การคัดแยกและการจําแนกสารยับยั้งจุลินทรีย ในแบคทีเรียกรดแลคติกที่แยกไดจากลําไสไกโดยใช PCR Technique

Screening and Identification of Antimicrobial Substance Producing-Lactic Acid Bacteria Isolated from

Chicken Intestine by PCR Technique

คํานํา

ในอุตสาหกรรมการผลิตสัตวโดยเฉพาะไกนั้น มีการใชสารปฏิชีวนะที่สังเคราะหไดจากกระบวนการทางเคมีในการปองกันเชื้อกอโรคและสงเสริมการเจริญเติบโตของสัตว รวมทั้งในอุตสาหกรรมอาหารก็มีการใชสารปฏิชีวนะในการปองกันเชื้อจุลินทรียกอโรคและจุลินทรียที่ทําใหอาหารเนาเสีย แตสารเหลานี้มีผลทําใหเชื้อโรคตาง ๆ ดื้อตอยา และยังสามารถตกคางในสัตวและผลิตภัณฑอาหาร ซึ่งทําใหเกิดอันตรายตอผูบริโภคเมื่อไดรับปริมาณมากและติดตอกันเปนเวลานาน ดังนั้นเพื่อความปลอดภัยจากจุลินทรียกอโรคและสารที่ใชเปนสารกันเสียในอาหารจึงไดมีความพยายามที่จะหาทางแกไขปญหาเชื้อกอโรคและหาสารกันเสียธรรมชาติมาทดแทน ซึ่งมีความปลอดภัยมากกวาสารกันเสียที่สังเคราะหไดจากกระบวนการทางเคมี การใชสารตานทานจุลินทรียที่ผลิตจากจุลินทรียก็ไดรับความสนใจและมีการศึกษาวิจัย โดยเชื้อแบคทีเรียกรดแลคติก ซึ่งเปนแบคที่เรียที่สามารถพบไดในอาหาร ประเภทหมักดอง ผลิตภัณฑนม ในระบบทางเดินหายใจ ระบบทางเดินอาหารและระบบสืบพันธุของมนุษยและสัตวตาง ๆ ไดรับความสนใจ และมีการศึกษาอยางกวางขวาง เนื่องจากผลิตสารที่สามารถยับยั้งเชื้อจุลินทรียอื่นได และมีความปลอดภัยเปนที่ยอมรับ และแบคทีเรียกรดแลคติกนอกจากจะมีคุณสมบัติดังกลาวแลว ในบางสายพันธุสามารถนํามาใชเปนสารเสริมชีวนะ (probiotic) ผสมในอาหารสัตวโดยมีความสําคัญทางโภชนาการ (ธารารัตน, 2542) คือ

1.กรดแลคติกที่แบคทีเรียผลิตออกมาจะมีผลทําใหสภาวะความเปนกรด-ดาง ไมเหมาะสมตอการเจริญเติบโตของแบคทีเรียกอโรค

2.ทําใหการทํางานของระบบขับถายดี ลดการสะสมของเสีย เปนการลดอัตราเสี่ยงของการเกิดโรคมะเร็งในลําไส โดยเฉพาะมะเร็งในลําไสใหญ

3.ลดระดับน้ําตาลและโคเลสเตอรอลในกระแสเลือด 4.กระตุนการสรางเอนไซมแลคเตส สําหรับยอยน้ําตาลแลคโตส ลดการเกิดทองอืด และชวยใหการดูด

ซึมแคลเซียมดีขึ้น 5.กระตุนระบบภูมิคุมกันของรางกาย

จากคุณสมบัติที่เปนประโยชนของแบคทีเรียกรดแลคติกดังที่ไดกลาวมาขางตนทําใหเกิดความสนใจศึกษาความสามารถในการสรางสารที่มีคุณสมบัติในการยับยั้งการเจริญเติบโตของเชื้อจุลินทรียอื่น ที่เรียกวาแบ

คเทอริโอซิน โดยไดทําการศึกษาคัดแยกเชื้อในระบบทางเดินอาหารไก เพื่อเปนประโยชนในการผลิตสารเสริมชีวะจากธรรมชาติหรือโปรไบโอติกทดแทนสารปฏิชีวนะในอุตสาหกรรมการผลิตไกตอไป

1. ความสําคัญของแบคทีเรียกรดแลคติก

แลคติกแอซิด แบคทีเรีย หรือแบคทีเรียแลคติก (Lactic Acid Bacteria : LAB)จัดเปนแบคทีเรียในตระกูล Lactobacillaceae เปนแบคทีเรียแกรมบวก รูปรางมีทั้ง กลม ทอนส้ันและยาว ไมสรางสปอร ไมสรางเอนไซมคะตะเลส (catalase) ตองการอากาศเล็กนอยในการเจริญ (microaerophile) บางชนิดเจริญไดในที่ไมมีอากาศ (strictly anaerobe) (Frazier และ Westoff, 1979) โดยทั่วไปพบสามารถสรางผลิตภัณฑจากการหมักคารโบไฮเดรตไดเปน กรดแลคติก กรดอะซิติก ไดอะซิติล (diacetyl) ไฮโดรเจนเปอรออกไซด (hydrogenperoxide) ซึ่งทําใหผลิตภัณฑมีรสเปรี้ยวและมีกล่ินที่เฉพาะตัว กรดแลคติกยังมีคุณสมบัติยับยั้งเชื้อกอโรคและถนอมอาหาร โดยการไปทําใหสภาวะความเปนกรด – ดางไมเหมาะสมตอการเจริญเติบโตของเชื้อเหลานั้น และเชื้อแบคทีเรียกรดแลคติกบางชนิดยังสามารถผลิตสารตานแบคทีเรีย(antibacterial agent) ซึ่งมีคุณสมบัติในการยับยั้งการเจริญเติบโตของจุลินทรียชนิดอื่นที่ปนเปอน เปนสาเหตุของการเกิดโรคและสาเหตุของการเนาเสียของผลิตภัณฑอาหาร สารยับยั้งการเจริญเติบโตของจุลินทรียดังกลาวคือ แบคเทอริโอซิน (bacteriocin)

2. ลักษณะและวิธีการที่ใชในการจัดจําแนกแบคทีเรียกรดแลคติก 2.1 ลักษณะทางสัณฐานวิทยา (Morphology) ทําการศึกษาลักษณะทางสัณฐานวิทยาของเซลลภายใตกลองจุลทรรศน โดยการตรวจดูรูปราง การ

จัดเรียงตัวของเซลล การสรางแคปซูล สปอร หรือ แฟลกเจลลา เปนตน โดยทั่วไป Pediococci และ กลุม Streptococci จะมีลักษณะทางสัณฐานวิทยาที่สามารถแยกออกจากกันได ( Pot et al., 1994) โดยเซลลของ Pediococci มีรูปรางกลม มักเรียงกันเปนคูหรือส่ีเซลล เนื่องจากมีการแบงตัวแบบ 2 ทิศทางบนระนาบเดียวกัน (Simpson และ Taguchi., 1995) สวนเซลลของกลุม Streptococci ที่แบงออกเปน 3 สกุลไดแก Streptococcus, Lactococcus, และ Enterococcus (Stiles และ Holzapfel, 1997) จะมีรูปรางกลมหรือกลมรี เรียงกันเปนคูหรือเปนสาย (Hardie และ Whiley, 1995) แตอยางไรก็ตามสภาวะของการเจริญก็อาจจะมีผลตอลักษณะทางสัณฐานวิทยาของเซลลได (Pot และคณะ, 1994)

2.2 สรีระวิทยา (Physiology) ใชความสามารถของแบคทีเรียในการเจริญที่อุณหภูมิตาง ๆ สภาวะความเปนกรด – ดาง สภาวะที่มี

หรือไมมีอากาศ และความสามารถในการทนเกลือ เชนการแยกความแตกตางระหวาง Lactobacillus กับ

