Sesarini C 1 , Giménez ML 2 , Redal M 1 , Argibay P 1 , Otaño L 2

Sesarini y col. Diagnóstico prenatal no invasivo; determinación del genotipo del sistema RH fetal a través del análisis molecular de plasma materno.

Diagnóstico prenatal no invasivo; determinación del genotipo del sistema RH fetal a través del

análisis molecular de plasma materno.

Sesarini C1, Giménez ML2, Redal M1, Argibay P1, Otaño L2. (1) Unidad de Medicina Molecular y Genómica, ICBME

(2) Unidad Medicina Fetal, Servicio de Obstetricia

Hospital Italiano de Buenos Aires


Introducción

Diagnóstico prenatal No invasivo

Células fetales en sangre materna

• Técnicamente complejo

• Pocas células fetales en sangre

• A partir de las 15 semanas

• Vida media: 25-35 días.

• Pueden persistir por décadas

ADN fetal libre en plasma materno

• Técnicamente más simple: PCR

• 3 a 6% del ADN libre

• A partir de las 6 semanas

• Vida media: 16 minutos

• Persisten hasta 2 hs. post-parto


Aplicaciones

Diagnóstico(Alelos Paternos)

Screening

• Sexo

• RHD

• Anomalías Génicas

• Preeclampsia?

• RCIU?

• Parto pretérmino?

• Aneuploidías?

Introducción


Uso eficiente de la gammaglobulina- Escasa- Costosa - Exposición innecesaria a hemoderivados

Asesoramiento precozEvitar procedimientos invasivos

- Riesgo de pérdida- Mayor sensibilización

Pacientes no sensibilizadas

Pacientes sensibilizadas

Genotipificación del Rh fetal

Mujeres Rh (-) con Pareja Rh (+) heterocigota

Introducción


El diagnóstico de sexo genético prenatal requiere la extracción de material del embarazo.

El análisis de ADN fetal en sangre materna permitiría evitar estos procedimientos y mejoraría el manejo perinatal de patologías como:

- enfermedades ligadas al cromosoma X- virilización en HSC- malformaciones que afectan selectivamente a un sexo

Determinación del sexo fetal

Introducción


Objetivo General

Identificar y analizar marcadores de ácidos nucleicos fetales

libres en sangre de embarazadas con el objeto de desarrollar

un método no invasivo de diagnóstico prenatal de

condiciones genéticas fetales y de patologías del embarazo

con impacto sobre la salud materno-fetal.


Objetivos

Evaluar la factibilidad y la eficacia diagnóstica de la

determinación del genotipo RHD fetal a través del análisis

molecular de ADN fetal libre en plasma de embarazadas Rh (-)

Evaluar la factibilidad y la performance del diagnóstico de

sexo fetal a través del análisis molecular de ADN fetal libre en

plasma materno.


Materiales y Métodos

• Extracción de sangre (5 ml) de 60 embarazadas Rh (-),

previa firma del consentimiento informado.

• Edad gestacional media: 27 semanas (rango: 7 a 41)

• Separación del plasma y extracción de ADN- Vi: 1000 μl- Vf: 40 μl

• Real Time-PCR: amplificación de una secuencia del gen

RHD exón 7 (125 pb), marcador DYS14 del cromosoma Y

(84 pb) y β-Actina (88 pb).


Materiales y Métodos

• Resultados RhD positivoRhD negativo

Sexo masculino

Sexo femenino

• Se calculó - sensibilidad

- especificidad

- valor predictivo

- exactitud de la prueba


Resultados

Electroforesis (gel de agarosa) de productos de amplificación.

125 pb

1: Ladder; 2-3: Feto Rh (+), duplicados; 4-5: Feto Rh (-), duplicados; 6: Control

Rh (+); 7: Control Rh (-); 8: Agua

Curva de Amplificación gen RH


Rh de los RN

Positivo Negativo

Rh en plasma materno

Positivo 33 6 39

Negativo 2 19 21

35 25 60

Exactitud: 86,70% (52/60)

Sensibilidad: 94,30% (33/35)

Especificidad: 76,00% (19/25)

Valor predictivo de RhD positivo: 84,60% (33/39)

Valor predictivo de RhD negativo: 94,50% (19/21)

