llr-Flrru-

HroslGlrn

Mffi

SEMINAR NASIONAL TAHUNAN XIIIHASIL PENELITIAN PERIKANAN

JfiMd IBUDIDAVA

Seminar NasionatTahunan Xlll Hasit Penetitian Perikanan dan Kelautan, 13 Agustus 2016

Berbagai metode secara molekuler untuk mendeteksi jenis bakteri ini telah pula berkembang

iH71V"rJ et al.,2OO3; Sarjito, 2O1O).ldentifikasi secara molekuler mengunakan 165 rDNA PCR

ielifr Oiaptit<asikan untuI agensia penyebab vibriosis pada kerapu bebek (Cromileptes altivelis)

(Sarjito et al., 2OO7), ikan k"rrpu (Sarjito et al., 2009) dan tiger shrimp (Penaeus monodon)

iSrr,ito et a;.,2012). Oleh karena itu, menarik untuk dikaji bakteriyang berassosiasidengan lele

sakii secara molekuler. Pada penelitian ini akan dilaporkan bakteri yang merupakan agensia

penyebab penyakit lele yang berasal dari sentral produksi Kabupaten Demak, berdasarkan'puOZ lO S iONn pCR dan sensitivitasnya terhadap beberapa obat-obatan yang beredar.

Bahan dan Metode

Tempat dan waktu PenelitianMetode yang digunakan pada penelitian ini adalah eksploratif konfirmatori (Nazir, 1999)'

Sepututr it4it"tJ.rkit diperoleh dari kolam pembesaran dari^Kabupaten Demak lkan sampel

dipilih secara selektif berdasarkan Kamiso ",t

ut. (1994) dan Sarjito et at. (2013o). Sedangkan

ikan lele uji berukuran 7-8 cm diperoleh darr unit pembenihan rakyat di Kabupaten semarang'

lsolasi dan purifikasi bakteri dilakukan dengan metode strea.k pada media NA (merk) dan GSP

(Brock & Madigan, 1991; Sarjito et a1.,2507; Sarjito et al.,2O13b) di Laboratorium Terpadu

Universitas Diponegoro. Tujuh'belas isolat murni (D01-D 16)diperoleh dari ginjal, hatidan luka

ikan sampel, kemudian disimpan pada media Nutrien Agar Trisalt (NA, Merck) miring'

Uji postutatkoch dilakukan untuk mengetahui agensia penyebab penyakit bakteri pada lele sakit

dari Kabupaten Demak. Hasil uji postilat koch*mendasari pemilihan isolat untuk uji selanjutnya

dikarakterisasi secara molekuler dan uji sentivitas terhadap obat-obatan yang beredar' Ekstrasi

DNA dan amplifikasi DNA untuk pci oitat<sanakan di Laboratorium Kelautan Terpadu FPIK

Universitas Diponegoro, sedangkan sekuensing DNA dikirimkan ke Macrogen Korea Selatan'

MetodeUii postulat koch . -^tt, , ,-:..^-^:+^^ n.i'iTp"tt"lrt k""t dilakukan di laboratorium Budidaya Perairan, FPIK, Universitas Diponegoro'

Semua isolat dikuttui paOa media cair zobelt (Sarjito, 2O1O). Penyuntikan isolat pada ikan uji

dilakukan secara intraperitoneal dengan Oosis O,t mL dan keiadatan bakteri 1Os Cotony

iirming Unit (CFU)lml. Sebetum penyuntikan ikan uji diaklimatisasi selama satu minggu,

kemudian dianastesi menggunakan minyak cengkeh dengan dosis 1 mLl20 L air' Pengamatan

gejala klinis dan t<ematiariikan dilakukan setia[ 6 jam, selama 96 jam pasca infeksi' Saat uji

piiiitrtkoch ditakukan pertantian air sebanyakts6to pada pagi hari setelah pemberian pakan'

Kualitas air selama ui postitat koch adalah layak untuk budidaya lele yaitu temperatur berkisar

antara 26-28'C, pn i-l,S; amoniak 0,15-0,25 mg/L dan oksigen terlarut sebesar 3-5 mg/L'

