ปญหาพิเศษปริญญาตรี

สาขาวิชาเทคโนโลยีชีวภาพทางการเกษตร

เร่ือง

การตรวจคัดเลือกสายพันธุมะเขือเทศดัดแปรพันธุกรรมรุน R1 และ R2 ใหตานทานตอ cucumber mosaic virus

Screening and checking of R1 and R2 transgenic tomato for resistance to cucumber mosaic virus

โดย นายปรัชพงษ กุศลพุทธรักษ

ควบคุมและอนุมัติโดย

………………………………………. ……….. วันท่ี…..เดือน……………พ.ศ. ……. (ผูชวยศาสตราจารย ดร.พิสสวรรณ เจียมสมบัต)ิ

สารบัญ

หนา สารบัญตาราง (1) สารบัญภาพ (2)

คํานํา 1 วัตถุประสงค 2 ตรวจเอกสาร 3

อุปกรณและวธีิการ 7 ผลการทดลอง 10 วิจารณผลการทดลอง 16 สรุปผลการทดลอง 17 เอกสารอางอิง 18

สารบัญตาราง

ตารางที่ หนา 1 อัตราการงอกของเมล็ดพันธุมะเขือเทศดัดแปรพนัธุกรรมรุน R1 10 2 อัตราการงอกของเมล็ดพันธุมะเขือเทศดัดแปรพนัธุกรรมรุน R2 10

3 ผลการตรวจวดัปริมาณไวรัส CMV ในตนมะเขือเทศ 12 ดัดแปรพันธุกรรมรุน R2 จํานวน 7 lines ภายหลังการปลูก เชื้อ CMV สายพันธุ 30RS เปนเวลา 20 วัน โดยใชเทคนิค ELISA

สารบัญภาพ

ภาพที่ หนา

1 ผลการตรวจหายีน Rep ของ CMV บนโครโมโซมของ 13 มะเขือเทศจําลองพันธุรุน R1 ดวยเทคนิค PCR วิเคราะห ขนาดดีเอ็นเอดวย 0.8% agarose gel electrophoresis 2 ผลการตรวจหายีน Rep ของ CMV บนโครโมโซมของ 14 มะเขือเทศจําลองพันธุรุน R2 ดวยเทคนิค PCR วิเคราะห ขนาดดเีอ็นเอดวย 0.8% agarose gel electrophoresis 3 ลักษณะอาการของมะเขือเทศพันธุ VF 134-1-2 รุน R2 15

และตนยาสูบ

การตรวจคัดเลือกสายพันธุมะเขือเทศดัดแปรพันธุกรรมรุน R1 และ R2 ใหตานทานตอ

cucumber mosaic virus

นายปรัชพงษ กุศลพุทธรักษ

บทคัดยอ ตรวจสอบมะเขือเทศพันธุ VF134-1-2 ที่ดัดแปรพนัธุกรรมรุนลูกชั่วที่ 1 (R1) และรุนลูกชั่ว

ที่ 2 (R2) ที่ไดรับการถายยีนเรพลิเคสที่ไมสมบูรณ (ยีน Rep) ของ cucumber mosaic virus (CMV) เพื่อคัดเลือกสายพันธุที่มีความตานทานตอไวรัส ตรวจสอบการมี transgene ในโครโมโซมของมะเขือเทศ และปลูกเชื้อ CMV ใหกับมะเขือเทศดัดแปรพันธุกรรมรุน R2 เพื่อประเมินระดับความตานทานตอไวรัส เก็บและเพาะเมล็ดมะเขอืเทศดัดแปรพนัธุกรรมรุน R1 line# A1-1 , B1-1 B1-3, C/10-1, C/20-1 และ C/20-2 พบวาเมล็ดมีอัตราการงอก 77.23-100% ผลการตรวจสอบ transgene ในมะเขือเทศดัดแปรพันธุกรรมรุน R1 ดวยเทคนิค Polymerase Chain reaction (PCR) พบวามะเขือเทศรุน R1 line #A1-1มี transgene จึงเก็บผลมะเขือเทศที่ไดจากการผสมตัวเองของ line ดังกลาวมา 7 ผล เพาะเมล็ดผลละ 6 เมล็ดไดเปนมะเขือเทศดัดแปรพนัธุกรรมรุน R2 line# 1-1-1 , 1-1-2 1-1-3 , 1-1-4 , 1-1-5 , 1-1-6 และ 1-1-7 พบวาเมล็ดมีอัตราการงอก 83.33-100% มะเขือเทศรุน R2 ทุกตนที่ทดสอบดวยเทคนิค PCR มี transgene (ยีน Rep) และเมื่อตรวจสอบปริมาณไวรัส CMV ในตนมะเขือเทศรุน R2 ดวยเทคนิค ELISA ภายหลังปลูกเชื้อดวยวธีิกลแลว 20 วัน ไมพบวาในมะเขือเทศดัดแปรพันธุกรรมมีเชื้อ CMV จากการทดลองครั้งนี้ ทําใหไดมะเขือเทศ VF 134-1-2 ดัดแปรพันธุกรรมรุน R1 line #A1-1 และ รุนลูก R2 ทุกตนที่มีการถายทอด transgene และมีแนวโนมสามารถตานทานตอเชือ้ CMVไดด ี คําสําคัญ :ยีนเรพลิเคสทีไ่มสมบูรณ, cucumber mosaic virus,มะเขอืเทศดัดแปรพนัธุ กรรม สาขาวิชา :เทคโนโลยีชีวภาพทางการเกษตร ปญหาพิเศษ :ปริญญาตรี สาขาวิชาเทคโนโลยีชีวภาพทางการเกษตร คณะเกษตร กําแพงแสน มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร อาจารยที่ปรึกษา :ผูชวยศาสตราจารย ดร.พิสสวรรณ เจยีมสมบัติ ปที่พิมพ :2546 จํานวนหนา :19

Screening of R1 and R2 transgenic tomato for resistance to cucumber mosaic virus

Mr.Patchapong Kusonphutdharak

ABSTRACT

Screening of R1 and R2 transgenic tomato plants,VF134-1-2 , for resistance to cucumber mosaic virus (CMV) was performed by examining the present of transgene, and by mechanical inoculation of the virus on tomato leaves followed by determination of virus titre in plants using ELISA .Producing of the R1 progenies line #A1-1, B1-1, B1-3, C/10-1, C/20-1 and C/20-2 was done by self pollination of R0 plants.Seeds from these R1 fruits had about 77.23-100 germination percentage.Detection of defective replicase gene (Rep gene) by polymerase chain reaction showed that R1 line # A1-1 contained transgene.At 20 days post inoculation , all R2 transgenic tomato plants exhibited non-detectable titre of CMV , showing potential resistance to CMV infection. Key words :Defective replicase gene ,cucumber mosaic virus,transgenic tomato Field :Agricultural Biotechnology Degree :B.S.(Agricultural Biotechnology) Advisor :Pissawan Chiemsombat ,Dr.Agr. Year :2003 Pages :19

