SINH TỔNG HỢP ENZYME AMYLASE TỪ NẤM Aspergillus niger VÀ Mucor

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC******************

KHÓA LUÂN TÔT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU CÁC YẾU TÔ ẢNH HƯỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG

SINH TỔNG HỢP ENZYME AMYLASE TỪ NẤM

Aspergillus niger VÀ Mucor TRÊN MÔI

TRƯỜNG LÊN MEN BÁN RẮN

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện: NGUYỄN BÁ PHƯƠNG THẢO

Niên khóa: 2005 – 2009

Tháng 08 năm 2009

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHÔ HỒ CHÍ MINH

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC******************

KHÓA LUÂN TÔT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU CÁC YẾU TÔ ẢNH HƯỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG

SINH TỔNG HỢP ENZYME AMYLASE TỪ NẤM

Aspergillus niger VÀ Mucor TRÊN MÔI

TRƯỜNG LÊN MEN BÁN RẮN

Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện

TS. VŨ VĂN ĐỘ NGUYỄN BÁ PHƯƠNG THẢO

CN. ĐỖ THỊ TUYẾN

Tháng 08 năm 2009

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy Vũ Văn Độ và cô Đỗ

Thị Tuyến đã hết lòng hướng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong

suốt quá trình thực hiện đề tài.

Xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đối với quý thầy cô trong Khoa Công Nghệ

Sinh Học – trường đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh cũng như quý thầy cô là

giáo viên thỉnh giảng tại các khoa, trường, viện nghiên cứu đã tận tình giảng dạy em

trong thời gian học tập tại trường.

Xin chân thành cảm ơn đến ban lãnh đạo Viện sinh học Nhiệt Đới, quý cô, chú,

anh, chị và các bạn sinh viên đang công tác và làm việc tại viện công nghệ sinh học

nhiệt đới, và đội bảo vệ đã giúp đỡ em trong quá trình thực hiện đề tài.

Xin gửi lời cảm ơn đến các bạn lớp DH05SH, đại học chính quy khóa 2005 -

2009 đã quan tâm và động viên tôi trong thời gian học tập và thực hiện đề tài.

Cuối cùng, con xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến ba, mẹ và những người thân

trong gia đình đã động viên, giúp đỡ và chia sẻ cùng với con trong thời gian qua.

Nguyễn Bá Phương Thảo

iii

TÓM TẮT

Enzyme amylase là một enzyme có thể tìm thấy ở rất nhiều sinh vật. Hiện nay,

ezyme này được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như nông nghiệp, công nghiệp

và y học. Mục tiêu đề tài là nghiên cứu khả năng tạo enzyme amylase của nấm

Aspergillus niger và Mucor và những yếu tố tác động đến khả năng tạo amylase của

chúng. Đề tài đã thu được một số kết quả về sự tác động của các yếu tố môi trường đến

khả năng sinh tổng hợp enzyme amylase từ nấm Aspergillus niger và Mucor.

Aspergillus niger khi sinh trưởng và tổng hợp enzyme amylase trên môi trường

bán rắn với cơ chất là cám gạo bổ sung thêm trấu và bã đậu nành chịu tác động của rất

nhiều yếu tố môi trường như tỷ lệ cơ chất, pH môi trường, thời gian nuôi cấy, nhiệt độ,

độ ẩm, nồng độ dinh dưỡng và tỷ lệ giống. Đề tài đã nghiên cứu sự tác động của các

yếu tố môi trường nêu trên đầu tiên là ở mức độ riêng lẻ từng yếu tố, sau đó là sự

tương tác qua lại của những yếu tố có ảnh hưởng mạnh đến sự tổng hợp enzyme. Kết

quả thu được cho thấy với những môi trường có tỷ lệ Cám gạo: trấu: bã đậu nành

(2:1:1), pH 5, thời gian nuôi cấy là 28 giờ, nhiệt độ 350C, độ ẩm 55%, 2 lần nồng độ

dinh dưỡng, tỷ lệ giống 0,8*108 bt/g là tối ưu cho Aspergillus niger sinh tổng hợp

amylase.

Khả năng tổng hợp enzyme amylase từ Mucor khi sinh trưởng trên môi trường

bán rắn với cơ chất là cám gạo bổ sung thêm trấu và bã đậu nành chịu tác động của rất

nhiều yếu tố môi trường như tỷ lệ cơ chất, pH môi trường, thời gian nuôi cấy, nhiệt độ,

độ ẩm, nồng độ dinh dưỡng và tỷ lệ giống. Đề tài đã nghiên cứu sự tác động của các

yếu tố môi trường nêu trên đầu tiên là ở mức độ riêng lẻ từng yếu tố, sau đó là sự

tương tác qua lại của những yếu tố có ảnh hưởng mạnh đến sự tổng hợp enzyme. Kết

quả thu được cho thấy với những môi trường có tỷ lệ Cám gạo: trấu: bã đậu nành

(2:1:1), pH 5, thời gian nuôi cấy là 32 giờ, nhiệt độ 300C, độ ẩm 55%, 3 lần nồng độ

dinh dưỡng, tỷ lệ giống 1,6*108 bt/g là tối ưu cho Mucor sinh tổng hợp amylase.

iv

SUMMARY

Enzyme amylase can be found in many living organisms. Nowadays, this is

applied in many domains, such as agriculture, industry and medicine. The purpose of

the survey is to find out Aspergillus niger and Mucor’s ability to produce enzyme

amylase, and some factors can affect this ability. Finally, the survey has some

following results

The first, for Aspergillus niger, they are born and grow up on semi-solid

environments including rice bran, rice rind, and soya residuum. Growing up and

biosynthesized enzyme ability of A. niger depend on environment factors, such as ratio

of rice bran to rice rind and to soya residuum, time, humidity, nutritious concentration,

and ratio of spore. The survey finds out affect of environment factors in individual of

each and compose of some factors, which have stronger affect. Results showed with

environments have ratio of rice bran to rice rind and to soya residuum is 2:1:1; after 28

hours at 350C with 55% humidity, double nutritious concentration and ratio of 0,8*108

spore to one g environment is the most suitable for Aspergillus niger to biosynthesize

enzyme amylase on semi-solid fermatable environment.

