RUOLO DEI BIOSENSORI NEL CONTROLLO DI QUALITÀ DEGLI …old.iss.it/binary/cnra/cont/CONTAMINANTI CHIMICI... · miele, bevande alcoliche e analcoliche, succhi di frutta Analiti primari:

RUOLO DEI BIOSENSORI NEL CONTROLLO DI

QUALITÀ DEGLI ALIMENTI

G.E. Pellegrini, G. Carpico, M. Guidotti

Reparto Contaminanti ChimiciCNQRA - ISS

G.E. Pellegrini, G. Carpico, M. Guidotti FOCUS SU SICUREZZA D’USO E NUTRIZIONALE DEGLI ALIMENTI

Roma, 21- 22 Nov. 2005

CONTROLLO DEGLI ALIMENTI

ANALISI

ChimicheFisiche Microbiologiche

Informazioni sulle caratteristiche qualitative e nutrizionali, sulla sicurezza e sullo stato di conservazione di un alimento

Cromatografia, Spettrofotometria, Elettroforesi, Titolazioni e altro

Richiedeono tempi lunghi, trattamento dei campioni, e soprattutto non adatte al controllo in linea


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I biosensori si presentano come una sintesi tecnologica di biologia, fisica e chimica, combinando così i vantaggi

della specificità dei sistemi biologici con la risposta quantitativa e veloce degli strumenti elettronici.

Definizione: un biosensore è un dispositivo analitico che utilizza un mediatore biologico sensibile per rilevare selettivamente e con alta sensibilità, analiti chimici o biologici, senza la necessità di un complesso pretrattamento del campione. Ciò viene solitamente ottenuto accoppiando il mediatore biologico sensibile ad un opportuno sistema di trasduzione, il quale converte la risposta biochimica in un segnale fisico quantificabile e processabile.


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CAMPI DI APPLICAZIONE DEI BIOSENSORI

AMBIENTALE

BIOMEDICO

BIOTECNOLOGICO

FARMACEUTICO

ALIMENTARE

nutrienti, conservanti, coloranti, dolcificanti, contaminanti chimici e biologici, residui di farmaci veterinari e di fitofarmaci, monitoraggio di processi, controllo di qualità.


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Biosensore

Mediatore biologico sensibile

Analita SegnaleTrasduttoreIntesità di correntePotenzialeConducibilitàAssorbanza

Temperatura

Frequenza

Frequenza di vibrazione

Microrganismi, Oligonucleoti, Metaboliti, Antigeni, Anticorpi, Proteine, Enzimi, Ioni, Gas

Elettrochimico

Ottico

Calorimetrico

Acustico

Piezoelettrico

MicrorganismiRecettoriAnticorpiAntigeniEnzimiTessutiOligonucleotidi


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ClassificazioneClassificazione dei Biosensoridei Biosensori

In base al mediatore

- biocatalitici o sensori enzimatici

- chemorecettoriali o sensori a recettore

- immunologici o immunosensori In base al trasduttore- biosensori elettrochimici - biosensori ottici o bio-optrodi; - biosensori calorimetrici o biotermistori; - biosensori acustici

conduttometrici impedometrici potenziometrici amperometrici


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TRASDUTTORI E CAMPI DI APPLICAZIONE

elettrodo ione selettivo (ISE)

elettrodo a O2

elettrodo a H2O2

Glutammato, urea, aminoacidi, penicillina, DNA, RNA, glucosio, colesterolo, alcoli, amigdalina.

Glucosio, solfito, glutammato, etanolo, ossalato, L-aminoacidi, saccarosio, lattato, colesterolo, aspartame, nucleotidi, galattosio, acido acetico, BOD.

Solfito, glucosio, colesterolo, glutammato, nucleotidi, putrescina, cadaverina, istamina, L-aminoacidi, aspartame, lattato, glutamina, alcoli, ecc.


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TRASDUTTORI E CAMPI DI APPLICAZIONEAcetaldeide, alanina, malato, lattato, nitrato, glucosio, glicerolo, etanolo, xilitolo, isocitrato, glutammato, sorbitolo, galattosio

sistemi ottici

piezoelettrico

calorimetrico

ISFET

Glucosio, atrazina, propazina, Salmonella, Escherichia coli, Candida, altri microrganismi e tossine microbiche

Acido ascorbico, glucosio, lattato, trigliceridi, colesterolo, galattosio, etanolo, saccarosio, penicillina G, ossalato, lipidi, xantina e ipoxantina

Glucosio, lattato, urea e diversi ioni


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Teoria e funzionamentoIl biosensore utilizzato impiega un trasduttore potenziometrico non invasivo a diffusione gassosa per ladeterminazione del biossido di carbonio, mediante il quale viene misurata l'attività respiratoria di cellule microbiche, in presenza e in assenza di sostanze ad attivitàantimicrobica. Il sistema impiega cellule non immobilizzate.