Carnobacterium พบวา Carnobacterium ไมสามารถเจริญไดในสภาวะที่มีพีเอชต่ํากวา 4.5 และบนอาหารวุนอะซิเตท (Stiles และ Holzaofel, 1997) แตเจริญไดในสภาวะที่พีเอชมีคาตั้งแต 5.0 เปนตนไป (Hammes et al., 1991) นอกจากนี้ยังพบวา Lactobacillus สามารถเจริญไดที่อุณหภูมิ 45 องศาเซลเซียส ในขณะที่ Carnobacterium ไมสามารถเจริญไดที่อณุหภูมิดังกลาว (Kandler และ Weiss, 1996) และในการจัดจําแนกถึงชนิดของแบคทีเรียในสกุลที่มีขนาดใหญ เชน Lactobacillus การใชลักษณะทางสรีระวิทยาทั่วไปยังไมเพียงพอตองศึกษาถึงผลิตภัณฑที่ไดจากกระบวนการหมักของเชื้อประกอบดวย

3.รูปแบบการหมักสารประเภทคารโบไฮเดรต (Carbohydrate fermentation)

เมื่อใชความสามารถในการหมักน้ําตาลของแบคทีเรียกรดแลคติกชนิดตาง ๆ มาพิจารณาสามารถจัดกลุมแบคทีเรียกรดแลคติกออกเปน 2 กลุมใหญ (Axelsson, 1993) ดังนี้ 3.1 กลุมที่ใชน้ําตาลผานวิถีไกลโคไลซิส (Embden-Meyerhof-Parnas Pathway) ในการหมักและไดกรดแลคติกเปนผลิตภัณฑสุดทายเพียงชนิดเดียวซึ่งเปนแบคทีเรียกรดแลคติกกลุมที่มีเมตาบอลิสมแบบ homofermentative ไดแก Enterococcus, Streptococcus, Lactococcus, Vagococcus และ Tetra gonococcus 3.2 กลุมที่ใชน้ําตาลผานวิถี 6-phosphogluconate/phosphoketolase ในการหมักและไดผลผลิตสุดทายหลายชนิด เชน เอทานอล อะซิเตท คารบอนไดออกไซด และกรดแลกติก เปนแบคทีเรียกรดแลคติกกลุมที่มีเมตาบอลิสมแบบ heterofermentative ไดแก Leuconostoc, Oenococcus, Weisella และ Lactobacillus บางกลุม 4. สวนประกอบของผนังเซลล (Cell-wall composition) แบคทีเรียกรดเปนแบคทีเรียแกรมบวก องคประกอบของผนังเซลลจึงประกอบไปดวย เพปทิโดไกลแคน, ลิโพพอลีแซคคาไรด, ลิโพโปรตีน, กรดไทโคอิก, และกรดอะมิโนหลายชนิด เปนตน ซึ่งความแตกตางของโครงสรางเปปทิโดไกลแคน ปริมาณและชนิดของกรดอะมิโนที่เปนองคประกอบของผนังเซลล จะมีความแตกตางกันตามชนิดของแบคทีเรีย (Schleifer และ Kandler, 1972) จึงสามารถนํามาใชเปนเกณฑในการจําแนกชนิดของแบคทีเรียได การศึกษาองคประกอบของผนังเซลลสามารถตรวจสอบไดโดยงายดวยวิธี Thin-layer-chromatography ซึ่งเหมาะสําหรับใชในกรณีที่แบคทีเรียสกุลนั้น ๆ มีจํานวนสายพันธุอยูมาก (Kandler และ Weiss, 1986) ตัวอยางเชน ผนังเซลลของ Pediococci ประกอบดวยกรดอะมิโน L-Lys-L-Asp (Kandler,1970) สวนผนังเซลลของ Lactobacillus ประกอบดวยกรดอะมิโนชนิด Lys-D-Asp (pot et al., 1994)

5. การเคลื่อนที่ผานสนามไฟฟาของ Lactic Acid Dehydrogynases แบคทีเรียแตละชนิดจะมีรูปแบบของเอนไซมที่แตกตางกัน จึงนํามาใชในการจัดจําแนกแบคทีเรียไดโดยหลักการแยกเอนไซมดวยเทคนิคเจลอิเล็กโตรโฟเลซิส (Gel electrophoresis) ใชจําแนกสายพันธุที่มีความใกลเคียงกันมาก ๆ (Fujisawa et al., 1992) เชน Lactobacillus acidophilus, L.gasseri, และ L.crispatus เปนตน 6. SDS-PAGE ของ Whole-Cell Protein เปนการเปรียบเทียบลักษณะของโปรตีนทั้งหมดที่อยูภายในเซลล กับรูปแบบโปรตีนของแบคทีเรียที่จําแนกชนิดแลว โดยวิธี Gel electrophoresis บน Polyacrylamide gel ใหผลที่ถูกตองแมนยําถึงระดับสปชีสและซับสปชีส ซึ่งแกปญหาในการจัดหมวดหมูเชน การจําแนก Lactobacillus brevis ซึ่งมีลักษณะทางฟโนไทดใกลเคียงกับ Lb.buchneri 7. เซรุมวิทยา (Serology) เปนหลักเกณฑที่สําคัญในการจําแนกในสกุล Streptococci โดยอาศัยคุณสมบัติการเปนแอนติเจนของผนังเซลลที่ตางชนิดกัน ซึ่งจะแบงเปนกลุมตาง ๆ เรียงตามลําดับตัวอักษรเรียกวา Lancifield’s group (Lancefield, 1933) เชนการมีแอนติเจนที่เปนสารประกอบโพลีแซคคาไรดที่ผนังเซลลจัดจําแนกไดเปนกลุม A และ G สวนใน Lactobacillus เมื่อแบงกลุมโดยใชลักษณะทางเซรุมวิทยาสามารถแบงกลุมไดเปน 7 กลุม ตั้งแต A-G ตามชนิดของแอนติเจน (Kandler และ Weiss, 1986) 8. Chemotoxonomic markers เปนการจัดจําแนกแบคทีเรียกรดแลคติกโดยพิจารณาการสรางสารประกอบทางเคมีที่จําเพาะเพื่อใชเปนตัวบงชี้ ไดแกสารประเภท Quinone เชน menaquinones ubiquinones ซึ่งสามารถตรวจสอบปริมาณสารประเภทนี้ไดดวยวิธี High Pressure Liquid-Chromatography (HPLC)(Collins, 1982) หรือการวิเคราะหหาปริมาณ Fatty Acid Methyl Ester (FAME) ซึ่งทําการวิเคราะหไดโดยวิธี Gas-liquid Chromatography (GC)(Moss et al., 1974)

9. การศึกษาองคประกอบของดีเอ็นเอ DNA base composition and DNA:DNA hybridization studies เปนการศึกษาลักษณะทางพันธุกรรมของแบคทีเรียในระดับโมเลกุล เพื่อหาความสัมพันธของแบคทีเรียชนิดตาง ๆ โดยการเปรียบเทียบเบส ที่เปนองคประกอบของดีเอ็นเอซึ่งอยูในรูป mol% G+C ซึ่งพบวาแบคทีเรียที่จัดอยูในสปชีสเดียวกันจะมีคา mol% G+C ใกลเคียงกัน แตใหผลที่ถูกตองแมนยํานอย ดังนั้นจึงตองอาศัย การวิเคราะหลําดับนิวคลีโอไทด โดยใชคุณสมบัติชนิดเบสที่ที่สามารถเขาคูกันไดบนแตละสายดีเอ็นเอ โดยวัดจากเปอรเซ็นความเหมือนหรือคลาย ทั้งนี้เนื่องจากสิ่งมีชีวิตที่มีเบสบนสายดีเอ็นเอใกลเคียงกันไมจําเปนตองมีความใกลชิดกัน

