TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘIKHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

*******&*******

SEMINARTẾ BÀO GỐC

GV HƯỚNG DẪN: NGUYỄN HỮU ĐỨC

SV THỰC HIỆN: ĐOÀN HỮU THANH

MÃ SV : 533296

HÀ NỘI, 2011I- MỞ ĐẦU:

Tế bào gốc là một trong những lĩnh vực sinh học lôi cuốn nhất hiện nay. Nghiên cứu tế bào gốc đã được ca ngợi về tiềm năng cách mạng hóa trong tương lai của thuốc đối với khả năng tái tạo cơ thể bị hư hỏng hay bị bệnh. Tế bào gốc là tế bào có khả năng biệt hoá thành nhiều loại tế bào khác để thay thế cho các tế bào bị mất đi do già và chết tự nhiên hay do chấn thương vì nhiều nguyên nhân khác nhau.

Công nghệ tế bào gốc là công nghệ nghiên cứu tìm kiếm, duy trì và khai thác các ứng dụng của tế bào gốc. Công nghệ tế bào gốc gồm có 3 nhóm công việc chính là:

Tạo nguồn tế bào gốc: tìm kiếm các nguồn cung cấp tế bào gốc, tách chiết và duy trì các tế bào gốc trong các ngân hàng hoặc phòng thí nghiệm để có nguồn tế bào gốc thường trực sử dụng cho nghiên cứu và ứng dụng tế bào gốc.

Biệt hoá tế bào gốc: các tế bào gốc là các tế bào còn non trẻ chưa có cấu trúc và chức năng chuyên biệt như các tế bào đã biệt hoá. Biệt hoá tế bào gốc chính là biến đổi các tế bào gốc từ chỗ chưa có cấu trúc và chức năng chuyên biệt thành tế bào có cấu trúc và chức năng chuyên biệt như tế bào xương, tế bào da, tế bào cơ, tế bào gan, tế bào thần kinh...

Ứng dụng tế bào gốc: là công việc sử dụng tế bào gốc vào các mục đích khác nhau như nghiên cứu các cơ chế sinh lý và bệnh lý của cơ thể, nghiên cứu phát triển thuốc và các biện pháp điều trị mới.

Tạo nguồn tế bào gốc trước tiên là phải có phương pháp nhận dạng tế bào gốc trong mô, cơ quan và trong cơ thể rồi từ đó tách và thu nhận tế bào gốc. Muốn biệt hóa tế bào gốc cần phải dựa trên tiềm năng biệt hóa của từng loại tế bào gốc khác nhau. Một trong những ứng dụng tế bào gốc là liệu pháp tế bào gốc. Đó là các vấn đề cần tìm hiểu trong bài seminar tế bào gốc này.

II- NỘI DUNG:II.1- Phân loại tế bào gốc1, Dựa trên tiềm năng biệt hóa:

- Toàn năng: là tế bào có khả năng hình thành bất cứ tế bào nào trong cơ thể.Vd: tế bào trứng được thụ tinh

- Vạn năng: là tế bào có khả năng hình thành bất cứ tế bào nào ngoại trừ những tế bào từ màng phôi.

Vd: những tế bào thu nhận từ lớp ICM- Đa năng: tế bào có khả năng hình thành nhiều loại tế bào.

Vd: TB gốc tạo máu có thể biệt hóa thành TB cơ tim, xương, gan và TB máu- Vài tiềm năng: TB chỉ có khả năng hình thành 1 số loại tế bào

Vd: tb cơ chất từ gan thai chuột -> TB Lympho B, Macrophage- Đơn năng: TB chỉ có thể hình thành 1 loại tb duy nhất.

Vd: Cơ chất dưỡng bào2, Dựa vào vị trí thu nhận:

- TB gốc phôi(ES): thu nhận từ lớp sinh khối bên trong của phôi nang (ICM). Tế bào gốc phôi có khả năng phân chia vô hạn trong nuôi cấy và biệt hóa thành các tế bào khác nhau từ 3 lớp phôi. Do vây, đây là nhóm tế bào vạn năng.- TB mầm phôi(EG): thu nhận từ rãnh sinh dục là tiền thân của cơ quan sinh dục sau này, chúng có tính vạn năng- TB gốc ung thư biểu mô phôi(EC): thu nhận từ khối u trong tinh hoàn và buồng trứng ở 1 số chủng chuột. EC có thể biệt hóa thành nhiều kiểu tế bào khác- TB gốc trưởng thành: là TB chưa chuyên hóa được tìm thấy ở hầu hết những mô chuên hóa trong cơ thể trưởng thành (trong tủy xương, máu, giác mạc, võng mạc, tủy răng, gan, da, dạ dày, tụy…). Các tế bào này có thể tự đổi mới và biệt hóa thành những tế bào chuyên biệt. Vd: tb gốc tủy xương là tb gốc thu nhận từ tủy xương.

II- Các đặc tính cơ bản của tế bào gốcA, Đặc tính của tế bào gốc

Tế bào gốc ( stem cells ) tuy có những điểm khác biệt so với những tế bào bình thường,nhưng nó vẫn mang những đặc tính cơ bản của một tế bào động vật :1 . Tế bào gốc được sinh ra từ những tế bào trước đó.2 . Chứa các thông tin di truyền cần thiết để điều khiển các chức năng của mình, và có thể truyền vật liệu di truyền này cho các thế hệ tế bào tiếp theo.3 . Tế bào là một hệ thống mở, tự duy trì và tự sản xuất , có khả năng :

Sinh sản thông qua phân bào . Trao đổi chất và năng lượng .

Tổng hợp các protein .

Đáp ứng với các kích thích, hoặc thay đổi của môi trường bên trong và bên ngoài như các thay đổi về nhiệt độ, pH hoặc nguồn dinh dưỡng .