The second, for Mucor, they are born and grow up on semi-solid environments

including rice bran, rice rind, and soya residuum. Growing up and biosynthesized

enzyme ability of A. niger depend on environment factors, such as ratio of rice bran to

rice rind and to soya residuum, time, humidity, nutritious concentration, and ratio of

spore. The survey finds out affect of environment factors in individual of each and

compose of some factors, which have stronger affect. Results showed with

environments have ratio of rice bran to rice rind and to soya residuum is 2:1:1, after 32

hours at 300C with 55% humidity, treble nutritious concentration and ratio of 1,6*108

spore to one g environment is the most suitable for Mucor to biosynthesize enzyme

amylase on semi-solid fermatable environments.

v

MỤC LỤCTrang

LỜI CẢM ƠN iii

TÓM TẮT iv

SUMMARY v

MỤC LỤC vi

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT x

DANH SÁCH CÁC HÌNH xi

DANH SÁCH CÁC BẢNG xii

Chương 1 MỞ ĐẦU1

1.1. Đặt vấn đề 1

1.2. Yêu cầu 2

1.3. Nội dung............................................................................................................2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1. Giới thiệu sơ lược về enzyme 3

2.1.1. Khái niệm chung về enzyme 3

2.1.2. Tính chất ưu việt của enzyme 3

2.2. Tổng quan về enzyme amylase 4

2.2.1. Amylase 4

2.2.2. Phân loại 4

2.2.3. Đặc tính và cơ chế tác dụng của 3 loại amylase thông dụng 4

2.2.3.1. α-amylase 4

2.2.3.2. β-amylase 5

2.2.3.3. γ-amylase 6

2.2.4. Nguồn thu nhận 6

2.2.4.1. Thực vật 6

2.2.4.2. Vi sinh vật 7

2.2.5. Ứng dụng 7

2.2.5.1. Ứng dụng trong công nghệ thực phẩm 7

2.2.5.2. Trong công nghiệp dệt, giấy 8

vi

2.2.5.3. Trong y học 8

2.2.5.4. Trong nông nghiệp 9

2.2.5.5. Trong công nghệ tẩy rửa 9

2.2.6. Cơ chất của enzyme amylase 9

2.2.6.1. Tinh bột 9

2.2.6.2. Glycogen 11

2.3. Giới thiệu về nấm mốc Aspergillus niger và Mucor 12

2.3.1. Nấm mốc Aspergillus niger 12

2.3.2. Nấm mốc Mucor 13

2.4. Nuôi cấy vi sinh vật tổng hợp amylase 14

2.4.1. Sinh tổng hợp enzyme cảm ứng 14

2.4.2. Ảnh hưởng của các yếu tố dinh dưỡng 14

2.4.2.1. Nguồn carbon 14

2.4.2.2. Nguồn Nitơ 14

2.4.2.3. Các nguyên tố khoáng 15

2.4.2.4. Nhiệt độ nuôi cấy 16

2.4.2.5. pH ban đầu 16

2.4.2.6. Độ ẩm 16

2.4.2.7. Môi trường không khí 16

2.5. Môi trường lên men bán rắn 16

2.5.1. Cám gạo 16

2.5.2. Bã đậu nành 18

2.6. Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật sản xuất enzyme18

2.6.1. Phương pháp nuôi cấy bề mặt 18

2.6.2. Phương pháp nuôi cấy chìm19

2.7. Thu nhận enzyme từ môi trường nuôi cấy bề mặt 20

2.7.1. Trích ly enzyme từ môi trường nuôi cấy bề mặt 20

2.7.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình li trích 20

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

3.1. Thời gian và địa điểm thí nghiệm 21

3.2. Vật liệu thí nghiệm 21

3.2.1. Đối tượng thí nghiệm 21

vii

3.2.2. Cơ chất 21

3.2.3. Hóa chất và thiết bị 21

3.2.3.1. Hóa chất 21

3.2.3.2. Thiết bị 21

3.3. Phương pháp nghiên cứu 21

3.3.1. Phương pháp cấy truyền 21

3.3.2. Phương pháp nhân giống cấp 2 23

3.3.3. Phương pháp mô tả hình thái A. niger và Mucor 24

3.3.3.1. Quan sát hình thái đại thể 24

3.3.3.2. Quan sát hình thái vi thể 24

3.3.4. Xác định trực tiếp số lượng bào tử nấm sợi bằng buồng đếm hồng cầu24

3.3.5. Phương pháp xác định độ ẩm 25

3.3.6. Phương pháp lên men bán rắn để thu nhận enzyme amylase 26

3.3.7. Phương pháp xác định hàm lượng amylase 27

3.3.8. Phương pháp xác định hoạt tính amylase 29

3.3.9. Phương pháp quy hoạch thực nghiệm 30

3.3.10. Phương pháp bố trí và xử lí số liệu thí nghiệm 30

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31

4.1. Khả năng sinh tổng hợp amylase của nấm mốc Aspergillus niger31

4.1.1. Nấm mốc A. niger 31

4.1.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ cám gạo: bã đậu nành: trấu 31

4.1.3. Ảnh hưởng của pH 33

4.1.4. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy 35

4.1.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ 36

4.1.6. Ảnh hưởng của độ ẩm ban đầu 38

4.1.7. Ảnh hưởng của nồng độ dinh dưỡng 39

4.1.8. Ảnh hưởng của tỷ lệ giống 40

4.2. Khả năng sinh tổng hợp amylase của nấm mốc Mucor 42

4.2.1. Nấm mốc Mucor 42

4.2.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ cám gạo: bã đậu nành: trấu 43

4.2.3. Ảnh hưởng của pH 44

4.2.4. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy 45

viii

4.2.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ 47

4.2.6. Ảnh hưởng của độ ẩm ban đầu 49

4.2.7. Ảnh hưởng của nồng độ dinh dưỡng 50

4.2.8. Ảnh hưởng của tỷ lệ giống 52

4.3. Qui hoạch thực nghiệm 53

4.3.1. Xác định giá trị tối ưu của một số yếu tố ảnh hưởng 53

4.3.1.1. Xác định giá trị tối ưu của một số yếu tố ảnh hưởng đến A. niger 53

4.3.1.2. Xác định giá trị tối ưu của một số yếu tố ảnh hưởng đến Mucor 58

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 63

5.1. Kết luận 63

5.2. Đề nghị 63

TÀI LIỆU THAM KHẢO 64

PHỤ LỤC

ix

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

A. niger : Aspergillus niger

B : Bã đậu nành

bt : bào tử

C : Cám gạo

CT : Canh trường

UI : Unit International, đơn vị quốc tế

One-Way ANOVA : Phân tích phương sai một yếu tố

PGA : Potato glucose agar

Pt : phương trình

T : Trấu

TĐY : Kế hoạch thực nghiệm đầy đủ các yếu tố

UV : Ultraviolet

x

DANH SÁCH CÁC HÌNHTrang

Hình 2.1 Cấu trúc phân tử của amylose.............................................................10

