Simplexa Dengue - Focus Diagnostics · Ásia, o principal vetor da dengue é o A. albopictus. Recentemente, houve relatos de casos autóctones em Key West e em Miami-Dade County no

SimplexaTM Dengue

REF MOL3100 Rev. C

Ensaio de RT-PCR pra detecção e tipagem in vitro dos sorotipos 1, 2, 3 e 4 do vírus da dengue

Para uso diagnóstico in vitro

APLICAÇÃO

O teste SimplexaTM Dengue da Focus Diagnostics é um ensaio de reação em cadeia de polimerase em tempo real (RT-PCR) para uso com o Integrated Cycler 3M para detecção e tipagem in vitro dos sorotipos 1, 2, 3 e 4 do vírus da dengue em soro humano. RESUMO E EXPLICAÇÃO A dengue é uma virose aguda e autolimitada, cujo quadro clínico é caracterizado por febre, cefaleia, dores no corpo, erupção cutânea, linfadenopatia e prostração. Em sua forma mais grave, conhecida como dengue hemorrágica (DH), o paciente apresenta febre intensa e insuficiência renal, que muitas vezes causa a síndrome de choque da dengue (SCD)1. Estima-se que haja no mundo cerca de dois bilhões de pessoas sob risco de contrair a doença e até 100 milhões de infecções por ano.2,3 Essas taxas e as centenas de milhares de casos de choque tornam a dengue a arbovirose mais importante do mundo.4

A DH foi caracterizada pela primeira vez na década de 50 em epidemias nas Filipinas e na Tailândia. Em 1970, já haviam ocorrido epidemias da doença em nove países; atualmente, este número é quatro vezes maior e continua aumentando. A emergência da DH vem causando cada vez mais epidemias nas Américas e na Ásia, onde todos os quatro sorotipos de dengue são endêmicos. A SCD tornou-se uma das principais causas de hospitalização e óbito de crianças em vários países.5 O vírus da dengue (VD) é um flavivírus de RNA de fita simples bastante semelhante aos vírus da febre amarela, da encefalite japonesa e a outros arbovírus do grupo B. Existem quatro cepas diferentes e sorologicamente distintas de vírus da dengue, e a infecção por uma delas não protege o hospedeiro contra as outras. Pelo contrário, um estudo sugeriu que a DH e a SCD são mais frequentes em indivíduos que já foram infectados por outra cepa.6 A presença na circulação de anticorpos antidengue não-neutralizantes que fazem reação cruzada pode contribuir para exacerbar a reação imunológica,6 mas anticorpos não-neutralizantes que fazem reação cruzada contra outros flavivírus não estão associados a aumento da resposta imune.6

O vírus da dengue pode ser transmitido onde quer que haja os mosquitos vetores Aedes aegypti e Aedes albopictus. O A. aegypti é encontrado principalmente nas regiões tropicais e subtropicais das Américas e é originário do sul dos Estados Unidos.4 Na Ásia, o principal vetor da dengue é o A. albopictus. Recentemente, houve relatos de casos autóctones em Key West e em Miami-Dade County no estado da Flórida.7

Historicamente, a suspeita de dengue era confirmada por exames sorológicos. Pacientes com infecções primárias agudas apresentam imunoglobulinas G e M (IgG e IgM) específicas para o vírus da dengue, mas pode haver pouca ou até nenhuma resposta de IgM nas formas secundárias da doença.8 Existe também uma forte reatividade cruzada entre membros da família dos flavivírus. Com isso, a resposta de anticorpos pode ser difícil de interpretar na fase aguda da dengue se não for possível descartar outras infecções por flavivírus por métodos clínicos, laboratoriais ou epidemiológicos. Mais recentemente, métodos de RT-PCR de tempo real foram desenvolvidos para detectar o vírus da dengue no sangue de pacientes. A detecção do RNA do vírus da dengue por PCR da transcriptase reversa (RT-PCR) em amostras de soro humano é altamente sugestiva de infecção aguda pelo vírus da dengue.9 O vírus da dengue pode ser detectado no sangue (soro) do paciente a partir de cerca de cinco dias após o início dos sintomas.10

PRINCÍPIOS DO PROCEDIMENTO O ensaio é um RT-PCR que diferencia os sorotipos 1 e 4 em uma reação e os sorotipos 2 e 3 em outra reação, sendo que cada reação é realizada em um poço separada. O teste é realizado em duas etapas principais: (1) extração do RNA de amostras e (2) amplificação do RNA extraído usando primers fluorescentes bifuncionais e primers reversos. O ensaio amplifica quatro regiões específicas para o sorotipo: dengue 1 (gene NS5), dengue 2 (gene NS3), dengue 3 (gene NS5) e dengue 4 (gene do capsídio). O processo de extração é monitorado por um controle interno de RNA que também detecta eventuais inibições da reação de RT-PCR.

Simplexa™ Dengue Página 2

MATERIAIS FORNECIDOS O kit Simplexa Dengue contém reagentes suficientes para sorotipagem de 100 amostras.

