Upload
others
View
11
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
UNIVERZITET U NIŠU PRIRODNO - MATEMATIČKI FAKULTET
DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU
Sanja Ničić
Uticaj etarskog ulja ruzmarina (Rosmarinus officinalis L.) na rast Salmonella enterica subsp.
enteritidis u mesu
MASTER RAD
Niš, 2015
UNIVERZITET U NIŠU PRIRODNO - MATEMATIČKI FAKULTET
DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU
Uticaj etarskog ulja ruzmarina (Rosmarinus officinalis L.) na rast Salmonella enterica subsp.
enteritidis u mesu
MASTER RAD Kandidat: Mentor: Sanja Ničić dr Zorica Stojanović-Radić Broj indeksa: 120
Niš, 2015
UNIVERSITY OF NIŠFACULTY OF SCIENCES AND MATHEMATICS DEPARTMENT OF BIOLOGY AND ECOLOGY
Effect of rosemary essential oil (Rosmarinus officinalis
L.) to the growth of Salmonella enterica subsp. enteritidis
in meat
Master thesis
Candidate: Mentor: Sanja Ničić 120 PhD Zorica Stojanović-Radić
Niš, 2015
ZAHVALNICA
Najiskrenije se zahvaljujem svojoj mentorki dr Zorici Stojanović‐Radić na
ukazanom poverenju, ogromnoj i nesebičnoj pomoći tokom izrade ovog
master rada.
Beskrajnu zahvalnost dugujem svojim roditeljima, na
neizmernoj ljubavi, moralnoj podršci i razumevanju tokom
studiranja.
BIOGRAFIJA
Sanja Ničić, rođena je 13.5.1990. godine u Vranju. Osnovnu školu
˝Branko Radičević˝ u Bujanovcu završava 2005. godine. Iste godine
upisuje Gimnaziju ˝Bora Stanković˝ u Vranju, društveno-jezički smer
koju završava 2009. Prirodno matematički fakultet Univerziteta u Nišu
upisala je 2009/2010. godine, na Departmanu za biologiju i ekologiju.
2013. godine završava osnovne akademske studije sa zvanjem “biolog” i
upisuje master akademske studije, smer biologija, na istom fakultetu.
Sažetak
Ruzmarin (Rosmarinus officinalis L.) predstavlja biljnu vrstu iz familije usnatica
odnosno Lamiaceae. To je zimzeleni aromatični žbun, visine do 2 m, jakog i prijatnog
mirisa.Niz aktivnih supstanci koje su prisutne u ruzmarinu čine ga jako korisnim u
prehrambenoj i farmaceutskoj industriji. Etarska ulja i ekstrakti dobijeni iz ruzmarina
karakterišu se visokom antimikrobnom aktivnošću.
Iako je industrija mesa ostvarila veliki napredak na polju higijene i kontrole mesa,
Salmonella spp. i dalje predstavljaju najčešće patogene koje se prenose hranom. U
brojnim ogledima ispitano je antimikrobno dejstvo etarskog ulja ruzmarina (Rosmarinus
officinalis), ali nema istraživanja na temu njegovog konzervirajućeg efekta nakon
dodavanja u razne vrste hrane. Zbog toga je cilj ovog master rada bio ispitivanje
njegovog dejstva na rast Salmonella enterica subsp. enteritidis u pilećem mesu kao
modelu hrane. Nakon destilacije etarskog ulja iz osušenog biljnog materijala, određene su
njegova minimalna inhibitorna (MIK) i minimalna baktericidna koncentracija (MBK) u
odnosu na referentni soj Salmonella enterica subsp. enteritidis (ATCC 13076).
Eksperiment na mesu kao modelu hrane je rađen sa etarskim uljem u koncentracijama
MIK (5 mg/ml) i 4 x MIK (20 mg/ml). Meso inokulisano bakterijom i sa različitom
količinom dodatog etarskog ulja inkubirano je na sobnoj temperaturi tokom četiri
različitih vremenskih perioda inkubacije. Nakon ukupnog perioda inkubacije od 72 časa,
izvršeno je vijabilno brojanje preživelih ćelija u tretiranom mesu. Rezultati su pokazali da
se etarsko ulje ruzmarina ne može koristiti kao dodatak mesu u cilju prevencije njegovog
kvarenja, jer ne vrši značajnu inhibiciju razmnožavanja ćelija salmonele.
Ključne reči: etarsko ulje, ruzmarin (Rosmarinus officinalis L.), antimikrobna
aktivnost, Salmonella, pileće meso
Abstract
Rosemary (Rosmarinus officinalis L.) is a plant species of the family Lamiaceae.
It is an aromatic evergreen shrub, up to 2 m, with strong camphor like odor. A number of
active substances that are present in rosemary make it very useful in the food and
pharmaceutical industries. Essential oils and extracts obtained from rosemary are
characterized by high antimicrobial activity.
Although the meat industry has made great progress in the field of hygiene and
the control of meat, Salmonella spp. continues to represent the most common pathogens
that are transmitted by food. In a number of experiments, antimicrobial activity of
essential oils of rosemary (Rosmarinus officinalis) was tested, but there are anystudies on
the subject of its preservative effect when addedinto various types of food. Therefore, the
goal of thismaster thesis was to investigateits effect to the growth of Salmonella enterica
subsp. enteritidis in chicken meat as a foodmodel. After distillation of the essential oil
from the dried plant material,minimal inhibitory concentrations (MIC) and minimum
bactericidal concentration (MBC) were determined against the reference strain of
Salmonella enterica subsp. enteritidis (ATCC 13076). The experiment on the meat as a
food model was doneatMIK (5 mg/ml) and 4 x MIC (20 mg/ml) concentractions of
essential oil. The meat samples were inoculated with bacteria and different amounts of
added essential oil and incubated at room temperature for four different periods of
incubation. After a total incubation period of 72 hours,a viable count of surviving cells in
the treated meat was carried out. The results pointed to the fact that the essential oil of
rosemary can not be used as a preservative agent in meat, because its inhibition of
salmonella cell growth is not significant.
Keywords: essential oil, rosemary (Rosmarinus officinalis L.), antimicrobial
activity, Salmonella, chicken meat.
Sadržaj
1. UVOD .......................................................................................................................... 1
1.1. Etarska ulja ............................................................................................................... 2
1.2. Opšte karakteristike roda Rosmarinus ...................................................................... 4
1.2.1. Sastav i antimikrobna aktivnost sekundarnih metabolita ruzmarina ................. 6
1.3. Istorijat, morfologija, klasifikacija i taksonomija roda Salmonella ......................... 9
1.3.1. Morfološke, kulturelne i biohemijske karakteristike salmonela ..................... 10
1.3.2. Toksini i patogenost salmonele ....................................................................... 12
1.3.3. Pregled istraživanja efikasnosti etarskih ulja na rast salmonele u različitim
modelima hrane ......................................................................................................... 14
1.4. Ciljevi istraživanja .................................................................................................. 16
2. MATERIJAL I METODE ............................................................................................. 17
2.1. Rastvori i podloge ................................................................................................... 17
2.2. Bakterijski sojevi .................................................................................................... 18
2.3. Izolacija etarskog ulja ruzmarina ............................................................................ 19
2.3.1. Utvrđivanje antimikrobne aktivnosti etarskog ulja ruzmarina ........................ 20
2.3.2. Određivanje efekta etarskog ulja u minimalnoj inhibitornoj koncentraciji na
rast i razmnožavanje vrste Salmonela enterica subsp. enteritidis na modelu hrane . 22
2.4. Statistička analiza dobijenih rezultata .................................................................... 23
3.REZULTATI I DISKUSIJA ........................................................................................... 24
3.1. Prinos etarskog ulja ruzmarina ............................................................................... 24
3.2. Antimikrobna aktivnost etarskog ulja biljne vrste Rosmarinus officinalis ............ 24
3.3. Efekat etarskog ulja ruzmarina na rast Salmonella enterica subsp. enteritidis u
modelu hrane ................................................................................................................. 26
4. ZAKLJUČAK ................................................................................................................ 29
5. LITERATURA: ............................................................................................................. 30
1
1. Uvod
Upotreba biljaka kao začina stara je koliko i čovečanstvo, a njihovo viševekovno
korišćenje kao dodataka hrani i piću potvrđuje njihovo blagotvorno dejstvo (Elgayyar et
al., 2001). Još u preantičkom i antičkom periodu, primećeno je da dodavanje određenih
biljaka hrani, pored toga što poboljšava njen ukus i miris, sprečava njeno kvarenje i
produžava joj rok trajanja. Kasnije, sa istraživanjem začinskih biljaka došlo se do
saznanja da one poseduju razne supstance koje imaju antimikrobno, antifungalno i
antioksidativno dejstvo (Bubonja-Šonje et al., 2011). Jedna od najznačajnijih komponenti
začinskih biljaka jesu etarska ulja. Etarska ulja predstavljaju smeše mirišljavih, lako
isparljivih jedinjenja koja nastaju u sekretornim delovima biljaka koji se mogu naći u
cvetovima, stablu, listovima i drugim delovima biljke. Mogu se izolovati iz različitih
delova biljke, zbog čega njihov hemijski sastav, a samim tim i biološka aktivnost
značajno variraju.
Aromatične biljke i njihovi sekundarni metaboliti predstavljaju potencijalne
prirodne konzervanse hrane, čija bi uloga bila u produženju održivosti namirnica,
smanjenju broja ili potpunom eliminisanju bakterija i povećanju kvaliteta proizvoda
(Tajkarimi et al., 2010). Za razliku od sintetičkih konzervanasa, začini su neškodljivi po
zdravlje konzumenata hranetretirane na ovaj način. Jedna od ovih biljaka je i ruzmarin,
koja se u obradi hrane koristi kao začin i pojačivač arome salata i raznih vrsta pečenog
mesa, najčešće piletine i jagnjetine (Klaus et al., 2009).
Većina dosadašnjih istraživanja koja su se odnosila na aktivnost etarskog ulja
ruzmarina bazirana su pre svega na proučavanju sastojaka koji imaju antioksidativna
svojstva, radi mogućnosti upotrebe u prehrambenoj industriji, sa ciljem održavanja boje i
svežine mesa. U ovom master radu, cilj istraživanja bio je ispitivanje antimikrobnog
2
potencijala etarskog ulja ruzmarina na pilećem mesu kao modelu hrane koji, za razliku od
klasičnih mikrobioloških podloga, pruža uvid u efikasnost ovog ulja u realnim uslovima.