Hình 2.2 Cấu trúc phân tử của amylopectin 10

Hình 2.3 Cấu trúc phân tử glycogen 11

Hình 4.1 Hình ảnh đại thể và vi thể của A. niger. 30

Hình 4.2 Hình ảnh đại thể và vi thể của Mucor. 42

Đồ thị 4.1 Hoạt tính và hàm lượng theo tỷ lệ cơ chất của A. niger. 31

Đồ thị 4.2 Hoạt tính và hàm lượng theo pH của A. niger. 33

Đồ thị 4.3 Hoạt tính và hàm lượng theo thời gian của A. niger 34

Đồ thị 4.4 Hoạt tính và hàm lượng theo nhiệt độ của A. niger...............................36

Đồ thị 4.5 Hoạt tính và hàm lượng theo độ ẩm của A. niger. 37

Đồ thị 4.6 Hoạt tính và hàm lượng theo nồng độ dinh dưỡng của A. niger. 38

Đồ thị 4.7 Hoạt tính và hàm lượng theo tỷ lệ giống của A. niger. 40

Đồ thị 4.8 Hoạt tính và hàm lượng thteo tỷ lệ cơ chất của Mucor. 42

Đồ thị 4.9 Hoạt tính và hàm lượng theo pH của Mucor.44

Đồ thị 4.10 Hoạt tính và hàm lượng theo thời gian của Mucor 45

Đồ thị 4.11 Hoạt tính và hàm lượng thteo nhiệt độ của Mucor.47

Đồ thị 4.12 Hoạt tính và hàm lượng theo độ ẩm cuả Mucor. 48

Đồ thị 4.13 Hoạt tính và hàm lượng theo các nồng độ dinh dưỡng của Mucor. 50

Đồ thị 4.14 Hoạt tính và hàm lượng theo các nồng độ giống của Mucor.........51

xi

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Trang

Bảng 2.1 Thành phần dinh dưỡng của cám gạo 17

Bảng 3.1 Các bước tiến hành tạo dung dịch albumin chuẩn 27

Bảng 4.1 Mã hóa các biến số các yếu tố ảnh hưởng đến A. niger 53

Bảng 4.2 Ma trận kế hoạch hóa đối với TĐY-24 của A. niger 53

Bảng 4.3 Hoạt lực amylase của A. niger theo thực nghiệm và pt hồi qui 53

Bảng 4.4 Mã hóa các biến số các yếu tố ảnh hưởng đến Mucor 57

Bảng 4.5 Ma trận kế hoạch hóa đối với TĐY-24 của Mucor 57

Bảng 4.6 Hoạt lực amylase của Mucor theo thực nghiệm và pt hồi qui 58

xii

Chương 1

MỞ ĐẦU

1.1. Đặt vấn đề

Enzyme là một loại protein đặc biệt được sinh vật tổng hợp nên và tham gia các

phản ứng sinh học, là thành phần không thể thiếu trong mọi tế bào sinh vật. Chúng

đóng vai trò quyết định mối quan hệ giữa cơ thể sống và môi trường sống.

Enzyme amylase có vai trò rất quan trọng trong nhiều ngành công nghiệp và

chữa trị bệnh, như công nghiệp thực phẩm, dệt, tẩy rửa, chữa bệnh kém tiêu hóa ở

người và trong ngành chế biến thức ăn gia súc…

Cuối thế kỉ 19 và suốt thế kỉ 20, ngành công nghiệp sản xuất enzyme đã rất phát

triển, ngày càng thiên về xu hướng sản xuất enzyme dựa vào hoạt động sống của vi

sinh vật vì nhiều lợi ích thiết thực. Công nghệ sản xuất enzyme đã và đang mang lại

những nguồn lợi lớn cho nhiều quốc gia trên thế giới.

Hiện nay, doanh thu từ việc sản xuất enzyme lên đến hơn 1,7 tỷ USD, trong đó

góp phần không nhỏ là lợi nhuận thu được từ enzyme amylase. Thị trường enzyme

công nghệ sẽ còn tiếp tục gia tăng trong tương lai đến. Ở nước ta, nhu cầu sử dụng các

chế phẩm enzyme trong đó có amylase trong chế biến thực phẩm, thức ăn gia súc và

trong các ngành công nghiệp khác ngày càng nhiều. Vì vậy, hằng năm, nước ta phải

nhập khẩu lượng lớn những nguồn enzyme này.

Ngày nay, việc tận dụng phế liệu trong công, nông nghiệp làm nguồn carbon để

sản xuất amylase bởi vi sinh vật bằng phương pháp lên men chìm và lên men bán rắn

rất được quan tâm ở nước ta và nhiều nước trên thế giới. Việt Nam là một nước nhiệt

đới có nền nông nghiệp lâu đời và đa dạng, đang trên đà phát triển. Vì vậy lượng phế

phẩm nông nghiệp thải ra ngày càng gia tăng, như cám gạo, bã đậu nành… là nguồn

cung cấp carbon thích hợp để cảm ứng nấm mốc sinh tổng hợp amylase bằng phương

pháp lên men bám rắn. Mặc khác, đây là cơ chất khá rẻ tiền và ổn định có tiềm năng

sử dụng để sản xuất amylase ở qui mô lớn.

Hiện nay, viện công nghệ sinh học nhiệt đới có một số chủng nấm mốc có khả

năng sinh tổng hợp enzyme amylase khá cao, trong đó có chủng Aspergillus niger và

Mucor. Tuy nhiên, để thu được enzyme amylase có hiệu suất cao chỉ cần chủng vi sinh

vật có khả năng tạo ezyme amylase cao là chưa đủ. Các vi sinh vật đó cần phải được

1

nuôi trên môi trường cơ chất thích hợp có khả năng cảm ứng kích thích chúng sinh

amylase. Môi trường nuôi cấy cần được bổ sung thêm những nồng độ dinh dưỡng và

các vi sinh vật phải được nuôi ở nhiệt độ thích hợp. Cuối cùng, thời gian thu nhận dịch

chiết enzyme từ canh trường nuôi cấy cũng sẽ ảnh hưởng rất lớn đến hàm lượng và

hoạt tính amylase thu được.

Trên cơ sở đó, chúng tôi chọn đề tài “Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến

khả năng sinh tổng hợp enzyme amylase từ nấm mốc Aspergillus niger và Mucor trên

môi trường lên men bán rắn” nhằm xây dựng điều kiện môi trường tối ưu cho hai

chủng nghiên cứu tạo enzyme nhiều và có hoạt tính cao cũng như điều kiện để thu

nhận enzyme tốt nhất. Đề tài đã được thực hiện tại phòng các chất có hoạt tính sinh

học - viện Sinh Học Nhiệt Đới, thành phố Hồ Chí Minh.