Descrição do Kit

Nome do Componente REF SÍMBOLO CE NO RÓTULO

Abreviação do Nome

Cor da Tampa

Número de

Frascos

Reações por frasco ou kit

Volume por

Frasco Simplexa Dengue 1 & 4 Primer Mix MOL3101 REAG A PM Marrom 2 50/100 30 µL Simplexa Dengue 2 & 3 Primer Mix MOL3102 REAG B PM Roxa 2 50/100 30 µL HS Master Mix MOL9060 REAG C MM Verde 4 50/200 200 µL RT Mix MOL9103 REAG D RT Amarela 2 100/200 50 µL

Simplexa RNA Internal Control MOL2004 CONTROL IC IC Azul 2 50/100 250 µL Simplexa Dengue Molecular Control MOL3103 CONTROL + MC Vermelha 2 4/8 800 µL

Descrição do componente

Componente do Kit Descrição

Simplexa Dengue 1 & 4 Primer Mix [Mistura de primers Simplexa Dengue 1 e 4]

Primers fluorescentes marcados com corante para detecção de dengue sorotipos 1 e 4 e controle interno de RNA

Alvo Fluoróforo da sonda (corante)

Excitação Emissão Gene- alvo

Dengue tipo 1 FAM 495 nm 520 nm Gene NS5

Dengue 4 CFR610 590 nm 610 nm Gene do

capsídio

Controle interno (RNA IC) Q670 644 nm 670 nm N/D

Simplexa Dengue 2 & 3 Primer Mix [Mistura de primers Simplexa Dengue 2 e 3]

Primers fluorescentes marcados com corante para detecção de sorotipos 2 e 3 da dengue e controle interno de RNA

Alvo Fluoróforo da sonda (corante)

Excitação Emissão Gene- alvo

Dengue 3 (VD3) FAM 495 nm 520 nm Gene NS5

Dengue 2 (VD2) CFR610 590 nm 610 nm Gene NS3

Controle interno (RNA IC) Q670 644 nm 670 nm N/D

HS Master Mix (MM) [Mistura de reagentes HS] DNA polimerase, tampão e dNTPs

Simplexa™ RNA Internal Control (RNA IC) [Controle interno de RNA Simplexa™]

Referência de RNA encapsulado.

Simplexa™ Dengue Molecular Control (MC) [Controle molecular para dengue Simplexa]

Vírus da dengue inativado sorotipos 1, 2, 3 e 4

RT Mix (RT) [Mistura de RT] Transcriptase reversa em tampão.

MATERIAIS NECESSÁRIOS MAS NÃO FORNECIDOS 1. 3M Integrated Cycler com o programa Integrated Cycler Studio versão 4.2 ou superior 2. Universal Discs (Discos Universais) para uso com o Integrated Cycler 3. Universal Disc Sealer (Selador de Discos Universais) 4. Água sem nuclease (recomendada para o No-Template Control (NTC)) 5. Micropipeta(s) individual(is) do tipo multicanal e/ou de repetição com exatidões entre 1-10 µL, 10-100 µL e 100-1.000 µL 6. Sistema Roche MagNA Pure LC e material de consumo associado. 7. MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation (nº. cat. Roche 3038505001) 8. Bloco de colocação em disco universal 9. Freezer (degelo manual) a temperaturas entre -10 e -30°C (para o armazenamento dos componentes congelados do kit) 10. Freezer (degelo manual) a temperaturas entre -10 e -30°C (para o armazenamento de amostras congeladas, se necessário) 11. Refrigerador a temperaturas entre 2 e 8°C (para os componentes descongelados do kit)


12. Capela de biossegurança (fluxo laminar) para processamento de amostras 13. Microcentrífuga 14. Misturador de vórtex 15. Ponteiras para micropipetadores, estéreis, descartáveis, que não contenham RNase/DNase, com proteção contra aerossóis. 16. Tubos e estantes de polipropileno de 1,5 mL para microcentrífugas (recomenda-se usar tubos sem RNase/DNase) 17. Luvas descartáveis, sem talco 18. Estantes de resfriamento para tubos de microcentrífugas de 1,5 mL

VALIDADE E MANUSEIO 1. Armazene os reagentes a temperaturas entre -10 e -30ºC (não utilize congeladores com degelo automático). 2. Não utilize os kits nem os reagentes fora das datas de validade. 3. Deixe os Primer Mix, o HS Master Mix, o Molecular Control e o RNA Internal Control degelarem em temperatura ambiente

(cerca de 18 a 25 °C) antes de usar. 4. Após adicionar o RT Mix, as misturas de reação devem ser usadas em até uma hora. 5. Se a preparação de PCR não for realizada imediatamente após o preparo dos Reaction Mix, armazene-os entre 2 e 8 ºC até

terminar o preparo do PCR, que deverá ser concluído em uma hora. 6. Após cada utilização coloque o RT Mix novamente no freezer (-10 a -30ºC) até a data de validade. 7. Após o degelo, os Primer Mix, o HS Master Mix, o Molecular Control e o RNA Internal Control não devem permanecer a

temperaturas de 2 a 8 ºC por mais de 30 dias. 8. Não recongele os Primer Mix, o HS Master Mix, o RNA Internal Control ou o Molecular Control. 9. Não misture reagentes de kits de lotes diferentes. ADVERTÊNCIAS E PRECAUÇÕES 1. Siga as precauções padrão. As amostras de teste e os controles moleculares devem ser considerados potencialmente

infecciosos e manipulados como tal. 2. Ao manusear os reagentes do kit, use equipamentos de proteção individual como luvas, aventais de laboratório, etc. Ao

terminar os testes, lave bem as mãos. 3. Não pipete com a boca. 4. Não fume, beba, coma, manipule lentes de contato ou aplique maquiagem em áreas onde os reagentes do kit e/ou amostras

de seres humanos sejam usados. 5. Descarte todos os reagentes do kit e as amostras de teste não utilizados, de acordo com as normas locais, estaduais e

federais. 6. O fluxo de trabalho no laboratório deve ser organizado de forma unidirecional, começando nas áreas de pré-amplificação e

procedendo em direção à área de amplificação/detecção. A sequência de eventos entre a extração da amostra e a amplificação por PCR em tempo real é a seguinte: • Extração da amostra, configuração do equipamento de PCR em tempo real, preparo dos reagentes e amplificação por