Di chuyển các túi tiết .

Ngoài những đặc tính chung thì tế bào gốc mang 2 đặc tính riêng biệt khác với những tế bào khác :

1.Tính vạn năng :  - Là đặc tính của tế bào gốc có thể biệt hóa thành các dạng tế bào khác nhau của cơ thể.                   - Như tế bào gốc từ phôi có khả năng biến hóa vô song. Từ một tế bào gốc ban đầu, nó có thể tạo thành bất kỳ bộ phận nào trên cơ thể như mong muốn và nó cũng có thể tạo thành một cơ thể hoàn chỉnh

2 . Tính tự làm mới :- Khả năng tiến hành một số lượng lớn chu kỳ phân bào nguyên nhiễm

mà vẫn duy trì trạng thái không biệt hóa.

- Tế bào gốc hoạt động như một hệ thống sửa chữa, tái tạo bằng cách phân chia không giới hạn để bổ sung các dạng tế bào khác nhau . Trong khi phân chia sẽ tạo ra tế bào tương tự nó

B, Các con đường tín hiệu điều khiển tính vạn năng và sự tự làm mới của tế bào gốc

1.LIF/gp130/STAT3:

- Ở tế bào gốc phôi chuột để duy trì khả năng không biệt hóa người ta đồng nuôi cấy tế bào gốc phôi chuột với lớp tế bào feeder MEF(Mouse embryonic fibroblast). Chính các tế bào feeder đã tiết ra tín hiệu ngăn cản sự biệt hóa đó là LIF (Leukemia inhibitory actor - nhân tố ức chế bạch cầu). Khi nhân tố này kết hợp với receptor phức chứa LIFR & gp130 . Jak(tyrosin janus kinase) gắn trên gp130 sẽ phosphoryl hóa đầu tyrosine của gp130 & LIFR, do đó kích thích nhân tố hoạt hóa phiên mã STAT (activator of transcription protein) hình thành homodimer hay heterodimer, chúng vào nhân gắn vào DNA và hoạt hóa phiên mã ngăn cản sự biệt hóa của tế bào gốc phôi chuột, đồng thời làm cho tế bào có khả năng tăng sinh (sự tự làm mới).- Ngoài việc hoạt hóa STAT3 , LIF cũng cảm ứng các tín hiệu khác như hoạt hóa ERK- 1 nhân tố kích thích sự biệt hóa ở tế bào gốc phôi người và khỉ . Do đó sự cân bằng giữa trạng thái hoạt hóa STAT3 & ERK sẽ quyết định số phận của tế bào : hoặc phân chia bình thường hoặc biệt hóa.2.BMP/smad- BMP (Bone morphogenetic protein_BMP) là thành viên thuộc họ TGF-beta , liên quan đến sự ngăn cản biệt hóa của tế bào gốc phôi chuột (mES). LIF chỉ ngăn chặn hiệu quả sự biệt hóa của tế bào mES trong môi trường có huyết thanh còn khi không có huyết thanh thì kể cả khi có mặt LIF thì sự biệt hóa thành tế bào thần kinh vẫn xảy ra . Nhưng khi ta bổ sung BMP4 vào môi trường nuôi cấy không huyết thanh (có mặt LIF) thì không xảy ra biệt hóa.

- BMP gắn vào phức hợp receptor BMPRI và BMPRII cảm ứng sự phosphoryl hóa R-smad tạo thành các phức hợp với Co-smad & tích lũy trong nhân điều hòa sự phiên mã các gen. I-smad ức chế con đường truyền tín hiệu Smad thông qua ức chế sự kết hợp giữa receptor và R-smad hay không cho R-smad gắn với Co-smad.-Trong mES , BMP4 cảm ứng sự biểu hiện của nhân tố kìm hãm sự biệt hóa Id(Inhibitor of differentiation) ngăn cản sự biệt hóa tế bào thần kinh. Trái lại trong tế bào phôi người (hES) , BMP4 lại cảm ứng sự biệt hóa.

3. Wnt/β-catenin / TCF

- β-catenin là 1 protein trong tế bào chất trong sự dính giữa tế bào với tế bào. Nó cũng có thể hoạt động như một phân tử truyền tín hiệu giữa các tế bào của con đường truyền tín hiệu Wnt.- Khi không có sự hóa Wnt , β-catenin bị phosphoryl hóa bởi APC(adenomatous poluposis coli gene), axin & GSK(glycogen synthase kinase) rồi bị phân giải bởi hệ thống ubiquitinproteasome → giữ mức β-catenin trong tế bào chất thấp.

- Khi Wnt kết hợp vào receptor của nó(Frizzled , LRP5/6 ) thì GSK3 bị bất hoạt ( cơ chế chưa rõ) → β-catenin bị tích tụ trong tế bào chất & vận chuyển vào nhân , kết hợp với nhân tố phiên mã, nhân tố tăng cường lympho(LEF) & nhân tố tế bào T (TCF).

-Trong cả tế bào ES chuột và người , con đường Wnt/ β-catenin đều có thể phát huy sự tự làm mới

4.Ras/Raf/ERK

- Protein Ras thuộc họ pro gắn GTP có trọng lượng phân tử thấp & kiểm soát chu kỳ tế bào & sự biệt hóa cho nhiều kiểu tế bào. Ras tồn tại trong 2 trạng thái: một trạng thái gắn GTP hoạt động và một trạng thái gắn GDP bất hoạt.Sự thay đổi cấu hình từ dạng bất hoạt GDP sang dạng hoạt động GTP thông qua nhân tố trao đôỉ Ras-GTP .- Sự gắn của các nhân tố tăng trưởng vào receptor hay sự phosphoryl hóa các protein kết hợp receptor. Các Grb protein adaptor gắn với tyrosine được phosphoryl hóa thông qua domain SH2 và hoạt hóa con đường Ras/ERK thông qua các nhân tố thay đổi Ras-GTP, SOS. Ras được hoạt hóa gắn vào nhiều pro tác động xuôi (downstream pathways) , hoạt hóa kinase điều hòa tín hiệu ngoại bào(extracellular signalregulatred kinase - ERK) → sự phosphoryl hóa & hoạt hóa các nhân tố phiên mã như c-Jun ,c-Fos, Rts & Elk.→ phát huy sự biệt hóa và kìm hãm tăng sinh(sự tự làm mới) của các tế bào ES.

