Sejtbiológia – gyakorlati szempontból

Alapfogalmak, tematika

A sejttenyésztés jelentősége

Kutatás: az állati és humán sejtekre jellemző biokémiai utak, különböző sejtszintű szabályozások vizsgálata

Rekombináns fehérjék előállítása Monoklonális ellenanyag termeltetése (hibridóma sejtekkel) Állati vírusok szaporítására vakcinagyártás céljából Sérült szövetek rekonstrukciója, nem funkcionáló

szövetek helyettesítése a saját szövetek tenyésztésével (pl. bőrszövet, porcszövet)

Állatkísérletek kiegészítése, részleges helyettesítése, gyógyszerfejlesztés

Sejttípusok

Primer sejtek Eredeti szervből vagy szövetből

származnak Normál, nem transzformált és nem

immortalizált sejtek Genetikailag és funkcionálisan is

jobban hasonlítanak az in vivo sejtekre, mint az immortalizált sejtvonalak

Véges élettartamúak, nem tenyészthetők korlátlan ideig

A fenntarthatóság korlátja: a kromoszómavégek (telomerek) minden osztódási ciklusban bekövetkező megrövidülése

aktiválódnak a sejtciklust ellenőrző (és azt leállító) mechanizmusok

Primer sejtek beszerzési forrásai

Saját izolálás Viszonylag olcsó A megfelelő donor beszerzése problémás lehet Etikai aspektusok Az izoláló protokol kidolgozása hosszadalmas lehet A minőség reprodukálhatósága nehézkes lehet

Kereskedelemben kapható sejtek beszerzése Megbízható minőség, minőségi bizonylattal Részletes donorinformáció Kidolgozott sejttenyésztési protokol Az adott sejttípushoz kifejleszett optimális médium

A Lonza cég primer sejt kínálata

A legnagyobb primer sejt választékkal rendelkező cég

Több, mint 200 féle sejttípus rendelhető

Biztonságos folyékony nitrogénben történő szállítás

Garancia www.lonza.com www.biocenter.hu/cellist.pdf

Sejttípusok

Sejtvonal Genetikailag viszonylag homogén Korlátlan ideig fenntartható

sejtkultúra Normál sejtek in vitro

transzformációjával, vagy tumor sejtek felhasználásával nyerik

Előnye: könnyen és viszonylag olcsón fenntartható

Hátránya: biológiailag nem feltétlen releváns eredményeket kapunk

HeLa sejtek

Sejtvonalak beszerzési forrásai

A laborban van évek óta Genetikailag már módosulhatott a sok passzálás során Mycoplasma kontamináció?

Más labortól kaptuk Az eredete nem biztos, hogy ismert Mycoplasma kontamináció?

Biztonságos beszerzési források, sejtbankok: European Human Cell Bank (Salisbury, UK) European Collection of Animal Cell Cultures (Salisbury, UK) American Type Culture Collection (USA) ATCC Tumor Bank, Deutsche Krebs Forschungszentrum,

(Heidelberg, Germany) Collection of Cancer Cell Lines (Japan)

Kondicionálisan immortalizált sejtek

A primer sejtek és a sejtvonalak előnyei egy sejttípusban

Kondicionális immortalizáció: az onkogének expressziójának kikapcsolása bizonyos körülmények között

Lonza: az SV40 Large T antigen tsA58 hőmérséklet szenzitív variánsának (tsSV40T) és a humán telomeráz katalitikus alegységének együttes alkalmazása:

33°C-on: immortalizált fenotípus37°C-on: primer sejt fenotípus

33°C-on: – immortalizált fenotípus37°C-on: – primer sejt fenotípus

A sejtkultúrák fenntartása

Az in vitro sejttenyésztés módjai: Adherens módon, monolayer kultúra – a sejtek a tenyésztő

edény aljára kitapadnak (mátrix fehérjék, Ca2+ ionok) Szuszpenzióban – csak bizonyos sejtek képesek erre, pl.CHO, BHK, VeRo, HeLa

A sejtkultúrák fenntartása - passzálás

A sejtek növekedése a telítési szakaszban leáll - passzálás Szuszpenzióban – a sejtek friss médiummal való higítása Letapadó sejtek – a konfluens kultúra elérésekor a

sejteket először szuszpenzióba visszük (fizikai mód, proteázok, kelátképzők), majd ezután tesszük friss médiumba

A sejtkultúrák fenntartása - tápfolyadékok

A tápfolyadék (médium) feladata, hogy a sejtek számára biztosítsa a növekedéshez szükséges tápanyagokat, növekedési faktorokat, a megfelelő fizikai és kémiai környezetet

Sóoldat: anorgainikus ionok (Na+, K+, Ca2+, Mg2+, Cl-, foszfát, hidrogénkarbonát)Glükóz: energiaforrásEsszenciális aminosavak: ezeket az aminosavakat a gerincesekből származó sejtek

nem tudják előállítaniVitaminok: pl. kolin, folsav, nikotinamid, inozitol, pantoténsav, piridoxin, riboflavin, tiamin,

biotin, B12

Pufferrendszer: oldott CO2/bikarbonát, vagy 20 mM HEPES

Fenolvörös: pH indikátorSzérum: 5-20% (pl. Fetal Bovine Serum, Human Serum) A sejtek proliferációjához

elengedhetetlen komponenseket tartalmaz. Alternatíva: szérummentes médiumAntibiotikumok: penicillin, streptomycin, gentamycin – bakteriális fertőzések ellen véd

A sejtkultúrák fenntartása – tenyésztő edények

Letapadó sejtekhez: sejttenyésztéshez alkalmas felület (bevonattal vagy anélkül)

Flaskák (normál, vagy szűrős kupakos) Petri csészék 6, 12, 24, 48, 96-lyukú platek Roller bottle

A sejtkultúrák fenntartása – tenyésztő edények

Speciális tenyésztőedény – UpCell

Cells harvested by trypsinization

Cells harvested from UpCell Surface by temperature reduction

37°C

20-25°C

A sejtkultúrák fenntartása – tenyésztő edények

3D szövetmodell – UpCell segítségével

37°C

20-25°C

A sejtkultúrák fenntartása – tenyésztő edények

Szuszpenziós sejtekhez.

Kíméletes kevertetés Spinner flask (műanyag vagy üveg) Reaktorok

A sejtkultúrák fenntartása – berendezések

Steril fülke Szűrt levegőt áramoltatnak a munkafelület

fölött 0,3 mm-nél nagyobb részecskéket szűr ki UV (germicid) lámpa segít fenntartani a

sterilitást

CO2 inkubátor Egyenletes 37°C hőmérséklet 5% CO2 koncentráció Megfelelő páratartalom biztostása Fontos a felületek jól

tisztántarthatósága (élek, csavarok, stb. nélkül)

A sejtkultúrák fenntartása – berendezések

Centrifuga A sejtek kíméletes lecentrifugálásához Ha lehet, kilendülőfejes rotor 15, 50 ml-es Falcon cső rotor

Mikroszkóp Inverz mikroszkóp Fluoreszcens mikroszkóp Konfokális mikroszkóp

Miről lesz még szó?

Primer sejtek kezelése, passzálása -film Sejtek transzfektálása – módszertani áttekintés,

truobleshooting Amaxa Nuclofector System Sejt viabilitás, citotoxicitás Luminométeres meghatározás Vialight, Toxilight kitekkel Mycoplasma és detektálása MycoAlert mérés (mintát lehet hozni)