คํานิยม

ขอขอบพระคุณผูชวยศาสตราจารย ดร.พิสสวรรณ เจียมสมบัติ อาจารยที่ปรึกษาปญหาพิเศษเปนอยางสูงที่ไดใหความรู คําแนะนาํ และเปนทีป่รึกษาที่ดี รวมทั้งใหความชวยเหลือในดานตาง ๆ ทั้งที่เกี่ยวของกับการทําปญหาพิเศษและที่ไมเกีย่วของเปนอยางดีเสมอมา ขอขอบพระคุณพี่อัญจนา บญุชด,พี่วิมล สีเทา,พี่สิริรัตน หินออน,สุดารัตน ขุนเมือง และพี่ ๆ ทุกทานในหองปฏิบัติการภาควิชาโรคพืช และหองปฏิบตัิการอาคารปฏิบัติการวิจัยพนัธุวิศวกรรมดานพืชและพัฒนาผลิตภัณฑเทคโนโลยีชีวภาพ ที่คอยใหความชวยเหลือ ใหความรู และเปนกําลังใจทีด่ีในการทําการทดลองมาตลอด ขอขอบพระคุณคุณพอสมเจตน คุณแมสุดารัตน และนองสาวที่คอยใหกําลังใจ และใหการสนับสนุนมาตลอด จนกระทัง่ปญหาพิเศษฉบับนี้เสร็จสิ้นลง การทําปญหาพิเศษครั้งนี้สําเร็จไดดวยดีเนือ่งจากไดรับความกรุณาจากบุคคลหลาย ๆ ทาน ทําใหรูวาในการทํางานชิ้นหนึ่ง ๆ ขึ้นมานั้น ไมสามารถทําเพียงคนเดียวได หรือทําไดแตก็อาจจะไมมีประสิทธิภาพที่ดีพอ สงผลใหรูวา คนเราไมสามารถอยูคนเดยีวบนโลกใบนี้ได

ปรัชพงษ กุศลพุทธรักษ มีนาคม 2547

คํานํา

มะเขือเทศจัดเปนผักที่มีความสําคัญทางเศรษฐกิจชนิดหนึ่งของประเทศไทย ซ่ึงใชสําหรับการบริโภคผลสดและนําไปใชประโยชนในทางดานอุตสาหกรรมอาหารและการแปรรูป เชน เครื่องดื่ม เครื่องปรุงรส และขนมหวาน เปนตน แตการผลิตมะเขือเทศในประเทศไทยมักจะประสบปญหาอยูเสมอ ที่สําคัญ คือ ปญหาดานการควบคุมโรคและแมลง โดยเฉพาะโรคตางๆ ที่เกิดจากเชือ้ไวรัส โรคของมะเขือเทศที่เกิดจากเชื้อไวรัสที่มีรายงานพบในประเทศไทยไดแก โรคใบหงิกที่เกิดจาก Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) โรคใบดางเรียวเล็กทีเ่กิดจาก cucumber mosaic virus (CMV) และโรคใบดางที่เกดิจาก tomato mosaic virus (ToMV) หรือ tobacco mosaic virus (TMV) (ธีระ,2532) สําหรับ cucumber mosaic virus (CMV) เปนเชื้อสาเหตทุี่ทําใหมะเขือเทศแสดงอาการใบดางเขียวเขมสลับสีเขียวออน และใบลดขนาดเรียวเล็กเห็นไดชัดเจนจนมีลักษณะคลายเสนดายหรือเชือกผูกรองเทา (shoe string) ซ่ึงสรางความเสียหายใหกับมะเขือเทศพันธุการคาในแหลงปลูกทั่วไป โรคนี้ถายทอดไดโดยเพลี้ยออนและยังไมมีวิธีควบคุมโรคไดอยางมีประสิทธิภาพ (ธีระ,2532) พันธุวิศวกรรมเปนวิธีการหนึ่งที่นํามาใชในการสรางพันธุพืชที่มีความตานทานตอการเขาทําลายของไวรัส โดยการตัดตอยีนบางสวนของไวรัสสาเหตุโรคพืชเขาไปในพืชชนิดนั้น ๆ โดยพืชที่ไดรับกาiถายยีนนั้นจะเรยีกวา พืชจําลองพันธุ หรือพืชดัดแปรพนัธุกรรม (transgenic plant หรือ GMO) ในประเทศไทยอัญจนา (2543)ไดผลิตมะเขือเทศจําลองพันธุที่มีความตานทานตอ CMV โดยการถายยนีเรพลิเคสที่ไมสมบูรณ (defective replicase gene) เขาสูมะเขือเทศพนัธุ VF 134-1-2 พบวามะเขือเทศดัดแปรพนัธุกรรมรุน R0ตานทานตอการทําลายของเชื้อ CMV ได สิริรัตน (2546)ทําการตรวจสอบมะเขือเทศดัดแปรพนัธุกรรมรุนลูกชั่วที่ 1 (R1) พบวา line # 1-1, #7 และ #2 บางตนมีตานทานตอเชื้อ CMV ได กลไกความตานทานตอไวรัสนั้น อาจเกิดจากยนี Rep ไปยับยั้งการเพิ่มปริมาณของไวรัส หรือเกิดจากการผลิตเอนไซม replicase ที่ผิดปกติไปจากเดมิและมีปริมาณมากจนสามารถที่จะยับยั้งกิจกรรมของเอนไซม replicase ของไวรัสได (Anderson และคณะ,1992)โดยยนีและความตานทานดังกลาวนั้นสามารถถายทอดไปสูรุนลูกไดตามกฎ gene segregation ของเมนเดล ในการทดลองครั้งนี้ทําการผลิตมะเขือเทศจําลองพันธุรุน R1 และ R2 พรอมทั้งตรวจสอบการปรากฏของยีน Rep และความตานทานตอเชื้อ CMV ซ่ึงพบวามีการถายทอดยีนและความตานทานตอไวรัสไปสูรุนลูกชั่วที่ 2 ได

วัตถุประสงค

1.ผลิตมะเขือเทศ VF134-1-2 ดัดแปรพันธกุรรมรุนลูกชั่วที ่1 และ 2 (R1 และ R2) ที่ไดรับ transgene 2. ตรวจสอบและคัดเลือกมะเขือเทศดัดแปรพันธุกรรมรุนลูก R2 ที่มีความตานทานตอ เชื้อ CMV

สถานที่ทําการทดลอง หองปฏิบัติการภาควิชาโรคพืช คณะเกษตร มหาวทิยาลัยเกษตรศาสตร วิทยาเขต

กําแพงแสน จงัหวัดนครปฐม หองปฏิบัติการพันธุวิศวกรรมดานพืช อาคารปฏิบัติการวิจัยพันธุวิศวกรรมดานพชืและ

พัฒนาผลิตภณัฑเทคโนโลยีชีวภาพ มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร วิทยาเขตกําแพงแสน จังหวดันครปฐม

โรงเรือนและแปลงปลูกพืชทดลองภาควิชาโรคพืช คณะเกษตร มหาวทิยาลัยเกษตรศาสตร วิทยาเขตกําแพงแสน จังหวดันครปฐม

