chem. Inż. Ekol., 10, 7 (2003) [75.] Kozłowska K., Polkowska Ż., Przyjazny A., Namieśnik J., Pol. J. Environ. Stud., 5, 503 (2003) [76.] Kościelniak P., Piekoszewski., Chemia sądowa, WIES, Kraków 2002 [77.] Saracoglu S., Soylak M., Elci L., Talanta, 59 287 (2003)

Rozdział 28

598

[78.] Vamnes J. S., Eide R., Isrenn R., Höl P. J., Gjerdet N. R., Sci. Total. Environ., 308 63 (2003) [79.] Río Segade S., Tyson J. F., Spectrochim. Acta, Part B, 58 797 (2003) [80.] Narin I., Soylak M., Anal. Chim. Acta, 493 205 (2003) [81.] Lin J-L. Tan D-T., Ho H-H., Yu Ch-Ch., Am. J. Med. 113 563 (2002) [82.] Parsons P. J., Geraghty C., Verostek M. F., An assessment of contemporary atomic spectroscopic

techniques for the determination of lead in blood and urine matrices, Spectrochim. Acta, Part B, 56 (2002) 1593-1604

[83.] Sperlingova I., Dabrowska L., Stransky V., Kucera J., Tichy M., Accred. Qual. Assur., 8, 113 (2003)

[84.] Heinrich-Ramm R., Jakubowski B., Heinzow J., Molin Christensen J., Olsen E., Hertel O., Pure Appl. Chem., 72, 385 (2000)

[85.] Namieśnik J., Zygmunt B., Biziuk M., Wiergowski M., Torres L., Pol. J. Environ. Stud., 5, 5 (1996)

[86.] Kuran P., Sojak L., J. Chromatogr. A, 733, 119 (1996) [87.] Lee Ch-W., Weisel C. P., J. Anal. Toxic., 22, 1 (1998) [88.] Sakra N., Nishimura S., Fujita N., Namera A., Yashiki M., Kojami T., J. Chromatogr. B, 719, 209

(1998) [89.] Fustinoni S., Giampiccolo R., Pulvirenti S., Buratti M., Colombi A., J.Chromatogr. B, 723, 105

(1999) [90.] Grimmer G., Dettbarn G., Seidel A., Jacob J., Sci. Total. Environ., 247, 81 (2000) [91.] Crespín M.A., Gallego M., Valcarcel M., J. Chromatogr. B, 773, 89 (2002) [92.] Gonzalez C., Kogevinas M., Huici A., Gadea E., Ladona M., Bosch A., Bleda MJ., Chemosphere,

36, 419 (1998) [93.] Juan C-Y., Thomas G.O., Semple K.T., Jones K.C., Chemosphere, 39 1467(1999) [94.] Pierce C. H., Chen Y., Dills R. L., Kalman D. A., Morgan M. S., Toxicol. Lett., 129, 65 (2002) [95.] Cheng T-J., Huang Y-F., Ma Y-Ch., JOEM., 247, 81 (2000) [96.] Smith Ch. J., Huang W., Walcott Ch. J., Tuner W., Grainger J., Patterson D. G. Jr., Anal. Bioanal.

Chem., 372, 216 (2002) [97.] Truchon G., Begin D., Lesage J., Goldberg M., Talbot D., Drolet D., Gerin M., J. Occup. Health,

40, 350 (1998) [98.] Bieniek G., Am. J. Ind. Med., 34, 445 (1998) [99.] Sandanger T. M., Odland J. Ø., Tkachev A., Burkow I. C., Sci. Total. Environ., 306 171 (2003) [100.] B’Hymer C., Cheever K.L, Butler M.A., Brown K.K., J. Chromatogr. B, 795, 145 (2003) [101.] Wahl H. G., Hoffmann A., Luft D., Liebich H. M., J. Chromatogr. A, 847, 117 (1999) [102.] Baelum J., Molhave L., S Hansen. H., Vaeth M., Scand. J. Work Environ. Health, 24, 30 (1998) [103.] Janák K., Jensen E., Becher G., J. Chromatogr. B, 734, 219 (1999) [104.] Otsuka M., Harada N., Itabashi T., Ohmori S., Alcohol, 17, 119 (1999) [105.] Mendaš G., Tkalčević B., Drevenkar V., Anal. Chim. Acta, 424, 7 (2000) [106.] Christensen J. M., Rasmussen K., Koppen B., J. Chromatogr., 442, 317 (1988) [107.] Furuki K., Ukai H., Okamoto S., Takada S., Kawai T., K., Miyama Y., Mitsuyoshi K., Zhang