1.1. Etarska ulja
Termin etarsko ulje potiče još iz 16. veka i to od strane reformiste Švajcarske
medicine, Paracelsus von Hohenheim-a. Kao metod za proizvodnju etarskog ulja
destilacija je prvi put upotrebljena na Istoku (Egipat, Indija i Persija) pre više od 2000
godina (Guenther, 1948),a metodologija je usavršena od strane Arapa u 9. veku (Bauer et
al., 2001). Farmakološki efekti etarskih ulja su opisani i u farmakopejama (Bauer et al.,
2001), ali njihova upotreba nije bila rasprostranjena u Evropi sve do 16. veka
(Crosthwaite, 1998). Međutim, u početku su široko upotrebljavanisamo terpentin, kleka,
ruzmarin, lavanda, karanfilić, muskatni oraščić, anis i cimet. Već u 17. veku, apoteke su
bile opremljene sa 15-20 različitih vrsta etarskog ulja (Guenther, 1948).
Do sada je poznato oko 3000 vrsta etarskih ulja, od kojih su 300 komercijalno
značajna (Van de Braak and Leijten, 1999). Od davnina je poznato da etarska ulja imaju
antimikrobna svojstva (Guenther, 1948; Boyle, 1955), a kao začini se koriste zbog
njihovog mirisa, ukusa i konzervirajućih svojstava (Bauer et al., 2001). Aktivne
komponente etarskih ulja se na osnovu hemijske strukture mogu podeliti na terpene,
terpenoide, fenilpropene i „ostale“. Terpeni se sintetišu u citoplazmi iz acetil-Co A.
Glavne klase terpena čine monoterpeni i seskviterpeni, a u manjim koncentracijama, u
biljnim produktima često se nalaze i hemiterpeni, diterpeni, tripenteni i dr. Terpenoidi su
terpeni koji su podlegli enzimskim modifikacijama i sadrže kiseonik. Ova jedinjenja
mogu imati alkoholne, estarske, aldehidne, ketonske, etarske, fenolne i epoksidne
funkcionalne grupe. Za razliku od terpena, ova jedinjenja često poseduju veoma jaka
antibakterijska svojstva. Antimikrobna aktivnost terpenoida pripisuje se njihovoj
funkcionalnoj grupi ili fenolnoj strukturi (Bošković i sar., 2013).
3
Generalno, etarska ulja poseduju značajna antibakterijska svojstva, jer sadrže
visok procenat fenolnih jedinjenja kao što su karvakrol, eugenol i timol. Hemijska
struktura utiče na antibakterijsku aktivnost, a važnost prisustva određene funkcionalne
grupe je veoma velika, što je potvrđeno za hidroksilnu grupu u karvakrolu i timolu (Burt,
2007). Međutim, u jednom istraživanju je pronađeno da karvakrol i timol različito deluju
protiv Gram-pozitivnih i Gram-negativnih bakterija. Utvrđeno je da se dodavanjem
acetata na jedinjenje geraniol dobija geranil-acetat, koji ima veću antibakterijsku
aktivnost i protiv Gram pozitivnih i Gram negativnih bakterija od geraniola (Burt, 2007).
U velikom broju radova ispitana su antimikrobna, ali i antioksidativna
svojstvavećine poznatih etarskih ulja (Azzouz and Bullerman, 1982; Akgul and Kivanç,
1988; Burt, 2004; Tajkarimi et al., 2010). Etarska ulja pokazuju i antivirusno (Bishop,
1995), antiparazitsko (Pandey et al., 2000; Pessoa et al., 2002) i insekticidno svojstvo
(Konstantopoulou et al., 1992). Antimikrobna, ali i druge biološke aktivnosti su zapravo
posledica specifičnog hemijskog sastava etarskih ulja, tj. funkcije aktivnih jedinjenja u
njihovom sastavu (Guenther, 1948; Mahmoud and Croteau, 2002). Iako su antimikrobna
svojstva i komponente etarskih ulja u velikoj meri ispitani, mehanizam njihovog dejstva
još uvek nije detaljno poznat. Postoji nekoliko mesta u i na bakterijskoj ćeliji na koja
deluju etarska ulja, a zbog često jako velikog broja različitih hemijskih jedinjenja u
sastavu etarskog ulja, njihova antibakterijska aktivnost se ne može pripisati samo jednom
mehanizmu. Važna karakteristika etarskih ulja i njihovih komponenti je njihova
hidrofobnost, što im omogućava da se rastvore u lipidima bakterijske ćelijske membrane,
narušavajući njenu strukturu i čineći je neselektivno propustljivom. Povećana
propustljivost membrane vodi ka narušavanju membranskog potencijala i do određene
mere, ćelija je sposobna da zadrži vijabilnost, ali ako se membrana ne oporavi (ne povrati
svoju selektivnost), nastupiće smrt ćelije.
4
1.2. Opšte karakteristike roda Rosmarinus
Lekovite, aromatične i začinske biljke iz familije Lamiaceae (žalfija - Salvia
officinalis, ruzmarin - Rosmarinus officinalis i majčina dušica - Tymus vulgaris) su široko
rasprostranjene u Srbiji kao samonikle, ali i kao kultivisane vrste. Ove biljke se u
tradicionalnoj i zvaničnoj medicini koriste kao spazmolitik, stomahik, ekspektorans i
karminativ.
Ime roda Rosmarinus potiče od latinskih reči ˝ros marinus˝ što znači ˝morska
rosa˝. Monotipski je rod i njegove karakteristike su date u opisu vrste (Josifović, 1974).
Ruzmarin (Rosmarinus officinalis L.) predstavlja biljnu vrstu iz familije usnatica
(Lamiaceae). To je zimzeleni aromatični žbun, visine do 2m, jakog mirisa nalik na
kamfor. Stablo ruzmarina je jako razgranato, sa uspravnim granama i sivom korom.
Listovi su linearni, naspramni, kožasti, sedeći, dužine 2-3 cm i širine 2-4 mm, sa veoma
kratkom lisnom drškom. Sa gornje strane, listovi su tamnozelene boje, dok su sa donje
strane sivo beli i gusto pokriveni sitnim žlezdastim dlakama. Između listova na
peteljkama se nalaze sitni plavičasti cvetovi jakog mirisa.
Ruzmarin potiče sa Mediterana, i sastavni je deo makija sredozemne oblasti
(Borras-Linares et al., 2014).Raste u suvim klimatskim uslovima na priobalnom tlu
bogatim kalcijumom. Može se naći od južne Francuske do Grčke, u severnoj Africi i
zapadnim obalama Male Azije, kao i u priobalnim delovima Hrvatske i u Makedoniji.
Odavno je kultivisan širom sveta, gde se uzgaja kao ukrasna biljka po parkovima,
baštama i vrtovima. Rosmarinus officinalis L. je opisan kao čudesna biljka. Njegovo ulje
se široko primenjuje u proizvodnji visoko kvalitetnih parfema, u kozmetici i u pripremi
određenih lekova. U antičkom dobu, ruzmarin je bio posvećen grčkoj boginji Afroditi i
predstavljao je simbol ljubavi, mudrosti i lepote. U Grčkoj su studenti pravili vence od
ruzmarina i stavljali ih na glavu kada su pripremali ispite, zbog verovanja da ruzmarin
5
podstiče pamćenje. Grane ruzmarina se leti seku i suše, a zatim se njihovom destilacijom
dobija ruzmarinovo etarsko ulje (Aetheroleum rosmarini). Niz aktivnih supstanci koje su
prisutne u ruzmarinu čine ga jako korisnim u prehrambenoj i farmaceutskoj industriji.
Tabela1: Sistematika Rosmarinus officinalis L.
Carstvo
Plantae
Razdeo
Magnoliophyta
Klasa
Magnoliopsida
Red
Lamiales
Familija
Lamiaceae
Rod
Rosmarinus
Vrsta
Rosmarinus
officinalis L.
Slika 1. Rosmarinus officinalis
https://commons.wikimedia.org/wiki/File:259_Rosmarinus_officinalis_L.jpg
6
1.2.1. Sastav i antimikrobna aktivnost sekundarnih metabolita ruzmarina
List ruzmarina (Rosmarinus officinalis) sadrži oko 2.0% etarskog ulja. Glavni
sastojci Aetheroleum rosmarini su cineol, kamfor, pinen i borneol. Hemijski sastav
etarskih ulja zavisi od geografskog porekla vrste, faze razvoja i sastava zemljišta
(Bošković et al., 2013).Etarsko ulje ruzmarina dobija se destilacijom nadzemnog dela
biljke (Rosmarinus officinalis) pomoću vodene pare. Ulje je svetlo žute boje, sa veoma
karakterističnim jakim mirisom.
Najzastupljenije komponente etarskog ulja ruzmarina gajenog na Balkanskom
poluostrvu su: 1,8-cineol, kamfor, α-pinen i borneol. Etarsko ulje koje je dobijeno iz
ruzmarina koji je uzgajan u Beogradu sadržalo je kamfor (18.2–28.1%), 1,8-cineol (6.4–
18.0%), α-pinen (9.7–13.5%), borneol (4.4–9.5%), kamfen (5.1 – 8.7%), β-pinen (2.1–
8.1%), β-felandren (4.6 – 6.5%), mircen (3-4–5.9%) i bornil acetat (0.2–7.9%) (Lakušić,
2013).Koristi se kao holagog, dijaforetik, digestiv, diuretik, emenagog, laksativ i kao
tonik, kao i protiv glavobolje, menstrualnih bolova, umora, radi poboljšanja pamćenja,
protiv uganuća i modrica.
Slika 2. Hemijska struktura borneola, kamfora i 1.8-cineola
Najveći deo pronađenih podataka u literaturi se odnosi na antioksidativne i
antimikrobne osobine etarskog ulja ruzmarina. Brojni autori su utvrdili da dejstvo
7
etarskog ulja ruzmarina na odabrane mikroorganizme zavisi od njegovog sastava,
karakteristika biljnog materijala i koncentracije koja se koristi.