Ekstraksi dan amPlifikasi DNAUntuk analisis eCR,]t,1R g-enom dari isolat D2, D7 dan D12 dlekstraksi dari sel dengan cara

mengambil sel bakteri iai ptate agar, disuspensi dalam air dengan mengacu pada metode

Ausubet ef a/. (1995tVrng airoOifiklsi oleh Radjasa et at. (2007). PCR dilakukan dengan DNA

thermal cycler (Mini'cycleiTM, MJ Research tnc, Watertown, MA, USA) adalah sebagai berikut:

2 uL template DNA,40 pmol primer, 125;rmol deoxyribonucleoside triphosphate, 5 prl 10x

AJd-r#il il a o,un", lbigma, German"y), 1,2 mg mL-' (konsentrasi akhir\ bovine serum

albumin (Sigma) orn o,)s"u,nit' n"aruq'M'oNn potymerase (Sigma) diatur konsentrasi akhir

hingga volume 50 pL dengan air steril (sigma). PCR menggunakan metode Radjasa ef a/'

(2007) yang telah dimooifi[asi sebagai beri"kut: denaturasi awal paoas+ oC selama 2 menit'

kemudian 30 siktus ;;;;i;;;i (% "6 selama 2 menit), anneating (45 "C selama. 2 menit) dan

"f..i"..i tZZ-oC selama 2 menit), serta ekstensiterakhir pada72 oC selama 3 menit'

Hasilamplifit.u,iecn@blD2,D7danD,12dipurifikasi.Kemudiananalisissekuensing dilakukan i"ngrn metode dari Brinkhoff & Muyzer (1997) dan Radjasa et al' (2007)'

iH;l:-;";"iro,ui,' rc*;il];; ;,ounJrgxun homorosinya dengan sekuen DNA pada DNA

Seminar NasionatTahunan Xltt Hasil Penetitian Perikanan dan Kelautan, 13 Agustus 2016

Tabel 2. Homologi isolat bakteri agensia penyeba penyakit bakteri pada ikan lele dengan

bakteri dari database gen bank.

No Kode lsolat Kekerabatan Terdekat H

P/esiomonas sp.Aeromonas caviaeAeromonas sobria

o//o No. Akses

1.

2.J.

Hasil uji sensitivitas terhadap ketiga agensia penyebab penyakit bakteri D2, D7 dan D7

terhadap beberapa obat yang beredar di pasaran disajikan pada Tabel 3.

879b97

D2D7D12

sb1KR189337.1gblJQ231 158.1

107

1 c^^^^.t,^^ I lf:^1 I Qarii*a al al

Serninar Nasronal Tahunan Xlll Hasil Penelitian Perikanan dan Kelautan, 13 Agustus 2016

PembahasanGejala klinis yang terlihat pada ikan sampel adalah lendir yang berlebihan, luka dibagiankepala, berenang menyendiri, hemorrhagic, luka kemerahan/borok (u/cer) pada permukaan\ubuh, sungu\ kemerahan, peru\ membesar, s\r\p grip\s yang d\sertai \uka kemerahan pada s\ripdada, sirip punggung, sirip ekor, serta hati dan ginjal berwarna pucat. Gejala klinis yang samapernah dilaporkan oleh Kamiso et al. (1994) serta Red & Davar (2010) pada ikan lele yangterserang penyakit bakteri. Ditemukan kemirrpan gejala klinis antara ikan sampel dan ikan uji,antara lain: luka kemerahan pada tubuh, boroklulcer, geripis, kemerahan di sirip dan ujungantenula memerah, tubuh menjadi lebih gelap dan ikan cenderung berenang secara tidakberaturan.

Perbandingan hasil sekuen gen 165 rDNA dari ketiga isolat (D2, D7 dan D12) dengan sekuendari gen bank menunjukkan bahwa strain ini mempunyai kekerabatan dekat denganPleisomonas sp. (87%), isolat D7 dengan A. caviae (96%) dan isolat JT 20 dengan A. sobria(97%).Tabel2. juga menunjukkan pula bahwa ketiga isolat tersebut memiliki tingkat homologiyang cukup tinggi dengan kisaran 87-97%. lsolat yang mempunyai persamaan sekuen 165rDNA lebih dari 97o/o dapat mewakili spesies yang sama, sedangkan persamaan sekuen antara93-97o/o dapat mewakili identitas bakteri pada tingkat genus tetapi berbeda spesies. Olehkarena itu, agensia penyebab bakteri tersebut teridentifikasi secara molekuler memenuhi kaidahpada level genus, akan tetapi beda spesies.