PCR em tempo real. • Não utilize suprimentos e equipamentos nas áreas dedicadas a extração e preparo de amostras. Recomenda-se evitar

movimento cruzado entre as áreas. • Os suprimentos e equipamentos utilizados para o preparo de amostras não devem ser usados para atividades de

preparação de reagentes nem para o processamento de DNA amplificado ou de outras fontes de ácido nucleico alvo. • Todo o suprimento e equipamento para amplificação deve ser mantido o tempo todo na área destinada ao equipamento

para PCR em tempo real. • Os equipamentos de proteção individual, tais como aventais de laboratório e luvas descartáveis, devem ser separados

para cada área. 7. A contaminação de amostras de teste ou de reagentes pode falsear os resultados. Empregue técnica asséptica. 8. Pipete e manuseie cuidadosamente os reagentes para evitar que haja a mistura de amostras entre poços adjacentes. 9. Empregue técnicas de pipetagem apropriadas e mantenha sempre o mesmo padrão de pipetagem ao longo de todo o

procedimento para garantir resultados exatos e reprodutíveis. 10. Não substitua nem misture reagentes de diferentes lotes do kit e nem com os de outros fabricantes. 11. Não troque as tampas dos tubos de reagentes, ou pode haver contaminação e comprometimento dos resultados do teste. 12. Desvios do protocolo ou não observação dos intervalos de tempo ou temperatura especificados podem falsear os resultados. 13. A configuração do teste deve ser realizada à temperatura ambiente (entre 18 e 25°C, aproximadamente). Enquanto estiver

misturando os reagentes, mantenha as enzimas resfriadas em um bloco de resfriamento. 14. Não reutilize os Universal Discs que já foram expostos a reagentes ou a amostras de teste. 15. Descarte o disco usado sem destacar nem remover a faixa de cobertura. 16. Se kits dos lotes diferentes de Simplexa ™ forem montados no mesmo disco, recomenda-se testar os Molecular Controls de

cada kit. 17. A HS Master Mix e a RT Mix contêm glicerol a >1%, que pode causar irritação se for inalado ou entrar em contato com a

pele. Se ocorrer inalação ou contato com a pele, devem-se tomar medidas de primeiros socorros. 18. A armazenagem prolongada de amostras extraídas entre 2 e 8 °C não é recomendada, pois isto afeta o desempenho do

teste.


INSTRUÇÕES DE USO A. COLETA DE AMOSTRAS

O único tipo de amostra aceitável é o soro. As amostras de sangue devem ser colhidas por pessoal qualificado usando técnicas assépticas aprovadas.11 Deixe as amostras coagularem em temperatura ambiente antes de centrifugá-las para separar o soro. Transfira o soro usando técnica asséptica para um recipiente estéril bem vedado para armazenamento.

As amostras de soro separadas não devem permanecer em temperatura ambiente por mais de 8 horas. Se não for concluir o ensaio em 8 horas, refrigere a amostra entre 2 e 8 ºC. Se não for concluir o ensaio em 48 horas ou precisar transportar as amostras, congele-as a -20 ºC ou menos. Evite congelar e descongelar várias vezes as amostras.11 Após descongelar, misture bem antes de usar.

B. EXTRAÇÃO DE AMOSTRAS

Extração pelo método Roche MagNA Pure LC 1. Os ácidos nucleicos são extraídos de amostras de pacientes e dos controles do ensaio com o kit Roche MagNA Pure

Total Nucleic Acid Isolation Kit e o extrator Roche MagNA Pure LC Automated Nucleic Acid Extractor. Para obter informações sobre como utilizar o kit, consulte as instruções fornecidas pelo fabricante.

2. Na caixa de listagem “Protocol”, do MagNA Pure LC System, selecione “Total NA” e depois “Total NA Variable_elution_volume.blk” na lista. As configurações apropriadas para a sequência serão carregadas.

3. O protocolo de amostra deve ser “Total NA Variable_elution_volume”. 4. O volume da amostra deve ser de 200 µL e o volume de eluição deve ser de 50 µL. 5. O volume de diluição deve ser zero para todas as amostras. 6. Verifique se o Post Elution Protocol está em “None”. 7. Verifique se as amostras e os controles estão posicionados corretamente no Cartucho de amostra 8. Agite as amostras e o Molecular Control em vórtex por 2 a 4 segundos e centrifugue-as rapidamente para depositar o

conteúdo na parte inferior do tubo. 9. Pipete 200 µL de cada amostra, com o Molecular Control (MC) ou o No-Template Control na posição correspondente no

cartucho de amostra. 10. Inspecione visualmente os níveis das amostras e dos controles no cartucho de amostra para verificar se a(s) amostra(s)

foi(ram) adicionadas. 11. Agite o RNA Internal Control no vórtex duas vezes e centrifugue rapidamente para depositar o conteúdo na parte inferior

do tubo. 12. Pipete 5 µL do RNA Internal Control nos poços com amostras e controles usando uma ponteira separada para cada

amostra. 13. Coloque o cartucho de amostra com as amostras no extrator MagNA Pure LC Automated Nucleic Acid e inicie a

sequência de extração. 14. Ao final da extração de ácidos nucleicos, o cartucho com os controles extraídos e as amostras do paciente pode ser

retirado do MagNA Pure e selado. Armazene o RNA extraído entre 2 e 8 ºC antes de usá-lo. Recomenda-se não armazenar as amostras extraídas a esta temperatura por períodos prolongados. Mantenha as amostras de RNA extraído refrigeradas ao carregar o disco.