Analizirajući ekstrakte ruzmarina koji sadrže 30% karnozinske kiseline, 16%
karnozina i 5% ruzmarinske kiseline, Moreno et al. (2006) su primetili da su oni
efikasniji protiv Gram-pozitivnih nego protiv Gram-negativnih bakterija ili gljivica.
Ekstrakti su pokazali relativno slab inhibitorni efekat na Gram-negativne bakterije, ali pri
koncentracijama od 0.06-1.00% oni su inhibirali rast Gram-pozitivnih patogena
Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes i Bacillus cereus (Moreno et al., 2006).
Etarska ulja i ekstrakti (dva vodena i jedan uljani) dobijeni iz ruzmarina pokazali su
antimikrobnu aktivnost, a bakterijski sojevi koji su bili posebno osetljivi na aktivnost
etarskog ulja ruzmarina bili su Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus,
Staphylococcus epidermidis, Bacillus subtilis i Klebsiella pneumonia (Celiktas et al.,
2007). Posebno osetljive na aktivnost ekstrakta ruzmarina su takođe i bakterije iz roda
Lactobacillus i Brochothrix (Del Campo et al., 2000; Moyosoluwa et al., 2004;
Fernandez-Lopez et al., 2005). Prema podacima Svetske Zdravstvene Organizacije
(WHO, 2009), etarsko ulje ruzmarina se smatra slabim antimikrobnim agensom, jer ne
inhibira u potpunosti rast mikroorganizama (Acinetobacter iwoffi, Bacillus subtilis,
Erwinia carotovora, Shigella flexneri, Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes i
Yersinia enterocolitica). Takođe, utvrđeno je da se zbog prisustva kamfora, čija je
maksimalna dnevna doza za ljude 1.43 mg/kg telesne mase, kao i nekih drugih
potencijalno toksičnih jedinjenja (borneol, timol), ovo ulje mora koristiti sa izvesnom
dozom opreza.
Pored mnogih istraživanja koja su određivala antimikrobnu aktivnost, određeni
broj studija bio je usmeren na efekat sekundarnih metabolita (etarskog ulja i ekstrakta)
ruzmarina na rast bakterija u različitim modelima hrane. Wieczorkiewicz-Gurnik (2003)
je prilikom ispitivanja efekta ulja ruzmarina na bakteriju Pseudomonas fluorescens,
utvrdio da je ovaj soj inhibiran tek nakon dodatka ulja u koncentraciji preko 1%. U
istraživanju Georgantelis et al. (2007) ispitanje antimikrobni efekat ekstrakta ruzmarina
8
na svežoj svinjskoj kobasici kao modelu hrane.Utvrđenoje da je broj mikroorganizama iz
familije Enterobacteriaceae povećan posle 20 dana čuvanja na 4 °C u kobasicama koje
su pripremljene bez dodavanja ekstrakta ruzmarina. U kobasicama kojima je dodat
ruzmarin,zabeleženje drastičan pad brojnosti ćelija (Georgantilis et al., 2007). Burt et al.
(2007) utvrdili su da je karvakrol u gasovitoj fazi bio u stanju da smanji ili eliminiše
kolonije Salmonella enterica subsp. enteritidis kojom je bilo inokulisano sirovo pileće
meso, kao i da etarsko ulje majčine dušice ima veću antilisterijsku aktivnost od etarskog
ulja ruzmarina. Govaris et al. (2007) zaključili su da hranjenje mladih ćurki suvim
ruzmarinom do četvrte nedelje starostipoboljšava kvalitet mesa, koje je kasnije dobijeno.
Takođe, ćureći file od ovako hranjenih životinja je ostao svež duži vremenski period
tokom skladištenja u hladnjačama,što se verovatno dešava zbog aktivnosti jedinjenja
ruzmarina koja sprečavaju oksidaciju lipida. Karpinska-Timoszczik (2008) proučavali su
efekat 1% ulja ruzmarina na turske kebabe, koji su bili termički obrađeni i čuvani na
temperaturi između -1°C i -3°C. Uočenoje da dodatak ulja doprinosi inhibiciji rasta
psihrofilnih bakterija. Ekstrakti ruzmarina u obliku emulzije, praha ili rastvora ulja, mogu
se koristiti kao zamena za BHA (butilovani hidroksianizol), kao dodatak dehidratisanim
kokošjim jajima, mesu i ribi, kobasicama, makaronima, kikiriki puteru i ulju (Hać-
Szymańczuk et al, 2011). Istraživanje sa ciljem da se utvrdi dejstvo ruzmarina na
saprofitsku mikrofloru i proces oksidacije masti izvršeno je na svinjskom mesu kao
modelu hrane, tokom njenog skladištenja u rashlađenim uslovima (4-6 ºC).Rezultati
dobijeni u ovom radu pokazali su da preparati ruzmarina primenjeni u eksperimentalnim
dozama nisu imali značajan uticaj na inhibiciju oksidacije lipida, verovatno zbog niskog
sadržaja jedinjenja koja su za to odgovorna. Takođe, ekstrakti ruzmarina nisu inhibirali
rast mezofilnih anaerobnih bakterija, ali su pokazali visoku antimikrobnu aktivnost protiv
E. coli. Dodavanjem etarskog ulja ruzmarina u svinjsko meso primećeno je da ono
inhibira rast koliformnih bakterija i enterokoka (Hać-Szymańczuk et al, 2011). U radu de
Oliveira et al. (2013), dokazana je antilisterijska aktivnost etarskog ulja ruzmarina na
svinjskoj kobasici, viršlama i mlevenom goveđom mesu.
9
1.3. Istorijat, morfologija, klasifikacija i taksonomija roda
Salmonella
Prvu salmonelu, bacil tifusa, otkrio je 1880. Eberth u slezini i mezenterijalnim
limfnim žlezdama bolesnika koji je umro od crevnog tifusa. Međutim, tek 1884. godine
Gaffky je uspeo da je kultiviše, a zatim i detaljno opiše. Salmon i Smith su iz svinja koje
su bolovale od svinjske kolere izolovali drugu bakteriju koja je po mnogim osobinama
ličila na bakteriju koja je uzročnik crevnog tifusa. Gärtner je 1888. godine našao
salmonelu u slezini čoveka koji je umro od teškog enterokolitisa i ona je nazvana
Salmonella gartneri, a kasnije Salmonella Enteritidis. Ime “Salmonella” su dobile po
doktoru Danielu Salmonu (Karakašević, 1987). Do danas je otkriveno 2500 različitih
serotipova bakterija koje se ubrajaju u rod Salmonella, a stalno se izoluju, opisuju i
objavljuju novi serotipovi (Grimont & Weill, 2007).
Salmonele su ranije bile klasifikovane na vrste na osnovu rezultata serotipizacije,
gde je svaki serotip smatran posebnom vrstom, pa su serotipovima davani nazivi prema
Lineovoj binominalnoj nomenklaturi. Međutim ovaj opšteprihvaćen koncept je morao biti
redefinisan, nakon 1973. godine kada su Cross i saradnici DNK-DNK hibridizacijom
dokazali da su svi serotipovi salmonela veoma srodni, osim, Salmonella bongori
(Kozoderović, 2012).Danas je poznato da postoje dve vrste roda Salmonella: Salmonella
enterica i Salmonella bongori. Salmonella enterica je dalje podeljena na 6 podvrsta na
osnovu biohemijskih karakteristika i fenotipskih osobina (litičke osetljivosti na
bakteriofag Felix O1): Podvrsta I enterica, podvrsta II salamae, podvrsta IIIa arizonae,
IIIb diarizonae, IV podvrsta hautenae i VI podvrsta indica.
Salmonella enterica subsp. enterica je najznačajnija, jer obuhvata većinu kliničkih
izolata. Podvrste se dalje identifikuju kao serotipovi (serovari) koji generalno dobijaju
imena na osnovu geografskog porekla izolacije (Guthrie, 1992) (S. Kentucky, S. Dublin,
S. Newport), prema sindromu koji izazivaju (S. Typhi, S. Paratyphi) ili specifičnim
domaćinima (S. Gallinarium) (Grimont & Weill, 2007).Prihvaćeno je da se umesto
10
Salmonella enterica subsp. enterica serotip Enteritidis koristi naziv Salmonella
Enteritidis (gde je Enteritidis oznaka serotipa, a ne vrste) (Gunell, 2010; Kozoderović,
2012).
1.3.1. Morfološke, kulturelne i biohemijske karakteristike salmonela
Sve salmonele su Gram negativni, fakultativno anaerobni, katalaza-pozitivni,
oksidaza-negativni (Adams & Moss, 2008) štapići asocirani sa crevnim sadržajem, koji
su veličine od 0.7-1.5 do 2.0-5.0 µm (Grimont et al., 2000). Kreću se peritrihim
flagelama. Ne obrazuju spore i nemaju kapsulu (Karakašević, 1987). Njihov rast je
zabeležen na temperaturama od 5–47 ºC, a optimalni rast je pri temperature od 37 ºC
(Adams & Moss, 2008) i na pH od 4-8. Temperatura od 56 ºC ubija ćelije salmonela za
20-30 minuta. Osetljive su na prisustvo hlora, a otporne na benzil-penicilin i sulfonamide.
Slabo su osetljive na streptomicin i na većinu cefalosporina. Veći broj sojeva salmonela
osetljiv je na hloramfenikol, ureido-peniciline i aminoglikozide (Karakašević, 1987).
Salmonele se dobro razvijaju na svim klasičnim podlogama i u aerobnim i u
anaerobnim uslovima. Nakon perioda inkubacije od 12 h na površini hranljivog agara,
javlja se rast u vidu okruglih, glatkih, beličastih kolonija prečnika 2-3 mm.Za izolaciju
salmonela iz fecesa, urina i drugog materijala koriste se selektivne podloge, a najčešće
dezoksiholat-citratni agar (DCA), Wilson-Blairov agar i SS-agar (Salmonella-Shigella
agar).
Raznim biohemijskim testovima i testom aglutinacije na pločici se potvrđuje
identifikacija salmonela. U serološkoj identifikaciji, kao pomoćno sredstvo koristi se
Kauffmann-White-ova šema prema kojoj su salmonele podeljene na osnovu somatskih
antigena u 67 O grupa, ali najčešće uzročnici oboljenja kod ljudi pripadaju grupama A, B,
C1, C2, D i E. Dalja podela u serotipove se vrši prema H ili flagelarnim antigenima faze
1 i faze 2 (WHO, 2009; Kozoderović, 2012).