Resultados

Análisis del gen RHD en plasma materno y Rh del RN


Embarazadas RhD negativas n: 60

Fetos RhD positivos n: 35

Fetos RhD negativos n: 25

Test positivo n: 33

Test falso negativo n: 2

Test falso positivo n: 6

Test negativo n: 19

ɣ-globulina Ahorro de ɣ-globulina

ɣ-globulina

innecesario

No se aplicaría tratamiento necesario

ResultadosUso de Gammaglobulina Anti Rh D en base al resultado del análisis del ADN Fetal


Curva de aprendizaje de genotipificación RHD

Resultados

0

1

2

3

1 a 10 11 a 20 21 a 30 31 a 40 41 a 50 51 a 60

Casos

Dis

co

rda

nc

ias

Rh


Resultados

Sexo de los RN

Masculino Femenino

DYS14 en

plasma materno

Positivo 38 2 40

Negativo 1 19 20

39 21 60

Exactitud: 95,00% (57/60)

Sensibilidad: 97,44% (38/39)

Especificidad: 90,48% (19/21)

Valor predictivo sexo masculino: 95,00% (38/40)

Valor predictivo sexo femenino: 95,00% (19/20)

Análisis del marcador DYS14 en plasma materno y sexo fenotípico del RN.


Resultados

0

1

2

1 a 10 11 a 20 21 a 30 31 a 40 41 a 50 51 a 60

Casos

Dis

co

rda

nc

ia

DY

S1

4

Curva de aprendizaje de la determinación del sexo fetal


Discusión

• La amplificación de secuencias (RHD y DYS14) en embarazadas

demuestra la factibilidad de realizar un diagnóstico prenatal no invasivo

del Rh y sexo fetal a partir del análisis de ADN fetal en plasma materno.

• La determinación del Rh fetal en madres Rh (-) fue factible en la

mayoría de los casos; exactitud 86,70%

• Problemas diagnósticos:

- Primera etapa de la serie

- Falsos positivo (6) sin riesgo en la práctica clínica contaminación,

“vanishing twin” o variantes alélicas.

- Falsos negativo (2) baja concentración de ADN fetal


• La asignación del sexo fetal se predijo correctamente en 57 de 60

embarazos evaluados (95%).

• Problemas diagnósticos:

- Primera etapa de la serie

- Falsos positivo (2): contaminación, “vanishing twin”

- Falso negativo (1): baja concentración de ADN fetal

• Se han detectado secuencias de ARN fetal libre en plasma materno (Poon et al. 2000)

• Detección de secuencias de expresión placentaria (gen PLAC4,

cromosoma 21) permitiría cuantificar niveles de expresión y podrían

utilizarse para medir ploidía (Lo et al. 2007)

Discusión


Conclusión

• Aplicación en práctica clínica: mujeres Rh (-) no sensibilizadas limitaría

profilaxis a fetos Rh (+) y sensibilizadas permitiría asesoramiento más

preciso, realizando estudios invasivos sólo en embarazos con fetos Rh

(+)

• La determinación del sexo fetal a partir de la semana 7 permitiría el

manejo temprano de embarazos en riesgo de ciertas patologías.

• La inclusión de otra secuencia del gen RHD (exón 5) y del cromosoma

Y (gen SRY), permitirán aumentar la especificidad del método.

• Desafíos diagnósticos: evaluación diferenciada de ácidos nucleicos

fetales de maternos y evaluación de ploidía.


Gracias por su atención.


• Poon LL, Leung TN, Lau TK & Lo YM. Presence of fetal RNA in maternal

plasma. Clin Chem 2000; 46: 1832-1834.

• Lo YM, Tsui NB, Chiu RW, Lau TK, Leung TN, Heung MM, Gerovassili A,

Jin Y, Nicolaides KH, Cantor CR & Ding C. Plasma placental RNA allelic

ratio permits noninvasive prenatal chromosomal aneuploidy detection. Nat

Med 2007; 13: 218-223.

• Hahn S & Chitty LS. Noninvasive prenatal diagnosis: current practice and

future perspectives. Curr Opin Obstet Gynecol 2008; 20: 146-151.

Bibliografía

Documents

Sesarini C 1 , Giménez ML 2 , Redal M 1 , Argibay P 1 , Otaño L 2