เวลาท่ีทําการทดลอง

เมษายน 2546-กุมภาพนัธ 2547

ตรวจเอกสาร ลักษณะทั่วไปของมะเขือเทศ

มะเขือเทศเปนพืชที่ปลูกกันทั่วไปเพื่อใชรับประทานผลสดหรือนําไปแปรรูป มีช่ือ

วิทยาศาสตรวา Lycopersicon esculentum Mill. จัดอยูในวงศ Solanaceae เชนเดียวกับมะเขือ มันฝร่ังพริกและยาสูบ เปนไมพุมเตี้ย อายุปเดยีว สูงประมาณ 0.75-2 เมตร ลําตนแข็งแรงมีขนปกคลุม มีตอมน้ํามันกระจายอยูทั่วไป ทําใหมีกล่ินเฉพาะตวั มรีะบบรากแกวแข็งแรงและเกดิรากฝอยใหมไดตามลําตนที่สัมผัสกับดิน ใบมีลักษณะแตกตางกันไปตามพันธุ สวนใหญใบยอยเรียงสลับกัน มีหยักลึกตื้นตางกัน ชอดอกจะเกดิระหวางใบหรือตรงขามกับใบ โดยทั่วไปมีจํานวนดอกยอยในแตละชอดอกประมาณ 4-8 ดอกเปนดอกสมบูรณเพศ กลีบดอกมีสีขาวขณะยังตูม แลวเปลี่ยนเปนสีเหลืองสดเมื่อถึงระยะดอกบาน มะเขือเทศเปนพืชผสมตัวเองเกือบ 100 เปอรเซ็นต ผลมีสีเขียวออนแลวเปลี่ยนเปนสีชมพูหรือสมแดงหรือเหลือง เมื่อผลสุก ขนาดผลจะแตกตางกันไป ตั้งแต 10-200 กรัม หรือกวาง 1-15 เซนติเมตร มีเมล็ดภายในผล 60-300 เมล็ดตอผล และน้ําหนกัเมล็ด 1 กรัม มีจํานวนเมล็ดประมาณ 400 เมล็ด (กรุง , 2536;ศุภลักษณ,2536)

ลักษณะประจําพันธุของมะเขือเทศพันธุ VF134-1-2

เปนมะเขือเทศพันธุแท มีลักษณะการเจริญเติบโตของตนแบบไมทอดยอด ประกอบดวยชอดอกขาง (axillary raceme) และชอดอกปลายยอด (terminal raceme) ชอดอกขางจะออกดอกขอเวนขอ ตนแข็งแรงดี มีใบปกคลุมมาก ทรงพุมแนนไมตองขึ้นคาง ผลมีน้ําหนักประมาณ 57 กรัม เนื้อหนา แนน เปนพันธุที่สามารถปรับตัวใหเขากับสภาพแวดลอมตาง ๆไดดี มีอายุการเก็บเกีย่วผลไดหลังจากยายกลาปลูกประมาณ 70 วัน (กลุมเกษตรสัญจร,2531;มณีฉัตร,2538)

มะเขือเทศเปนพืชที่ออนแอตอการเขาทําลายของโรคตางๆ ไดเกือบทกุชนิด โรคสาํคัญที่พบแพรระบาดและสรางความเสียหายใหกับมะเขือเทศในแหลงปลูกทั่วไปคือโรคเหี่ยวที่เกดิจากเชื้อแบคทีเรีย โรคเหี่ยวทีเ่กิดจากเชื้อรา Fusarium โรคใบจุดสีน้ําตาล (early blight) โรคตนใบแหง (late blight) โรครากปมที่เกดิจากไสเดือนฝอย และโรคที่เกิดจากเชื้อไวรัสชนิดตางๆ (ศักดิ,์2537)

อาการของโรคใบดางที่เกิดจาก cucumber mosaic virus (CMV)

CMV เปนเชือ้ไวรัสที่พบแพรระบาดทั่วไปในทุกเขตทัว่โลก มีพืชอาศัยหลายชนิด แพรระบาดไดโดยแมลงจําพวกเพลี้ยออนหลายสปชีส ทําใหการควบคุมโรคนี้เปนไปไดยาก สําหรับในประเทศไทยพบวา มะเขือเทศพันธุที่ปลูกเปนการคาโดยทั่วไปเมื่อถูก CMV เขาทําลาย จะแสดงอาการใบดางสีเขียวเขมสลับสีเขียวออน ใบมีขนาดเล็กลงกวาปกติ ถามะเขือเทศแสดงอาการรุนแรง ใบจะมีลักษณะเรียวยาว เพราะเนื้อใบหดหายไป ในที่สุดจะเหลือแตเสนกลางใบ จึงทําใหมีลักษณะคลายเสนดายหรือเชือก อาการแบบนี้เรียกวา fern leaf หรือ shoe string ซ่ึงเปนอาการที่พบเฉพาะพืชที่ถูก CMV เขาทําลาย เชน พืชจําพวกแตง และพริกตางๆ ตนมะเขือเทศที่แสดงอาการใบเรียวเล็กนี้จะไมติดผล หรือผลมีขนาดเล็ก (ธีระ,2532;ศุภลักษณ,2536) CMV มีอนุภาคเปนรูปทรงกลม ขนาดเสนผาศูนยกลางประมาณ 30 นาโนเมตร มคีวามคงทนตอความรอน (Thermal inactivation point, TIP) ที่อุณหภูมิ 60-65 องศาเซลเซียส ความคงทนในสภาพอณุหภูมิหอง (Longevity in vitro , LIV) นาน 12-15 ช่ัวโมง เชื้อ CMV สามารถถายทอดโรคไดโดยวิธีสัมผัส และแมลงพาหะจําพวกเพลีย้ออนมากกวา 60 ชนิด มีความสมัพันธกับเพลีย้ออนในลักษณะ non-persistent เมื่อเพล้ียออนดูดกนิตนมะเขือเทศที่เปนโรคเพียง 5-10 วินาที ก็สามารถถายทอดโรคได โดยที่ไวรัสไมจําเปนตองเขาไปอยูในตวัแมลง (ศุภลักษณ,2536;ศักดิ,์2537) การเพิ่มปริมาณของไวรสัเกดิภายในไซโตพลาสซึมของเซลลพืช เมื่ออนุภาคไวรัสเขาไปในเซลลพืช RNA จะหลุดจากโปรตีนหอหุม จากนั้น RNA ของไวรัสจะใชไรโบโซมจากเซลลพืชในกระบวนการแปลรหัสไดเอนไซม RNA polymerase และโปรตีนชนิดอื่น ๆ ที่ใชเพื่อเจริญเพิ่มปริมาณเชื้อตอไป(Matthews,1992) CMV มีจีโนมเปนแบบ multipartite ประกอบดวย RNA สายเดี่ยวแบบ sense (+) จํานวน 3 โมเลกุล คือ RNA1, RNA2 และ RNA3 ขนาด 3410,3035 และ 2193 นิวคลีโอไทดตามลําดับ เมื่ออยูภายในเซลล RNA3 จะสราง subgenomic RNA หรือ RNA4 มีขนาด 1027 นิวคลีโอไทด (Murphy และคณะ,1995) มีการทดลองใชโปรโตพลาสตของยาสูบ เพื่อแสดงใหเห็นวา CMV RNA1 และ RNA2 เทานัน้ที่จําเปนตอการเพิ่มปริมาณของไวรัสโดยอาศัยกิจกรรมของเอนไซม replicase ที่ควบคุมโดยยนีบน RNA1 และ RNA2 จากการวิเคราะห enzyme complex ที่แยกไดจากเซลลพืชที่ถูก CMV เขาทําลาย ซ่ึงมีการเพิ่มปริมาณ RNA ของ CMV ไดอยางสมบูรณในสภาพหลอดทดลอง พบวา virus replication complex ประกอบดวยโปรตนี 1a, 2a จาก RNA1 และ RNA2 ของ CMV และโปรตีนจากเซลลพืช (Nitta และคณะ,1988)