5.PI3 kinase

- Sự gắn của các nhân tố tăng trưởng ( FGF,EGF,PDFG..) vào các receptor cảm ứng sự tự phosphoryl hóa của các receptor .- Con đường PI3 kinase có thể được hoạt hóa thông qua 3 con đường:

Gab1 gắn vào Grb2 , phosphoryl hóa tyrosine Tiểu phần điều hòa PI3 kinase p85 gắn vào đầu tyrosine được

phosphoryl hóa của receptor Ras được hoạt hóa có thể cảm ứng sự định vị màng và hoạt hóa các tiểu

phần xúc tác p110 của PI3 kinase

Con đường PI3 kinase có khả năng phát huy sự tự làm mới của tế bào & có thể bị kìm hãm bởi con đường ERK

III- Các phương pháp xác định tế bào gốc

III.1- Phương pháp nhuộm màu:1.Xét nghiệm quần thể phụ (SP assay):

Nguyên lí: Hệ thống bơm trên màng trong các tế bào gốc luôn ngăn chặn hiệu quả dòng các chất độc gây hại di chuyển vào trong.Bằng cách ứng dụng nguyên lí này, xét nghiệm SP, một phương pháp xác định đầu tiên được phát triển bởi Margaret Goodell, đến nay được sử dụng không chỉ để xác định sự hiện diện của tế bào gốc giả định, mà còn được sử dụng để phân tách tế bào gốc khỏi tế bào hàng xóm còn lại- hay còn gọi là phương pháp tách tế bào hoạt hóa huỳnh quang fluorescence activated cell sorter (FACS). Sử dụng đặc tính này, người ta có thể phân biệt được tế bào gốc giả định như quần thể tế bào âm tính Hoechst 33342, để phân lập định vị vùng ngoại vi của giao diện FACS. Các phân tử Adenosine triphosphate (ATP)- bingding cassette (ABC)-trasporter MDR1 xuyên màng. Sau đó những kênh vận chuyển ABC transporter khác xẽ được xác định để đáp ứng cho kiểu hình SP.SP được cho là một marker thích hợp cho việc phát hiện các HSC im lặng với marker bề mặt của tế bào cần xét nghiệm.2. Xét nghiệm quần thể phân chia chậm:Nguyên lí: Đặc tính tự nhiên của tế bào gốc là có chu kì phân chia chậm, nên có thể phân biệt chúng với các tế bào khác bằng sự giữ lại hay lưu lại các đánh dấu trong DNA của tế bào bằng việc sử dụng các chất đánh dấu như 5- bromo-2 deoxyuridine (BrdU- là một chất chuyên biệt cho S-phase của chu kì tế bào) hay 3H- thymidine. Sau khi đánh dấu tế bào sẽ được theo dõi trong một thời gian dài, chỉ có các tế bào phân chia chậm còn lưu lại nồng độ thông qua chất đánh dấu sẽ cho phép phát hiện chúng khi nhuộm với kháng thể anti- BrdU, hay đánh dấu phóng xạ.Khoảng 75% tế bào HSC được biết là “im lặng” trong tủy xương bình thường và có thể giữ BrdU trong thời gian tương đối dài. Khi đánh dẫu BrdU, sau đó đánh dấu với các kháng thể khác như histone H3 phosphoryl hóa ( là marker cho tế bào trong phase M) hay T187- phosphor-p27(KIP1) có thể phân biệt được tế bào gốc với tế bào đang tăng sinh.Xét nghiệm quần thể phân chia chậm sử dụng hiệu quả để xác định các tế bào gốc như ung thư, tế bào gốc trưởng thành từ tuyến vú, cơ xương, tụy, phổi, tim, biểu mô, biểu bì, tuyến tiền liệt và tế bào bulge nang lông người.Hạn chế: Nhiều vấn đề kĩ thuật khác nhau làm cản trở sự chính xác trong sự sát nhập của BrdU, hay sự phát hiện chúng trong tế bào. Nguyên nhân có thể do:+ cấu trúc tự nhiên của quy trình phát hiện BrdU sẽ khó phân biệt tế bào vạn năng in vitro ở dạng phân chia chậm in vivo.+ BrdU chỉ sát nhập ở phase S của chu kì tế bào, nghĩa là không phải tất cả các tế bào đều được đánh dấu.+ Sự lưu lại dấu phụ thuộc vào chu kì chiều dài của tế bào, do chiều dài chu kì tế bào khác nhau nên việc định lượng tế bào gốc thông qua kĩ thuật này, bao gồm việc nhận diện và tách được chúng thì trước hết phải xác định được các đặc tính của phương pháp khi sử dụng để không gây hại tế bào.3. Nhuộm màu bằng thuốc nhuộm alkaline phosphatase:

Nhuộm tế bào bằng Akaline phosphatase: Đây là một phương pháp đơn giản để phát hiện nhanh chóng tế bào gốc. Akaline phosphatase là một loại enzyme tồn tại trên màng của tế bào và được hoạt hoá trong điều kiện kiềm.

Enzyme này đã được chứng minh là hoạt động mạnh ở các tế bào chưa biệt hoá và giảm dần ở các tế bào đã được biệt hoá. Vì vậy đây có thể coi là một chỉ thị tin cậy để phân biệt các tế bào gốc và các tế bào đã biệt hoá.