C. CONFIGURAÇÃO DO EQUIPAMENTO DE PCR EM TEMPO REAL

1. O manual do operador do Integrated Cycler contém instruções sobre como configurar o programa Integrated Cycler

Studio e incluir definições de ensaios, programar sequências no equipamento e analisar os resultados.

Observação: O ensaio possui dois códigos de barra diferentes: um corresponde à definição do ensaio para os sorotipos 1 e 4 da dengue e o outro à definição do ensaio para os sorotipos 2 e 3 da dengue. É necessário que haja dois segmentos para obter resultados para todos os sorotipos.


Ordenação sugerida dos discos. Este ensaio requer dois segmentos

Raio 1 Raio 2 Raio 3 Raio 4 Raio 5 Raio 6 Raio 7 Raio 8 Raio 9 Raio 10 Raio 11 Raio 12 A MC S8 S16 S24 S32 S40 MC S8 S16 S24 S32 S40 B S1 S9 S17 S25 S33 S41 S1 S9 S17 S25 S33 S41 C S2 S10 S18 S26 S34 S42 S2 S10 S18 S26 S34 S42 D S3 S11 S19 S27 S35 S43 S3 S11 S19 S27 S35 S43 E S4 S12 S20 S28 S36 S44 S4 S12 S20 S28 S36 S44

F S5 S13 S21 S29 S37 S45 S5 S13 S21 S29 S37 S45

G S6 S14 S22 S30 S38 S46 S6 S14 S22 S30 S38 S46

H S7 S15 S23 S31 S39 NTC S7 S15 S23 S31 S39 NTC

Legenda:

= Dengue 1 & 4 Reaction Mix

= Dengue 2 & 3 Reaction Mix

D. ÁREA DE PREPARAÇÃO DE REAGENTES Área reservada ao preparo do Reaction Mix para ensaio de dengue. 1. Descongele o Primer Mix e o HS Master Mix em temperatura ambiente (cerca de 18 a 25 °C). Antes de cada uso,

misture os Primer Mix, o HS Master Mix e o RT Mix pipetando-os 6 a 8 vezes e centrifugue rapidamente para precipitar os conteúdos no fundo do tubo.

2. Prepare o volume de cada Reaction Mix indicado na tabela a seguir pipetando o volume apropriado de cada componente em um tubo de microcentrifugação de polipropileno de tamanho adequado.

Volumes de Reaction Mix – Reaction Mix de dengue 1&4

Reagente Volumes de Reaction Mix

para 1 reação Volumes de Reaction

Mix para 10 reações

HS Master Mix 4,0 µL 40 µL Simplexa Dengue 1 & 4

Primer Mix 0,5 µL 5 µL

RT 0,5 µL 5 µL Volume Total 5,0 µL 50 µL

Volumes de Reaction Mix – Reaction Mix de dengue 2&3

Reagente Volumes de Reaction Mix

para 1 reação Volumes de Reaction

Mix para 10 reações

HS Master Mix 4,0 µL 40 µL Simplexa Dengue 2 & 3

Primer Mix 0,5 µL 5 µL

RT 0,5 µL 5 µL Volume Total 5,0 µL 50 µL

3. Misture suavemente as Reaction Mix pipetando 8 a 10 vezes. 4. Centrifugue rapidamente em velocidade baixa para precipitar os conteúdos no fundo do tubo. 5. Configure a PCR. 6. As Reaction Mix preparadas devem ser usadas em até uma hora. Se a configuração da PCR não for realizada

imediatamente após o preparo da Reaction Mix, guarde-a em temperaturas entre 2 e 8 °C até que seja possível configurar a PCR (em até uma hora).

E. ÁREA DE AMPLIFICAÇÃO POR PCR EM TEMPO REAL

Prepare o Universal Disc de 96 poços para o ensaio de dengue uma área separada. Use o bloco de colocação do Universal Disc para preparar o disco. Consulte o exemplo de disposição do disco na Seção C ao executar a seguinte configuração: 1. Adicione em cada poço 5,0 µL da mistura apropriada. 2. Adicione 5,0 µL do Molecular Control extraído a cada poço “MC”. 3. Adicione 5,0 µL do extrato a ser testado ao poço “S” apropriado do disco. 4. Adicione 5,0 µL do extrato do No-Template Control a cada cavidade “NTC”. 5. Cubra o disco com a Universal Disc Cover Tape . 6. Abra a tampa do Integrated Cycler. 7. Coloque o Universal Disc selado sobre a plataforma. 8. Feche a tampa com cuidado. 9. Clique em Run [Efetuar corrida]. 10. Clique em Start [Iniciar].


F. ANÁLISE DE DADOS 1. O Manual do Operador do Integrated Cycler descreve em detalhes a análise dos dados e como exportar as sequências

conforme necessário. ANÁLISE DOS RESULTADOS

O processo para relatar os resultados consiste em três etapas. 1. Exame dos controles para determinar se o segmento é válido. O programa Integrated Cycler Studio suprimirá a

interpretação dos resultados do paciente se qualquer das amostras programadas, como no caso do controle, estiver inválida.

2. Exame da validade dos resultados da amostra do paciente. 3. Interpretação dos resultados do paciente. Se os controles não estiverem válidos, não será possível interpretar os

resultados do paciente.