11
Sve salmonele fermentišu ugljene hidrate uz produkciju kiseline i gasa, osim S.
Typhi koja ne produkuje gas pri fermentaciji šećera. Pored toga su sposobne da redukuju
nitrate, ne proizvode citohrom oksidazu, ne hidrolizuju ureu i ne vrše dezaminaciju
triptofana i fenilalanina. Prilikom fermentacije glukoze proizvode gas i ne fermentišu
laktozu, adonitol, saharozu, salicin i 2-ketoglukonat. Produkuju H2S iz tiosulfata,
dekarboksiluju ornitin i lizin (Kozoderović, 2012).
Slika 3. Kolonije Salmonella enteritidis na hranljivom agaru
http://lib.jiangnan.edu.cn/ASM/075-1.jpg
12
1.3.2. Toksini i patogenost salmonele
Od svih toksina koje salmonela luči najznačajnija su tri i to: termolabilni
enterotoksin, vezuje se za gangliozide, povećava nivo intracelularnog cikličnog adenozin
monofosfata (cAMP) i povećava sekreciju tečnosti. Citotoksin je drugi toksin salmonele,
to je nelipopolisaharidna komponenta spoljašnje membrane, koja inhibira sintezu proteina
eukariota i dovodi do izduživanja ćelija tkivne kulture - CHO (Chinese Hamsters Ovary)
ćelija. Treći je endotoksin koji predstavlja glicido-lipido-polipeptidni kompleks koji se
nalazi na spoljnoj membrani ćelijskog zida. Endotoksin izaziva groznicu i propustljivost
kapilara, aktivira makrofage i limfocite, što za posledicu ima niz bioloških efekata:
povišenje temperature, leukocitozu i pad pritiska (Miljković-Selimović et al., 2010).
Pretpostavlja se da svi predstavnici roda Salmonella mogu biti patogeni, što
uključuje više od 2500 serotipova. Međutim postoje neki izolati koji su specifični samo
za određene domaćine. Sve bolesti uzrokovane salmonelom, mogu se generalno podeliti
na tifusne i ne-tifusne (Perry, 2010). Kod ljudi, salmoneloze mogu biti u vidu enterične
groznice i gastroenteritisa.
Enterična groznica, odnosno tifus se smatra ozbiljnijom bolešću uzrokovanom
salmonelom, ali se ređe javlja od ne-tifusnih bolesti. Uobičajeni simptomi su groznica,
glavobolja i opšta slabost, a ponekad i osip na koži (Crump et al., 2004). Uzročnicisu
isključivo Salmonella Typhi i Paratyphi serotipovi, koje se najčešće unose
konzumiranjem hrane i vode zagađene fekalijama. Tifus se i danas često javlja u
nerazvijenim područjima. Konzumacija antibiotika može dovesti do stvaranja rezistentnih
sojeva S. Typhi, što dodatno komplikuje lečenje (Rowe et al., 1997).
Gastroenteritis je česta infektivna bolestu narodu poznata i kao salmoneloza.
Bolest se javlja nakon konzumacije zagađene hrane, a karakteriše je mučnina, dijareja,
groznica i stomačni grčevi koji se javljaju u periodu od 8 do 72 h nakon uzimanja
kontaminirane hrane. Salmonela je najčešći bakterijski uzročnik oboljenja uzrokovanih
hranom u SAD, a u Evropi je odmah iza Campylobacter sp. Oko 1% infekcija zahteva
13
hospitalizaciju (Hoelzer et al., 2011). Od ukupnih slučajeva salmoneloze, procenjuje se
da je 96% uzrokovano hranom (Mead et al., 1999). Hrana životinjskog porekla je najčešći
uzročnik sporadičnih slučajeva i velikih epidemija salmoneloze (WHO, 2002).
Salmonela enterica subspecies enterica serotip Enteritidis je najčešći serotip
salmonela dokazan globalno kod ljudi, a posebno u Evropi, gde predstavlja 85%
slučajeva izazvanih vrstom Salmonella enterica (Guard-Petter, 2001). U Srbiji se S.
Enteritidis pojavljuje na prvom mestu po broju izolata 1984. godine (RZZZ, 1984), mada
je u niškom regionu postala dominantan serotip 1982. godine, sa 30 primoizolata u
odnosu na 160 izolovanih sojeva različitih serotipova (RZZO, 1982) (Miljković-
Selimović et al., 2010).
Salmonele se mogu naći u skoro svim grupama životinja. Kod nekih životinja
salmonele mogu izazvati oboljenja, dok su mnogeasimptomatskinosiocii predstavljaju
opasnost za ljude kao rezervoari infekcije. Potencijalni putinfekcije ljudi su upravo
životinje gajene za ljudsku upotrebu (Kozoderović, 2012).Poznato je da meso u toku
proizvodnje, prerade i prometa dolazi u kontakt sa mikroorganizmima, od čijeg broja i
vrste zavisi njegova higijenska ispravnost i održivost (Dimitrijević, 2000).
Salmoneloze kod živine se smatraju jako velikim problemom. Infekcije se mogu
javiti kao akutne ili hronične i mogu biti izazvane sa jednim ili više serotipova roda
Salmonella. Pilići se najčešće inficiraju oralnim putem, preko hrane ivode, mada je
infekcija moguća irespiratornim putem. Glavno mesto umnožavanja salmonele je njihov
digestivni trakt. Klinički simptomi izazvani od strane Salmonella Enteritidis su često
blagi i nezapaženo prolaze, međutim pilići postaju kliconoše. Takođe su zapažene i
akutne epidemije kod pilića koji su mlađi od dve nedelje (Velge et al., 2005). Pacovi
doprinose širenju salmonela na farmama pilića (Kabir, 2010).
14
1.3.3. Pregled istraživanja efikasnosti etarskih ulja na rast salmonele u različitim modelima hrane
Pošto se često može naći kao kontaminant u mesu, nekoliko istraživanja se bavilo
ispitivanjem sposobnosti etarskih ulja nekih začinskih biljaka da redukuju njen rast u
mesu. Burt et al. (2007) utvrdili su da je karvakrol, značajna fenolna komponenta etarskih
ulja, u gasovitoj fazi bio u stanju da smanji ili eliminiše kolonije Salmonella enterica
subsp. enteritidis kojom je bilo inokulisano sirovo pileće meso. Eksperiment je rađen in
vitro na temperaturi od 37 °C, koja je povoljna za lako isparavanje jedinjenja iz etarskog
ulja.
Hayouni i sar. (2008) su proučavali dejstvo etarskog ulja žalfije (Salvia officinalis)
i peruanskog bibera (Schinus molle) na S. anatum i S. enteritidis u koncentracijama od
0.02, 0.06, 0.1, 1.0, 1.5, 2.0 i 3.0%, u mlevenom goveđem mesu, skladištenom na
temperaturi od 4 °C do 7 °C tokom 15 dana. Etarsko ulje žalfije je ispoljilo
bakteriostatski efekat na obe bakterije, u koncentracijama 0.02, 0.06 i 0.10%, dok je ulje
peruanskog bibera ispoljilo isti efekat i u koncentraciji od 1.0%.
Govaris i sar. (2010) su ispitivali uticaj etarskog ulja origana na S. enteritidis u
mlevenom ovčijem mesu na temperaturama od 4° C i 10° C. Rezultati su pokazali da
etarsko ulje origana aplikovano u 0.6% kao i 0.9% koncentraciji, pokazuje antimikrobnu
aktivnost na obe temperature.
Rattanachaikunsopun i Phumkhachorn (2010) su u svom ogledu ispitivali dejstvo
više vrsta etarskih ulja, i dokazali su da najjači antimikrobni efekat na S. enteritidis ima
etarsko ulje bosiljka (Ocimum basilicum). Etarsko ulje bosiljka u koncentraciji od 50, 100
i 150 ppm je dodato u mešavinu mlevenog svinjskog mesa (62.5%), prokuvanih i
iseckanih svinjskih kožica (27.5%), soli (2.5%), šećera (2.5%) i mlevenog prženog
pirinča (10%) i skladišteno na 4° C, tokom pet dana. U kontroli u kojoj nije dodavano
etarsko ulje bosiljka broj bakterija je bio 5 log CFU/g nakon pet dana, u uzorku u kome je
15
dodato ulje u koncentraciji od 50 ppm nakon trećeg dana skladištenja se smanjio na 2 log
CFU/g, dok je nakon dodavanja većih koncentracija broj bakterija bio manji od 1 log
CFU/g. Pored ovih ogleda, rađeni su i ogledi u kojima je ispitivano dejstvo pojedinačnih
komponenti etarskih ulja na Salmonella spp. u mesu i dokazano da karvakol može da
spreči širenje Salmonella u mesu.
Ristić (2015) je ispitala efekat etarskog ulja bosiljka na rast Salmonella enterica
subsp. enteritidis na kuvanom pilećem mesu kao modelu hrane. Ispitivanje je vršeno na
sobnoj temperaturi pri različitim periodima inkubacije. Zaključeno je da i nakon ukupnog
perioda inkubacije od 72 časa, etarsko ulje bosiljka nije značajno redukovalo broj ćelija i
da se samim tim ne može očekivati prezervativni efekat ulja bosiljka u ovoj vrsti hrane.
16
1.4. Ciljevi istraživanja
Izolovanje etarskog ulja iz herbe ruzmarina metodom
hidrodestilacije
Utvrđivanje antimikrobne aktivnosti etarskog ulja herbe ruzmarina
na vrstu Salmonella enterica subsp. enteritidis u in vitro uslovima
Utvrđivanje uticaja etarskog ulja u minimalnoj inhibitornoj
koncentraciji na rast i razmnožavanje ćelija Salmonella enterica subsp. enteritidis
na pilećem mesu kao modelu hrane
Ispitivanje uticaja vremena inkubacije na efikasnost etarskog ulja
ruzmarinana pilećem mesu kao modelu hrane
Procena potencijala etarskog ulja ruzmarina kao dodatka hrani u
prevenciji kvarenja mesa uzrokovanog bakterijskom vrstom Salmonella enterica
subsp. enteritidis.