การปรับปรงุพันธุพืชใหมีความตานทานตอการเขาทําลายของไวรัสดวยเทคนิคพันธุวิศวกรรม

เทคนิคพันธุวศิวกรรม (Genetic engineering) โดยเฉพาะอยางยิ่งเทคนิคการถายยนี (plant transformation) เปนวิธีการหนึ่งที่นํามาใชในการสรางพืชใหมีความตานทานตอโรคไวรัสโดยการตัดตอยีนของไวรัสเขาไปในพืช แลวทาํใหพืชมีความตานทานตอไวรัสนั้น และไวรัสชนิดอื่นที่ใกลเคียง พืชที่ไดรับการตัดตอยีนจากภายนอกเขาไปเรยีกวา Transgenic plants (Register,1997) หรือพืชจําลองพันธุ (สุพัฒน และคณะ,2535) หรือพชืดัดแปรพนัธุกรรม การสรางพืชดัดแปรพันธุกรรมที่ตานทานตอโรคไวรัสประสบความสําเร็จเปนครั้งแรกจากการถายยีนโปรตีนหอหุมอนุภาค (coat protein gene หรือ CP gene) ของ tobacco mosaic virus (TMV) เขาไปในยาสูบแลวทาํใหยาสูบตานทานตอการเขาทําลายของ TMV ได (Abel และคณะ,1986) เรียกการสรางความตานทานแบบนี้วา CP-mediated resistance

ในประเทศไทย สุพัฒน และคณะ (2535) ไดถายยีนควบคมุการสรางโปรตีนหอหุมอนภุาค (CP gene) ของ TYLCV เขาสูมะเขือเทศพันธุ VF134-1-2 โดยใชเชื้ออะโกรแบคทีเรียเพื่อสรางพันธุมะเขือเทศใหตานทานตอไวรัสใบหงิกเหลอืง พบวาเนื้อเยื่อมะเขือเทศ ที่ไดรับการถายยีนสามารถพัฒนาเปนตนได เมื่อเพาะเลีย้งบนอาหารคดัเลือกที่มีสารปฏิชีวนะ kanamycin 100 มก./ล. และตรวจพบยีนดงักลาวในตนมะเขือเทศจําลองพันธุที่ผลิตได

ตอมาจึงมีการศึกษาเพื่อนํายนีสวนอื่นนอกเหนือจาก CP gene หรือ nonstructural gene sequence ของไวรัสมาใช เชน satellite RNAs, virus-specific antisense RNA และยนี replicase ซ่ึงการใชยนี replicase ทั้งหมดหรือเพียงบางสวนในการสรางความตานทานขึ้นในพืชเรียกวา Replicase-mediated resistance (Carr และคณะ,1994) การผลิตพชืดดัแปรพนัธุกรรมท่ีไดรับการถายยีนเรพลิเคสท่ีไมสมบูรณ (defective replicase gene) ของ CMV และกลไกการสรางความตานทาน

อัญจนาและคณะ (2544) ถายยีนเขาสูมะเขอืเทศโรงงานพันธุ VF134-1-2 ดวยวิธีการใช เชื้ออะโกรแบคทีเรียบมรวมกับชิ้นใบของมะเขือเทศแลวเพาะเลี้ยงใหเปนตนที่สมบูรณ เพือ่ปรับปรุงพันธุใหมีความตานทานตอโรคใบดางที่เกิดจาก CMV โยใชยนีที่ควบคุมการจําลองตัวของไวรัส (Replicase gene,หรือ ยีน Rep) เปนกลไกในการสรางความตานทานโรค โดยมะเขือเทศรุนแรกที่เพาะเลี้ยงได (R0) line ตาง ๆ มียีน Rep จํานวน 1-2 ชุด สอดแทรกในโครโมโซม จากการทดสอบความตานทานโรคของมะเขือเทศจาํลองพันธุรุน R0 line#2, #3-2 และ #4 ภายหลังการปลูกเชื้อ CMV โดยวิธีกลและตรวจวัดปริมาณไวรัสดวยเทคนคิ ELISA พบวามะเขือเทศ R0 แต ละสาย

พันธุมีความความตานทานตอไวรัส CMV แตกตางกัน เนื่องจากตรวจไมพบ CMV ในมะเขือเทศจําลองพันธุ line# 2 สวน line #3-2 และ #4 ตรวจพบปริมาณเชื้อ CMV ในระดับต่ํา (การประชุมวชิาการเกษตร,2544) Gal-On และคณะ (1998) ทดลองถายยีน Rep ที่ไมสมบูรณของ CMV สายพันธุ Fny (Fny-CMV) เขาสูมะเขือเทศพันธุลูกผสม คัดเลือกมะเขือเทศดัดแปรพันธุกรรมจํานวนทั้งสิ้น 63 lines มาผสมตัวเองเพื่อผลิตมะเขือเทศดัดแปรพันธุกรรมรุน R1 แลวทดสอบความตานทานตอไวรัสดวยการปลูกเชื้อ CMV พบวามะเขือเทศดัดแปรพนัธุกรรมรุน R1 มีการแสดงออกของโรคทั้งที่เปนแบบรุนแรง (28 lines) แสดงอาการเล็กนอย (30 lines) และไมแสดงอาการ (5 lines) จากนัน้นํามะเขือเทศ R1 2 lines ที่ไมแสดงอาการมาทดสอบขั้นตอไป โดยปลูกเชื้อ CMV 5 สายพันธุดวยวิธีทาน้ําคั้น ภายหลังการปลูกเชื้อพบวามะเขือเทศดัดแปรพนัธุกรรมทั้ง 2 lines แสดงลักษณะตานทานอยางสมบูรณตอเชื้อCMV สายพันธุที่จัดอยูใน Subgroup IA, Fny-CMV, CMV สายพันธุประเทศอิสราเอล และสายพันธุที่จดัอยูใน subgroup IB ไดแก K-CMV แตพบตนที่แสดงความตานทานตอ CMV สายพันธุ LS-CMV ซ่ึงจัดอยูใน subgroup II เพียงบางตนเทานั้น ซ่ึงใหผลเชนเดยีวกับการถายทอดเชื้อโดยใชเพล้ียออนเปนแมลงพาหะ นอกจากนี้เมื่อปลูกเชื้อ CMV ลงบนมะเขือเทศดดัแปรพันธุกรรมโดยวิธีทาบกิง่ (grafting) พบวาไวรัสไมสามารถเคลื่อนที่จากตนตอที่เปนโรคไปยังกิ่งพันธุของมะเขือเทศดัดแปรพันธุกรรมได ความตานทานที่เกิดจากยนีของ CMV ที่สอดแทรกอยูในโครโมโซมพืชนั้น เกิดขึน้ไดจากหลายกลไก เชน homology-dependent resistance ซ่ึงเปนกลไกความตานทานทีม่ีความจําเพาะเจาะจงสูงโดยจะตองมี ลําดบันิวคลีโอไทดที่เหมือนกันระหวางไวรัสที่ใชในการปลกูเชื้อกับยีนจากไวรัสที่สอดแทรกอยูในโครโมโซมของพืช (transgene) (Baulcombe,1996) เรียกปรากฏการณนีว้า homology –dependent gene silencing โดย transgene ในพืชจําลองพันธุจะชกันําใหเกดิการยับยั้งกิจกรรมหรือการทํางานของยีน (gene silencing) ของไวรัสที่เขาทําลายพืชซ่ึงมีลําดับนิวคลีโอไทดเหมือนกับ transgene (Ratcliff และคณะ,1997) กลไกดังกลาวอาจเกิดจากการจับกันในรูป RNA duplex ซ่ึงจะถูกยอยสลายโดยเอนไซม RNase ที่จําเพาะเจาะจงซึ่งอยูภายในเซลลพืช (Van Den Boogaart และคณะ,1998) หรือเกิดจากการสรางสาย RNA ที่ผิดปกต ิ (aberrant RNA) โดยมีสาเหตุมาจากคุณสมบัติของ transgene เอง เชน ยีนในรูปแบบ untranslatable หรือลักษณะที่ผิดปกติอ่ืน ๆ โดย RNA duplex ชนิดดังกลาวจะชกันําใหเกิดกลไกการยอยสลายลําดับนิวคลีโอไทดสายคูเปนชิน้ยอย ๆ ขนาดเล็ก ที่มีคุณสมบัติไปยับยั้งการเพิ่มปริมาณของไวรัสที่มีลําดับนิวคลีโอไทดเหมือนกันกับของtransgene (Baulcombe,1996;Van Den Boogaart และคณะ,1998)