1. Para determinar se o segmento é válido, examine o Dengue Molecular Controle, o No Template Control e o RNA Internal Control.

Critérios (simplificados) para um Controle Válido* Segmento para dengue 1 e 4 Segmento para dengue 2 e 3 Controle

VD1 VD4 RNA IC Ct VD2 VD3 RNA IC Ct No Template Control

0 0 ≤40,0, ≠0 0 0 ≤40,0, ≠0

Molecular Control

≤40,0, ≠0 ≤40,0, ≠0 Não se aplica ≤40,0, ≠0 ≤40,0, ≠0 Não se aplica

* Para uma descrição completa, veja as observações a seguir.

a. No Template Control (NTC) (segmento para dengue 1 e 4)

i. Se Ct=0 para VD1 e VD4 e Ct≤40 para o controle interno, o controle é válido.

b. No Template Control (NTC) (segmento para dengue 2 e 3)

i. Se Ct=0 para VD2 e VD3 e Ct≤40 para o controle interno, o controle é válido.

c. Molecular Control (MC) (segmento para dengue 1 e 4)

i. Se o resultado do Molecular Control for Ct = 0 para VD1 ou VD4, este segmento do ensaio será

considerado inválido e inaceitável. Todas as amostras dos pacientes devem ser testadas novamente.

ii. Se os valores de Ct para VD1 e VD4 forem ≤40 mas ≠0, e houver um No Template Control válido, o

segmento será considerado válido e aceitável.

d. Molecular Control (MC) (segmento para dengue 2 e 3)

i. Se o resultado do Molecular Control for Ct = 0 para VD2 ou VD3, este segmento do ensaio será

considerado inválido e inaceitável. Todas as amostras dos pacientes devem ser testadas novamente.

ii. Se os valores de Ct para VD2 e VD3 forem ≤40 mas ≠0 e houver um No Template Control válido, o

segmento será considerado válido e aceitável.

2. Exame dos Resultados da Amostra do Paciente. O exame dos resultados da amostra clínica deve ser realizado depois que o Molecular Control e o No Template Control forem examinados para determinar se são válidos e aceitáveis. Os resultados de VD1, VD4 e RNA IC e de VD2, VD3 e RNA IC devem ser avaliados em todos os segmentos para cada amostra de paciente.

a. As curvas de amplificação devem ser analisadas para cada resultado, sobretudo se houver uma mensagem “Data Quality” (qualidade dos dados). Uma curva de amplificação válida exibe um crescimento exponencial progressivo. Consulte o manual do operador sobre as ações recomendadas.


Curva de amplificação válida Curva de amplificação válida Curva de amplificação inválida

b. Se a curva de amplificação para o alvo for válida, não será necessário usar o RNA IC para considerar o resultado positivo.

3. Interpretação dos Resultados

Interpretação dos Resultados

Segmento para dengue 1 e 4 Segmento para dengue 2 e 3

Exemplo VD1

Valor de Ct

VD4 Valor de Ct

RNA IC Valor de Ct*

Interpretação VD2 Valor de

Ct

VD3 Valor de

Ct

RNA IC Valor de Ct* Interpretação

1 0 0 ≤40,0, ≠0 VD1 e VD4 não detectados

0 0 ≤40,0, ≠0 VD2 e VD3 não detectados

2 ≤40,0, ≠0 0 N/D VD1 detectado 0 0 ≤40,0, ≠0 VD2 e VD3 não detectados

3 0 ≤40,0, ≠0 N/D VD4 detectado 0 0 ≤40,0, ≠0 VD2 e VD3 não detectados

4 ≤40,0, ≠0 ≤40,0, ≠0 N/D VD1 e VD4 detectados 0 0 ≤40,0, ≠0 VD2 e VD3

não detectados

5 0 0 ≤40,0, ≠0 VD1 e VD4 não detectados

≤40,0, ≠0 0 N/D VD2 detectado

6 0 0 ≤40,0, ≠0 VD1 e VD4 não detectados 0 ≤40,0, ≠0 N/D VD3 detectado

7 0 0 ≤40,0, ≠0 VD1 e VD4 não detectados ≤40,0, ≠0 ≤40,0, ≠0 N/D VD2 e VD3

detectados

8 0 0 0 Resultado inválido;

realizar nova extração e repetir o segmento.

N/D N/D N/D N/D

9 N/D N/D N/D N/D 0 0 0

Resultado inválido; realizar nova extração e

repetir o segmento.

Ct = limiar do ciclo. Ct ≤40.0, ≠0 significa detectado. Ct=0 significa não detectado

*A detecção do Internal Control de RNA Simplexa™ não é obrigatória para classificar o resultado como detectado. LIMITAÇÕES 1. Para uso diagnóstico in vitro. 2. Somente para exportação. 3. Este ensaio foi projetado para uso com amostras de soro e não foi avaliado com outros tipos de amostra. 4. A detecção de ácidos nucleicos virais depende de que as amostras sejam colhidas, manuseadas, transportadas,

armazenadas e preparadas da maneira correta, incluindo-se os procedimentos de extração. Em qualquer dessas etapas, a não observação dos procedimentos corretos pode produzir resultados incorretos

5. Os analistas devem ser treinados e adquirir familiaridade com os procedimentos de ensaio e interpretação dos resultados antes de executarem o teste.

6. Todos os resultados deste e de outros testes devem ser correlacionados com o quadro clínico, dados epidemiológicos e outras informações disponíveis ao clínico responsável pelo paciente.