Tế bào mầm phôi( EG) thường thể hiện sự hoạt động mạnh của Alkaline phosphatase, đặc biệt bắt đầu vào ngày thứ 7, và tiếp tục cho đến cuối đời sống của phôi. Mặc dù trong phôi, những tế bào khác cũng dương tính với alkaline phosphatase, nhưng sự hiện diện của tế bào dương tính với alkaline phosphatase thu nhận từ mẫu mô sinh dục là không thể nhầm lẫn, bởi không có tế bào nào khác biểu hiện đặc tính này.4. Biệt hóa in vitro:Nguyên lí: Tế bào gốc trưởng thành chuyên biệt mô có thể biệt hóa thành các tế bào của mô ấy. Ví dụ, các tế bào gốc giả định được nuôi trong môi trường bổ sung các chất biệt hóa định hướng cho dòng, sự biệt hóa sau đó được nhận diện.Biệt hóa in vitro là một chuỗi kĩ thuật đã được sử dụng để đánh giá tế bào gốc phôi, khi chúng có khả năng biệt hóa thành các tế bào thuộc 3 lớp phôi, thường được sử dụng để xác định tế bào gốc trung mô.Hạn chế: có nhiều hạn chế, hạn chế lớn nhất là phải biết được hóa chất sử dụng cho biệt hóa định hướng.Phương pháp này thường được sử dụng để nhận diện tế bào đã được xác định bằng các phương pháp khác, hày cùng loài tế bào của các mô, hay các loài khác nhau. Ví dụ, qua nghiên cứu thấy rằng,tế bào trung mô của máu cuống rốn có thể biệt hóa thành xương, sụn và mỡ bằng các tác nhân xác định. Khi xác định các tế bào gốc trung mô từ mỡ, người ta có thể sử dụng các hóa chất này cho biệt hóa các tế bào từ mô mỡ thành xương sụn mỡ, để có thể xác nhân đó là tế bào gốc trung mô.III.2- Sử dụng bằng các marker:

Phát hiện tế bào gốc bằng các maker phân tử: bao gồm các maker DNA cũng như maker protein kháng thể nhằm phát hiện ra các sản phẩm đặc trưng của tế bào gốc. Các tế bào gốc được đặc trưng bởi sự hoạt hoá của một số gene và tạo ra các sản phẩm của chúng, trong đó có các protein kháng nguyên bề mặt của tế bào gốc. Từ đó bằng các kĩ thuật phân tích DNA như các kĩ thuật lai, microarray… Ta có thể phát hiện ra các tế bào gốc cũng như tách chúng ra khỏi hỗn hợp tế bào. Trong đó, hiện nay phổ biến nhất là các kĩ thuật xác định tế bào gốc bằng các kĩ thuật dựa trên phản ứng kháng nguyên – kháng thể đặc hiệu.1.1 Nhận diện bằng các marker bề mặt:Đây là phương pháp phát hiện và thu nhận nhanh các tế bào gốc đã xác định từ trước.Nguyên lí: Dựa trên phản ứng kháng nguyên- kháng thể như các kĩ thuật flow cytometry, hóa mô miễn dịch….Yêu cầu: tế bào gốc đó thuộc loại nào để xác định được marker bề mặt của tế bào gốc nào đó là gì,Hạn chế:

- không thể xác định được một dòng tế bào gốc mới. Ví dụ, nếu giả định CD34+ là marker tế bào gốc tạo máu thì chắc chắn phải biết tế bào có biểu hiện CD34+ là tế bào gốc tạo máu

- Đến nay, người ta chưa biết hết danh sách các protein bề mặt của tất cả các tế bào gốc, nhiều trường hợp xảy ra là khi vừa phát hiện người ta đã cho rằng nó là marker chuyên biệt.

Phương pháp này được sử dụng nhiều vì ít tốn kém, ít tốn thời gian và công sức, có thể dễ dàng tách và thu nhận tế bào nếu dòng tế bào đó được xác định với các marker thật chuyên biệt.

Fluorescent markers can be used to identify stem cellshidden among ordinary adult cells. Here, humanembryonic stem cells are recognized by the markerproteins they express (green). Courtesy of Paul J. Tesar,Laboratory of Molecular Biology, NINDS and the NIHStem Cell Unit.

1.2 Sử dụng các kĩ thuật để xác định tế bào gốc:- Kĩ thuật Realtime-PCR- Kĩ thuật lai Western Blot- Kĩ thuật lai Northern Blot- Kĩ thuật FACSTrong đó kĩ thuật FACS hiện nay đang được sử dụng phổ biến để xác định và tách dòng các tế bào gốc

Đây là phương pháp dựa trên việc đánh dấu các dòng tế bào gốc bởi các chất mang màu khác nhau (các maker chọn lọc sẽ được gắn với các chất màu, dòng tế bào không phải tế bào gốc sẽ không được gắn với maker). Sau khi tiến hành phép lai giữa các maker với các nguồn tế bào có chứa tế bào gốc, hốn hợp sẽ được đi qua một hệ thống trong đó dòng tế bào thoát ra theo từng tế bào một. Một máy quét laze sẽ quét và ghi lại các tế bào mang màu khác nhau, đồng thời phân loại chúng về một ống thu kết quả. Từ đó ta có thể tách riêng từng dòng tế bào gốc tương ứng với các maker chọn lọc khác nhau để phục vụ cho các nghiên cứu sau này.