17
2. Materijal i metode
2.1. Rastvori i podloge
Fiziološki rastvor je 0.9% (m/V) rastvor natrijum hlorida u destilovanoj
sterilisanoj vodi. Dobija se rastvaranjem 0.9 g NaCl u 100 ml destilovane vode.
Miler Hinton bujon je podloga namenjena za određivanje minimalnih inhibitornih
koncentracija (MIK) antimikrobnih agenasa metodom dilucije u bujonu. 1litar gotove
podloge sadrži: mesni ekstrakt 30.00 g, kazein hidrolizat 17.50 g, štirak 1.50 g. Priprema
ove podloge vršena je suspendovanjem 21.00 g suve podloge u 1000 ml destilovane
vode. Nakon stajanja od 15 minuta i inicijalnog zagrevanja na rešou radi potpunog
rastvaranja, vršena je sterilizacija podloge autoklaviranjem u trajanju od 20 minuta na
121°C.
Hranljivi agar (Torlak) je homogen, rastresit prah svetlo žute boje. Primenjuje se
za kultivisanje velikog broja mikroorganizama. 1litar gotove podloge sadrži: pepton
15.00 g, mesni ekstrakt 3.00 g, natrijum hlorid (NaCl) 5.00 g, kalijum fosfat 0.3 g, agar-
agar 18.00 g. Priprema ove podloge vršena je suspendovanjem 21.00 g suve podloge u
1000 ml destilovane vode. Nakon stajanja od 15 minuta i inicijalnog zagrevanja na rešou
radi potpunog rastvaranja, vršena je sterilizacija podloge autoklaviranjem u trajanju od 20
minuta na 121 °C.
18
2.2. Bakterijski sojevi
Ispitivanje antimikrobne aktivnosti etarskog ulja biljne vrste Rosmarinus
officinalis vršeno je u odnosu na bakterijsku vrstu Salmonela enterica subsp. enteritidis.
Za potrebe ovog istraživanja korišćen je standardni soj ATCC (American Type Culture
Collection) 13076. Kulturaje održavana na kosom hranljivom agaru u Laboratoriji za
mikrobiologiju Prirodno-matematičkog fakulteta u Nišu.
19
2.3. Izolacija etarskog ulja ruzmarina
Izolacija etarskog ulja ruzmarina je izvršena pomoću metode hidrodestilacije
aparaturom po Klevendžeru (Clevenger, 1928). Ova aparatura se sastoji iz kondenzora,
bočne cevi sa čepom i oduškom i cevi koja služi za merenje volumena destilata.
Slika 2. Aparatura po Klevendžeru
http://www.technosklo.com/en/index.php?page=katalog/laboratory-glass/apparatus-for-determination-of-
volatile-oil-in-drugs/apparatus-for-determination-of-volatile-oil-in-drugs-with-accessories
Balon u kome se nalazi voda i biljni materijal se zagreva do tačke ključanja, usled
čega dolazi do izdvajanja vodene pare u kondenzor, a nastala vodena para sa sobom nosi i
20
etarsko ulje. U kondenzoru vodena para prelazi u tečno stanje i vraća se u balon za
destilaciju, a ulje ostaje u cevi, na površini vodenog stuba.
Nadzemni deo (herba) biljne vrste Rosmarinus officinalis je sakupljen u decembru
2014. godine, u selu Srpska Kuća, Opština Bujanovac (leg. Sanja Ničić). Prikupljeni
materijal je zatim sušen na promajnom mestu u hladu, u trajanju od 3 nedelje. Iz 80 g
suvog, usitnjenog biljnog materijala Rosmarinus officinalis, izolovano je etarsko ulje.
Usitnjen biljni materijal stavljen je u balon i preliven sa 1l destilovane vode, nakon čega
je sastavljena aparatura po Klevendžeru. Nakon destilacije koja je trajala 2 h, etarsko ulje
iz destilata ektrahovano je pomoću etra, a zatim osušeno anhidrovanim magnezijum-
sulfatom (MgSO4). MgSO4 je uklonjen fitriranjem, a etar uparavanjem na rotacionom
vakuum uparivaču. Izolovano čisto ulje je izmereno na analitičkoj vagi, aprinos je izražen
preko težinskih procenata (w/w), obračunatih na 100 g biljnog materijala.
2.3.1. Utvrđivanje antimikrobne aktivnosti etarskog ulja ruzmarina
Da bi se utvrdilo postojanje antimikrobne aktivnosti neke supstance i odredila
koncentracija pri kojoj je ta supstanca aktivna, korišćena je mikrodiluciona metoda. Uz
pomoć ove metode, može se utvrditi minimalna inhibitorna koncentracija (MIK), tj.
najniža koncentracija ispitivane supstance koja je sposobna da inhibira rast testiranog
mikroorganizma.
U ovom radu ispitana je antimikrobna aktivnost (MIK) etarskog ulja ruzmarina u
odnosu na vrstu Salmonela enterica subsp. enteritidis.Kulture ispitivane bakterijske vrste
su presejane na svežu podlogu Hranljivi agar i inkubirane na 37°C. Nakon inkubacije od
18časova, pravljene su suspenzije bakterija u sterilnom fiziološkom rastvoru. Zatim je
turbiditet ćelija prekonoćne kulture podešen na standardnu vrednostod 0.5 McFarland
jedinica (turbiditet koji odgovara koncentraciji bakterija od 108 ćelija/ml). Turbiditet je
određen na McFarland densitometru (DEN-1, Biosan).
21
Za izvođenje mikrodilucionog testa korišćene su mikrotitar ploče sa 96 bunarčića.
Nakon pravljenja suspenzija, mikrotitarske ploče su punjene sa po 100 μl Miler Hinton
bujona, koji je zasejan odgovarajućim volumenom suspenzije turbiditeta McFarland u
cilju dobijanja finalne koncentracije ćelija od ~ 106 CFU/ml (colony forming units – CFU
– jedinica za formiranje kolonija). Etarsko ulje je rastvoreno u 0.05% Tween-u, a početna
koncentracija iznosila je 20mg/ml. Zatim su u ploči pravljena dupla razređenja početnog
rastvora ulja. Zasejane ploče sa etarskim uljem u opadajućim koncentracijama su
inkubirane 24 h na 37 °C. Nakon perioda inkubacije, očitani su rezultati. Minimalna
inhibitorna koncentracija je određivana kao najniža koncentracija etarskog ulja na kojoj
nije bilo vidljivog rasta, odnosno zamućenja podloge. Eksperiment je rađen u triplikatu.
22
2.3.2. Određivanje efekta etarskog ulja u minimalnoj inhibitornoj koncentraciji na rast i razmnožavanje vrste Salmonela enterica
subsp. enteritidis na modelu hrane
Model hrane na kome je ispitivan efekat etarskog ulja ruzmarina bilo je sveže
pileće meso (pileće grudi, Biftek). Meso je najpre isečeno skalpelom na 24 komada od po
5 g, nakon čega je svaki komad sterilisan u autoklavu u zasebnoj Petri šolji (20minuta na
121 °C). Svaki komad mesaje zatim potapan u 100 ml bakterijske suspenzije turbiditeta
107 ćelija/ml u trajanju od 15 minuta. Nakon potapanja, komadi mesa su sušeni 30 minuta
u otvorenim Petri šoljama u neposrednoj blizini plamenika.
Kako bi se ispitao efekat različitih perioda inkubacije na efikasnost delovanja
etarskog ulja ruzmarina, eksperimentalni dizajn je uključivao četiri vremena inkubacije i
to 0 h, 24 h, 48 h i 72 h. Za svaki period inkubacije, korišćen je kontrolni uzorak
(netretiran komad mesa) i uzorak koji je potapan u rastvor etarskog ulja ruzmarina u
koncentracijama MIK i 4 x MIK.Nakon sušenja, 12 komada mesa ostavljena su kao
kontrolni uzorci, dok je 12 preostalih potopljeno u rastvor ulja ruzmarina u fiziološkom
rastvoru. Rastvor je napravljen u sterilnim flakonima, tako što je u 150 mg uljarastvoreno
u1ml Tween-a i dodato u 29 ml fiziološkog rastvora, što je koncentracija koja odgovara
minimalnoj inhibitornoj koncentraciji određenoj u prethodnom eksperimentu (5 mg/ml).
Rastvor je zatim homogenizovan u ultrazvučnom kupatilu, a zatim je u flakone ubačeno
inokulisano meso i ostavljeno u kontaktu sa rastvorenim uljem 15minuta. Meso je nakon
toga izvađeno i sušeno u Petri šoljama uz plamenik.
Odmah nakon potapanja, za period inkubacije 0 h, u triplikatu su uzeti uzorci iz
kontrolne i tretirane grupe. Preostalih 18 komada mesa ostavljeno je na sobnoj
temperaturi u sterilnim Petri šoljama (temperatura inkubacije). Uzorci za analizu su zatim
uzimani u intervalima od 24 h, 48 h i 72 h.
Svako uzorkovano parče je ubačeno u 30 ml sterilnog fiziološkog rastvora i
homogenizovano u njemu.
23
Iz svakog ovako obrađenog uzorka, mikropipetom je uzeto po 100 μl supernatanta
i napravljena je serija razblaženja (faktor razblaženja 10x). Iz svakog razblaženja uzet je
uzorak i zasejan na hranljivi agar za vijabilno brojanje (Drop count metod). Nakon
inkubacije od 16 h, izvršeno je vijabilno brojanje kolonija i preračunavanje broja ćelija po
ml na osnovu sledeće formule:
N = broj kolonija x faktor korekcije do 1 ml x razblaženje
Isti postupak je ponovljen za sve ostale periode inkubacije (24 h, 48 h i 72 h).
Isti eksperiment je ponovljen uz korišćenje etarskog ulja u koncentraciji od
20mg/ml (4 x MIK).
2.4. Statistička analiza dobijenih rezultata
Statistička analiza podataka rađena je u programskom paketu Origin 7.
Eksperimenti su rađeni u triplikatu, a srednje vrednosti su poređene jednofaktorskom
analizom varijansi (ANOVA).