7. A prevalência da infecção afeta o valor preditivo do teste.


8. Assim como com outros testes, resultados negativos não excluem a presença de infecções por dengue. 9. Resultados falso-negativos podem ocorrer quando o organismo infectante apresenta mutações, inserções, deleções,

rearranjos genômicos ou quando o teste for realizado em fases muito precoces da doença. 10. Resultados falso-negativos podem ocorrer se houver poucos microrganismos na amostra em virtude de coleta, transporte ou

manuseio inadequados. 11. Assim como em outros testes, podem ocorrer resultados falso-positivos. Em algumas situações, poderá ser indicada a

repetição ou execução do teste com outro dispositivo. 12. Este é um teste qualitativo e não fornece um valor quantitativo da presença do organismo detectado. 13. Este teste não exclui a presença de doenças causadas por outros patógenos bacterianos ou virais.

CARACTERÍSTICAS DE DESEMPENHO

COMPARAÇÃO ENTRE MÉTODOS

Um painel de 179 amostras com resultados de PCR para dengue caracterizados anteriormente foi obtido do Center of Disease Control and Prevention (CDC) dos EUA. As amostras foram testadas usando-se o ensaio Simplexa™ Dengue e os resultados foram comparados com os valores históricos obtidos pelo CDC.

Tabela 1: Comparação dos resultados com a série histórica para o vírus da dengue 1 Resultado histórico do

CDC Simplexa™ Dengue VD1

n Detectado Não detectado

% concordância (observada/esperada) IC 95%

Detectado 32 32 0 PCP: 100,0%(32/32) IC 95%: 89,3 a 100,0%

Não detectado 147 11a 136 PCN: 92,5%(136/147) IC 95%: 87,1 a 95,8%

PCP = Porcentual de concordância positiva, PCN = Porcentual de concordância negativa a Ao repetir o exame, o ensaio Simplexa Dengue e um ensaio desenvolvido internamente com base em publicações do CDC detectou 5 de 11 amostras. As outras seis amostras não foram detectadas pelo ensaio baseado em publicações do CDC.

Tabela 2: Comparação dos resultados com a série histórica para o vírus da dengue 2

Resultado histórico do CDC Simplexa™ Dengue VD2



Detectado 30 29 1b 96,7%(29/30) IC 95%: 83,3 a 99,4%

Não detectado 149 1b 148 99,3%(148/149) IC 95%: 96,3 a 99,9%

PCP = Porcentual de concordância positiva, PCN = Porcentual de concordância negativa b A repetição do exame confirmou os resultados. Tabela 3: Comparação dos resultados com a série histórica para o vírus da dengue 3




Detectado 29 29 0 100,0%(29/29) IC 95%: 88,3 a 100,0%

Não detectado 150 0 150 100,0%(150/150) IC 95%: 97,5 a 100,0%

PCP = Porcentual de concordância positiva, PCN = Porcentual de concordância negativa


Tabela 4: Comparação dos resultados com a série histórica para o vírus da dengue 4




Detectado 38 37 1c 97,4%(37/38) IC 95%: 86,5 a 99,5%

Não detectado 141 8d 133 94,3%(133/141) IC 95%: 89,2 a 97,1%

PCP = Porcentual de concordância positiva, PCN = Porcentual de concordância negativa c A repetição do exame confirmou os resultados. d Ao repetir o exame, 2 de 8 amostras foram detectadas como VD4 pelo ensaio Simplexa Dengue e por um ensaio desenvolvido internamente com base em publicações do CDC. Em ambos os ensaios, uma amostra foi detectada como VD1 e outra como VD2. Em ambos os ensaios, as duas amostras restantes não foram detectadas ao se repetir o teste.

REPRODUTIBILIDADE A reprodutibilidade do ensaio Simplexa Dengue foi avaliada usando-se três instrumentos diferentes. Um painel de amostras e do molecular control foram testados em triplicata em cada instrumento duas vezes por dia durante um período de cinco dias. O controle negativo foi testado uma vez em cada sequência e cada instrumento foi testado por um operador diferente, que ensaiou todo o painel de amostras duas vezes por dia, totalizando dois conjuntos de dados por dia. A reprodutibilidade da resposta qualitativa do instrumento e a avaliação dos vários componentes da variabilidade dos valores de Ct são descritos nas tabelas abaixo. Tabela 5: Reprodutibilidade da resposta qualitativa

Reaction Mix 1 e 4 Reaction Mix 2 e 3 VD1 VD4 Nome da

amostra Todos Não detectado Detectado Não

detectado Detectado

Dengue-1 Low

Positive 90 0 90 90 0

Dengue-1

Medium Positive

90 0 90 89 1

Dengue-4 Low

Positive 90 90 0 1 89

Dengue-4

Medium Positive

89 89 0 0 89

Negative 90 90 0 90 0 Negative Control 30 30 0 30 0

Molecular Control 90 0 90 0 90

VD2 VD3 Nome da amostra Todos Não

detectado Detectado Não detectado Detectado

Dengue-2 Low

Positive 88 0 88 88 0

Dengue-2

Medium Positive

88 0 88 88 0

Dengue-3 Low

Positive 90 90 0 11 79

Dengue-3

Medium Positive

89 89 0 0 89

Negative 88 88 0 88 0 Negative Control 30 30 0 30 0

Molecular Control 90 0 90 0 90


Tabela 6: Reprodutibilidade da resposta do instrumento (valores de Ct) Componente da variância