1.2. Yêu cầu

- Xác định các giá trị tối ưu của các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến

khả năng sinh tổng hợp enzyme amylase của hai chủng thí nghiệm.

- Xác định mối tương quan giữa các yếu tố môi trường có tác động mạnh

đến khả năng tổng hợp amylase của hai chủng thí nghiệm.

1.3. Nội dung

- Khảo sát khả năng tổng hợp amylase của hai chủng thí nghiệm.

- Khảo sát sự ảnh hưởng của các yếu tố như tỷ lệ cơ chất, độ ẩm, nhiệt

độ nuôi cấy, thời gian nuôi cấy, pH môi trường ban đầu, nồng độ dinh dưỡng,

và tỷ lệ giống đến khả năng sinh tổng hợp amylase của hai chủng thí nghiệm.

- Tối ưu hóa các yếu tố trên bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm

nhằm tìm ra điều kiện nuôi cấy và thành phần môi trường tối ưu cho hai chủng

trên sinh ra lượng amylase cao.

2

Chương 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Giới thiệu sơ lược về enzyme

2.1.1. Khái niệm chung về enzyme

Enzyme là một chất xúc tác sinh học chỉ được tạo ra trong tế bào sinh vật, và

đóng vai trò quan trọng không thể thiếu được trong quá trình trao đổi chất của cơ thể

sinh vật. Tất cả các phản ứng chuyển hóa các chất trong cơ thể sinh vật đều có sự tham

gia xúc tác của enzyme. Enzyme không chỉ tham gia xúc tác các phản ứng trong tế bào

mà ngay cả ngoài tế bào của vi sinh vật. Điều này có ý nghĩa quan trọng trong việc

ứng dụng enzyme vào nhiều lĩnh vực khác nhau của công nghiệp và đời sống.

Enzyme có bản chất là protein có khả năng xúc tác đặc hiệu cho các phản ứng

hóa học và làm chất xúc tác sinh học. Dưới tác dụng của enzyme các phản ứng hóa

sinh trong cơ thể sinh vật xảy ra rất nhanh, không cần những điều kiện về nhiệt độ, áp

suất, nồng độ các chất một cách quá khắc nghiệt. Tên enzyme được bắt nguồn từ chữ

Hy Lạp có nghĩa là “chất trong con men”. Tất cả quá trình biến đổi hóa sinh đều xảy ra

dưới tác dụng của hệ men.

Nếu cơ thể thiếu enzyme thì các quá trình chuyển hóa hóa sinh sẽ bị đình chỉ,

sinh vật không thể sống, sinh trưởng, phát triển và sinh sản bình thường. Sự sống của

sinh vật sẽ không tồn tại.

Ngày nay, enzyme còn đóng vai trò quan trọng trong các hoạt động sản xuất

công nghiệp và ngày càng có nhiều những nghiên cứu và ứng dụng enzyme vào trong

các lĩnh vực khoa học, công nghiệp, kinh tế quốc dân, vân vân.

2.1.2. Tính chất ưu việt của enzyme

Thứ nhất, enzyme có thể thu nhận được từ nhiều nguồn khác nhau như động

vật, thực vật, và vi sinh vật, và hầu như các enzyme không có tính chất độc hại.

Thứ hai, chúng có thể hoạt động xúc tác phản ứng trong điều kiện nhiệt độ bình

thường, áp suất thường, pH acid yếu, kiềm yếu hay trung tính.

Thứ ba, tính đặc hiệu của enzyme cao hơn hẳn các xúc tác khác, và chỉ có tác

dụng lên những cơ chất nhất định và theo một kiểu phản ứng nhất định.

3

Thứ tư, vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác có thể dễ dàng điều chỉnh thậm chí

ngừng phản ứng bằng cách tác động vào các yếu tố như: nhiệt độ, pH, các chất kiềm

hãm, chất hoạt hóa, nồng độ cơ chất, nồng độ enzyme, vân vân (Lê Ngọc Tú, 2002).

Cuối cùng, cường lực xúc tác của enzyme cao hơn hẳn các chất xúc tác thông

thường, nên chỉ cần một lượng nhỏ có thể chuyển hóa một lượng lớn cơ chất trong thời

gian ngắn. Đây là điều các chất xúc tác hóa học khó có thể làm được.

2.2. Tổng quan về enzyme amylase

2.2.1. Amylase

Amylase là enzyme được dùng rất thông dụng trong các ngành sản xuất, chế

biến, đặc biệt là trong ngành công nghiệp thực phẩm. Enzyme này cũng rất phổ biến

trong thế giới sinh vật. Các enzyme amylase đều thuộc nhóm enzyme thủy phân, xúc

tác phân giải các liên kết nội phân tử trong polysaccharide với sự tham gia của nước.

R.R’ + H-OH RH + R’OH

Amylase thủy phân tinh bột, glycogen, và dextrin thành glucose, maltose và

dextrin giới hạn. Hệ enzyme này có trong nước bọt, dịch tiêu hóa của người, động vật,

trong hạt nảy mầm, nấm mốc, nấm men và vi khuẩn. Amylase bao gồm nhiều enzyme

khác nhau về tính đặc hiệu tác dụng lên tinh bột (cắt tinh bột tại những vị trí khác nhau

trên mạch tinh bột).

2.2.2. Phân loại

Hiện nay, amylase được phân thành 6 loại, gồm có α-amylase, β-amylase, γ-

amylase hay glucoamylase (thủy phân các liên kết α-1,4-glucoside của tinh bột và các

polysaccharide đồng loại), dextrin-6-glucanhydrolase, amylopectin-6-glucanhydrolase

và oligodextrin-6-glucanhydrolase (hay dextrinnase thủy phân các liên kết oligodextrin

α-1,6-glucoside trong polysaccharide và các dextrin cuối).

2.2.3. Đặc tính và cơ chế tác dụng của 3 loại amylase thông dụng

2.2.3.1. α-amylase

α-amylase dễ tan trong nước, trong các dung dịch muối và rượu loãng. Protein của α-

amylase có tính chất acid yếu và tính chất của globuline. Điểm đẳng điện nằm trong

vùng pH 4,2 – 5,7. α-amylase là một metaloenzym, chứa từ 1 đến 30 nguyên tử gam

Ca/mol. Khi tách hoàn toàn Ca ra khỏi enzyme thì α-amylase mất hết khả năng thủy

phân cơ chất. α-amylase bền với nhiệt độ hơn so với các amylase khác. Độ bền với tác

4

dụng acid thì α-amylase của nấm mốc bền vững hơn so với α-amylase của malt và vi

khuẩn. Tất cả α-amylase đều bị kìm hãm bởi kim loại nặng (Cu2+, Ag+, Hg2+, vân vân).