24
3.Rezultati i diskusija
3.1. Prinos etarskog ulja ruzmarina
Etarsko ulje dobijeno iz nadzemnog dela (herba) biljne vrste Rosmarinus
officinalis procesom hidrodestilacije pomoću aparature po Klevendžeru imalo je prinos
od 1.2% (v/w). Ulje se odlikovalo svetlo žutom bojom, i bilo je jakog karakterističnog,
prijatnog mirisa.
Prosečan prinos etarskog ulja ruzmarina izolovanog iz nadzemnog dela biljke
kreće se u opsegu između 0.5 do 2.0% (v/w) na 100 g suvog biljnog materijala
(Boutekedjiret et al., 2003).
3.2. Antimikrobna aktivnost etarskog ulja biljne vrste
Rosmarinus officinalis
Mikrodilucionom metodom je utvrđeno da etarsko ulje ruzmarina inhibira rast
bakterije Salmonella enterica subsp.enteritidis pri MIKod 5 mg/ml. Zasejavanjem
bunarića u kojima nije bilo vidljivog rasta na hranljivi agar, utvrđeno je da je minimalna
baktericidna koncentracija (MBK) jednaka minimalnoj inhibitornoj koncentraciji (MIK).
Antibakterijsko dejstvo etarskog ulja ruzmarina je potvrđeno od strane mnogih
naučnika. Del Campo et al. (2000) su dokazali da antibakterijsko dejstvo etarskog ulja
ruzmarina potiče od fenola i diterpenoida. Od ostalih fenolnih jedinjenja, u ovom
etarskom ulju prisutni su i flavonoidi i fenolne kiseline (Babović & Petrović, 2011).
Mnogobrojni eksperimenti su urađeni u cilju određivanja antibakterijskog dejstva
etarskog ulja, i zaključeno je da su Gram pozitivne bakterije osetljivije na dejstvo
25
etarskog ulja, dok su Gram negativne bakterije, gde spada i Salmonella spp. bile
rezistentnije na testirano ulje. To se objašnjava razlikom u građi ćelijskog zida, tako što
on sprečava difuziju hidrofobnih jedinjenja kroz lipopolisaharidni omotač (Bošković et
al., 2013).
Roldan et al. (2010) ispitali su antimikrobnu aktivnost šest etarskih ulja izolovanih
iz biljaka iz porodice Lamiaceae, i to Mentha spicata, Mentha piperita, Ocimum
basilicum, Salvia officinalis, Rosmarinus officinalis i Thymus vulgaris.Antimikrobna
aktivnost ovih ulja je ispitana na pet vrsta bakterija:Escherichia coli, Salmonella
enteritidis, Salmonella typhimurium, Lactobacillus acidophilus i Bifidobacterium
breveagar dilucionom metodom. Etarsko ulje ruzmarina je pokazalo antibakterijsku
aktivnost protiv svih testiranih bakterija. Konkretno za Salmonella enterica subsp.
enteritidis(ATCC 13076)minimalna baktericidna koncentracija je iznosila 40 mg/ml. U
studiji Stojanović-Radić et al. (2010) je dokazana antimikrobna aktivnost ruzmarina
protiv pet bakterijskih sojeva, i to: Staphylococcus aureus ATCC 25923, S. aureus
(klinički izolat), Escherichia coli (klinički izolat), Bacillus subtilis ATCC 6633
iKlebsiella pneumoniae (klinički izolat). Određene su MIK i MBK vrednosti za svaki soj.
MIK vrednosti etarskog ulja ruzmarina protiv testiranih bakterija se kreću u rasponu od
1.562 – 3.125 μl/ml, dok se MBK vrednosti kreću u rasponu od 1.562 do >25.00 μl/ml
(Stojanović-Radić et al., 2010). Minimalna inhibitorna koncentracija etarskog ulja
ruzmarina protiv bakterija Staphylococcus aureus ATCC 25923, Lysteria monocitogenes
ATCC 19117 i Bacilluscereus ATCC 11778 se kreće u u rasponu od 5.0-20.0 mg/ml, dok
je MBK između 10.0-20.0 mg/ml (da Silveira et al., 2012).
Pošto ova biljna vrsta ima dokazano antibakterijsko dejstvo, a u isto vreme
predstavlja i začinsku biljku, dalje istraživanje je bilo usmereno na ispitivanje uticaja
njenog etarskog ulja na bakterijsku vrstu Salmonella enterica subsp. enteritidis, koja je
patogen hrane, na mesu kao modelu hrane u kome je taj efekat testiran.
26
3.3. Efekat etarskog ulja ruzmarina na rast Salmonella
enterica subsp. enteritidis u modelu hrane
Nakon određivanja MIK i MBK etarsko ulje ruzmarina je ispitano na modelu
hrane u odnosu na vrstu Salmonellaenterica subsp. enteritidis. Kao model je korišćeno
pileće meso, na kome je ispitan efekat perioda inkubacije na aktivnost etarskog ulja. Na
grafiku 1. prikazane su krive rasta S. enterica subsp. enteritidis u toku ukupnog perioda
inkubacije od 72 h u prisustvu etarskog ulja ruzmarina u minimalnoj inhibitornoj
koncentraciji od 5 mg/ml, 4 x MIK odnosno 20 mg/ml. Prikazana je i kontrola, odnosno
brojnost bakterija u mesu koje nije tretirano etarskim uljem.
Grafik 1: Rast S. enterica subsp. enteritidis u pilećem mesu pod dejstvom etarskog ulja ruzmarina u minimalnoj inhibitornoj koncentraciji, 4 x MIK i bez prisustva etarskog ulja (kontrola), u različitim
periodima inkubacije (0h, 24h, 48h i 72h)
Na grafiku zapažamo da je naneto ulje u startu delovalo (0 h) na bakterije,
redukovalo je znatan broj bakterija i rezultiralo nižom stopom rasta.Ćelije su se nakon tog
inicijalnog mikrobicidnog efekta oporavile i nastavile eksponencijalno razmnožavanje do
neke maksimalne vrednosti koja je slična kontrolnoj, dok nisu ušle u stacionarnu fazu (48
27
h) nakon čega, usled nedostatka resursa i nagomilavanja toksičnih produkata
metabolizma, njihova brojnost opada.
Slika 4. Rast kolonija salmonele iz mesa tretiranog etarskim uljem ruzmarina nakon 16 h inkubacije
Slika 5. Rast kolonija salmonele iz mesa koje nije tretirano etarskim uljem ruzmarina nakon 16 h
inkubacije
Pored toga što je antimikrobna aktivnost ruzmarina dokazana u mnogim naučnim
radovima, rezultati istraživanja na modelima hrane (Georgantelis et al., 2007; Karpinska-
28
Timoszczik, 2008; de Oliveira et al, 2013) koji su ukazivali na potencijal ovog ulja da
redukuje broj mikroorganizama u hrani nisu potvrđeni našim istraživanjem. Radovi na
različitim modelima hrane (mlevena govedina, pileće meso, ovčije mleveno meso)
kojima je tretirana salmonela ukazali su na činjenicu da određena etarska ulja imaju
mogućnost inhibicije njenog rasta (Burt et al., 2007; Hayouni et al., 2008; Govaris et al.,
2010; Rattanachaikunsopun & Phumkhachorn, 2010). Za razliku od njih, rezultati
postignuti ovim radom ukazuju na zanemarljiv efekat etarskog ulja kada se aplikuje na
pilećem mesu u koncentraciji do 2%.
Iako je eksperiment rađen sa dvema koncentracijama, etarsko ulje ruzmarina nije
pokazalo značajno inhibitorno dejstvo na rast ove bakterije u mesu. Međutim, u ovom
radu je korišćen veoma veliki početni inokulum od 107 ćelija po 5 g hrane za zaražavanje
mesa, što je veoma teško da se u realnim uslovima dogodi. Antimikrobni efekat etarskog
ulja ruzmarina bi se jače ispoljio ukoliko bi bio korišćen manji inokulum. Činjenica
proizašla iz ovog rada je da se u ovim koncentracijama etarsko ulje ruzmarina ne može
koristiti kao začinski dodatak koji će u isto vreme vršiti prevenciju kvarenja
mesauzrokovanog vrstom Salmonella enterica subsp. enteritidis.
29
4. Zaključak
Na osnovu rezultata prezentovanih u ovom radu zaključuje se:
1. Etarsko ulje dobijeno metodom hidrodestilacije iz nadzemnog dela biljne vrste R.
officinalis imalo je prinos 1.2% (v/w).Odlikovalo se svetlo žutom bojom, i bilo je
jakog karakterističnog, oporog mirisa, nalik na kamfor.
2. Mikrodilucionom metodom je ispitivana antimikrobna aktivnost etarskog ulja
nadzemnog dela ruzmarina i utvrđeno je dapri koncentraciji od 5 mg/ml etarsko
ulje pokazuje inhibitornu i mikrobicidnu aktivnost u odnosu na vrstu Salmonela
enterica subsp. enteritidis (ATCC 13076).
3. Prilikom upotrebe pilećeg mesa kao modela hrane, zapaženo je da je etarsko ulje
ruzmarina u samom startu značajno redukovalo brojnost bakterijskih ćelija.
Međutim, u kasnijim periodima inkubacije etarsko ulje pokazuje slabu
antimikrobnu aktivnost.
4. Rezultati su ukazali na činjenicu da se etarsko ulje ruzmarina ne može koristiti kao
dodatak mesu u cilju prevencije njegovog kvarenja, jer ne vrši značajnu inhibiciju
razmnožavanja ćelija salmonele.
30
5. Literatura:
Adams, M.R. & Moss, M.O., 2008: Food Microbiology (Third Edition).
University of Surrey, Guildford, UK.
Akgul, A., Kivanc¸, M., 1988: Inhibitory effects of selected Turkish spices and
oregano components on some foodborne fungi. - International Journal of Food
Microbiology 6: 263– 268.
Atti-Santos, A.C.; Rossato, M.; Fernandes Pauletti, G., Duarte Rota, L.; Ciro
Rech, J.; Regina Pansera, M.; Agostini, F.; Atti Serafini, L. i Moyna, P. 2005: Physico-
chemical Evaluation of Rosmarinus officinalis L. Essential Oils, - Brazilian archives of
biology and technology 6(48): 1035-1039.
Azzouz, M.A., Bullerman, L.B., 1982: Comparative antimycotic effects of
selected herbs, spices, plant components and commercial antifungal agents. - Journal of
Food Protection 45(14): 1298–1301.