10. Plasmid Profiling ความไมเสถียรของระบบเมตาบอลิสมและลักษณะทางสัณฐานวิทยาหลายประการ รวมถึงความสามารถในการสรางสารแบคเทอริโอซินของแบคทีเรียกรดแลคติกที่เกิดขึ้น อธิบายไดวาอาจเกิดจากการสูญหายของพลาสมิด เนื่องจากพลาสมิดสามารถเคลื่อนที่ไดจากเซลลหนึ่งไปยังอีกเซลลหนึ่ง ทําใหระบบที่ควบคุมดวยยีนบนพลาสมิดหายไปดวย จึงนําคุณสมบัติการมีพลาสมิดของแบคทีเรียกรดแลคติกนี้มาใชในการจัดอนุกรมวิธานดวย รวมทั้งความหลากหลายของขนาดพลาสมิดและความเสถียรของพลาสมิดดวย (Josephson และ Nielsen, 1988) 11. DNA : rRNA Hybridization เทคนิคนี้ใชความสัมพันธของลําดับเบสบนสาย DNAและ RNA เปนเกณฑในการจัดหมวดหมูของแบคทีเรียกรดแลคติก ซึ่งมีการนํามาใชหลายรูปแบบ เชน การวิเคราะหลําดับเบสของยีน 16S rRNA และ 23S rRNA (Vandamme และคณะ, 1996) โดยการเปรียบเทียบลําดับความเหมือนของลําดับเบสบนสายดีเอ็นเอและอารเอ็นเอ ซึ่งอาจจะเปรียบเทียบทั้งหมดหรือทุกสวนของจีโนม อยางไรก็ตามความสัมพันธกันทางสารพันธุกรรมอาจไมสัมพันธกับลักษณะทางสัณฐานวิทยาและชีวเคมี 12. Polymerase Chain Reaction ( PCR )

เปนเทคนิคที่เปนที่นิยมนํามาใชเปนเครื่องมือในการศึกษาในระดับอณูชีวโมเลกุล ชวยเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอตนแบบ และสารพันธุกรรมอื่น ๆ ที่มีอยูอยางจํากัดใหมีปริมาณมากขึ้น

3. แบคทีเรียกรดแลคติกถูกจัดจําแนกเปน 12 สกุล ดังนี้

1. Lactobacillus

เปนแบคทีเรียแกรมบวก มีรูปรางเปนทอนหรือทรงรีและมีโมเลกุลเปอรเซ็นต G+C โดยทั่วไปจะต่ํากวา 50 mol % ( Hammes และ Vogal, 1995 ) พบไดทั่วไปในแหลงที่มีคารโบไฮเดรตซึ่งเปนสารอาหารหลักที่เชื้อตองการเชน น้ํานม รวมถึงในแหลงธรรมชาติตางๆเชน ในเยื่อเมือกของมนุษย สัตว พืช แหลงน้ําทิ้งและในผลิตภัณฑอาหารหลักที่กําลังจะเนาเสีย เนื่องจาก Lactobacillus เปนสกุลที่ใหญมีสมาชิกมากมายจึงไดมีการจัดกลุมของ Lactobacillus ออกเปน 3 กลุมโดยอาศัยหลักเกณฑทางชีวเคมีสรีระวิทยาและความสัมพันธทางพันธุศาสตรมาใชซึ่งสามารถแบงไดเปน 3 กลุมดังตอไปนี้ กลุม A Obligately homofermentative lactobacilli เชื้อในกลุมนี้จะเปลี่ยนน้ําตาลเฮกโซสใหเปนกรดแลกติกโดยผานวิถี Embden-Meyerhof-parnas (EMP) ไดมากกวา 85 % เนื่องจากเชื้อในกลุมนี้มีเอนไซม fructose 1,6 bisphosphate-aldolase แตมีเอนไซม phosphoketolase ดังนั้นจึงไมสามารถหมักน้ําตาลกลูโคเนสและน้ําตาลเพนโทสได กลุม B facultatively homofermentative lactobacilli เชื้อในกลุมนี้สวนใหญจะใชน้ําตาลเฮกโซสผานวิถี EMP ไดผลิตภัณฑหลักเปนกรดแล็กติกและสามารถผลิตเอนไซมทั้ง fructose 1,6 bisphosphate- aldolase และ phosphoketolase แตในสภาวะที่มีน้ําตาลกลูโคสเอนไซมในวิถี phosphogluconate จะถูกกดไว กลุม C Obligately heterofermentative lactobacilli เชื้อในกลุมนี้จะใชน้ําตาลเฮกโซสผานวิถี Phosphogluconate ไดผลิตภัณฑเปนแลคเตท เอทานอลและคารบอนไดออกไซด ในปริมาณเทาๆกัน นอกจากนี้เชื้อก็ยังสามารถใชน้ําตาลเพนโทสผานวิถีนี้ไดเชนกัน

ตารางที่ 1 การแบงกลุมของสมาชิกในสกุล Lactobacillus สมบัติของ กลุม A กลุม B กลุม C Lactobacillus หมักเพนโทส - + + สราง CO2 จากกลูโคส - - + สราง CO2 จากกลูโคเนท - + + สราง FDP adolase + + - สราง phosphoketolase - + + ตัวอยางของกลุม Lb. cidophilus Lb. casei Lb.brevis Lb. delbruckii Lb.curvartus Lb.buchneri Lb. heviticus Lb. plantarum Lb.fermentum Lb. salivarius Lb. sake Lb. reuteri หมายเหตุ + ใหผลการทดลองเปนบวก

- ใหผลการทดลองเปนลบ

ที่มา : Axelsson ( 1998 )

2. Lactococcus เซลลมีรูปรางกลมหรือรูปรางไข ขนาดเสนผานศูนยกลาง 0.5 – 1 ไมครอน จัดเรียงตัวเปนเซลลเดี่ยว

เปนคูหรือตอกันเปนสายโซ ผลิตกรดแลกติกชนิด L ( + ) จากการหมักกลูโคสมักใชเปนกลาเชื้อ ( starter ) ในผลิตภัณฑนม สามารถเจริญไดที่ 10 องศาเซลเซียส แตไมเจริญที่ 45 องศาเซลเซียส พบในแหลงตางๆเชน ผักกาด ถั่ว หญา มันฝรั่ง น้ํานมดิบ ปจจุบันประกอบดวย 5 สปชีส ไดแก Lactococcus lactis ssp. Lactis, Lc.lactis ssp. Cremoris, Lc. Lactis ssp.hordniae, Lc. Plantarum, Lc. Raffinolactis และ Lc. Piscium มี mol%G+C อยูระหวาง 34-43%

3. Streptococcus

เซลลรูปกลมหรือรูปไข ขนาดเสนผานศูนยกลาง 0.8-1.2 ไมครอน จัดเรียงตัวเปนคู หรือตอกันเปนสายยาว ผลิตกรดแลคติกชนิด L(+) เทานั้น เปนผลิตภัณฑหลักจากการหมักกลูโคส (homofermentative) ตองการอาหารที่คอนขางซับซอนในการเจริญ พบวามีอยูหลายสปชีสที่เปนปรสิตในคนหรือสัตว และบางสปชีสเปนสาเหตุของการเกิดโรคได เจริญที่อุณหภูมิ 20-42 องศาเซลเซียส ปจจุบันประกอบดวย 39 สปชีส มี mol%G+C อยูระหวาง 34-46% (Hardie and Whiley, 1995)

4. Enterococcus

เซลลมีลักษณะเปนรูปไข จัดเรียงตัวเปนเซลลเดี่ยว ๆ เปนคู หรือตอกันเปนสายสั้น ๆ ตองการอาหารในการเจริญเติบโตที่ซับซอน ผลิตกรดแลคติกชนิด L(+) จากการหมักกลูโคส มี mol% G+C อยูระหวาง 37-40% พบวามีบางชนิดที่กอโรคได ปจจุบันประกอบดวย 5 สปชีส ไดแก Enterococcus faecalis, Ent. avium, Ent.gallinarum, Ent. faecium และ Ent. cecorum