E = E° + k · log (yco2))


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TRASDUTTORE POTENZIOMETRICO

(A) elettrodo indicatore

(B) uscita gas trasportatore

(C) ingresso gas trasportatore

(D) elettrodo di riferimento

(E) soluzione elettrolitica

(F) sonda campionatrice


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Sistema analitico

Cellule non immobilizzate

Non invasivo

Gas di trasporto, CG; valvola elettromagnetica, EV; trasduttore elettrochimico, HyBS; celle di analisi, X; cella di riferimento, R; flussimetro, FM; multimetro, M; sistema di acquisizione ed elaborazione dati, PC.


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Applicazioni del biosensore potenziometrico nel settore alimentare

Matrici: latte, vino, birra, acque minerali, miele, bevande alcoliche e analcoliche, succhi di frutta

Analiti primari: CO2 - O2 - NO2 - HCl - H2O - NH3 - SO2

Analiti secondari: residui di farmaci antibatterici, metalli pesanti, VOC, VIC, composti aromatici, anidride solforosa, ammoniaca, nitrati e nitriti


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Esempi di ModalitEsempi di Modalitàà OperativeOperative

∆Ε (mV)

Sono state vagliate due diverse modalità operative: flumechina

(100 µg kg-1) controllo (E. coli )

la seconda basata sulla variazione della velocità di produzione di CO2 da parte delle cellule, dovuta alla presenza dell’inibente.

la prima basata sulla riduzione dell’attivitàrespiratoria delle cellule dopo incubazione con la sostanza inibente.

0

2

4

6

8

10

0 60 120 180 240 300

time (min)

∆Ε (m

V)

E. coli

Penicillina (4ppm)

Penicillina (4ppm + Pasi)

time (min)


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Percentuali di inibizione

PENICILLINE Ampicillina -65 Penicillina G -67 Amoxicillina -69 Cloxacillina

-69

AMINOGLICOSIDI Streptomicina -51 Neomicina -52 Gentamicina -54 Spectinomicina -49

MACROLIDI Eritromicina -55 Tilosina -59 Spiramicina -57 Tilmicosina

-55

SULFAMIDICI Sulfadiazina -63 Sulfadimetossina -67 Sulfatiazolo -66 Sulfametazina -70

Microrganismo utilizzato: Bacillus stearothermophilus var. calidolactis


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Percentuali di inibizione

Tetraciclina -49Ossitetraciclina -48Clortetraciclina -53

Norflossacina -49Ciproflossacina -68Enroflossacina -59Flumechina -78Acido nalidixico -52Marboflossacina -77Danoflossacina -64

TETRACICLINE

Microrganismo utilizzato:Escherichia coli

CHINOLONI


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PERCENTUALI DI INIBIZIONE

Cadmio -33

Mercurio -41

Piombo -36

METALLI PESANTI

Microrganismo utilizzato:Saccharomyces cerevisiae


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ALCUNI ESEMPI DI APPLICAZIONI SUI CONTAMINANTI CHIMICI

Metodi messi a punto:• Metodo di screening per la determinazione di

antibatterici nel latte• Metodi di screening per la determinazione di metalli

pesanti in matrici alimentari liquide

Metodi in prova:• Metodo di screening per la determinazione di

antibiotici nel miele• Metodo di post-screening per la determinazione di

antibiotici nel latte


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VANTAGGI E LIMITAZIONI• Economico• Breve tempo di analisi• Buona precisione e sensibilità• Ampio range di linearità• Elevato rapporto s/r e s/d• Piccola quantità di campione• Nessun trattamento del

campione• Possibilità di seguire in continuo

i processi• Impiego di un elettrodo non

invasivo• Non richiede immobilizzazione

dei microrganismi• Possibilità di impiego in matrici

solide• Non soggetto a inibizione da

accumulo di CO2

• La specificità dipendente dal microrganismo impiegato

• Il segnale elettrico può essere influenzato da variazioni di temperatura e pressione atmosferica

• Il rumore risente dell’effetto dei campi elettrici

• La stabilità del segnale richiede la formazione di uno strato di ossido

• il raggiungimento e la stabilità della linea di base si ottengono in circa 30 minuti


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ConclusioniLa tecnologia dei sensori chimici e dei biosensori è in grado di soddisfare importanti requisiti necessari al monitoraggio di bioprocessi, grazie a sensibilità, selettività, velocità di risposta, compattezza e facilità d'uso dei sensori stessi.

Tali caratteristiche peraltro, ben si prestano a soddisfare i nuovi criteri della normativa europea in tema di sicurezza alimentare che ha introdotto l’autocontrollo mediante sistema HACCP durante tutte le fasi di produzione degli alimenti.

Da qui la necessità di controlli in linea e monitoraggi durante i cicli di produzione mediante metodi semplici, rapidi, specifici e a basso costo come quelli basati sui biosensori.


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