Cơ chế tác dụng của α-amylase là phân cắt các liên kết α-1,4 glucoside ở bất kì

vị trí nào trong phân tử tinh bột, glycogen và các polysaccharide. Dưới tác dụng của

enzyme α-amylase tinh bột có thể chuyển hóa thành maltose, glucose và các dextrin có

phân tử lượng thấp, nhưng thông thường thì α-amylase chỉ thủy phân tinh bột chủ yếu

thành dextrin có phân tử lượng thấp, maltose và một ít glucose (Nguyễn Đức Lượng,

2004). Do vậy α-amylase có tác dụng làm giảm độ nhớt của dung dịch hồ tinh bột rất

mạnh (dịch hóa).

Sơ đồ thủy phân tinh bột bằng α-amylase:

α-amylase

Tinh bột (hoặc glycogen) --------------> α-dextrin + maltose + glucose + H2O

2.2.3.2. β-amylase

β-amylase khác với α-amylase, nó hầu như không thủy phân hạt tinh bột

nguyên vẹn mà thủy phân mạnh mẽ hồ tinh bột. β-amylase không bền khi có Ca2+, β-

amylase bị kiềm hãm bởi Cu2+, Hg+, urea, iodoacetamide, iodine, ozon… chịu nhiệt

kém hơn α- amylase nhưng bền với acid hơn. β-amylase bị vô hoạt ở nhiệt độ 700C,

hoạt động tối ưu ở 550C, pH từ 5,1 đến 5,5.

Enzyme này xúc tác sự thủy phân các liên kết α-1,4 glucan trong tinh bột,

glycogen và polysaccharide đồng loại, phân cắt tuần tự từng gốc maltose một từ đầu

không khử của mạch. β-amylase phân giải 100% amylose thành maltose và phân giải

54 - 58% amylopectin thành maltose. Quá trình thủy phân được tiến hành từ đầu

không khử của các nhánh ngoài cùng. Mỗi nhánh ngoài cùng có từ 20 – 26 gốc

glucose nên tạo được từ 10 – 12 phân tử maltose. Khi gặp liên kết α-1,4 glucoside

đứng kế cận liên kết α-1,6 glucoside thì β-amylase ngừng tác dụng. Phần

polysaccharide còn lại là dextrin phân tử lớn có chứa rất nhiều liên kết α-1,6 glucoside

cho màu tím đỏ với iodine. Độ nhớt của dung dịch giảm chậm.

Tác dụng của β-amylase lên tinh bột có thể được diễn tả theo sơ đồ sau:

β-amylase

Tinh bôt (glycogen) ------------> maltose (54 – 58%) + β-dextrin (42- 46%)

Nếu cho đồng thời cả α-amylase và β-amylase cùng tác dụng lên tinh bột thì

tinh bột bị thủy phân tới 95%. (Nguyễn Đức Lượng, 2004).

5

2.2.3.3. γ-amylase (hay gluoamylase hoặc α-1,4 glucan-glucanhydrolase)

γ-amylase có khả năng thủy phân hoàn toàn tinh bột, glycogen, amylopectin,

dextrin, panose, isomaltose và maltose thành glucose mà không cần có sự tham gia của

các enzyme amylase khác. γ-amylase là enzyme ngoại bào, có nhiều tên gọi khác

nhau: glucoamylase, amyloglucozidase, taka-amylase B, maltulase…Đa số γ-amylase

đều thuộc loại enzyme “acid”. γ-amylase có hoạt lực cao nhất ở vùng pH từ 3,5 – 5,5

và nhiệt độ 500C. γ-amylase bền với acid hơn α-amylase, nhưng lại kém bền hơn dưới

tác dụng của rượu etylic, aceton không được bảo vệ bằng Ca2+. Glucoamylase xúc tác

phản ứng thủy phân liên kết α-1,4 lẫn α-1,6 glucoside, glucoamylase còn có khả năng

thủy phân các liên kết kết α-1,2 và liên kết α-1,3 glucoside. Điểm đẳng điện của γ-

amylase từ các nguồn khác nhau cũng không đồng nhất. Đa số glucoamylase đã biết

đều thuộc loại enzyme “acid”, thể hiện hoạt lực tối đa ở vùng pH từ 3,5 đến 5,5. So với

α-amylase, glucoamylase bền đối với acid hơn, nhưng lại kém bền dưới tác dụng của

rượu và aceton do không được bảo vệ bởi Ca2+.

Dây là enzyme thủy phân liên kết α-1,4 lẫn α-1,6 glucoside. Khi thủy phân liên

kết α-1,4 glucan trong chuỗi polysaccharide, γ-amylase tách lần lượt từng phân tử

glucose ra khỏi đầu không khử của mạch để tạo ra glucose. Sự thủy phân tinh bột được

thực hiện theo cơ chế “đa mạch” mà không phải theo cơ chế “đơn mạch”.

Fukumoto đề nghị chia γ-amylase của vi sinh vật làm hai loại theo khả năng

thủy phân tinh bột của chúng. Đó là enzyme kiểu Rhizopus delemar và enzyme kiểu

Aspergillus niger (Nguyễn Đức Lượng, 2004).

Sơ đồ thủy phân glucid bởi glucoamylase:

γ-amylase kiểu Rh.delemar

Tinh bột hay oligosaccharide -------------> 100% glucose. (có các liên kết α-1,4 và α-1,6)

γ-amylase kiểu Asp.niger Tinh bột hay oligosaccharide -------------> 80 – 85% glucose + oligosaccharide.

2.2.4. Nguồn thu nhận

2.2.4.1. Thực vật

Từ lâu con người đã biết cách sử dụng amylase từ hạt nảy mầm để sử dụng

trong ngành chế biến thực phẩm (mạch nha), nước giải khát (bia), hoặc sản suất chế

6

phẩm hỗn hợp bột enzyme để bổ sung vào chế phẩm bột dinh dưỡng dành cho trẻ em,

người già và những người bị suy tiêu hóa. Ở thực vật, nguồn amylase được thu nhận từ

những hạt nảy mầm, đặc biệt là ở hạt ngũ cốc nảy mầm.