Z. W., Higashikawa K., Ikeda M., Int. Arch. Occup. Environ. Health, 73, 221(2000) [108.] Kostrzewski P., Medycyna Pracy, XLIV, 131-139 (1993) [109.] Corrêa C.L., Pedroso R. C., J. Chromatogr. B, 704 365 (1997) [110.] Takeuchi A., Kawai T., Zhang Z.-W., Miyama Y., Sakamoto K., Higashikawa K., Ikeda M., Int.

Arch. Occup. Environ. Health, 75, 387 (2002) [111.] Kramer A., Linnert M. Jr, Wrbitzky R., Angerer J., Int. Arch. Occup. Environ. Health, 72, 52

(1999) [112.] Kawai T., Yasugi T., Mizunuma K., Horiguchi S., Iguchi H., Uchida Y., Int. Arch. Occup. En-

viron. Health, 64, 223 (1992) [113.] Kostrzewski P., Wiaderna-Brycht A., Czerski B., Sci. Total. Environ., 199, 73 (1997)

Rozdział 28

599

[114.] Kouniali A., Cicolella A., Gonzalez-Flesca N., Dujardin R., Gehanno J-F., Bois F. Y., Sci. To-tal. Environ., 308 73 (2003)

[115.] Ikeda M., Toxicol. Lett., 108, 99 (1999) [116.] Kawai T., Yasugi T., Mizunuma K., Horiguchi S., Ikeda M., Toxicol. Lett., 63, 333 (1992) [117.] Carlsson A., Scand. J. Work Environ. Health, 8, 43 (1982) [118.] Brugnone F., Gobbi M., Ayyad K., Giuliari C., Cerpelloni M., Perbellini L., Int. Arch. Occup.

Environ. Health, 66, 421 (1995) [119.] Kawai T., Mizunuma K., T Yasugi., Horiguchi S., Ikeda M., Int. Arch. Occup. Environ. Health,

66, 309 (1994) [120.] Engstrom K., Husman K., Pfaffli P., Riihimaki V., Scand. J. Work Environ. Health, 4, 114

(1978) [121.] Engstrom K., Husman K., Riihimaki V., Int. Arch. Occup. Environ. Health, 39, 181 (1977) [122.] Jonai H., Sato M., Ind. Health, 26, 197 (1988) [123.] Ng T. P., Ong S. G., Lam W. K., Jones M. G., Cheung C. K., Ong C. N., Int. Arch. Occup.

Environ. Health, 62, 43 (1990) [124.] Qin Y., Wang X.B., Wang C., Zhao M., Wu M.T., Xu Y.X., Peng S.Q., J. Chromatogr. B, 794,

193 (2003) [125.] Holm A., Molander P., Lundanes E., Øvrebø S., Greibokk T., J. Chromatogr. B, 794, 175

(2003) [126.] Kawai T., Mizunuma K., Yasugi T., Horiguchi S., Uchida Y., Iwami O., Iguchi H., Ikeda M.,

Int. Arch. Occup. Environ. Health, 63, 69 (1991) [127.] Inoue O., Kanno E., Yusa T., Kakizaki M., Ukai H., Okamoto S., Higashikawa K., Ikeda M.,

Int. Arch. Occup. Environ. Health, 75, 341 (2002) [128.] Karahalil B., Burgaz S., G Fisek., Karakaya A.E., Genet. Toxicol. Environ. Mutagen., Mutat.

Res., 412, 261 (1998) [129.] Li H., Krieger R. I., Li Q. X., Sci. Total. Environ., 257, 147 (2000) [130.] Lafontaine M., Payan J. P., Delsaut P., Morele Y., Ann. Occup. Hyg., 44, 89 (2000) [131.] Guchelaar H-J., Chandr L., Schouten O., Van den Brand W. A., Fresenius J. Anal.Chem., 363,

700 (1999) [132.] Heudorf U., Angerer J., Umweltmed Forsch Prax, 5, 218 (2000) [133.] Inaoka T., Nagano M., Kitano T., Ushijima K., Minamoto K., Tasaki R., Koyanagi A., J.

Occup. Health., 44, 83 (2001) [134.] Baelum J., Int. Arch. Occup. Environ. Health, 62, 59 (1990)