5. Vagococcus

เปนแบคทีเรียกรดแลคติกที่สามารถเคลื่อนที่ได ยกเวนบางสกุล ประกอบดวย 2 สปชีส ไดแก Vogococcus fluvialis เดิมจัดอยูในสกุล Streptococcus กลุม N แยกไดจากอุจจาระของไก และ V. salmoninalum แยกไดจากปลาแซลมอนที่เปนโรค (Stiles และ Holzapfel, 1997) 6. Pediococcus

เซลลรูปรางกลม ขนาดเสนผานศูนยกลาง 0.36-1.43 ไมครอน มีการแบงตัวในลักษณะสองทิศทางบนระนาบเดียวกัน โดยการแบงครั้งที่สองจะตั้งฉากกับการแบงครั้งแรก ทําใหเกิดลักษณะเฉพาะเปน 4 เซลลติดกันคลายจัตุรัส (tetrad formation) ในสภาวะที่ไมมีอากาศผลิตกรดแลคติกชนิด DL และ L(+) จากการหมักกลูโคส บางชนิดทําใหเบียรและไวนเส่ือมสภาพ ประกอบดวย 6 สปชีส ไดแก Pediococcus acidilactici, P. dextrinicus, P. inopinatus, P. parvurus, P. pentosaceus และ P. domonocus mol% G+C อยูระหวาง 34 - 44% (Simpson และ Taguchi, 1995)

7. Tetradgenococcus เชื้อในสกุลนี้แยกมาจากสกุล Pediococcus (กอนหนานี้คือ P. halophilus) โดยมีลักษณะพิเศษสามารถเจริญไดในอาหารที่มีความเขมขนของเกลือโซเดียมคลอไรด 18% และมีลําดับเบส 16S rRNA ใกลเคียงกับเชื้อในสกุล Enterococcus และ Carnobacterium มากกวาสกุลเดิม (Simpson และ Taguchi, 1995) 8. Carnobacterium เซลลรูปรางเปนแทงตรงยาว มักพบอยูเดี่ยว ๆ หรือเปนคู เสนผานศูนยกลาง 0.5 – 0.7 ไมครอนและยาว 1.1 – 3.0 ไมครอน mol% G+C อยูระหวาง 31.6 – 37.2% สามารถหมักน้ําตาลเฮกโซสเปนกรดแลคติกชนิด L(+) เอธานอล กรดอะซิติกและคารบอนไดออกไซด นอกจากนี้ยังสามารถผลิตสารอะซิโตอิน(acetoin) หรือกรดฟอรมิก ไดในปริมาณตาง ๆ กัน ภายใตสภาวะที่มีอากาศ แตในสภาวะที่ไมมีอากาศจะผลิตกรดฟอรมิกไดเพียงเล็กนอย ประกอบดวย 6 สปชีส 9. Leuconostoc ลักษณะทางสัณฐานวิทยาของเซลลขึ้นอยูกับอาหารเลี้ยงเชื้อ ในอาหารที่มีกลูโคสเซลลมีลักษณะยืดออกคลายกลุม Lactobacilli แตเมื่อเจริญในน้ํานมเซลลจะมีลักษณะกลม การจัดเรียงตัวเปนเซลลเดี่ยว ๆ อยูเปนคู หรือสายโซส้ันจนถึงปานกลาง ผลิตกรดแลคติกชนิด D(-) เอธานอล คารบอนไดออกไซด และสารหอมระเหยจากการหมักกลูโคส จึงชวยสรางกลิ่นรสในอาหารหมักดอง จัดเปนแบคทีเรียกลุม heterofermentative การเจริญตองการอาหารที่ซับซอน ประกอบดวย 8 สปชีส mol% G+C อยูระหวาง 37-40% 10. Aerococcus มีลักษณะการแบงตัวคลายกับ Pediococcus สามารถเจริญไดในสภาวะที่มีความเปนดางสูงพีเอชประมาณ 9 สองสปชีสคือ A. viridans และ A. urinae มีรายงานพบวา A. viridans เปนสาเหตุใหกุงลอบสเตอรเกิดโรคและเกี่ยวของกับการติดเชื้อในมนุษย 11. Weissella มีรูปรางทั้งแบบกลมและเปนทอนปนกัน และยังมีลักษณะที่คลายคลึงกันกับ Leuconostoc ประกอบดวย 7 สปชีส

12. Oenococcus

เชื้อในสกุลนี้มีอยูเพียงชนิดเดียวคือ Oenococcus oeni ซึ่งแยกออกมาจาก Leu. oenos มีลักษณะเดนคือคุณสมบัติการทนกรด และสามารถผลิตเอธานอลไดในปริมาณสูง และมีลําดับเบสบน 16S rRNA ที่แตกตางจาก สปชีสอื่นในสกุล Leuconostoc อยางชัดเจน (Dellaglio และคณะ, 1995)

4.สารที่แบคทีเรียกรดแลคติกผลิตและมีคุณสมบัติในการยบัยั้งการเจริญของเชื้อจุลินทรียอื่น ในกระบวนการหมักของแบคทีเรียกรดแลคติกนั้น จะเปนการลดปริมาณคารโบไฮเดรตโดยเกิดควบคู

ไปกับการลดลงของคาพีเอชเนื่องจาการสะสมกรดอินทรียที่มีขนาดโมเลกุลเล็ก ซึ่งมีคุณสมบัติในการยับยั้งการเจริญของเชื้อจุลินทรียอื่น โดยระดับและสัดสวนของผลผลิตเหลานี้จะสะสมในสภาพแวดลอม และขึ้นอยูกับสายพันธุของเชื้อจุลินทรีย องคประกอบทางเคมี และคุณสมบัติทางกายภาพของกระบวนการหมัก ตัวอยางกรดอินทรียที่เปนผลิตผลของการหมักไดแก กรดแลคติก กรดอะซิติกและกรดโพรพิโอนิก (Blom และ Mortvedt, 1991) และนอกจากกรดอินทรียแลวยังพบวาแบคทีเรียกรดแลคติกยังสามารถสรางสารที่มีคุณสมบัติในการยับยั้งชนิดอื่น ๆ อีกเชน

เอธานอล แอมโมเนีย ไฮโดรเจนเปอรออกไซด ไดอะซิติล คารบอนไดออกไซด และสารแบคเทอริโอซิน

เปนตน และพบวาสารยับยั้งบางชนิดสามารถยับยั้งเชื้อจุลินทรียกอโรค และจุลินทรียที่เปนสาเหตุการเนาเสียของอาหารได(Vuyst และ Vandamme, 1994)

สารยับยั้งดังกลาวขางตนเมื่อพิจารณาถึงสวนประกอบสามารถแบงออกเปนกลุมใหญได 2 กลุม

ดังนี้คือ(Axelsson, 1993) 4.1 สารยับยั้งกลุม Non – peptide inhibitor สารยับยั้งในกลุมนี้ไมมีสารประเภทโปรตีนเปน

องคประกอบ ไดแก 4.1.1 กรดอินทรีย กระบวนการหมักในกลุมแบคทีเรียกรดแลกติกนั้นจะไดผลผลิตเปนกรดอินทรียที่มีโมเลกุลขนาดเล็ก

และมีคุณสมบัติในการยับยั้งการเจริญของเชื้อจุลินทรียอื่นได เชน กรดแลคติก กรดอะซิติก และกรดโพรพิโอนิก การยับยั้งที่เกิดจากกรดอินทรียนั้นเนื่องมาจากกรดอินทรียไปมีผลทําใหสภาวะความเปนกรด – ดาง ไมเหมาะสมตอการเจริญ โดยทําใหคาพีเอช คาคงที่การแตกตัว (pKa) และ เขมขนของกรด ซึ่งจะเปนตัวกําหนด