2.2.4.2. Vi sinh vật

Ngày nay, do ưu thế về nhiều mặt, vi sinh vật đã trở thành nguồn thu enzyme

chủ đạo. Hiện nay, có rất nhiều loại vi sinh vật có khả năng tổng hợp được enzyme

amylase đã được nghiên cứu và đưa vào sản xuất. Những chủng vi sinh vật này thường

được phân lập từ tự nhiên. Những chủng tạo amylase nhiều hơn cả là nấm sợi, nấm

men, vi khuẩn và xạ khuẩn.

Để thu nhận enzyme amylase người ta thường dùng các giống nấm sợi

Aspergillus, Rhizopus. Nhiều loài thuộc giống này (A. orizae, A. niger, A. usamii) và

một số loài của Neurospora và Mucor sinh tổng hợp rất mạnh mẽ loại enzyme này.

Nấm men và giả nấm men thuộc các giống Candida, Saccharomysec.

Endomycopis, Endomyces cũng tạo nên nhiều enzyme amylase.

Nhiều vi khuẩn cũng có khả năng tạo lượng lớn amylase như Bac. Polymyxa,

Phytomonas dptructans, Bact. casavanum,… Các vi khuẩn ưa nhiệt có khả năng sinh

trưởng nhanh gấp 4 - 6 lần vi khuẩn ưa ẩm và sinh trưởng tốt nhất từ 65 0 - 700C, và tạo

amylase mạnh nhất ở 500C. Vì vậy mà loại vi khuẩn này thường được nuôi cấy ở 700C

để làm giống và nuôi thu enzyme ở 500C.

Trong xạ khuẩn hiếm gặp loài nào có khả năng sinh tổng hợp amylase mạnh

mẽ, tuy nhiên cũng có một số ít xạ khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzyme này như

Micromonospora vulgaris.

2.2.5. Ứng dụng

Chế phẩm amylase dạng thô hay tinh khiết được ứng dụng khá rộng rãi trong

công nghiệp, đặc biệt là trong công nghiệp thực phẩm (sản xuất rượu bia, bánh mì,

bánh ngọt, đường mật tinh bột, vân vân).

2.2.5.1. Ứng dụng trong công nghệ thực phẩm

Trong công nghệ rượu bia việc sử dụng amylase từ vi sinh vật trong công

nghiệp sản xuất rượu bia thay cho malt đã tiết kiệm được hàng vạn tấn nguyên liệu

(đại mạch) loại tốt, giúp giảm giá thành và rút ngắn quy trình sản xuất, tiết kiệm công

sức, tiền bạc. Biện pháp thay enzyme chế phẩm cho malt có ý nghĩa đặc biệt quan

trọng. Việc này giúp giảm giá thành mà chất lượng sản phẩm vẫn không bị thay đổi.

7

Đặc biệt là đối với ngành công nghiệp bia của nước ta do hiện nay việc gieo trồng đại

mạch trong nước chưa mang lại nhiều kết quả, nên nước ta vẫn phải nhập malt từ nước

ngoài với giá thành cao. Vì vậy nếu sử dụng enzyme amylase từ vi sinh vật sẽ góp

phần làm giảm giá nguyên liệu và giảm sự phụ thuộc vào việc nhập khẩu malt.

Trong sản xuất bánh mì sử dụng enzyme amylase có tác dụng rút ngắn quá

trình lên men, tăng nhanh thể tích bánh mì, làm tăng mùi thơm của bánh, màu sắc của

bánh đẹp hơn và tăng độ xốp của bánh. Trong sản xuất bánh ngọt, nếu thêm chế phẩm

amylase vào bột sẽ xảy ra quá trình thủy phân bột thành đường, do đó giảm lượng

nguyên liệu tiêu tốn cho sản xuất.

Trong sản xuất mật, tinh bột, maltose, glucose nhu cầu sử dụng enzyme

amylase cũng ngày càng cao. Ban đầu các sản phẩm mật, tinh bột thường được sản

xuất theo phương pháp thủy phân tinh bột bằng acid hoặc malt. Ngày này, qui trình

này được thực hiện nhờ chế phẩm amylase. Chế phẩm enzyme amylase ứng dụng rất

hiệu quả trong sản xuất tinh bột, glucose, và các loại mật tinh bột. Khi thủy phân tinh

bột bằng acid không cho phép sản xuất các loại đường mật theo ý muốn, bởi vì khi đó

phân tử tinh bột bị thủy phân vô trật tự và không thể điều chỉnh được tỷ lượng của các

cấu tử của dịch thủy phân. Phẩm chất của đường mật, tính chất hóa lí … của chúng lại

phụ thuộc vào tỷ lượng của các cấu tử chính này. Khi thủy phân tinh bột bằng chế

phẩm enzyme sẽ không giống như thủy phân bằng acid, không xảy ra sự thủy phân các

hợp chất lẫn trong tinh bột nên làm dịch thủy phân tốt hơn, dễ dàng tinh chế hơn.

2.2.5.2. Trong công nghiệp dệt, giấy

Trong công nghiệp dệt, amylase được sử dụng để rũ hồ vải, tẩy lớp hồ bột trên

vải làm vải mịn, mềm, dễ tẩy trắng và dễ bắt màu khi nhuộm. Xử lí vải bằng phương

pháp ezyme tốt hơn rất nhiều so với việc xử lí bằng các chất hóa học. Xử lí vải bằng

enzyme không chỉ nhanh mà còn giữ được độ bền, độ dai, không hại vải, độ mao dẫn

tốt và đảm bảo vệ sinh. Do vậy tăng được năng suất lao động.

2.2.5.3. Trong y học

Amylase được dùng phối hợp với các coenzyme A, cytocrom C, carbonxydase

để chế thuốc điều trị các bệnh tim mạch, bệnh thần kinh, phối hợp với enzyme thủy

phân để chữa bệnh thiếu enzyme tiêu hóa. Ngoài ra chế phẩm enzyme amylase dùng

để điều chế môi trường nuôi vi sinh vật phục vụ cho công tác nghiên cứu khoa học

cũng như chẩn trị bệnh.

8

2.2.5.4. Trong nông nghiệp

Chế phẩm enzyme amylase được sử dụng riêng lẻ hay phối hợp với các enzyme

khác như protease, hemicellulase, cellulase, vân vân để sản xuất các loại thức ăn dễ

tiêu hóa, hấp thu trong chăn nuôi gia súc, gia cầm, đặc biệt là gia súc non.

Trong chế biến thức ăn gia súc, thành phần ngũ cốc chiếm một khối lượng rất

lớn. Trong khối lượng này, thành phần tinh bột rất cao. Để tăng hiệu suất sử dụng năng

lượng từ nguồn tinh bột, người ta thường cho thêm enzyme amylase vào. Enzyme

amylase sẽ tham gia phân giải tinh bột tạo thành đường, giúp cho quá trình chuyển hóa

tinh bột tốt hơn. Sử dụng thức ăn có bổ sung chế phẩm enzyme sẽ làm tăng khả năng

hấp thu, tiêu hóa, do đó làm giảm lượng thức ăn, tăng trọng nhanh, tăng khả năng sinh

sản, chống bệnh tật, vân vân.