อุปกรณและวิธีการ

การเตรียมมะเขือเทศดัดแปรพันธุกรรมรุน R2

ทําการคัดเลือกมะเขือเทศดดัแปรพันธุกรรมรุน R1 จากมะเขือเทศพันธุ VF134-1-2 ที่ไดรับการถายยีนเรพลิเคสที่ไมสมบูรณของ CMV สายพันธุ 30RSโดย อัญจนาและคณะ(2544) และตนมะเขือเทศปกติที่ไมไดรับการถายยีนในรุนเดียวกันมาเพาะเปนตนมะเขอืเทศดัดแปรพนัธุกรรมรุน R2โดยการเก็บผลจากตนมะเขือเทศดัดแปรพันธุกรรมรุน R1 สายพันธุที่ตรวจพบยีน Rep มา 7 ผล แลวนําเมล็ดของแตละผลมาเพาะในดินที่อบฆาเชื้อแลวภายในโรงเรือนกระจกผลละ 6 เมล็ด หลังจากนัน้ 15-20 วัน เก็บใบมะเขือเทศดัดแปรพนัธุกรรมจากตนกลารุน R2 ที่เพาะได มาสกัดดีเอ็นเอจากโครโมโซมเพื่อตรวจหายีน Rep ที่เปน transgene การคัดเลือกและตรวจสอบมะเขือเทศรุน R1และ R2 การสกัดดีเอ็นเอจากโครโมโซม (genomic DNA) ของมะเขือเทศ สกัด chromosomal DNA (หรือ genomic DNA) จากใบมะเขือเทศทีไ่ดรับการถายยีน และจากตนปกติทีไ่มไดรับการถายยีน ตามวิธีของ Fulton และคณะ (1995) เตรียม extraction buffer โดยผสมสารละลาย 3 ชนิด คือ DNA extraction buffer (0.35 M sorbitol,0.1 M Tris-HCl, 5 mM EDTA pH 7.5 ) 2.5 สวน และ nuclei lysis buffer (0.2 M Tris-HCl, 0.05M EDTA, 2M NaCl, 2% CTAB) 2.5 สวน แลวเติม 5 % sarkosyl 1 สวน และเติม sodium bisulfite ในอตัรา 0.3-0.5 กรัมตอบัฟเฟอร 100 มล. ตัดใบยอดมะเขือเทศมา 1-2 ใบ ช่ังน้ําหนกัประมาณ 50-100 มก.ใสในหลอด microtube ขนาด 1.5 มล. ใส extraction buffer ปริมาตร 200 ไมโครลิตรลงในหลอดและบดใบพืชใหละเอียดมากที่สุด เติมบัฟเฟอรอีก 550 ไมโครลิตร ผสมใหเขากัน นําไปบมในอางน้ําอณุหภูมิ 65 องศาเซลเซียส เปนเวลา 30-60 นาที เติม chloroform:isoamyl alcohol (24:1) จนครบ 1.5 มล. ผสมใหเขากันดีโดยพลิกหลอดกลับหัว-ทาย ประมาณ 20 คร้ัง แลวหมนุเหวี่ยงที่ 12,000 รอบตอนาที เปนเวลา 10 นาที ดูดสวนใสชั้นบน ประมาณ 500 ไมโครลิตรใสหลอดใหม เติม isopropanol ที่เย็นจดั ปริมาตร 1 เทาของสวนใสที่ได ผสมโดยพลิกหลอดกลับหัว-ทาย จนกวาดีเอน็เอจะตกตะกอนใหเห็น หมนุเหวีย่งที่ 10,000 รอบตอนาที เปนเวลา 5 นาที แลวเท isopropanol ออก ลางตะกอนดีเอน็เอดวย 70 % ethanol ทําตะกอนใหแหง และละลายดีเอน็เอดวยน้ํากลั่นปริมาตร 30 ไมโครลิตร อุนที่ 65 องศาเซลเซียส เปนเวลา 15-30 นาที แลวหมุนเหวีย่งที่ 10,000 รอบตอนาที เปนเวลา 5 นาท ีดูดสวนใสใสหลอดใหม เกบ็ดีเอ็นเอไวที่ -20 องศาเซลเซียส

การตรวจสอบการปรากฏของยีน Rep บนโครโมโซมพืชดวยเทคนิค PCR (Polymerase chain reaction)

นําดีเอ็นเอที่สกดัไดจากมะเขือเทศมาเปนตนแบบ (template) ในปฏิกิริยา PCR โดยใช ไพรเมอรที่เฉพาะเจาะจงกับยีนRep(Carrและคณะ,1994)คือ RepCMV-F(5’-TATCGGATCCATGGCTTTCCCTGCCC-3’)และ RepCMV-R(5’-ACGAGGATCCTCAGACTGGGTAAC-3’) สวนผสมของปฏิกิริยา PCR 100 ไมโครลิตร ประกอบดวย 10X PCR buffer (500 mM KCl , 100 mM Tris-HCl pH 9.0 , 15 mM MgCl2 , 1% Triton X-100) 10 ไมโครลิตร , MgCl2 0.5 มิลลิโมลาร , dNTP 0.8 มิลลิโมลาร , RepCMV-F primer และ RepCMV-R primer อยางละ 0.3 ไมโครโมลาร และ Taq DNA polymerase 2.5 units เติมดเีอ็นเอตนแบบประมาณ 100 นาโนกรัม ทําปฏิกิริยา PCR จํานวน 30 รอบ อุณหภูมทิี่ใชสําหรับ denature , annealing และ extention คือ 94, 60 และ 72 องศาเซลเซียส เปนเวลาขั้นตอนละ 1, 1 และ 2 นาที ตามลําดับ เมื่อปฏิกิริยา PCR ส้ินสุดลงนําดีเอน็เอที่เพิ่มปริมาณไดมาวิเคราะหขนาดดวย 0.8% agarose gel electrophoresis ใน 0.5x TBE buffer การปลูกเชื้อไวรัส CMV ใหกับมะเขือเทศดัดแปรพนัธุกรรมรุน R2 ท่ีตรวจพบยีน Rep เพื่อทดสอบความตานทานไวรัส