ความสามารถในการยับยั้งของกรดแลคติกและกรดอะซิติก และจะมีผลตอการยับยั้งในวงกวาง รวมทั้งแบคทีเรียแกรมบวกและแกรมลบ ยีสต และรา (Vuyst และ Vandamme, 1994) ในภาวะที่พีเอชต่ํา กรดที่มีคา pKa สูงจะอยูในรูปไมแตกตัวมากกวากรดที่มีคา pKa ต่ํา เชน กรดอะซิติก (pKa = 4.74) ซึ่งผลิตจากแบคทีเรียกรดแลคติกกลุม herterofermentative มีกรดอยูในรูปไมแตกตัวมากกวากรดแลคติก (pKa = 3.85) 2-4 เทาที่พีเอชในชวง 4-4.6 (Lindgren และ Dobogrosz, 1990) ทําใหมีผลมากกวากรดแลคติก

การสะสมของกรดอินทรียสงผลกระทบตอเชื้อจุลินทรียเนื่องจากกรดออนสวนที่ไมแตกตัวจะละลายในไขมันแพรผานเยื่อหุมเซลล(Cramer และ Prestegard, 1977) มีผลทําใหภายในเซลลของจุลินทรียมีพีเอชสูงกวาภายนอก และเกิดการแตกตัวของกรดใหไอออนลบและโปรตอน ซึ่งจะไปรบกวนกระบวนการเมตาบอลิซึมที่จําเปน ตอเซลล เชน oxidative phosphorylation และ substrate translocation (Baird-Parker, 1980)

4.1.2 ไฮโดรเจนเปอรออกไซด (H2O2) ไฮโดรเจนเปอรออกไซดจะถูกผลิตขึ้นจากกระบวนการหมักภายใตสภาวะที่มีออกซิเจน โดยการทํางาน

ของฟลาโวโปรตีน(flavoprotein) ของเอนไซด ออกซิเดส (oxidase) NADH oxidase และ superperoxide dismutase ในสภาวะที่ไมมีธาตุเหล็กแบคทีเรียกรดแลคติกจะไมสรางเอนไซดคะตะเลส (catalase) ซึ่งทําหนาที่ในการสลายไฮโดรเจนเปอรออกไซดไปเปนน้ําและออกซิเจน และมีระบบอื่นที่จะใชกําจัดปริมาณของไฮโดรเจนเปอรืออกไซด ซึ่งเปนตามกลไกการสะสมไฮโดรเจนเปอรออกไซด (Condon, 1987) อยางไรก็ตาม Frontaine และคณะ ไดกลาวแยงวา ไมมีการสะสมไฮโดรเจนเปอรออกไซดในเซลลเพราะวาถูกสลายไปโดยเอนไซด peroxidase, flavoprotein และ pseudocatalase ไฮโดรเจนเปอรออกไซดสามารถทําลายแบคทีเรียชนิดอื่นไดเนื่องจากเปนตัวออกซิไดซที่มีฤทธิ์รุนแรงตอเซลลของแบคทีเรีย โดยออกซิไดซสวนประกอบของเซลลที่มีหมูซัลฟไฮดริล (sulfhydryl) คือ โปรตีนในเซลลและไขมันในเยื่อหุมเซลล (Morris, 1976; Schlegel,1985; Lingren และ Dobogrosz,1990) นอกจากนี้ในปฏิกิริยาการสรางไฮโดรเจนเปอรออกไซดจะมีการขนสงออกซิเจน สงผลใหเกิดภาวะขาดออกซิเจนทําใหแบคทีเรียชนิดอื่นไมสามารถเจริญได (Fortraine และคณะ, 1996)

ตารางที่ 2 เอนไซมที่เกี่ยวของกับการสังเคราะหไฮโดรเจนเปอรออกไซดโดยแบคทีเรียกรดแลคติก เอนไซม ปฏิกิริยา NADH:H2O2 oxidase NADH + H+ + O2 NAD + H2O2

Pyruvate oxidase Pyruvate + phosphate + O2 acetylphosphate + CO2 + H2O2

α – Glycerophosphate oxidase α – Glycerophosphate + O2 dihydroxyacetonephosphate + H2O2

superoxide dismutase 2O – 2 + 2H+ H2O2 + O2

ที่มา : Vuyst และ Vandamme (1994)

4.1.3 ไดอะซิติล (Diacetyl) ไดอะซิติล (2,3-butanedione) เปนผลิตภัณฑที่ไดจากกระบวนการสังเคราะหไพรูเวททั้งในสภาพที่มี

อากาศและไมมีอากาศ โดยแบคทีเรียกรดแลคติกบางสายพันธุของสกุล Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus และ Streptococcus (Jay, 1982) โดยจะสรางเมื่อเกิดกระบวนการเมตาบอลิซึมของซิเตรทใน วัฏจักรเครบ (Kreb’s cycle) ซึ่งกระบวนการหมักจะไดไพรูเวทจํานวนมาก และไพรูเวทเหลานี้จะถูกเมตาบอไลซ เปนไดอะซิติล

ไดอะซิติลจะมีประสิทธิภาพการยับยั้งสูงสุดที่พีเอชตํ่ากวา 7.0 (Jay, 1982) แตจะมีคุณสมบัติการยับยั้งก็ตอเมื่อมีน้ําตาลกลูโคส อะซิติลและทวีน 80 ในอาหาร โดยไดอะซิติลมีคุณสมบัติในการยับยั้งจุลินทรียกอโรคและและจุลินทรียที่เปนสาเหตุทําใหอาหารเนาเสีย และพบวาไดอะซิติลสามารถยับยั้งแบคทีเรียแกรมลบ ยีสต และรา ไดมากกวาแบคทีเรียแกรมบวก โดยทําปฏิกิริยากับโปรตีนที่จับกับอารจินีน (Arginine binding protein) ของแบคทีเรียแกรมลบ ทําใหแบคทีเรียไมสามารถใชอารจินีนได

4.1.4 คารบอนไดออกไซด (CO2) คารบอนไดออกไซดเปนผลิตภัณฑหลักที่ไดจากการหมักน้ําตาลที่มีคารบอน 6 อะตอม (Hexose) โดย

แบคทีเรียกรดแลคติกกลุม Heterofermentative และยังพบวาแบคทีเรียกรดแลคติกกลุม Homofermentative บางชนิดสามารถผลิตคารบอนไดออกไซดจากมาเลท และ ซิเตรทได (Fleming และคณะ, 1986; London,

1990) โดยมาเลทจะเปลี่ยนเปนแลคเตทและคารบอนไดออกไซดโดยเอนไซมมาโลแลกติก ในขณะที่ซิเตรทเปล่ียนเปนอะซิเตทและออกซาโลอะซิเตทโดยเอนไซดซิเตทไลเอส จากนั้นออกซาโลอะซิเตทจะเกิดปฏิกิริยา decarboxilation เปล่ียนเปนไพรูเวทและคารบอนไดออกไซด คารบอนไดออกไซดสามารถยับยั้งจุลินทรียอื่นไดเนื่องจากทําใหเกิดสภาพไรอากาศ โดยการแทนที่โมเลกุลของออกซิเจนทําใหคาพีเอชทั้งภายในและภายนอกเซลลลดลง และยังพบวามีผลในการทําลายเยื่อหุมเซลล

4.1.5 รูเทอริน (Reuterin) รูเทอริน 3-hydroxypopanol เปนสารยับยั้งที่มีโมเลกุลต่ํา ผลิตโดย Lactobacillus reuterin ซึ่งเปนแบคทีเรียที่อยูในระบบทางเดินอาหารของมนุษยและสัตวอื่น ๆ เมื่ออยูในสภาวะที่ไมมีออกซิเจน สามารถยับยั้งจุจินทรียไดในวงกวางโดยมีผลตอแบคทีเรียแกรมบวก รา ไวรัส และโปรโตซัว กลไกการยับยั้งเกิดจากรูเทอรินจะทําปฏิกิริยากับเอนไซมกลุมซัลฟไฮดริล (sulfhydryl) โดยจับกับเอนไซมบริเวณ substrate binding sub unit ของ ribonucleotide reductase ทําใหมีผลตอการสังเคราะหดีเอ็นเอ 4.2 สารยับยั้งกลุม Peptide inhibitor เปนกลุมที่มีสารประเภทโปรตีนเปนองคประกอบ ไดแก