Có thể sử dụng các loại chế phẩm enzyme amylase để chuyển hóa các phế liệu,

đặc biệt là các phế phẩm nông nghiệp, cải tạo đất phục vụ nông nghiệp. Đây cũng là

hướng mới trong nghiên cứu và ứng dụng tại nhiều quốc gia.

2.2.5.5. Trong công nghệ tẩy rửa

Enzyme α-amylase của vi khuẩn là những enzyme không bền nhiệt và pH kiềm

trong thời gian lâu nên chúng thường được bao lại rồi trộn chung với các thành phần

của chất tẩy rửa để bảo quản lâu và tăng khả năng hoạt động của chúng. Các enzyme

vi khuẩn sẽ làm cho các vết bẩn carbonhydrate trong quần áo dễ phân giải hơn.

Thường những enzyme này được lấy từ vi khuẩn do chúng có khả năng chịu được

nhiệt độ cao và pH kiềm lâu hơn.

2.2.6. Cơ chất của enzyme amylase

2.2.6.1. Tinh bột

Tinh bột là một chất bột vô định hình, màu trắng, không tan trong nước lạnh

nhưng khi đun nóng sẽ có khả năng tan trong nước. Tinh bột là carbonhydrate ở

thực vật chủ yếu trong các loại củ như khoai mì, khoai tây, khoai lang.., và là chất dự

trữ năng lượng quan trọng.

Mặc dù tinh bột lấy từ các nguồn khác nhau không hoàn toàn giống nhau, song

từ năm 1940, Meyer đã biết rằng tinh bột mọi nguồn đều có cấu tạo từ amylose và

amylopectin.

Dưới tác dụng của enzyme amylase, tinh bột bị thủy phân do các liên kết

glucoside bị phân cắt. Khi tác dụng với iod tinh bột cho màu tím xanh đặc trưng.

9

Cấu tạo của tinh bột là polysaccharide bậc hai, đồng thể (homopolysaccharide

hay homoglucan). Công thức tổng quát là (C6H10O5)n, cấu tạo từ những đơn vị cơ sở là

α-D-glucose. Liên kết với nhau bằng liên kết 1,4 glucoside và liên kết 1,6 glucoside.

Tinh bột tồn tại hai cấu tử: amylose và amylopectin có cấu tạo và tính chất khác nhau.

Tuy nhiên đa phần tinh bột đều có khoảng 20 - 30% amylose và phần còn lại là

amylopectin.

Amylose

Hình 2.1 Cấu trúc phân tử của amylose. (Wikipedia.com).

Có trọng lượng phân tử khoảng 50.000 đến 160.000 dalton, được cấu tạo từ

khoảng 200 - 1000 phân tử D-glucose nối với nhau bởi liên kết α-1,4 glucoside

(carbon ở vị trí thứ nhất của glucose sẽ liên kết với carbon ở vị trí thứ 4 của glucose kế

cận), tạo thành 1 chuỗi mạch thẳng. Vì vậy amylase còn được gọi là tinh bột mạch

thẳng. Do cấu tạo nên cấu hình không gian của amylose sẽ cuộn lại thành vòng xoắn

ốc, mỗi xoắn ốc sẽ gồm có 6 đơn vị glucose, khi cho dung dịch iod vào trong tinh bột

thị iod sẽ chiếm vị trí trung tâm của xoắn ốc tạo thành phức chất có màu xanh, đây là

phản ứng đặc trưng của amylose. Khi đun nóng thì mạch amylose nhận thêm một năng

lượng nên duỗi thẳng ra không còn xoắn ốc nên phức chất tinh bột iod không còn nữa

và màu xanh sẽ biến mất.

Amylopectin

H

Hình 2.2 Cấu trúc phân tử của amylopectin. (Wikipedia.com.).

10

Có trọng lượng phân tử khoảng vài triệu dalton, được cấu tạo từ khoảng 600

đến 6000 phân tử D-glucose, nối với nhau bởi liên kết α-1,4 glucoside và liên kết α-1,6

glucoside tạo thành mạch có nhiều nhánh.

Amylopectin cho màu tím đỏ với iod, hòa tan trong nước nóng cho dung dịch

có độ nhớt cao. Thủy phân tinh bột nhẹ nhàng với amylase, hay acid loãng thời gian

ngắn sẽ tạo thành dextrin, một ít maltose, glucose. Thủy phân thời gian lâu hơn với

acid hoặc enzyme với nhiệt độ cao hơn sẽ tạo nhiều maltose và glucose hơn.

2.2.6.2. Glycogen

Hình 2.3 Cấu trúc phân tử glycogen. (Wikipedia.com).

Glycogen là một loại carbonhydrate dự trữ ở cơ thể động vật và được cơ thể

động vật chuyển hóa từ từ để sử dụng. Amylase có vai trò quan trọng trong chuyển

hóa glucid ở tế bào động vật, vi sinh vật. Glycogen có cấu tạo tương tự như

amylopectin nhưng có mạch nhánh nhiều hơn, phân tử lượng khoảng 2 triệu đến 3

triệu dalton. Glycogen dễ tan trong nước. Ở động vật và người, glycogen tập trung chủ

yếu ở gan và bắp thịt.

11

2.3. Giới thiệu về nấm mốc Aspergillus niger và Mucor

2.3.1. Nấm mốc Aspergillus niger

Aspergillus niger cấu tạo dạng sợi, sinh bào tử (bào tử hở / bào tử ngoại sinh)

và không có diệp lục, sử dụng nguồn hữu cơ có sẵn để sinh sống. Aspergillus niger có

trong đất, xác bã thực vật và hoa quả vùng nhiệt đới. Van Tieghem là người đầu tiên

phát hiện và phân lập chủng nấm mốc Aspergillus niger từ quả, hạt, đặc biệt là hạt đậu

phộng, bồ đào, dừa…( Lương Đức Phẩm, 2004).

Vị trí phân loại của A. niger

Lớp : Deuteromyces.

Bộ : Moniliales.

Họ : Monilaceace.

Giống: Aspergillus.

Nhóm: Aspergillus niger.