Ưu điểm của phương pháp là có thể phân tách nhanh các dòng tế bào gốc và loại bỏ các tế bào đã biệt hoá trong một lượng mẫu ban đầu lớn

Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp này với chỉ một maker chỉ thị chọn lọc là chỉ có thể tách được một dòng tế bào, và dòng tế bào này không sạch (lẫn các tế bào T hoặc tế bào ung thư. Kết quả sẽ được cải thiện đáng

kể nếu sử dụng 2 maker chọn lọc, nhưng sẽ khiến thời gian bị kéo dài (10000-50000 tế bào được tách một giây) và đòi hỏi thiết bị đắt tiền hơn

III.3- Các marker phân tử thường dùng để nhận biết các tế bào gốc:1 . Tế bào gốc phôi (ES):1.1 Các marker phân tử nhận diện tế bào ES ở chuột:

Nhân tố phiên mã domain-POU Oct-4 được xác định gắn vào motif DNA hoạt hóa trong các tế bào EC không biệt hóa ( Scholer và cs,1990). Sự phiên mã Oct4 bị hạn chế ở tế bào vạn năng của phôi, hay cả trong tế bào vạn năng in vitro. Sự biểu hiện ở mức độ thấp các marker Oct4 đã được phát hiện trong nhiều dòng tế bào ngoại bì hay ngoại bì thần kinh cả ở in vivo và in vitro. Thí nghiệm trên chuột knockout gen Oct4 cho thấy, Oct4 giữ vai trò quyết định trong sự thiết lập tính đồng nhất của các tế bào vạn năng. Chuột bị knockout gen này sẽ vắng mặt tế bào vạn năng trong các phôi nang. Oct4 điều hòa một số gen như Rex1 và Fgf4 trong các dòng tế bào vạn năng. Kiểu biểu hiện giới hạn và vai trò quan trọng trong in vitro và in vivo đã làm Oct4 trở thành một trong các maker mạnh của tế bào gốc vạn năng.

1.2 Marker cho các tế bào ES ở người:Ngoài biểu hiện Oct4, còn nhiều kháng nguyên bề mặt tế bào cũng biểu hiện giới hạn như SSEA-4, TRA1-60, GCTM-2, TRA1-81 và SSEA-3…đã được sử dụng để xác định các tế bào ES người ( Reubinoff và cs, 2000). Những kháng nguyên này đầu tiên được xác định dựa vào sự biểu hiện trong các dòng EC vạn năng người, hay trong ES của linh trưởng.2. Tế bào gốc tạo máu (HSC):2.1 Marker tế bào gốc tạo máu người:CD34:Cd34 là marker biệt hóa đầu tiên được dùng để nhận diện các tế bào tạo máu người và là marker được dùng phổ biến cho việc thu nhận các quần thể giàu HSC của người, cũng như các tế bào tiền thân. CD34 được biểu hiện từ 1-4 % tế bào có nhân trong tủy xương người bình thường, và nhỏ hơn 0,1% ở các tế bào có nhân trong máu ngoại vi. Phần lớn các tế bào người có khả năng sản xuất nhiều dòng tế bào máu trong tủy đều biểu hiện CD34. Điều này được xác định thông qua thực nghiệm mô hình động vật linh trưởng và thông qua việc cấy ghép các tế bào CD34+ người tinh sạch vào chuột suy giảm miễn dịch.Việc sử dụng CD34+ như là một marker cho tế bào gốc người được thực hiện tốt, tuy nhiên có những bằng chứng cho thấy có thể tồn tại cả những quần thể nguyên thủy CD34- trong máu cuống rốn người và nguồn tế bào gốc tạo máu trưởng thành. Những tế bào HSC CD34- cũng được phát hiện bằng việc cấy ghép nhiều dòng tế bào người trong mô hình chuột NOD/SICD và thai cừu chưa trưởng thành miễn dịch.2.2 Marker nhận diện tế bào gốc tạo máu chuột:HSC và các tế bào gốc nguyên thủy liên quan của chuột, giống với ở người, chúng phân biệt với các tế bào khác trong mô máu nhờ thiếu các marker khác nhau chuyên biệt cho các tế bào máu trưởng thành như ( CD3, B220, Gr-1,Mac-1, TẺR119). Các HSC chuột dương tính với Sca-1, Thy-1 và c-kit, trong

khi đó các tế bào tiền thân dòng tủy, dòng hồng cầu trưởng thành hơn lại dương tính với c-kit, nhưng âm tính với Sca-1.Các tế bào tạo máu nguyên thủy chuột cũng biểu hiện CD34, mặc dù ở chuột sự điều hòa biểu hiện gen CD34 khác với ở người. Tất cả các HSC trong gan thai chuột được biết là CD34 và 50% vẫn còn CD34+ trong tủy xương chuột chưa trưởng thành. Vào tuổi trưởng thành, khoảng 90% trong số tế bào nói trên không biểu hiện CD34. Sự biểu hiện của CD34 của HSC chuột cũng cho thấy chúng không chỉ phụ thuộc vào giai đoạn phát triển mà còn phụ thuộc vào trạng thái hoạt hóa của tế bào. Do đó, ngay khi trong cơ thể trưởng thành, nó cũng có thể điều hòa tăng thuận nghịch và là marker chắc chắn của các loại tế bào tiền thân muộn, bao gồm các tế bào tiền thân giới hạn dòng tủy.