4.2.1 แบคเทอริโอซิน (Bacteriocin)

แบคเทอริโอซินเปนสารยับยั้งการเจริญของเชื้อจุลินทรียอื่นที่มีองคประกอบเปนสารประเภทโปรตีน สามารถยับยั้งจุลินทรียในสปชีสเดียวกันหรือใกลเคียงกันโดยไมมีผลกระทบตอเซลลที่ผลิต และนอกจากนี้ยังพบวาแบคเทอริดอซินสามารถยับยั้งจุลินทรียที่กอใหเกิดโรคและจุลินทรียที่ทําใหอาหารเนาเสียได เชน Listeria monocytogenes, Bacillus cereus, Clostidium botulinum และStaphylococcus aureus เปนตนในปจจุบันแบคเทอริโอซินไดรับความสนใจ และมีการนํามาใชประโยชนอยางกวางขวาง โดยนํามาใชในกระบวนถนอมและรักษาคุณภาพของผลิตภัณฑอาหารชนิดตาง ๆ ทั้งอาหารของมนุษยและอาหารสัตว นอกจากนี้มีการใชปองกันโรคเตานมอักเสบในวัว และใชจัดอนุกรมวิธาน 5.แบคเทอริโอซิน (Bacteriocin) คําจํากัดความของแบคเทอริโอซิน

การศึกษาแบคเทอริโอซินเริ่มตนจากการศึกษาคุณสมบัติของโคลิซิน (Colicin)ที่ผลิตโดย Escherichia coli โดยมีการศึกษาอยางละเอียดทั้งกลไกการทํางาน ลักษณะทางพันธุกรรม ความสามารถในการยับยั้ง และการทําใหบริสุทธิ์ Tagg และคณะไดใหคําจํากัดความของแบคเทอริโอซินวา เปนสารประกอบโปรตีนที่ออกฤทธิ์จํากัดเฉพาะแบคทีเรียสปชีสเดียวกันหรือสปชีสใกลเคียงกัน ผลของการออกฤทธิ์ทําใหแบคทีเรียที่ตองการยับยั้ง

ตาย มีตําแหนงการยึดจับกับเซลลที่ถูกทําลายอยางจําเพาะ การผลิตและการตานทานตอแบคเทอริโอซินของเซลลควบคุมดวย พลาสมิด และกระบวนการสังเคราะหทําใหเซลลที่ผลิตตาย (lethal biosynthesis) ตอมาเมื่อมีการศึกษาแบคเทอริโอซินชนิดอื่น ๆ พบวามีขอมูลหลายประการขัดแยงกับคําจํากัดความขางตน เชน leucocin A-UAL 187 และ leucocin S สามารถยับยั้งการเพิ่มจํานวนของแบคทีเรีย (bacteriostatic) เทานั้น (Hastings และ Stiles, 1991; Lewas และคณะ, 1992) แบคเทอริโอซิน Helveticin J, Lactacin B, Propionicin PLG-1 ถูกควบคุมการผลิตโดยยีนที่อยูบนโครโมโซม (Lyon และ Glatz, 1993) ดังนั้นจึงมีการนิยามแบคเทอริโอซินเปนเพียงสารประกอบโปรตีนซึ่งมีฤทธิ์ยับยั้งการเจริญแบคทีเรียอื่นและไมมีความเปนพิษตอเซลลที่ผลิต (Montville และ Kaiser, 1993) ตอมา Jack และคณะ ไดเสนอใหใชคําวา “สารเสมือนแบคเทอริโอซิน” (bacteriocin like inhibitory substance, BLIS) สําหรับโปรตีนที่มีคุณสมบัติยับยั้งแบคทีเรียชนิดอื่น การจัดแบงกลุมของแบคเทอริโอซิน (Classification of Bacteriocin)

ในปจจุบันไดมีการคนพบแบคเทอริโอซินอีกหลายชนิด จึงไดมีความพยายามจัดกลุมแบคเทอริโอซินให

เปนหมวดหมูเพื่องายตอการกลาวถึง โดยการแบงกลุมของแตละระบบมีการใชหลักการที่ตางกันออกไป แตที่ไดรับการยอมรับมากที่สุดคือการจัดแบงกลุมตามระบบของ Klaenhammer และคณะ (1992) ซึ่งไดแบงกลุมของแบคเทอรโิอซินออกเปน 4 กลุม (ตารางที่ 4) ดังนี้คือ ตารางที่ 3 การจัดแบงกลุมแบคเทอริโอซินจากแบคทีเรียกรอแลคติก

กลุม (Class) กลุมยอย ลักษณะ

I II

III IV

IIa

IIb IIc

แลนติไบโอติก (Lantibiotic) แบคเทอริโอซินขนาดเล็กกวา 10 กิโลดาลตัน ทนความรอน 100 – 121 องศาเซลเซียส ออกฤทธิ์ตอ Listeria ประกอบดวย – Y– G –N– G –V– X– C - บริเวณดานปลายเอ็น (N-terminal) การออกฤทธิ์ตองการการทํางานรวมกันของเปปไทด 2 สาย การออกฤทธิ์ตองการหมูไธออล แบคเทอริโอซินขนาดใหญกวา 30 กิโลดาลตัน ไมทนความรอน แบคเทอริ โ อซิ นที่ มีคาร โบ ไฮ เดรตและหรื อ ไข มัน เปนองคประกอบ

ที่มา : Ouwehand (1998)

Class I แลนติไบโอติก (Lantibiotic) เปนสายเปปไทดขนาดเล็กประกอบดวยกรดอะมิโนชนิด lanthionine, �-methylanthionine, dehydroalanine (DHA) และ dehydrobutyrine (DHB) การสังเคราะหกรดอะมิโนตาง ๆ เหลานี้เกิดขึ้นหลังจากการแปลรหัสที่ serine และ threonine ไปอยูในรูป dehydro form แลวกรดอะมิโนในรูปนี้จะไปทําปฏิกิริยากับ cystein เพื่อสรางวงแหวน thioether lanthionine ซึ่งเปนที่มาของชื่อกลุม ตัวอยางของแบคเทอริโอซินในกลุมนี้ คือ

- Nisin สรางโดย L.lactis subs. Lactis - Lactocin S สรางโดย Lactobacillus sake - Lactocin 481 สรางโดย L.lactis subs. Lactis CNRZ 481 - Carnocin U 149 สรางโดย Carnobacterium piscicola

Class II Small heat – stable proteins

เปนเปปไทดที่มีขนาดเล็กกวา 10 กิโลดาลตัน ทนอุณหภูมิไดตั้งแต 100 – 121 องศาเซลเซียส แบงเปน

กลุมยอย ๆ ได 3 กลุมดังนี้ Class IIa เปนแบคเทอริโอซินที่สามารถยับยั้งการเจริญของ Listeria monocytogenase มีรูปแบบของ

กรดอะมิโนที่ปลายเอ็นเปนT yr – Gly – Ans – Gly - Val – Xaa – Gys บางครั้งเรียกกลุมยอยนี้วาแบคเทอริโอซินในตระกูล Pediocin (Ennahar และคณะ, 2000)

ตัวอยางแบคเทอริโอซินในกลุมนี้ไดแก - Pediocin PA-1 ผลิตโดย Pediococcus acidilactici PAC 1.0 - Sakacin A ผลิตโดย Lactobacillus sake LB 706 - Pediocin AcH ผลิตโดย P. acidilactici H Class IIb เปนแบคเทอริโอซินกลุมที่ตองอาศัยการทํางานรวมกันของสายเปปไทด 2 สาย การออกฤทธิ์

จึงจะมีประสิทธิภาพเชน - lactacin F ผลิตโดย Lb. acidophilus 11088 -lactococcin G ผลิตโดย Lactococcus lactis subsp. lactis LMG 2081 - lactococcin M ผลิตโดย Lc. lactis subsp. cremoris 9B4