Hasil penelitian juga menunjukkan bahwa agensia penyakit bakteri pada ikan lele dariKabupaten Demak adalah Pleisomonas sp. (D2), A. caviae (D7) dan A. sobria (D12).Pleisomonas sp. masih merupakan anggota dari vibrionacea, telah berhasil diisolasi dari ikanair tawar dan kerang-kerangan (Austin & Austin,2007; Austin,201'1). Genus aeromonasmenyerang ikan lele (Kamiso et al., 1994; Sukenda et a\.,2008); ikan mas (Tambunan e/ a/.,2011) dan mengakibatkan kematian organisme budidaya tersebut (Smith, 2006). Penyakit yangdiakibatkan oleh infeksi bakteri patogen ini dapat menyebabkan kematian ikan secara massal(Austin & Austin, 2007). A. caviae merupakan salah satu bakteri patogen penyebab motiteaeromonas septicemia pada ikan lele (Austin & Austin, 2007) dan telah menginfeksi nila danikan mas (Niedziela et a\.,2002). Sedangkan A. sobria menginfeksi ikan marble goby (Manin eta1.,2010) dan ornamental fi'sh (Sreedharan et a1.,2013) dan lele (Sarjito et al.,2Ot3b). Hasilpenelitian menunjukkan bahwa ketiga agensia ini mengakibatkan kematian sebanyak 10%,2Oo/o dan 30%. Bakteri genus aeromona,s juga pernah dilaporkan mengakibatkan kematian 20-37,5o/o pada ikan lele (Sarjito et a\.,2013').

Hasil uji sensitivitas diperoleh bahwa ketiga agensia_penyebab pe_nyakit bakteri pada ikan lele(D2, D7 dan D12) tidak sensitif terhadap obat A ", B'", c " dan D'"' . Hat ini dibuktikan dengantidak terbentuknya zona bening disekitar kertas cakram pada ketiga bakteri tersebut. Bakteridikatakan resisten, karena memiliki besaran zona hambat 0-10 m (NCCLS, 2OO1). Resistennyabakteri Pleisomonas sp., A. caviae (Sreedharan et at.,2013) dan A. sobria (Mannin et at.,2010), diduga berkaitan dengan pemakaian obat-obatan selama proses budidaya secarameluas dan irrasional (Kemenkes Rl, 2011), serta kandungan bahan aktif/antibiotik pada obattersebut (White & Dermott, 2001). Resistensi terjadi ketika bakteri bermutasi dalam satu ataulain hal, sehingga menyebabkan turun atau hilangnya efektivitas obat, senyawa kimia ataubahan lainnya untuk mencegah atau mengobati infeksi (Sharma et at.,2OO9). Pemakaian obatsecara irrasionaljuga berdampak pada pencemaran lingkungan dan mengakibatkan munculnyabakteri resisten (Sukenda et al., 2008). Oleh karena itu, ketiga agensia penyebab penyakitbakteri pada lele tersebut resisten terhadap keempat obat tersebut, diduga pula berkaitandengan pemberian obat yang irrasional selama proses budidaya dalam rangka pencegahandan pengobatan penyakit. Resistensi bakteri juga dapat terjadi karena mutasi dan seleksimuatan secara acak, dalam hal ini antibiotik berperan sebagai agen seleksi, sehinggadimungkinkan terjadinya multiplikasi kelompok bakteri resisten dan menekan pertumbuhanbakteri yang memiliki sifat sensitif terhadap antibiotik (Atlas, 1995). Selanjutnya, resistensiterhadap antibiotik ini dapat ditularkan ke bakteri lainnya melalui kelompok gen resistenantibiotik, diantara genes locus yang sama dengan agen seperti plasmid, fransposons danintegrons (White & McDermott, 2001 ).