entre instrumentos/operador Entre dias

Entre sequências

Intraensaio (repetibilidade) Total Alvo Amostra N

Ct média

DP %CV DP %CV DP %CV DP %CV DP %CV

Dengue 1 baixa positividade

90 35,2 0,44 1,3 0,16 0,4 0,10 0,3 0,46 1,3 0,66 1,9

Dengue 1 positividade

mediana 90 33,5 0,54 1,6 0,22 0,7 0,00 0,0 0,29 0,9 0,65 1,9

VD1

Molecular Control 90 34,3 0,49 1,4 0,26 0,8 0,00 0,0 0,38 1,1 0,67 2,0


88 33,5 0,33 1,0 0,19 0,6 0,19 0,6 0,37 1,1 0,57 1,7


mediana 88 31,9 0,45 1,4 0,48 1,5 0,00 0,0 0,23 0,7 0,70 2,2

VD2



90 38,2 0,51 1,3 0,22 0,6 0,62 1,6 0,87 2,3 1,21 3,2


mediana 89 33,0 0,58 1,7 0,63 1,9 0,00 0,0 0,26 0,8 0,89 2,7

VD3



90 36,4 0,00 0,0 0,24 0,7 0,00 0,0 0,79 2,2 0,82 2,3


mediana 89 32,0 0,27 0,8 0,10 0,3 0,00 0,0 0,17 0,5 0,33 1,0

VD4


Para fins da análise de reprodutibilidade, um Ct de 40,1 foi atribuído aos resultados classificados como “Não detectados”

SENSIBILIDADE ANALÍTICA E LIMITE DE DETECÇÃO O limite de detecção (LD) foi determinando para o ensaio Simplexa™ Dengue usando estoques quantificados de cepas de vírus da dengue diluídos em série em soro humano. Para cada ensaio, o limite de detecção foi determinado como sendo a menor concentração com detecção ≥95% (pelo menos 19 de 20 replicados). Tabela 7: Resumo dos limites de detecção

Sorotipo de dengue Cepa viral Concentração do limite de detecção (LD) (UFP/mL)

Dengue 1 OMS WEST PAC 74 0,16

Dengue 2 OMS-S16803 2,0

Dengue 3 OMS-CH53489 0,2

Dengue 4 TVP-360 0,2

REATIVIDADE ANALÍTICA Além das cepas testadas para LD, uma cepa adicional de cada sorotipo de vírus da dengue foi avaliada para verificar a reatividade do ensaio. O material viral quantificado foi acrescentado a soros humanos negativos em uma única diluição na concentração indicada na tabela abaixo e ensaiado em triplicata. Todas as amostras testadas foram detectadas com o Reaction Mix apropriado. Tabela 2: Resumo de reatividade analítica

Detectado / Total

Reaction Mix 1 e 4 Reaction Mix 2 e 3 Cepa Concentração testada

VD1 VD4 VD2 VD3

Dengue 1, Hawaii não disponível 3/3 0/3 0/3 0/3

Dengue 2, Nova Guiné C 1,00 × 104 TCID50/mL 0/3 0/3 3/3 0/3

Dengue 3, H87 1,00 × 104 TCID50/mL 0/3 0/3 0/3 3/3

Dengue 4, H241 Sm14 1,00 × 104 TCID50/mL 0/3 3/3 0/3 0/3


REATIVIDADE CRUZADA A especificidade analítica do ensaio Simplexa™ foi avaliada testando-se a capacidade de identificar apenas vírus da dengue, sem reatividade cruzada com outros microrganismos relacionados, que causam sintomas clínicos semelhantes ou que estão presentes como flora normal nos tipos de amostras de interesse.

Vinte e oito possíveis contaminantes foram acrescentados separadamente em soro humano negativo em concentrações clinicamente relevantes. A que não recebeu acréscimo também foi testada para fins de referência. As amostras foram testadas em triplicata para verificar a reatividade cruzada. Se algum sinal foi detectado em qualquer um dos canais (VD1, VD2, VD3, VD4) em alguma das três réplicas, outras cinco réplicas foram testadas para confirmação. Não foi encontrada reatividade cruzada.

Tabela 3: Resumo de reatividade cruzada Detectado / Total

Reaction Mix 1 e 4 Reaction Mix 2 e 3 Material de reação cruzada Concentração testada