Babović, N.V. &. Petrović, S.D., 2011: Izolovanje antioksidanasa postupkom
natkritične ekstrakcije. - Hem. ind. 65(1): 79–86.
Bauer, K. D., Garbe and H. Surburg , 2001: Common Fragrance and Flavor
Materials: Preparation, Properties and Uses. Wiley-VCH, Weinheim, 293.
Bishop, C.D., 1995: Antiviral activity of the essential oil of Melaleuca alternifolia
(Maiden and Betche) Cheel (tea tree) against tobacco mosaic virus. - Journal of Essential
Oil Research 7: 641– 644.
31
Bona, D.M.M., Tânia, et al., 2012: Oregano, rosemary, cinnamon essential oil and
pepper extract to controlSalmonella, Eimeria and Clostridium in broiler chickens. - Pesq.
Vet. Bras. 32(5), - SciELO, Sao Paolo, Brazil.
Borras-Linares, I., Stojanovic, Z., Quirantes-Piné, R., Arráez-Román, D.,Švarc-
Gajić, J., Fernández-Gutiérrez, A., Segura-Carretero, A., 2014:Rosmarinus officinalis
Leaves as a Natural Source of Bioactive Compounds, - International Journal of
Molecular Sciences15: 20585-20606, - MDPI, Basel, Switzerland.
Bošković, M., Baltic, M., Janjic, J., Dokmanovic, M., Ivanovic, J., Markovic, T. et
al. 2013: Antimikrobna aktivnost etarskih ulja na Salmonella spp. u mesu i proizvodima
od mesa. – Lekovite sirovine 33: 39-52.
Boutekedjiret, C., Bentahar, F., Belabbes, R. & Bessiere, J., 2003: Extraction of
rosemary essential oil by steam distillation and hydrodistillation. - Flavour and
Fragrance J. 18: 481.
Boutoial, K., Ferrandini, E., Rovira, S., Garcia, V., López, B., 2013: Effect of
feeding goats with rosemary (Rosmarinus officinalisspp.) by-product on milk and cheese
properties,- Small Ruminant Research 112(1-3): 147–153, - Elsevier, Amsterdam.
Bozin, B., Mimica-Dukic, N., Samojlik, I., Jovin, E., 2007: Antimicrobial and
antioxidant properties of rosemary and sage (Rosmarinus officinalisL. and Salvia
officinalis L., Lamiaceae) essential oils. -Journal of agricultural and food chemistry
55(19): 7879-7885, - American Chemical Society,Washington.
Bubonja-Šonje, M., Giacometti, J., Abram, M., 2011: Antioxidant and antilisterial
activity of olive oil, cocoa and rosemary extract polyphenols. – Food Chemistry 127(4):
1821-1827, - Elsevier, Amsterdam.
Burt, S. 2007: Antibacterial activity of essential oils: potential applications in
food. - Ph.D. thesis
32
Burt, S., 2004: Essential oils: Their antibacterial properties and potential
applications in foods - a review. - International Journal of Food Microbiology 94: 223–
253, - Elsevier, Amsterdam.
Celiktas, O., Kocabas, E.E., Bedir E., Sukan, F., Ozek, T., Baser, K., 2007:
Antimicrobial activitiesof methanol extracts and essentials oils of Rosmarinus officinalis,
depending on location andseasonal variations. - Food Chem. 100 (2): 553-559.
Chalchat, J. C.; Garry, R. P.; Michet, A.; Benjilali, B. and Chabat, J. L., 1993:
Essential oils of rosemary (Rosmarinus officinalis L.) The chemical composition of oils
of various origins (Maroccom Spain, France). - Journal of Essential Oils Research 5:
613-618.
Crosthwaite, D., 1998: UK trade within the flavour and fragrance industry.
International Federation of Essential Oils and Aroma Trades — 21st International
Conference on Essential Oils and Aroma’s. IFEAT, London, 6–12.
Crump, J. A., Luby, S. P., Mintz, E. D. 2004: The global burden of typhoid fever.
Bulletin of the World Health Organization.Supplement 82346.
da Silveira, S. M., Cunha Junior, A., Scheuermann, G. N., Secchi, F. L. & Vieira,
C. R., 2012: Chemical composition and antimicrobial activity of essential oils from
selected herbs cultivated in the South of Brazil against food spoilage and foodborne
pathogens. - Cienia Rural 42(7): 1300-1306.
de Melo, A. M. A., Geraldine, M. R., Silveira, F. A. M., Lopes-Torres, C. M.,
Rezende, S., M., C., Fernandes, H. T., de Oliviera, N. A., 2012: Microbiological quality
and other characteristics of refrigerated chicken meat in contact with cellulose acetate-
based film incorporated with rosemary essential oil. - Braz J Microbiol. 43(4): 1419-
1427, - SciELO.
33
de Oliveira, M. M. M., Brugnera, D. F. & Piccoli, R. H., 2013: Essential oils of
thyme and rosemary in the control of Listeria monocytogenesin the raw beef. - Brazilian
Journal of Microbiology 44(4): 1181-1188.
Del Campo, J., Amiot, M., J., Nguyen-The, C., 2000: Antimicrobial Effect of
Rosemary Extracts. - Journal of Food Protection 10: 1315-1449; 1359-1368. -
International Association for Food Protection, Des Moines, Iowa.
Dimitrijević, D., 2000: Postupci sanitacije u proizvodnji i preradi mesa. -
Tehnologija mesa 41: 1–3, 39–48.
Duckova, V., Čanigová, M., Kročko, M., Bezeková, J., 2012:Antibacterial
Activity Of Thyme And Rosemary Essential Oil Against Enterococci Isolated From
Meat. – Potravinarstvo (Scientific Journal for Food Industry) 6(1): 10-13, - Association
HACCP Consulting, Nitrianske Hrnciarovce.
Elgayyar, M., Draughon, F. A., Golden, D. A., Mount, J. R., 2001: Antimicrobial
activity of essential oils from plants against selected pathogenic and saprophytic
microorganisms. - Journal of Food Protection 64(7): 1019-1024, - International
Association for Food Protection, Des Moines, Iowa.
Fernandez-Lopez, J., Zhi, N., Aleson-Carbonell, L., Pérez-Alvarez, J.A., Kuri, V.,
2005: Antioxidant and antibacterial activities of natural extracts: application in beef
meatballs. - Meat Science 69: 371-380. – Elsevier, Amsterdam.
Georgantelis, D., Ambrosiadis, I., Katikou, P., Blekas, G., Georgakis, S.A., 2007:
Effect of rosemary extract, chitosan and α-tocopherol on microbiological parameters and
lipid oxidation of fresh pork sausages stored at 4°C. - Meat Sci. 76(1): 172-181.
Govaris, A., Solomakos, N., Pexara, A., Chatzopoulou, P. S. (2010): The
antimicrobial effect of oregano essential oil, nisin and their combination against
34
Salmonella Enteritidis in minced sheep meat during refrigerated storage. International
Journal of Food Microbiology 137: 175-180.
Grimont, P. A. D., Weill, F. X. 2007: Antigenic Formulae of the Salmonella
Serovars, Ninth Edition, World Health Organization Collaborating Centre for Reference
and Research on Salmonella. Institut Pasteur, Paris, France.
Guard-Petter, J. 2001: The chicken, the egg and Salmonella enteritidis. –
Environmental Microbiology 3(7): 421-430.
Guenther, E. 1948: The Essential Oils. D. Van Nostrand, New York.
Gunell M. 2010: Salmonella enterica: Mechanisms of Fluoroquinolone and
Macrolide Resistance. Thesis PhD. University of Turku, Finland.
Guthrie, R. K. 1992: Salmonella. Boca Raton, Florida: CRC Press.
Gutierrez, J., Barry-Ryan, C., Bourke, P., 2008: The antimicrobial efficacy of
plant essential oil combinations and interactions with food ingredients. - International
Journal of Food Microbiology124(1): 91–97, - Elsevier, Amsterdam.
Hać-Szymańczuk, E., Lipińska, E. & Stasiukthe, M., 2011: Effect of rosemary
preparations on the microbial quality and tbars value of model pork batters. - Acta sci.
Pol., technol. Aliment., 10(2): 165-174. Warsaw Agricultural University – SGGW.
Han, J. H., Patel, D., Kim, E. J., Min, C. S., 2014: Retardation of listeria
monocytogenes growth in mozzarella cheese using antimicrobial sachets containing
rosemary oil and thyme oil. - J Food Sci.79(11): 2272-2278, - Institute of Food
Technologists, Chicago, Illinois, USA.
Hayouni, E. A., Chraief, I., Abedrabba, M., Bouix, M., Leveau, J. Y., Mohammed
H., Hamdi M., 2008: Tunisian Salvia officinalis L. and Schinus molle L. essential oils:
35
Their chemical compositions and their preservative effects against Salmonella inoculated
in minced beef meat. International Journal of Food Microbiology 125: 242-251.
Hoelzer, K, Switt, AIM and Wiedmann, M. 2011: Animal contact as a source of
human non-typhoidal salmonellosis. - Vet Res 42:34.
Ivanović, J., Aničić, N., Žižović, I., Petrović, S.D., 2007: Natkritični CO2 biljni
ekstrakti kao dodaci u proizvodnji i preradi mesa. - Tehnologija mesa 48: 5-6, 236-241. -
Institut za higijenu i tehnologiju mesa, Beograd.
Kabir, SML. 2010: Avian Colibacillosis and Salmonellosis: A Closer Look at
Epidemiology, Pathogenesis, Diagnosis, Control and Public Health Concerns. - Int J
Environ Res Public Health 7: 89-114.
Karakašević, B. 1987: Mikrobiologija i parazitologija.-Medicinska knjiga, str.677-
683, Beograd-Zagreb.
Karpinska-Tymoszczyk M., 2008: Effect of the addition of ground rosemary on
the quality and shelf-life of turkey meatballs during refrigerated storage. - British Poultry
Sci. 49(6), 742-750.
Klaus, A., Beatović, D., Nikšić, M., Jelačić, S., Petrović, T., 2009: Antibakterijska
aktivnost etarskih ulja iz aromatičnih biljaka iz Srbije na Listeria monocytogenes. -
Journal of Agricultural Sciences 54(2): 95-104, - Poljoprivredni fakultet, Beograd.