ปลูกเชื้อ CMV ใหกับมะเขอืเทศดัดแปรพนัธุกรรมรุน R2 line# 1-1-1 ถึง #1-1-7 lineละ 5 ตน รวมทั้งมะเขือเทศที่ไมไดรับการถายยนี 1 ตน ดวยเพื่อเปนสิ่งเปรียบเทียบ เตรยีมน้ําคั้นสําหรับปลูกเชื้อโดยใชใบยาสูบ N.tabacum ที่ไดรับเชื้อ CMV สายพันธุ 30RS เปนแหลงไวรัส บดใบยาสูบ 1 กรัม กับ 0.1 M phosphate buffer pH 7.0 ปริมาตร 2 มิลลิลิตร เติมผงคารโบรันดัมในน้ําคั้น ผสมใหเขากนัแลวทาลงบนใบพชืทุกใบที่แผเตม็ที่แลว ลางใบดวยน้ํา เก็บตนพืชที่ปลูกเชื้อแลวในโรงเรือนกระจกเปนเวลา 20 วัน สังเกตอาการบนพืชและ เก็บตัวอยางใบมะเขือเทศวัน เพื่อนําไปตรวจหาปริมาณเชื้อไวรัส CMV

การตรวจหาปริมาณเชื้อไวรัส CMV ในใบมะเขือเทศดัดแปรพันธุกรรมภายหลังการปลูกเชื้อดวยเทคนคิ ELISA

เก็บใบมะเขือเทศภายหลังการปลูกเชื้อแลว 20 วัน มาจากทุก ๆ ตน ตนละ 3 ใบจากบริเวณ

ยอดนํามาตรวจหาปริมาณเชือ้ไวรัส CMV ในใบพืชดวยเทคนิค ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay) โดยวิธี Direct antigen coating indirect ELISA (Dac-indirect ELISA) (โสภณ,2536) ดังนี้ เตรียม sample extraction buffer ซ่ึงประกอบดวย PBS (0.137M NaCl, 1.5mM KH2PO4,2.7mM KCl,3mM NaNO3,pH 7.4) ที่เติม 0.05% tween 20 และผสม 2% polyvinyl pyrrolidone บดใบยาสูบใน sample extraction buffer อัตรา 1:1 น้ําหนักตอปริมาตร ดูดเฉพาะสวนของน้ําคั้นใบพืชมาผสมกับ coating buffer (0.02M Na2CO3,0.2M NaHCO3,3mM NaN3, pH 9.6 กอนใชเติม 0.2% Na.DIECA) เพื่อเจือจางน้ําคั้นในอัตราสวน 1:10 สวน ใสน้ําคั้นพชืที่เจือจางแลวปริมาตร 200 ไมโครลิตร ลงในแตละหลุมของ microwell plate บมที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส นาน 1 ช่ัวโมง เทน้ําคั้นออกแลวลางหลุมดวย PBST (PBS ที่เติม 0.05% tween 20) 3 คร้ัง ๆ ละ 5 นาที เจือจางแอนติซีรัมตออนุภาคไวรัส CMV อัตรา 1:1000 สวน ใน enzyme conjugated buffer (sample extraction buffer ที่เติม 2% ovalbumin) เติมน้ําคั้นของยาสูบตนปกติที่ไมไดถายยีนลงในแอนติซีรัมใหมีความเจือจางในอัตรา 1:100 สวน นําแอนติซีรัมใสในแตละหลุมในปริมาตร 100 ไมโครลิตร บมที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส นาน 1 ช่ัวโมง เทแอนติซีรัมออก ลางดวย PBST 3 คร้ัง ๆ ละ 5 นาที ใสแอนติซีรัมชนิดทีส่อง คือ goat anti-rabbit IgG-alkaline phosphatase conjugate ที่เจือจางในอัตรา 1;10000 สวนใน enzyme conjugate buffer หลุมละ 100 ไมโครลิตรบมที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส นาน 1 ช่ัวโมง เทแอนติซีรัมออก แลวลางดวย PBST 3 คร้ัง ๆ ละ 5 นาที เตรียม substrate solution ทันทีกอนใช โดยละลาย p-nitrophenyl phosphate เขมขน 1 มก./มล. ใน 10% diethanolamine buffer ผสม diethanolamine 100 มล. กับน้ํากลั่นนึ่งฆาเชื้อใหมีปริมาตร 1000 มล. pH 9.6) ใสในหลุม ๆ ละ 100 ไมโครลิตร บมที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส นาน 20 นาที หยุดปฏิกิริยาโดยเติม 3N NaOH ปริมาตรหลุมละ 50 ไมโครลิตร นําไปอานคาการดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น 405 นาโนเมตร

ผลการทดลอง

จากการเพาะเมล็ดมะเขือเทศดัดแปรพนัธุกรรมรุน R1 line# A1-1,B1-1,B1-3,C/10-1,C/20-1 และ C/20-2 พบวาเมล็ดมีอัตราการงอก 77.23-100% (ตารางที่ 1)

ตารางที่ 1 อัตราการงอกของเมล็ดพันธุมะเขือเทศดัดแปรพันธุกรรมรุน R1

Line จํานวนเมล็ดทีเ่พาะ จํานวนเมล็ดทีง่อก VF134-1-2 ไมถายยีน 10 9

A1-1 20 18 B1-1 13 1 B1-3 10 8

C/10-1 20 20 C/20-1 22 22 C/20-2 28 17

สําหรับเมล็ดมะเขือเทศดัดแปรพันธุกรรมรุน R2 ที่นํามาเพาะพบวามีอัตราการงอก83.33-

100% (ตารางที่ 2)

ตารางที่ 2 อัตราการงอกของเมล็ดพันธุมะเขือเทศดัดแปรพันธุกรรมรุน R2

Line จํานวนเมล็ดทีเ่พาะ จํานวนเมล็ดทีง่อก

VF134-1-2 ไมถายยีน 2 2 1-1-1 6 5 1-1-2 6 6 1-1-3 6 6 1-1-4 6 5 1-1-5 6 6 1-1-6 6 5 1-1-7 6 5

การตรวจสอบมะเขือเทศจําลองพันธุรุน R1 และR2 การตรวจสอบการปรากฏของยีน Rep บนโครโมโซมมะเขือเทศดวยเทคนิค PCR

เมื่อนําใบมะเขอืเทศจากตนรุน R1 line ละ 1 ตนมาตรวจสอบยีน Rep ดวยเทคนิค PCR พบtransgene ใน R1 line# A1-1 สวนมะเขือเทศดัดแปรพนัธุกรรมรุน R2 จากการผสมตัวเองของ R1 line #A1-1 ทุกตนที่นํามาทดสอบ ใหแถบดเีอน็เอของยีน Rep ขนาด 2.48 กิโลเบส (ภาพที่ 1และ 2 )

การทดสอบความตานทานไวรัส CMV ในมะเขือเทศท่ีไดรับการถายยนี Rep

หลังจากปลูกเชื้อ CMV สายพันธุ 30 RS ลงบนมะเขือเทศดัดแปรพนัธุกรรมรุน R2 line# 1-1-1 ถึง 1-1-7 line ละ 5 ตน และมะเขือเทศที่ไมไดรับการถายยีน 1 ตน พบวาหลังปลูกเชื้อแลว 20 วัน ตนมะเขอืเทศที่ไมไดรับการถายยีนแสดงอาการใบหงิกโคงงอ และมีขนาดลดลง สวนมะเขอืเทศที่ไดรับการถายยีนแสดงอาการใบยอดโคงงอเล็กนอย (ภาพที่ 3) เมื่อตรวจปริมาณเชื้อไวรัส CMV ในใบมะเขือเทศจําลองพันธุ line #1-1-1 ถึง #1-1-7 ภายหลังปลูกเชื้อแลว 20 วัน ดวยเทคนคิ ELISA มีคา O.D. 405 เฉลี่ย เทากับ 0.032, 0.019, 0.032, 0.026, 0.019, 0.022 และ 0.031 ตามลําดับ ซ่ึงแสดงวาไมมีไวรัสแตกตางจากตนมะเขอืเทศที่ไมถายยีนที่ไดรับการปลูกเชื้อ ซ่ึงมีคา O.D. 405 เฉลี่ย เทากับ 0.196 (ตารางที่ 3)