VD1 VD4 VD2 VD3

Fluido de cultura de adenovírus (tipo 1) 1,00 × 105 TCID50/mL 0/3 0/3 0/3 0/3

Fluido de cultura de adenovírus (tipo 7A) 1,00 × 105 TCID50/mL 0/3 0/3 0/3 0/3

Aspergillus desconhecida 0/3 0/3 0/3 0/3

Vírus BK 1,00 × 105 cópias/mL 0/3 0/3 0/3 0/3

Vírus Chikungunya 1,00 × 105 TCID50/mL 0/3 0/3 0/3 0/3

Citomegalovírus (CMV) 1,00 × 105 TCID50/mL 0/3 0/3 0/3 0/3

Enterovírus 71 1,00 × 105 TCID50/mL 0/3 0/3 0/3 0/3

Vírus Epstein Barr (EBV) 1,00 × 105 cópias/mL 0/3 0/3 0/3 0/3

Controle para vírus da hepatite B 5.00 × 103 UI/mL 0/3 0/3 0/3 0/3

Controle para vírus da hepatite C 1.00 × 104 UI/mL 0/3 0/3 0/3 0/3

Vírus da hepatite D desconhecida 0/3 0/3 0/3 0/3

HIV-1 1,00 × 105 cópias/mL 0/3 0/3 0/3 0/3

HIV-2 desconhecida 0/3 0/3 0/3 0/3

HSV-1 1,00 × 105 TCID50/mL 0/3 0/3 0/3 0/3

HSV-2 1,00 × 105 TCID50/mL 0/3 0/3 0/3 0/3

HTLV-1 desconhecida 0/3 0/3 0/3 0/3

Vírus de herpes humana tipo 6 1,00 × 105 TCID50/mL 0/3 0/3 0/3 0/3



DNA de Mycobacterium tuberculosis 1,67 × 10-3 µg/mL 0/3 0/3 0/3 0/3

Parechovírus 1,00 × 105 TCID50/mL 0/3 0/3 0/3 0/3

Controle de parvovírus B19 1,00 × 107 UI/mL 0/3 0/3 0/3 0/3

Vírus da rubéola 1,00 × 105 TCID50/mL 0/3 0/3 0/3 0/3

Vírus da encefalite de St. Louis 1,00 × 105 TCID50/mL 0/3 0/3 0/3 0/3

Toxoplasma gondii 1,00 × 106 taquizoítas/mL 0/3 0/3 0/3 0/3

Vírus varicela zoster 1,00 × 105 cópias/mL 0/3 0/3 0/3 0/3

Vírus do oeste do Nilo desconhecida 0/3 0/3 0/3 0/3

Vírus da febre amarela 1,00 × 105 TCID50/mL 0/3 0/3 0/3 0/3

INTERFERÊNCIA

O desempenho do teste não foi avaliado na presença de substâncias com potencial de causar interferência. Durante a extração automática de ácidos nucleicos, o processo remove impurezas da amostra ao isolar e lavar os ácidos nucleicos. Controles internos alertam o usuário sobre a possibilidade de inibição do PCR. Se nem os alvos nem os controles internos forem detectados, o ensaio será inválido.


CONTAMINAÇÃO CRUZADA O transporte da amplificação foi avaliado para o equipamento e para o Universal Disc usando outros testes. Os estudos procuraram a presença de contaminação em amostras negativas altas. O estudo consistiu em colocar alternadamente uma amostra positiva alta e uma amostra negativa alta em cada disco. A contaminação cruzada foi avaliada comparando-se a taxa de resultados obtidos com a amostra negativa alta com a taxa esperada sob condições de reprodutibilidade normais. Em testes prévios, não foi observado nenhum efeito do transporte sobre a contaminação..

CONTROLE DE QUALIDADE

Cada laboratório deve estabelecer suas próprias faixas de controle de qualidade e a frequência dos testes de controle de qualidade com base nas leis e regulamentos locais pertinentes e nas boas práticas laboratoriais padrão. REFERÊNCIAS

1 Halstead, SB. 1980. Immunological parameters of togavirus disease syndromes. p.107-173. In RW Schlesinger (ed.), The Toga Viruses. Academic Press, Inc., New York.

2 WHO, Dengue Guidelines for Diagnosis, Treatment, Prevention and Control, New edition (2009) WHO/HTM/NTD/DEN/2009.1

3 CDC http://www.cdc.gov/dengue/epidemiology/index.html 4 Gubler, DJ. 1989. Aedes aegypti and Aedes aegypti-borne disease control in the 1990’s: top down or bottom up. Am. J. Trop.

Med. Hyg. 40:571-578. 5 WHO http://www.who.int/csr/disease/dengue/en/ 6 Halstead, SB. 1989. Antibody, Macrophages, Dengue Virus Infection, Shock, and Hemorrhage: A Pathogenic Cascade. Rev.

of Inf. Dis. 11:S830-S839 7 MMWR May 21, 2010 / 59(19);577-581 8 Laue T, Emmerich P, Schmitz H. Detection of dengue virus RNA in patients after primary or secondary dengue infection by

using the TaqMan automated amplification system. J Clin Microbiol. 1999 Aug; 37(8):2543–7 9 Chang GJ, Trent DW, Vorndam AV, Vergne E, Kinney RM, Mitchell CJ. An integrated target sequence and signal

amplification assay, reverse transcriptase-PCR-enzyme-linked immunosorbent assay, to detect and characterize flaviviruses. J. Clin. Microbiol. 1994 Feb; 32(2):477–83

10 Muñoz-Jordán J.L., Collins CS, Vergne E, et al. Highly sensitive detection of dengue virus nucleic acid in samples from clinically ill patients. J Clin Microbiol 2009; 47:927-931

11 CLSI H18-A4. Procedures for the Handling and Processing of Blood Specimens; Approved Guideline. 4th Ed. (2010). O uso de sondas Scorpions ® para diagnóstico in vitro em seres humanos possui uma licença da empresa Focus Diagnostics, Inc. através da DxS, Ltd. Os corantes Black Hole Quencher™, CAL Fluor™, Quasar™ são marcas registradas da Biosearch Technologies, Inc. ('BTI'). A tecnologia de corantes Black Hole Quencher, CAL Fluor e Quasar é autorizada conforme um acordo estabelecido com a BTI e esses produtos são comercializados exclusivamente com finalidades clínicas, diagnósticas ou de pesquisa e desenvolvimento. REPRESENTANTE AUTORIZADO mdi Europa GmbH, Langenhagener Str. 71 30855, Langenhagen-Hannover, Alemanha INFORMAÇÕES SOBRE PEDIDOS

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Data de edição: 26 de abril de 2012

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Simplexa Dengue - Focus Diagnostics · Ásia, o principal vetor da dengue é o A. albopictus. Recentemente, houve relatos de casos autóctones em Key West e em Miami-Dade County no