Klaus, A., Beatović, D., Nikšić, M., Jelačić, S., Petrović, T., 2009: Antibacterial
activity of aromatic plants essential oils from Serbia against the Listeria monocytogenes.
- Journal of Agricultural Sciences 54(2): 95-104, - Faculty of Agriculture, Belgrade.
Klaus, A., Beatović, D., Nikšić, M., Jelačić, S., Petrović, T., 2008: Influence of
ethereal oils extracted from Lamiaceae family plants on some pathogen microorganisms.
- Zbornik Matice srpske za prirodne nauke 115: 65-74, Novi Sad.
36
Konstantopoulou, I., Vassilopoulou, L., Mavragani-Tsipidou, P., Scouras, Z.G.,
1992: Insecticidal effects of essential oils. A study of the effects of essential oils
extracted from eleven Greek aromatic plants on Drosophila auraria. - Experientia 48 (6):
616– 619.
Kozoderović, G. 2012: Analiza prirode rezistencije na hinolone i molekularna
tipizacija odabranih serotipova Salmonella enterica subspecies enterica. Doktorska
disertacija, Biološki fakultet, Univerzitet u Novom Sadu.
Lakušić, D. V., Ristić, M. S., Slavkovska, V. N., Sinžar-Sekulić, J. B., Lakušić, B.
S. 2012: Environment-related variations of the composition of the essential oils of
rosemary (Rosmarinus officinalis L.) in the Balkan Penninsula. – Chemistry &
biodiversity 9(7): 1286-302.
Lakušić, D., Ristić, M.,Slavkovska, V. iLakusić, B. 2013: Seasonal variations in
the composition of the essential oils of rosemary (Rosmarinus officinalis, Lamiaceae). –
Natural product communications 8(1):131-4.
Mahmoud, S.S., Croteau, R.B., 2002: Strategies for transgenic manipulation of
monoterpene biosynthesis in plants. - Trends in Plant Science 7(8): 366–373.
Mead, P., Slutsker, L., Dietz, V., et al. 1999: Food-related illness and death in the
United States. - Emerging Infectious Diseases 5: 607–625.
Miljković-Selimović, B., Babic, T., Stojanovic, P. 2010: Salmonella enterica
subspecies enterica serotip Enteritidis – aktuelnost i znacaj. - Acta Medica Medianae
49(3): 71-75.
Moreno, S., Scheyer, T., Romano, C. S., Vojnov, A. A., 2006: Antioxidant and
antimicrobial activities of rosemary extracts linked to their polyphenol composition. -
Free Radic Res. 40(2): 223-31, - Informa Healtcare, Gubelstrasse, Switzerland.
37
Moyosoluwa, O., Kaatz, G.W., Gibbons, S., 2004: Antibacterial and resistance
modifying activity of Rosmarinus officinalis. - Phytochemistry 65(24): 3249-3254.
Pandey, R., Kalra, A., Tandon, S., Mehrotra, N., Singh, H.N., Kumar, S., 2000:
Essential oil compounds as potent source of nematicidal compounds. - Journal of
Phytopathology 148 (7–8), 501–502.
Perry, J. 2010: Ozone based treatments for inactivation of Salmonella enterica
serovar Enteritidis in shell eggs. - PhD Thesis, Food Science and Nutrition Graduate
Program, The Ohio State University.
Pessoa, L.M., Morais, S.M., Bevilaqua, C.M.L., Luciano, J.H.S., 2002:
Anthelmintic activity of essential oil of Ocimum gratissimum Linn. and eugenol against
Haemonchus contortus. - Veterinary Parasitology 109 (1– 2): 59–63.
Rattanachaikunsopon, P.& Phumkhachorn, P., 2010: Antimicrobial activity of
basil (Ocimum basilicum) oil against Salmonella enteritidis in vitro and in food. -
Bioscience, biotechnology, and biochemistry74(6): 1200-1204.
Ristić, J., 2015: Uticaj etarskog ulja bosiljka (Ocimum basilicum L.) na rast
Salmonella enterica subsp. enteritidis u mesu. PhD Master thesis. Prirodno matematički
fakultet, Univerzitet u Nišu.
Roldan, L. P., Gonzalo J Díaz, M. V., Duringer, M. J., 2010: Composition and
antibacterial activity of essential oils obtained from plants of the Lamiaceae family
against pathogenic and beneficial bacteria. - PhD thesis. Universidad Nacional de
Colombia, Bogotá.
Rowe, B., Ward, L. R., Threlfall, E. J. 1997: Multidrug-resistant Salmonella typhi:
A worldwide epidemic. - Clin Infect Dis 24: 106-109.
38
Stojanović-Radić, Z., Nešić, M., Čomić, Lj. i Radulović, N., 2010: Antimicrobial
activity and cytotoxicity of commercial rosemary essential oil (Rosmarinus officinalis
L.). - Biologica Nyssana 1 (1-2): 83-88.
Tajkarimi, M. M., Ibrahim, S. A., Cliver D. O. (2010): Antimicrobial herb and
spice compounds in food. Food Control 21: 1199-1218
Van de Braak, S.A.A.J., Leijten, G.C.J.J., 1999: Essential Oils and Oleoresins: A
Survey in the Netherlands and other Major Markets in the European Union. CBI, Centre
for the Promotion of Imports from Developing Countries, Rotterdam, p. 116.
Velge, P, Cloeckaert, A and Barrow, P. 2005: Emergence of Salmonella
epidemics: The problems related to Salmonella enterica serotype Enteritidis and multiple
antibiotic resistance in other major serotypes. - Vet Res 36: 267-288.
Wieczorkiewicz-Gornik M., 2003: Badanie skuteczności działania olejków
eterycznych metodą impedymetrii [Investigation on the effectiveness of essentials oils by
impedimentary method]. - Aromaterapia 9(3): 44-49 [in Polish].
World Health Organization (WHO), 2002: Risk assessments of Salmonella in eggs
and broiler chickens, Food and Agriculture Organization of the United Nations, Geneva,
Switzerland.
World Health Organization (WHO), 2009: WHO monographs on selected
medicinal plants 4,Food and Agriculture Organization of the United Nations, Geneva,
Switzerland.
39
Прилог 5/1
ПРИРОДНO - MАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ НИШ
КЉУЧНА ДОКУМЕНТАЦИЈСКА ИНФОРМАЦИЈА
Редни број, РБР:
Идентификациони број, ИБР:
Тип документације, ТД: монографска
Тип записа, ТЗ: текстуални / графички
Врста рада, ВР: мастер рад
Аутор, АУ: Сања Ничић
Ментор, МН: Зорица Стојановић-Радић
Наслов рада, НР: Утицај етарског уља рузмарина (Rosmarinus officinalis L.) на раст Salmonella enterica subsp. enteritidis
Језик публикације, ЈП: српски
Језик извода, ЈИ: енглески
Земља публиковања, ЗП: Р. Србија
Уже географско подручје, УГП: Р. Србија
Година, ГО: 2016.
Издавач, ИЗ: ауторски репринт
Место и адреса, МА: Ниш, Вишеградска 33.
Физички опис рада, ФО: (поглавља/страна/ цитата/табела/слика/графика/прилога)
38 стрaне, 1 табела, 6 слика, 1 график
Научна област, НО: биологија
Научна дисциплина, НД: микробиологија
Предметна одредница/Кључне речи, ПО: етарско уље, рузмарин (Rosmarinus officinalis L.), антимикробна активност, Salmonella
УДК 547.913..635.71+561.23..641.12
Чува се, ЧУ: библиотека
Важна напомена, ВН:
Извод, ИЗ: Циљ мастер рада је био да се истражи ефикасност етарског уља рузмарина у спречавању кварења пилећег меса. Пошто се Salmonella enterica subsp. enteritidis често може изоловати из ове врсте меса, истраживање је је усмерено ка ефикасности овог уља на дату врсту. Етарско уље је изоловано из сувог биљног материјала хидродестилацијом. Антимикробна активност је испитана одређивањем минималне инхибиторне концентрације микродилуционом методом, док је његов ефекат на раст испитиване бактерије тестиран на пилећем месу. Испитивање је вршено на собној температури при различитим периодима инкубације.
50 250Датум прихватања теме, ДП: 9.9.2015. Датум одбране, ДО:
Чланови комисије, КО: Председник: Члан: Члан, ментор:
Образац Q4.09.13 - Издање 1
Прилог 5/2
ПРИРОДНО - МАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ НИШ
KEY WORDS DOCUMENTATION
Accession number, ANO: Identification number, INO:
Document type, DT: monograph
Type of record, TR: textual / graphic
Contents code, CC: Master thesis
Author, AU: Sanja Ničić
Mentor, MN: Zorica Stojanović-Radić
Title, TI: Effect of rosemary essential oil (Rosmarinus officinalis L.) to the growth of Salmonella enterica subsp. enteritidis in meat
Language of text, LT: Serbian
Language of abstract, LA: English
Country of publication, CP: Republic of Serbia
Locality of publication, LP: Serbia
Publication year, PY: 2016.
Publisher, PB: author’s reprint
Publication place, PP: Niš, Višegradska 33.
Physical description, PD: (chapters/pages/ref./tables/pictures/graphs/appendixes)
38 pages, 1 table, 6 pictures, 1 graph
Scientific field, SF: biology
Scientific discipline, SD: microbiology
Subject/Key words, S/KW: Essential oil, rosemary (Rosmarinus officinalis L.), antimicrobial activity, Salmonella
E i idiUC 547.913..635.71+561.23..641.12
Holding data, HD: library
Note, N:
Abstract, AB: The aim of the master thesis was to investigate the effectiveness of essential oils of rosemary in preventing spoilage of poultry meat. Since Salmonella enterica subsp. enteritidis often be isolated from this type of meat, the research is directed towards the efficiency of this type of oil to date. The oil was isolated from the dried plant material by distillation. Antimicrobial activity was tested by determining the minimal inhibitory concentrations microdilution method, while its effect on the growth of the test bacteria on the chicken meat tested. The test was performed at room temperature for various periods of incubation.
Accepted by the Scientific Board on, ASB: 9.9.2015.
Defended on, DE:
Defended Board, DB: President:
Member:
Member, Mentor:
Образац Q4.09.13 - Издање 1