6-Semnoskon UGM / Sorjito ef ol.

Seminar Nasional Tahunan Xlll Hasil Penetitian Perikanan dan Kelautan, 13 Agustr,',. 2- -:

Manin, B.O. & J. Ransangan.2010. Molecular identification and biochemical assays of bacier :isolates from red sore disease in marble goby, Oxyeleotris marmoratus. Submittec,rr 3-DEC-201 1) Microbiology and Fish Disease Laboratory, Borneo Marine Resea.:-lnstitute, Jalan UMS, Kota Kinabalu, Sabah 88400. Malaysia.

Myers, M.L., G. Panicker, A.K. Bej. 2003. PCR detection of a newly emerged pandemic Vic.,cparahaemolyticus 03:K6 pathogen in pure cultures and seeded waters from the gu f o'Mexico. Appl Environ Microbiol. 699): 2194-2000

National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS). 2001. Performance standardsfor antimicrobial disk susceptibility testing. Approved standard M100-S11. Wayne PaNCCLS.

Nazir, M. 1999. Metode penelitian. Ghalia lndonesia. Jakarta.

Radjasa, O.K., D. Nasima, A. Sabdono, K.K. Tsukamoto & K. Ohwada, 2007. Characterizationof psycghrothropic bacteria from Sea Waters of Makasar Street, lndonesia. J. Biol Scr7(4): 658-662

Rad, M. & S. Davar.2010. lsolation and characterization of Vibrio (Listonella) anguittarumfromcat fish. J. Vet. Antm. Sci. 34(4):413-415

Sarjito.2010. Aplikasibiomolekuler untuk deteksiagensia penyebab vibriosis pada ikan lele danpotensi bakteri sponge sebagai anti vrbriosis. Disertasi. Program Pasca SarjanaUniversitas Diponegoro, Semarang.

Sarjito, N.E.W. Ningrum, O.K. Radjasa & S.B. Prayitno. 2012. Appication of repetitive sequercebase PCR on the richness of vibrio on the tiger shrimps (Penaeus monodon F ) J ciCoast. Dev. 15 (3): 304-310

Sarjito, S.B. Prayitno & A.H.C. Haditomo. 2013'. Pengantar parasit dan penyakit ikan UNDIpPress. Semarang.

Sarjito, S.B. Prayitno, O.K. Radjasa & S. Hutabarat.2007. Causative agent vibriosis padakerapu bebek (Cromileptes Altivelis) dari Karimunjawa 1: Pathogenisitasnya terhadapikan kerapu macan (Epinephelus fuscoguttafus). J. llmu Kelauta n 12(3): 1 73-180

Sarjito, O.K. Radjasa, A.H.C. Condro & S.B. Prayitno. 2013b. Causative agent motileaeromonas di sentral produksi ikan lele Provinsi Jawa Tengah. Disajikan Pada SeminarNasional KAI-2013. Solo, 2-3 September 2013.

Sarjito, A.H.C. Haditomo. & S.B. Prayitno. 2015. Causative agent vibriosis pada ikan lele dumbo(Clarias gaeripinus) yang dibudidayakan di kolam bersalinitas rendah. Seminar NasionalPerikanan dan Kelautan Vl, Semarang.

Sarjito, O.K. Radjasa, S. Hutabarat & S.B. Prayitno. 2009. Phylogenetik diversity of causativeagent of vibriosis associated with groupers fish from Karimunjawa lsland, lndonesia. Curr.Res. of Microbiol. 2(1):14-21

Sharma, A.C.R., C.R. Bora, R.K. Chaurasia & V. Sahu, 2009. Antibiotic suspectibtlity andgenetic analysis of Vibrio species isolated from reverine enviroent. Curr. Res. Bacteriol.19(1):1-13

Schaperclaus, W. 1992. Fish disease Vol 1. A.A. Balkema. Rotterdam.

Smith, P. 2006. Break points for disc diffusion susceptibility testing of bacteria associated withfish diseases: A review of current practice. Aquaculture 26j(j)..j j j3-1121

Q Qamnnc/.an I lr')Al I C^.;i+^ ^+ ^t