Class IIc แบคเทอริโอซินในกลุมนี้ตองลดปริมาณของ cysteine เพื่อใหประสิทธิภาพการออกฤทธิ์ดีขึ้น ตัวอยางแบคเทอริโอซินในกลุมนี้คือ lactacin B ผลิตโดย L. acidophilus N2

Class III Large heat – labile proteins

เปนแบคเทอริโอซินกลุมที่มีขนาดใหญ (มากกวา 30 กิโลดาลตัน) ไมทนตอความรอน ไดแก helviticin

J ผลิตโดย Lactobacillus helviticus 481

Class IV Complex bacteriocins

เปนแบคเทอริโอซินกลุมที่มีคารโบไฮเดรตและ/หรือไขมันเปนองคประกอบ เปนแบคเทอริโอซินที่ไมคอยไดรับการยอมรับเพราะอาจเกิดจากการทําใหแบคเทอริโอซินบริสุทธิ์ไดไมดีพอ ตัวอยางเชน - Lactocin 27 ผลิดโดย Lb. helviticus LP27 นอกจากการจัดกลุมและใหชื่อโดยวิธีการดังกลาวขางตน ยังมีวิธีอื่นที่นํามาทําการจําแนกกลุมและตั้งชื่ออีกเชน การใชหลักการ sulfhydryl chemistry สามารแบงแบคเทอริโอวินไดเปน 3 กลุม (Jack และคณะ, 1999)ดังนี้

1.กลุม lantibiotic เปนกลุมที่มีวงแหวน lanthionone 2.กลุม cystibiotic เปนกลุมที่มี disulfide bone 3.กลุม thiobiotic เปนกลุมที่ตองลด sulfhydryl

การทํางานของแบคเทอริโอซิน (antibacterial activity)

แบคเทอริโอซินที่มีคุณสมบัติในการยับยั้งการเจริญของจุลินทรียอื่นไดนั้นเปนผลมาจากลักษณะ

การทํางานดังนี้ - ทําลายเยื่อหุมเซลลทําใหความสามารถในการยอมใหผานเขา-ออก (permeability) ของ

เยื่อหุมเซลลเสียสภาพไป เกิดภาวะเสียสมดุลขึ้นภายในเซลล - ทําใหเอนไซมที่สําคัญบางชนิดเสียคุณสมบัติไป - ทําใหสารพันธุกรรมเสียรูปรางหรือหนาที่ไปจากเดิม

กลไกการออกฤทธิ์ของแบคเทอริโอซิน แบคเทอริโอซินในแตละกลุมจะมีกลไกการออกฤทธิ์ตอเซลลเปาหมายที่แตกตางกัน แตก็มีกลไกการ

ออกฤทธิ์ที่คลายกัน แบงเปน 2 ขั้นตอนคือ

ขั้นตอนที่1 แบคเทอริโอซินจะยึดเกาะกับผิวของเซลลเปาหมาย ขั้นตอนที่ 2 แบคเทอริโอซินจะสรางรู (pore) ในชั้นเยื่อหุมเซลล

กระบวนการสังเคราะหแบคเทอริโอซิน

การสรางแบคเทอริโอซินของแบคทีเรียกรดแลคติกถูกควบคุมโดยยีนที่อยูบนพลาสมิด โดยยีนที่

ควบคุมแบงออกเปน 2 สวน ไดแก สวนที่เปนยีนโครงสราง (structural gene) และยีนสวนที่ควบคุมการสรางแบคเทอริโอซิน (repressor gene) และในบริเวณที่ใกลเคียงจะเปนที่ตั้งของยีนที่ควบคุมความสามารถในการตานทานตอแบคเทอริโอซินที่เชื้อสรางขึ้น โดยปกติแลวเมื่อนําแบคทีเรียที่มียีนควบคุมการสรางสารแบคเทอริโอซินมาเพาะเลี้ยง พบวามีเฉพาะบางเซลลเทานั้นที่สรางแบคเทอริโอซินได สาเหตุเนื่องมาจากแบคทีเรียสวนใหญจะถูกยับยั้งโดยยีนที่ควบคุมการสรางสารแบคเทอริโอซิน (repressor gene) แบคทีเรียเหลานี้จะมีการสรางแบคเทอริโอซินไดก็ตอเมื่อมีการกดการทํางานของ repressor gene ซึ่งอาจเกิดขึ้นไดหลายวิธีเชน การกลายพันธุตามธรรมชาติ (spontaneous mutation) หรือจากสารกอมะเร็งตาง ๆ เชน รังสี อัลตราไวโอเลต, รังสี เอกซ, mitomycin 1–ascorbic acid และ ไฮโดรเจนเปอรออกไซด เปนตน ในขั้นตอนการสังเคราะหแบคเทอริโอซินนั้น พบวาเกิดขึ้นในไซโตพลาสม จากนั้นจะรวมตัวกับ immunity protein ในอัตราสวน 1 : 1 โมเลกุลเชิงซอนที่เกิดขึ้นนี้จะผานเยื่อบุชั้นใน (inner membrane) และสะสมอยูบริเวณ periplasmic space และจะกระจายไปยังบริเวณสวนผิวหนาของเซลลแบคทีเรีย ซึ่งบริเวณนี้สารดังกลาวจะจับกับโพลิแซคคาไรด (polysaccharidea หรือ O-antigen ของเยื่อบุชั้นนอก (outer membrane) และสารประกอบเชิงซอนนี้จะเกิดเปน cude bacteriocin ถูกขับออกนอกเซลลในที่สุด การคัดเลือกแบคทีเรียกรดแลคติกที่สามารถผลิตแบคเทอริโอซิน

การคัดเลือกนั้นสามารถทําไดทั้งบนอาหารแข็งหรือกึ่งแข็งและในอาหารเหลว โดยในอาหารแข็งหรือกึ่ง

แข็งสังเกตจากการเกิดบริเวณใสจากการยับยั้งเชื้อทดสอบโดยแบคเทอริโอซิน สวนในอาหารเหลวการทดสอบการยับยั้งวัดผลไดจากการเปลี่ยนแปลงความหนาแนนของเชื้อทดสอบโดยใชเครื่องสเปกโตโฟโตมิเตอร (spectrophotometer)

Hoover และ Harlander (1993) ไดสรุปเทคนิคการคัดเลือกแบคทีเรียกรดแลคติกที่ผลิตแบคเทอริโอซินไวดังนี้

5.6.1 การคักเลือกดวยอาหารแข็งหรือกึ่งแข็ง Simultaneous methods เปนวิธีการคัดเลือกที่ใหแบคทีเรียกรดแลคติกเจริญไปพรอมกับแบคทีเรีย

ทดสอบ เชน วิธี spot - on – lawn ทําไดโดยการเพาะเชื้อทดสอบบนอาหารแข็งหรือกึ่งแข็ง หรือเกลี่ยเชื้อทดสอบบนผิวหนาอาหารและทําการเพาะเชื้อที่สรางสารแบคเทอริโอซินลงไปใหเจริญพรอมกัน

Deferred methods คัดเลือกโดยการเพาะเชื้อที่ตองการตรวจสอบการสรางแบคเทอริโอซินบนอาหาร

เพาะเลี้ยงในสภาวะที่เหมาะสมใหเจริญกอน จากนั้นจึงเททับดวยอาหารวุนหลอมที่เติมเชื้อทดสอบ แลวจึงนําไปบมอีกครั้งภายใตสภาวะที่เหมาะสมสําหรับเชื้อทดสอบ วิธีนี้สามารถประยุกตเพื่อทดสอบหาเชื้อที่ผลิตแบคเทอริโอซินจากตัวอยางแบคทีเรียกรดแลคติกที่ปะปนกันอยูได

5.6.2 การคัดเลือกดวยอาหารเหลว เปนวิธีการที่ไมคอยเปนที่นิยมสําหรับใชในการคัดเลือก แตก็มีขอดีในการตรวจสอบผลของแบคเทอริ