1 2 3 4 5 6 7 8 9

ภาพที่ 1 ผลการตรวจหายีน Rep ของ CMV บนโครโมโซมของมะเขือเทศดัดแปรพนัธุกรรมรุน R1 ดวยเทคนิค PCR วิเคราะหขนาดดเีอ็นเอจาก PCR product ดวย 0.8% agarose gel electrophoresis ชอง 1 :ดีเอ็นเอมาตรฐาน (Lambda DNA/HindIII) ชอง 2-7 :ใชดีเอ็นเอจากมะเขือเทศดดัแปรพันธุกรรมรุน R1line# A1-1,B1-1,B1-3

C/10-1,C/20-1 และC/20-2 ตามลําดับ

ชองที่ 8 :ใชดีเอ็นเอตนแบบจากมะเขือเทศดัดแปรพันธุกรรมรุน R1 line #1-1 ที่มียีน Rep ของ CMV ชองที่ 9 : ใชดีเอน็เอตนแบบมะเขือเทศพันธุ VF134-1-2 ปกติ ที่ไมไดรับการถายยีน

M P M P M P H

ภาพที่ 2 ผลการตรวจหายีน Rep ของ CMV บนโครโมโซมของมะเขือเทศดัดแปรพนัธุกรรมรุน R2 ดวยเทคนิค PCR วิเคราะหขนาดดเีอ็นเอจาก PCR product ดวย 0.8% agarose gel electrophoresis ชอง M :ดีเอ็นเอมาตรฐาน (Lambda DNA/HindIII) ชอง P :ใชดีเอ็นเอตนแบบจากมะเขือเทศดัดแปรพันธุกรรมรุน R1 line #1-1 ที่มียีน Rep ของ CMV ชอง H : ใชดีเอ็นเอตนแบบมะเขือเทศพันธุ VF134-1-2 ปกติ ที่ไมไดรับการถายยีน

2.48kb 1-1-1 1-1-2 1-1-3 1-1-4 1-1-5 1-1-6 1-1-7

ภาพที่ 3 ลักษณะของยาสูบและมะเขือเทศพันธุ VF 134-1-2 รุน R2 (A) ตนยาสูบปลูกเชื้อ CMV สายพันธุ 30 RS แสดงอาการใบดางสีเขียวเขมสลับสีเขียวออน (B) มะเขอืเทศพันธุ VF134-1-2 ปกติที่ไมไดรับการถายยีน และไมไดปลูกเชื้อ (C) มะเขอืเทศดัดแปรพนัธุกรรมรุน R2 ที่ไดรับการปลูกเชื้อแลว 20 วัน (D)มะเขือเทศพันธุ VF134-1-2 ไมถายยีน ที่ไดรับการปลูกเชื้อแลว 20 วัน

A

D C B

ตารางที่ 3 ผลการตรวจวัดปริมาณไวรัส CMV ในตนมะเขือเทศดัดแปรพันธุกรรมรุน R2 จํานวน 7 lines ภายหลังการปลูกเชื้อ CMV สายพันธุ 30RS เปนเวลา 20 วัน โดยใชเทคนิค ELISA

ปริมาณไวรัสที่ตรวจสอบในใบมะเขือเทศ (O.D.405) หลังการปลูกเชื้อ 20 วัน

มะเขือเทศ R2 Line# ตนที่1 2 3 4 5 คาเฉลี่ย 1-1-1 0.062 0.006 0.009 0.026 0.056 0.032 1-1-2 0.030 0.024 0.003 0.028 0.012 0.019 1-1-3 0.014 0.004 0.064 0.046 0.032 0.032 1-1-4 0.032 0.060 0.008 0.022 0.010 0.026 1-1-5 0.017 0.031 0.003 0.025 0.019 0.019 1-1-6 0.031 0.029 0.006 0.022 0.021 0.022 1-1-7 0.010 0.028 0.023 0.020 0.076 0.031 ยาสูบปลูกเชื้อ CMV สายพันธุ 30 RS

HIGH HIGH HIGH

มะเขือเทศไมปลูกเชื้อ 0.077 0.080 0.078 มะเขือเทศไมถายยนี ปลูกเชื้อ CMV 30 RS

0.190 0.202 0.196

วิจารณผลการทดลอง จากการทดสอบความตานทานตอเชื้อไวรัส CMV สายพนัธุ 30 RS ดวยเทคนิค ELISAใน

มะเขือเทศดัดแปรพันธุกรรมรุน R2 พบวา มะเขือเทศทุกสายพันธุมคีวามตานทานตอการเขาทําลายของเชื้อไวรัสดังกลาว โดยตรวจพบอาการของโรคเพียงเล็กนอย หลังปลูกเชื้อแลว 20 วัน และตรวจไมพบไวรัสในมะเขือเทศดดัแปรพันธุกรรมรุนดังกลาว จึงเปนไปไดวาความตานทานโรคที่เกิดจากการถายยีน Rep ของ CMV อาจมีผลในการยับยั้งการเพิม่ปริมาณของอนุภาคไวรัส โดยอาจเกิดจากการทํางานของยีน (gene silencing) จากไวรัส ทําใหเกิดปรากฏการณ homology dependent gene silencing (Ratcliff และคณะ,1997) โดยอาจจะเกิดจากการจับกันในรปู RNA duplex แลวถูกยอยสลายโดยเอนไซม RNase ที่เฉพาะเจาะจงในเซลลพืช (Van Den Boogarrt และคณะ,1998) หรือเปนกลไกที่เกดิจากการสรางโปรตีนที่ผิดปกตซ่ึิงมีผลในการยับยั้งการรวมกันเปนอนุภาคของไวรัส (assembly) หรือมีผลไปยับยั้งการทําหนาที่ของ replication complex (Carr และคณะ,1994) นอกจากนี้อาจเกิดจากการที่ยนี Rep ที่ไมสมบูรณ ซ่ึงเปน transgene ที่ถายใหกับมะเขือเทศนั้นเขาไปแขงขันในการทํางานหรือไปยับยั้งกจิกรรมของเอนไซมreplicase ของไวรัสในธรรมชาติ(Herskowitz,1987) Carr และคณะ(1994) ทําการทดลองเพื่อศึกษาความตานทานที่เกิดขึ้นในพชืที่ไดรับการถายยีน Rep ที่ไมสมบูรณ ของ CMV subgroup I สายพันธุ Fny โดยนําโปรโตพลาสตที่ไดจากยาสูบรุนลูก R2 ที่ไดรับการถายยีนดังกลาวจํานวน 2 lines มาปลูกดวยเชื้อ CMV-Fny บมเปนเวลา 24 ช่ัวโมง พบวา โปรโตพลาสตทั้ง 2 lines ที่ไดรับการปลูกเชื้อมีปริมาณ RNA ของไวรัสในปริมาณที่ต่ํามาก เมือ่ตรวจวดัโดย Northern blotting และเมื่อปลูกเชื้อ CMV ลงบนใบออนของยาสูบที่พัฒนาเปนตนมาจากโปรโตพลาสตเหลานี้ พบวาพืชแสดงอาการจุดเหลืองเฉพาะแหง แตไมพบอาการของโรคแบบแพรกระจายทัว่ทั้งตนดังเชนที่พบในยาสูบปกติที่ไมไดรับการถายยีน