2.3 Những marker mới của HSC:a, ALDH:Các tế bào tạo máu nguyên thủy kháng được tương đối các tác nhân ankyl hóa như hoạt hóa các chất thu nhận từ cyclophosphamid. Sự kháng này do sự biểu hiện chọn lọc trong tế bào gốc tạo máu nguyên thủy của enzyme aldehyde dehydrogenase (ALDH). Cơ chất phát huỳnh quang như ALDEFLUOR, có thể sử dụng để xác định và tách chiết các tế bào tạo máu của người và của chuột bằng FCS.b, Kiểu hình quần thể phụ:Các phân tích chức năng và kiểu hình cho thấy rằng, tế bào tạo máu nguyên thủy có thể được xác định bằng khả năng bơm ra ngoài của thuốc nhuộm gắn DNA và ti thể phát quang. Với các kiểu đặc tính riêng khi chạy flow cytometry, quần thể tế bào gốc có Hoechstlow được cho là một kiểu hình SP.c, EPCR( CD201):CD201 được biết như là một receptor protein C nội mô, là một marker mới được xác định bởi profiling gen của các tế bào gốc tạo máu nguyên thủy được tinh sạchCác tế bào EPCR+ chuột tinh sạch được báo cáo là giàu số lượng các HSC, vì vậy, EPCR/CD201 có thể là marker hữu ích trong việc phát hiện và tách các HSC của chuột.3. Tế bào gốc trưởng thành (AS):Nhìn chung có 3 phương pháp để xác định một tế bào nào đó có phải là AS hay không:

(1) Các tế bào cần xác định sẽ được đánh dấu in vitro ( trong mô sống) và theo dõi kiểu tế bào cuối cùng mà chúng có thể biệt hóa thành tế bào nào.

(2) Tế bào cần khảo cứu được thu nhận, nuôi, đánh dấu và cấy vào cơ thể một động vật khác, để xác định sự phục hồi quần thể mô nguồn gốc của chúng.

(3) Các tế bào cần khảo cứu được thu nhận, nuôi, thao tác và phát triển in vitro, sau đó thêm vào môi trường nuôi cấy nhân tố tăng trưởng hay chuyển gen vào tế bào, tiếp tục theo dõi sự biệt hóa của chúng.

II.4- Liệu pháp tế bào gốc.

Liệu pháp tế bào gốc là sử dụng tế bào gốc để chữa bệnh, đưa các tế bào mới vào mô hư hỏng để điều trị bệnh hay sửa chữa các hư hại.1, Cấy ghép tế bào gốc:- Liệu pháp thay thế tế bào được xem như là một cách chữa trị tiềm năng cho các bệnh khó chữa trước đây. Thông qua liệu pháp tế bào gốc, những căn bệnh nan y đang được thử nghiệm điều trị hiệu quả, khả thi hơn trong thập niên vừa qua. Một số thành công đáng chú ý là liệu pháp tái tạo giác mạc, hoặc các sản phẩm của tế bào gốc cũng sẵn sàng được thương mại hosacho mục đích thay thế da và sụn. Đã có những tiến bộ mới trong việc sử dụng tế bào gốc thay thế đảo tụy, sự thương mại hóa của liệu pháp máu cuống rốn và tiềm năng thu nhận số lường lớn các tế bào từ nguồn phôi thai và cơ thể trưởng thành. Những thành tựu nói trên giúp người ta hi vọng rằng tế bào gốc có thể là một phương thức chữa trị hiệu quả cho rất nhiều bệnh, bao gồm các bệnh tim mạch, các khiếm khuyết tích trữ lysosome và các khối u di căn.a, Cấy ghép tế bào gốc phôi:Điều trị cấy ghép tế bào gốc phôi người cũng được ghi nhận ở nhiều bệnh chẳng hạn Parkinson, tiểu đường, các chấn thương cột sống, sự suy thoái dòng tế bào purkinje, loạn dưỡng cơ Duchene’s, bệnh tim, sự tạo xương… Tuy nhiên, để điều trị cho mỗi loại bệnh, tế bào gốc phôi người phải được điều khiển để biệt hóa thành các tế bào có chức năng chuyên biệt trước khi chúng được cấy ghép.Một thuận lợi của việc sử dụng tế bào ES so với tế bào gốc trưởng thành là khả năng tăng sinh invitro vô hạn và khả năng có thể biệt hóa với phổ rộng các loại tế bào thông qua điều khiển. Các ES được cấy ghép có thể tồn tại, hợp nhất và có chức năng trong cơ thể nhận.Bất lợi tiềm ẩn của ES trong cấy ghép là chúng có xu hướng cảm ứng, hình thành khối u, dù là khối u lành tính. Tuy nhiên, ES không biệt hóa cảm ứng teratomas (khối u) nên sự hình thành khối u có thể tránh được bằng cách di chuyển tế bào không biệt hóa trước khi cấy ghép, hay đưa ra cơ chế tự ngưng hoạt động nghĩa là chèn vào tế bào ES gen “tự chết” để chúng có thể khởi động quá trình tự chết của tế bào. Một bất lợi nữa của ES là sự thải loại miễn dịch, sự biểu hiện của các kháng nguyên tương hợp mô cho phép cơ thể phân biệt tế bào của mình với mô ngoại lai. Khả năng thải loại miễn dịch này có thể tránh được bằng kĩ thuật chuyển nhân tế bào sinh dưỡng, tức chuyển nhân của một tế bào nhận vào trứng đã loại nhân.Trứng được nuôi nuôi invitro đến blastocyst, tế bào ES được thu nhận từ lớp ICM, và chúng được điều khiển để biệt hóa thành kiểu tế bào mong muốn. Kết quả tạo ra những tế bào gốc ES, hay cơ quan phù hợp mô, chúng gần như thích ứng với chương trình miễn dịch của người cho nhân tế bào sinh dưỡng, và cũng chính là người nhận cơ quan cấy ghép.b, Cấy ghép tế bào gốc trưởng thành:Có thể sử dụng tế bào gốc trưởng thành cho cấy ghép khi chúng ở dạng tế bào gốc, hay dạng tế bào đã được biệt hóa từ tế bào gốc trưởng thành.Khi cấy ghép tế bào gốc , chúng phải được thu nhận và làm giàu thông qua nuôi cấy, hay các phương pháp khác để sau đó đưa vào cơ thể bệnh nhân. Trong cơ thể bệnh nhân các tế bào này sẽ biệt hóa và khôi phục lại những tổn