โอซินไดชัดเจนเนื่องจากสามารถจํากัดปจจัยอื่น ๆ ที่ยับยั้งการเจริญของเชื้อชนิดอื่นได เชน การปรับพีเอชเปนกลางเพื่อลดผลของกรด การเติมเอนไซมคะตะเลสเพื่อลดผลจากไฮโดรเจนเปอรออกไซด แตวิธีติดตามการสรางสารในอาหารเหลวทําไดคอนขางยากจึงมักใชยืนยันผลจากการตรวจสอบบนอาหารแข็งและใชในการศึกษารายละเอียด

6. ปฏิกิริยาลูกโซโพลิเมอเรส (Polymerase Chain Reaction,PCR) การเพิ่มปริมาณยีนในหลอดทดลองโดยปฏิกิริยาลูกโซโพลิเมอเรส เปนวิธีการที่ไดรับความนิยม

นํามาใชในงานวิจัยทางดานพันธุวิศวกรรม เนื่องจากเปนวิธีที่ชวยเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรมหรือดีเอนเอใหมีปริมาณเพิ่มขึ้นหลายเทา จากดีเอนเอตนแบบที่มีอยูอยางจํากัด เทคนิคนี้ถูกคนพบโดย Kary Mullis(1993) และมีรายงานวาผูที่นําเทคนิคนี้มาใชเปนครั้งแรกคือ Saiki และคณะ (1985) ไดทําการเพิ่มปริมาณยีนเฉพาะบริเวณยีนเบตาโกลบิน จากดีเอ็นเอที่สกัดจากเม็ดเลือดขาวของคนไขโรค sickle cell anemia และคนปกติ จุดเดนของเทคนิคพีซีอารคือสามารถยนระยะเวลาและลดขั้นตอนการทํางานในการเพิ่มปริมาณยีน จากเดิมที่ตองตัดตอยีนเขากับพลาสมิด แลวจึงเพิ่มปริมาณพลาสมิดในเซลล แลวจึงแยกสกัดพลาสมิดออกจากเซลลและแยกยีนออกมาตามลําดับ ซึ่งตองใชเวลาและมีขั้นตอนมากและยุงยาก เทคนิคพีซีอารลดเวลาในการทํางานไดมาก เนื่องจากไมตองทําการโคลนนิ่ง (cloning) และไมตองแยกดีเอ็นเอบริสุทธิ์จากปฏิกิริยาพีซีอาร เพราะดีเอ็นเอที่ไดมีความบริสุทธิ์ดีพอ ปจจุบันนี้นักวิทยาศาสตรและนักวิจัย ไดนําเทคนิคนี้มาใชประโยชนในงานวิจัยทั้งในรูปแบบพื้นฐานและการประยุกตใชตามความเหมาะสม

ปฏิกิริยาลูกโซโพลิเมอเรส หรือเทคนิคพีซีอาร อาศัยหลักการของการจําลองตัวของดีเอ็นเอ (DNA replication) ที่ เกิดขึ้นในหลอดทดลองซ้ํากันหลาย ๆ รอบ ซึ่ งอาศัยการเรงปฏิกิ ริยาโดยเอนไซมที่ มีความสามารถทนรอน ในระยะแรก ๆ ของเทคนิคพีซีอารจะใชเอนไซม Klenow fragment ซึ่งไมสามารถทนความรอนที่ 95 องศาเซลเซียส เปนเวลานานได ในทุกขั้นตอนของการ denaturation ที่อุณหภูมิสูง เอนไซมจะสูญเสียสภาพธรรมชาติ ไมสามารถเรงปฏิกิริยาได จึงตองมีการเติมเอ็นไซมใหมในขั้นตอน primer extention ตอมาไดมีการคนพบเอนไซมชนิดใหมที่มีความสามารถในการทนตออุณหภูมิสูง ซึ่งแยกสกัดไดจากแบคทีเรีย Thermus aquaticus (Taq) ซึ่งแยกไดจากน้ําพุรอน จึงไดมีการนํา Taq DNA polymerase มาใชแทนเอนไซม Klenow fragment

การเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอในหลอดทดลองโดยปฏิกิริยาลูกโซโพลิเมอเรส ตองอาศัยเอนไซม DNA

polymerase ที่ทนความรอน ซึ่งปฏิริยาจะเกิดขึ้นไดในหลอดทดลองตองประกอบดวย ดีเอ็นเอตนแบบ และ dNTPs เปนซับสเตรท โดยปฏิกิริยา 1 รอบจะประกอบดวยขั้นตอนดังตอไปนี้

1. Denaturation step เปนการทําใหดีเอ็นเอตนแบบที่เปนสายคู (double strand) แยกออกเปนสายเดี่ยว (single strand) ที่อุณหภูมิ 90 – 95 องศาเซลเซียส

2. Annealing step ไพรเมอรที่สังเคราะหขึ้น จะจับกับดีเอ็นเอตนแบบเสนเดี่ยวทั้งสองเสนที่มีลําดับเบสคูสมกัน โดยอุณหภูมิที่เหมาะสมประมาณ 40-60 องศาเซลเซียส

3. Extension step เปนขั้นตอนการนํานิวคลีโอไทดที่เหมาะสมเขามาตอที่ปลาย 3’ OH ของไพรเมอร โดยการทํางานของ เอนไซม Taq DNA polymerase ซึ่งตองการอุณหภูมิประมาณ 70-73 องศาเซลเซียส

6.1 องคประกอบที่สําคัญในปฏิกิริยาลูกโซโพลิเมอเรส (Polymerase chain reaction) 1. ดีเอ็นเอตนแบบ (DNA template) ใชไดทั้งดีเอ็นเอที่บริสุทธิ์คุณภาพดีและดีเอ็นเอที่คุณภาพไมดีนัก

ไดมาจากการสกัดโดยตรงจากแหลงตาง ๆ เชน แบคทีเรีย พืช สัตวและตัวอยางเลือดตางๆ 2. Oligonucleotide primer ที่นิยมใชจะมีขนาด 20-24 นิวคลีโอไทด มีองคประกอบของเบส G และ C

อยูระหวาง 40-60 เปอรเซ็นต โดยไพรเมอรทั้ง 2 ชนิดที่ใชรวมกันควรมีสวนประกอบของ G+C เทากัน และไมควรใหไพรเมอรทั้ง 2 มีลําดับเบสเปนคูสมกัน เพราะจะจับกันเองไดเปนผลิตภัณฑที่ไมตองการ

3. เอนไซม DNA polymerase ทําหนาที่ในการเติม deoxyribonucleotide ตรงตําแหนงปลายดาย 3’ ของดีเอ็นเอ ซึ่งตองมีคุณสมบัติในการทนอุณหภูมิสูง ซึ่งปจจุบันใช Taq DNA polymerase

4. บัฟเฟอรสําหรับทําปฏิกิริยา เปนบัฟเฟอรที่ เหมาะสมสําหรับการทํางานของเอนไซม DNA polymerase

5. dNTP ประกอบดวย dATP,dTTP,dCTPแ ละ dGTP เปนสารที่ DNA polymerase นํามาสรางเปนดีเอ็นเอสายใหม

6. แมกนีเซียมคลอไรด เปนสวนที่ชวยเสริมการทํางานของ DNA polymerase

วัตถุประสงค 1. เพื่อคัดเลือกเชื้อแบคทีเรียกรดแลคติกจากลําไสไก ที่มีคุณสมบัติในการสรางสารยับยั้งจุลินทรีย 2. การจําแนกชนิดสารยับยั้งจุลินทรียในเชื้อแบคทีเรียกรดแลคติกที่คัดเลือกโดยใช PCR technique สถานที่ทําการทดลอง ภ า ค วิ ช า สั ต ว แ พ ท ย ส า ธ า รณสุ ข ศ า ส ต ร แ ล ะ ก า ร บ ริ ก า ร วิ นิ จ ฉั ย คณะ สั ต ว แ พ ท ย ศ า ส ต ร มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร วิทยาเขตกําแพงแสน ระยะเวลาทําการทดลอง พฤศจิกายน 2547 – กุมภาพันธ 2548