ลักษณะความตานทานดังกลาวที่เกิดจากการถายยีนนั้นสามารถที่จะถายทอดไปยังในรุน ตอ ๆ ไปไดตามกฎ gene segregation ของเมนเดลจึงควรมีการทําการทดลองเพื่อคัดเลือกมะเขือเทศ ดัดแปรพนัธุกรรมในรุนตอ ๆ ไปเพื่อใหไดตนที่มีความตานทานแบบถาวร

สรุปผลการทดลอง การเพาะเมล็ดมะเขือเทศ VF134-1-2 ดัดแปรพันธุกรรมในรุนลูกชัว่ที่ 1 (R1) และ ในรุน

ลูกชั่วที่ 2 (R2) พบวามีอัตราการงอกเทากับ 77.23-100 % และ 83.33-100% ตามลําดับ เมื่อตรวจสอบหา transegene ในมะเขือเทศดัดแปรพนัธุกรรมทั้งสองรุนดวยเทคนิค PCR พบวา ในมะเขือเทศดัดแปรพันธุกรรมรุนลูกชั่วที่ 1 (R1) line #A1-1 และมะเขือเทศดัดแปรพนัธุกรรมรุนลูกช่ัวที่ 2 (R2) ทุกสายพันธุที่ทดสอบพบแถบดีเอ็นเอที่มีขนาด 2.48 kb ตามที่คาดหมาย แสดงใหเห็นวามีการสอดแทรกของยีน Rep บนโครโมโซมของมะเขือเทศดัดแปรพันธุกรรม และ transgene ถายทอดจากรุน R1 สูรุน R2 ได การทดสอบความตานทานตอไวรัส CMV สายพันธุ 30 RS ในมะเขือเทศ VF134-1-2 ดัดแปรพันธุกรรมรุน R2 พบวามะเขือเทศทั้ง 7 lines ที่นํามาทดสอบ ไดแก line# 1-1-1 ,1-1-2 ,1-1-3 1-1-4 ,1-1-5 ,1-1-6 และ 1-1-7 สามารถตานทานตอเชื้อ CMV และสามารถเจริญเติบโต ออกดอกและติดผลไดเปนปกต ิ

เอกสารอางอิง กรุง สีตะธน.ี 2536. การผลิตเมล็ดพันธุมะเขือเทศ.กองขยายพนัธุพืช กรมสงเสริมการเกษตร,

กรุงเทพฯ. 425 น. กลุมเกษตรสญัจร. 2531. มะเขือเทศ. สหมิตรออฟเซ็ท, กรุงเทพฯ. 63 น. ธีระ สูตะบุตร . 2532. โรคไวรัสและโรคคลายไวรัสของพืชสําคัญในประเทศไทย. หางหุนสวน จํากัดฟนนี่พับบลิชิง, กรุงเทพฯ. 130 น. มณีฉัตร นิกรพันธุ. 2538. มะเขือเทศ. โอเดียนสโตร, กรุงเทพฯ. 93 น. สุพัฒน อรรถธรรม,พิสสวรรณ เจยีมสมบัติ,ทิพยวดี อรรถธรรม,วิชัย โฆสิตรัตน,ธีระ สูตะบุตร, เพชรรัตน ศิริวงศ และนุชนาถ แซอ้ึง. 2535. การสรางพันธุมะเขือเทศใหตานทานโรคโดย

การถายยีน, น.193-200. ใน รายงานการประชุมวิชาการ คร้ังที่ 30,29 มกราคม-1 กุมภาพนัธ 2535.สาขาพืช มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร, กรุงเทพฯ.

อัญจนา บุญชด,พิสสวรรณ เจียมสมบัติและสุพัฒน อรรถธรรม. 2544. การถายยีนเรพลิเคสที่ไม สมบูรณของ cucumber mosaic virus เขาสูมะเขือเทศ.ใน รายงานการประชุมวิชาการเกษตร คร้ังที่ 39, 5-7 กุมภาพันธ 2544.มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร,กรุงเทพฯ.

ศักดิ์ สุนทรสิงห. 2537. โรคของผักและการปองกันกําจดั. ภาควิชาโรคพืช คณะเกษตร มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร, กรุงเทพฯ. 198 น.

ศุภลักษณ ฮอกะวัต. 2536. โรคผักตระกูลพริกและมะเขอืเทศ. ภาควิชาโรคพืชวิทยา คณะ เกษตรศาสตร มหาวิทยาลัยขอนแกน,ขอนแกน. 240 น.

สิริรัตน หินออน. 2546. การคัดเลือกสายพันธมะเขือเทศดัดแปรพนัธุกรรม ใหตานทานตอเชื้อ cucumber mosaic virus . ปญหาพิเศษปริญญาตรีภาควิชาโรคพืช คณะเกษตร มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร, นครปฐม.

Abel,P.P.,R.S. Nelson,B. De, N. Hoffman,S.G. Rogers,R.T. Fraley and R.N. Beachy. 1986. Delay of disease development in transgenic plants that express the tobacco mosaic virus coat protein gene. Science 232: 738-743.

Anderson,J.M.,P.Palukaitis and M.Zaitlin. 1992. A defective replicase gene induces resistance to cucumber mosaic virus in transgenic tobacco plants.Proc. Natl. Acad.Sci. U.S.A.89:8759-8763.

Baulcombe, D.C. 1996. Mechanisms of pathogen-derived resistance to viruses in transgenic plants. Plant Cell 8: 1833-1844.

Carr,J.P.,A. Gal-On, P.Palukaitis and M.Zaitlin. 1994. Replicase-mediated resistance to cucumber mosaic virus in transgenic plant involves suppression of both virus replication in the inoculated leaves and long-distance movement. Virology 199: 439-447.

Fulton, T.M.,J. Chunwongs and S.D. Tanksley.1995. Miniprep protocol for extraction of DNA from tomato and other herbaceous plants.Plant Mol.Biol. Rep. 13(3): 207-209.

Gal-On,A.,D. Wolf,Y. Wang,J.E. Faure, M. Pilowsky and A.Zelcer. 1998. Transgenic resistance to cucumber mosaic virus in tomato : Blocking of long distance movement of the virus in lines harboring a defective virus replicase gene. Phytopathology 88: 1101-1107.

Matthews, R.E.F. 1992. Fundamentals of Plant Virology. Academic Press, New York.403 p. Murphy, F.A., C.M. Fauquet, D.H.L. Bishop, S.A. Ghabrial, A.W. Jarvis, G.P. Martelli, M.A.

Mayo and M.D. Summers. 1995. Virus Taxonomy : Sixth Report of the international Committee on Taxonomy of Viruses. Springer-Verlag, New York. 586 p.

Nitta, N., Y. Takanami,S. Kuwata and S. Kubo. 1988. Inoculation with RNAs1 and 2 of cucumber mosaic virus induces viral RNA replicase activity in tobacco mesophyll protoplasts. J.Gen. Virol. 69: 2695-2700.

Ratcliff,F., B.D. Harrison and D.C.Baulcombe. 1997. A similarity between viral defense and gene silencing in plants. Science 276:1559-1560.

Register,J.C. 1997. Approaches to evaluating the transgenic status of transformed plants.Trends in Biotechnology 15 : 141-146.

Van Den Boogaart, T.,G.P. Lomonossoff and J.W.Davies 1998. Can we explain RNA-mediated virus resistance by homology-dependent gene silencing.Plant Microbe Interact. 11 :717-723.