thương, mất mát trong bệnh nhân. Các quy trình cấy ghép máu cuống rốn, cấy ghép tủy xương, cấy ghép rìa giác mạc… đều thuộc dạng này.Cấy các tế bào đã biệt hóa là sự bù đắp các tế bào chuyên hóa chức năng vào mô, cơ quan bị tổn thương thiếu lượng các tế bào chuyên hóa chức năng. Ví dụ, sự hủy hoại các tế bào tiết insulin trong tụy làm giảm mức insulin trong máu, gây bệnh tiểu đường; điều trị bệnh này cần bổ sung tế bào các tế bào chuyên hóa tiết insulin. Để làm được việc này, đầu tiên các tế bào gốc được thu nhận , có thể từ tủy xương, máu cuống rốn và chuyển biệt hóa thành các tế bào tiết insulin, sau đó tiến hành cấy các tế bào đã chuyển hóa chức năng này vào mô tụy của bệnh nhân.Hạn chế của phương pháp này là khi tiến hành cần dùng các thuốc gây ức chế miễn dịch hay chiếu xạ để làm giảm đáp ứng thải loại của cơ thể chủ với tế bào ghép.2, Công nghệ mô và cấy ghép cơ quan:Công nghệ mô là việc sử dụng các tế bào chuyên biệt cơ quan để nuôi cấy trên một dàn giáo “scaffold” ex vivo. Trong đó, các giàn giáo được thiết kế để tăng cường sự tái sinh đơn độc các tế bào cư trú tại vị trí cấy ghép nó.Hai ứng dụng của các tế bào gốc dễ thấy nhất trong công nghệ mô là tái tạo da có liên quan đến hình thành cấu trúc của các phiến 2 chiều, thứ hai là sự hình thành xương, liên quan đến quá trình tái cấu trúc của các cấu trúc bên trong dạng 3 chiều.Công nghệ tái tạo da từ tế bào gốc:Các tế bào gốc được sử dụng trong tái tạo da đặc biệt trong điều trị vết bỏng và vết thương có thể là tế bào gốc tự thân , hay tế bào gốc đồng loại. Trong cấy ghép tự thân các tế bào gốc thu nhận từ da, mô mỡ và tủy xương được sử dụng , trong đó các tế bào gốc từ da thường được sử dụng nhiều nhất. Cấy ghép tế bào gốc đồng loại có sự đa dạng hơn bao gồm : các tế bào thu nhận từ phôi, từ thai , từ cuống rốn và máu cuống rốn ,từ tủy xương. Ứng dụng tái tạo da từ tế bào sừng:

- Tái tạo biểu bì: bằng cách nuôi cấy tế bào sừng trên môi trường chứa huyết thanh và 1 lớp feeder của tế bào nguyên bào sợi chuột đã được chiếu xạ. Tự ghép da bằng nuôi cấy tế bào sừng trong các điều kiện thích hợp không chỉ tạo ra một phiến biểu bì mà còn duy trì quần thể tế bào gốc (holoclone)

- Tái tạo mô liên kết: nuôi cấy nguyên bào sợi trên scaffold. Nguyên bào sợi tạo ra các yếu tố tế bào liên kết chính, scaffold cấu thành bởi glycosaminoglygan sản xuất chất nền ngoại bào

Sau đó cấy phiến biểu bì lên trên nền mô liên kết. Sự hiện diện của mô liên kết sẽ hỗ trợ sự tái tạo biểu mô nhanh hơn, ức chế sự co rút của vết thương , cải thiện cảm giác và tham gia đóng kín vết thương.

Công nghệ mô xương:Các tế bào gốc xương (skeletal stem cell_ SSC) như là tế bào gốc nền tủy xương hay tế bào gốc trung mô có trong một nhóm phụ các tế bào gốc bám dính được của tủy xương, và chúng có thể tăng sinh dài hạn trong nuôi cấy.Để tái cấu trúc xương, SSC được tách và thu nhận từ một thể tích giới hạn của tủy xương, sau đó chúng được tăng sinh ex vivo, kết hợp chúng với các giá thể thích hợp trước khi cấy ghép. Sự kết hợp này nhằm cung cấp một giàn giáo không gian 3 chiều , giúp mạng lưới mạch máu được thiết lập , và các tế bào gốc tiền thân cấy ghép có thể được biệt hóa từ đó hình thành cơ quan tủy xương/ xương. Các vật liệu thích hợp đã được tạo ra và chuẩn hóa gồm các hydroxyapatite/tricalcium phosephate tổng hợp, các polyglyconic và polylactic acid. Hầu hết chúng rất hiệu quả trong sự hỗ trợ tái tạo xương , hoặc một mình hoặc kết hợp với các nhân tố tăng trưởng như nhân tố tạo hình thể xương (BMP)

Công nghệ này ứng dụng trong việc sửa chữa các khiếm khuyết nghiêm trọng mà ở đó mô không thể tự sửa chữa bởi các tế bào còn lại trong mô ngăn cản, và trong tái tạo invitro hoàn toàn các flap xương tạo mạch trên cơ sở hình dạng mong muốn trước khi sử dụng cho cấy ghép cục bộ.3, Liệu pháp gen tế bào gốc:Là phương pháp sử dụng tế bào gốc như 1 vector mang gen chuyển để điều trị sửa chữa thay thế các gen hỏng.. Hai khiếm khuyết lớn của liệu pháp gen là:- Các rủi ro do hệ thống mang gen có thể gây ra- Sự đáp ứng thải loại miễn dịchSử dụng tế bào gốc đưa gen vào cơ thể có thể khắc phục được 2 khó khăn trên bởi chúng là của bản thân, nghĩa là thu nhận tế bào tế bào sinh dưỡng trưởng thành của cơ thể dùng để cho nhân, nhân này được chuyển vào tế bào trứng được loại bỏ nhân và sau đó tế bào sẽ phát triển tạo thành phôi mới. Ở giai đoạn phôi nang, các tế bào gốc ở lớp ICM được thu nhận chúng được gọi là my stem cell (myES). Không giống như hệ thống mang gen của virus tiềm ẩn nhiều rủi ro, các myES hầu như an toàn, do bộ gen là của cơ thể chủ và vì vậy, các tế bào này khó bị thải loại.

Chiến lược liệu pháp gen:- Thêm gen: là việc đưa các đoạn DNA có trình tự đúng vào bộ gen nhằm

bù đắp hay thay thế các gen khiếm khuyết- Sửa chữa bộ gen: là việc dùng các DNA sửa chữa hay các quá trình tái

tổ hợp tương đồng để sửa chữa 1 trình tự gen khiếm khuyết, làm cho nó phục hồi trạng thái bình thường đúng của nó

Ứng dụng liệu pháp gen tế bào gốc tạo máu: Tế bào gốc tạo máu thu nhận từ tủy xương hay máu ngoại vi có thể tạo

ra các kết quả tốt trong việc sửa chữa hệ thống tạo máu 1 cách lâu bền, đồng thời tránh được sự đáp ứng miễn dịch

retrovirus là vector chính sử dụng cho chuyển gen vào trong tế bào gốc tạo máu

Quy trình liệu pháp tế bào gốc tạo máu:

HSC được huy động và thu nhận giàu CD34, nuôi cấy với fibronectin, cytokine và huyền phù retrovirus trong 1-2 ngày (vector lentivirus), 3-4 ngày(vector MLV). Các tế bào cấy ghép tự thân di cư vào tủy xương và bắt đầu quá trình hình thành máu

4,Điều trị bệnh tự miễn:Bệnh tự miễn là kết quả từ sự hoạt hóa sai lạc của hệ thống miễn dịch , thông qua sự kết hợp của các nhân tố môi trường và di truyền với nhau, dẫn tới sự thất bại trong cơ chế duy trì tính kháng miễn dịch.Chữa trị bệnh tự miễn bằng cách cấy ghép tế bào gốc tạo máuCơ sở của việc cấy ghép này là các tế bào chức năng miễn dịch trưởng thành nhận diện những tế bào của chính cơ thể là không phải của cơ thể, các tế bào nói trên sẽ bị tiêu hủy bằng các thuốc gây ức chế miễn dịch mạnh hay chiếu xạ, sau đó cơ thể được cấy ghép các tế bào gốc tạo máu mới. Nhiều nghiên cứu cho thấy việc sử dụng các tác nhân tiêu hủy này còn tiêu diệt cả hệ thống tạo máu tạo ra các tế bào hoạt động sai lạc. Khi cấy các tế bào gốc tạo máu mới vào, các tế bào này sẽ làm tổ và khôi phục lại hệ thống tạo máu, hệ thống tế bào miễn dịch của cơ thể. Các tế bào mới này được hi vọng là không nhận diện và đào thải thể chủ.Phương pháp điều trị này thành công với các bênh xơ cứng rải rác (multiple sclerosis), bệnh sơ cứng toàn thân (systemic sclerosis), viêm đa khớp , luput đỏ hệ thống, bệnh Crohn…

III- KẾT LUẬN:

Tất cả các loại tế bào gốc, dù bắt nguồn từ đâu, cũng đều có 3 đặc tính chung: chúng có khả năng phân chia và tự tái tạo trong khoảng thời gian dài; chúng không bị biệt hóa; và chúng có thể phát triển thành các loại tế bào chuyên biệt. Ở điều kiện thích hợp, tế bào gốc có thể phát triển thành các mô và cơ quan chuyên biệt.Những đặc tính độc nhất vô nhị này là yếu tố hứa hẹn, khiến tế bào gốc trở thành nguồn cung cấp tế bào, nhằm điều trị các chứng bệnh như chứng mất trí nhớ, ung thư, bệnh Parkinson, tiểu đường loại 1, chấn thương cột sống, đột quỵ, bỏng, bệnh tim, viêm khớp xương mãn tính và viêm khớp dạng thấp. Ngày nay, các mô hay cơ quan bị bệnh, bị hủy hoại đều được thay thế từ người hiến tặng. Về cơ bản, số lượng người cần cấy ghép vượt xa số lượng bộ phận thay thế sẵn có. Tế bào gốc chính là nguồn tiềm năng cung cấp các tế bào và mô có thể được ứng dụng trong điều trị nhiều căn bệnh, do tế bào gốc có thể tự phục hồi và tạo ra các tế bào chuyên biệt. Các tế bào ES có khả năng nhất để biệt hóa thành nhiều loại tế bào và khả năng tăng sinh của nó cũng vượt trội  bất kỳ loại tế bào nào khác. Có ba vấn đề lớn với các tế bào ES; vấn đề đạo đức, vấn đề đào thải miễn dịch và tiềm năng phát triển u quái.Trong tương lai, lý tưởng, các tế bào gốc soma của bệnh nhân sẽ được chiết xuất và chế tác và sau đó đưa lại vào cùng một bệnh nhân để chữa trị bệnh suy

nhược.Điều này sẽ loại trừ việc sử dụng tế bào gốc phôi cho liệu pháp tế bào, loại bỏ sự phản đối đạo đức chống lại nghiên cứu tế bào gốc, và cũng giải quyết vấn đề đào thải miễn dịch. Tuy nhiên, hiện nay khả năng tăng sinh và tiềm năng biệt hóa của các tế bào gốc phôi vẫn còn được dùng khả thi hơn so với các tế bào soma.