A. niger thuộc loại nấm sợi đa bào. Đầu sợi nấm sinh sản phình to ra tạo thành

tế bào hình chai và các chuỗi đỉnh bào tử. Cuống của đỉnh bào tử đơn bào, tế bào hình

chai và chuỗi đỉnh bào tử toả đều trên đầu sợi nấm sinh sản như những tia nước đi từ

xa vào vòi tưới. Cuống sinh bào tử được sinh ra từ khuẩn ty khí sinh, có chiều dài từ 1

đến 3 mm, có vách tế bào trơn bóng và trong suốt. Đỉnh cuống phình ra có dạng hình

cầu được gọi là bọng, có đường kính từ 50 – 75 µm, sinh ra hai lớp thể bình. Lớp thứ

nhất hình tam giác cân ngược, lớp thứ hai hình chai. Bào tử hình cầu, dạng bào tử đính

có đường kính 4 – 5 µm, có màu nâu đen, vách bào tử đính có dạng xù xì.

Loài nấm sợi này sinh trưởng ở nhiệt độ tối thiểu là 6 - 8oC, tối đa là 45 - 470C,

tối ưu là 30 - 370C, sinh trưởng trong môi trường có độ ẩm tối thiểu là 23%. Độ ẩm

môi trường thích hợp để lên men bán rắn là 50 - 65%, chỉ sinh trưởng và phát triển

trong sự có mặt của O2 và pH tối ưu từ 4 - 6,5. A. niger là nấm sợi chịu khô, bào tử

đính có thể nảy mầm trong điều kiện môi trường có thế nước 0,77 ở 35 0C. A. niger có

thể sinh trưởng ở pH 2 trong điều kiện có thế nước cao.

A. niger được xem là nấm sợi không sinh độc tố và được sử dụng rộng rãi trong

chế biến thực phẩm. Các enzyme thuỷ phân thu nhận từ chủng này không gây đột biến

12

vi khuẩn và các mô của chuột. Tuy nhiên, theo thông tin gần đây, có 2 trong số 19

chủng A. nger được phân lập sinh ra ochratoxin A (Abraca, 1994).

Loài nấm này chiếm ưu thế ở vùng khí hậu nhiệt đới. Bào tử đính màu đen nên

không chịu ảnh hưởng từ mặt trời và tia UV. A. niger thường được phân lập từ các

thực phẩm phơi nắng như cá, cây gia vị…

2.3.2. Nấm mốc Mucor

Nấm mốc Mucor là nấm đơn bào cấu tạo dạng sợi, sinh bào tử. Bào tử được tạo

thành trong các túi (bào tử nang) và thuộc loại bào tử nội sinh. Cuống bào tử nang có

phân nhánh và mọc lên từ bất kì chỗ nào của sợi nấm (Lương Đức Phẩm, 2004).

Vị trí phân loại của nấm Mucor

Lớp : Zygomycetes

Bộ : Mucorales

Họ : Mucoraceace

Giống: Mucor

Mucor là giống lớn nhất trong bộ Mucorales. Chúng bao gồm các loài: M.

mucedo, M. cremois, M. rouxii, M. hiemalis, M. silvaticus, M. subtilis,… Mucor là

một loại nấm phát triển rộng rãi, thường tìm thấy trong đất, phân bón, trái cây, bánh

mì, và những thực phẩm giàu tinh bột khác. Chúng phát triển tốt trong điều kiện hiếu

khí. Ở điều kiện yếm khí Mucor. sppr phân tách thành những sợi nấm nhỏ hình tròn

hay hình bầu dục và nảy chồi, vì thế người ta hay gọi loài này là men của nấm mốc.

Chúng có khả năng sử dụng một cách hiếu khí nhiều nguồn carbon, lên men

carbonhydrate, có thể sử dụng ammoniac hay nitơ hữu cơ cho quá trình sinh trưởng, và

còn có thể phát triển trên một thang nhiệt độ rộng. Vì thế chúng có mặt trên nhiều loại

môi trường, bao gồm nhiều loại thức ăn khác nhau.

Nấm Mucor có thể được phân biệt với các loại nấm khác qua các điểm đặc biệt

của khuẩn ty (không có vách ngăn), nang bào tử (hình thành trên tất cả các bộ phận khí

sinh của nấm), nang trụ hình nón, trụ, hoặc hình quả lê, bào tử đều, bóng loáng, không

có thân bò và rễ giả.

Mucor. spp có vai trò quan trọng trong một số quy trình sản xuất công nghệ

thực phẩm, chúng thúc đẩy quá trình chín của phomai hoặc một số thực phẩm Á Đông

như chao, tương, đường hoá các giai đoạn đầu của quá trình lên men bia, rượu.

13

2.4. Nuôi cấy vi sinh vật tổng hợp amylase

2.4.1. Sinh tổng hợp enzyme cảm ứng

Một quá trình sinh tổng hợp enzyme được gọi là cảm ứng nếu nó chỉ xảy ra ở

mức độ đáng kể khi trong môi trường có cơ chất đặc hiệu của enzyme này hoặc các

chất có cấu trúc tương tự cơ chất. Các cơ chất này được gọi là các chất cảm ứng, và

enzyme chỉ được tạo ra khi có chất cảm ứng gọi là enzyme cảm ứng. Amylase cũng là

một enzyme thuộc hệ enzyme cảm ứng. Enzym amylase chỉ được sinh ra khi nấm mốc

sinh trưởng trên môi trường có chứa tinh bột.

2.4.2. Ảnh hưởng của các yếu tố dinh dưỡng đối với quá trình sinh tổng hợp

enzyme amylase

2.4.2.1. Nguồn carbon

Để vi sinh vật tổng hợp enzyme amylase, trong môi trường nhất thiết phải có

chất cảm ứng là tinh bột. Tinh bột trong môi trường có thể là cám gạo, cám mì,…

Những loài sinh vật khác nhau sẽ có những nguồn cảm ứng khác nhau. Từ những chất

cảm ứng đó vi sinh vật sẽ tạo ra enzyme có hoạt tính khác nhau.

Các nguồn carbon khác như Glucose, Cellobiose, Acetat, Citrat, Oxalate,

Succinat và những sản phẩm trung gian của chu trình Krebs, nếu trong môi trường có

ở nồng độ rất ít sẽ kích thích vi sinh vật phát triển và tạo enzyme. Nhưng nếu ở nồng

độ cao sẽ có tác dụng ngược lại, kìm hãm sự tạo thành amylase.

2.4.2.2. Nguồn Nitơ

Hoạt tính của enzyme sẽ thay đổi rất nhiều nếu ta thay đổi các thành phần chính

của môi trường, đặc biệt là nguồn nitơ. Nitrat là nguồn nitơ vô cơ thích hợp nhất đối

với các vi sinh vật. NaNO3 là nguồn nitơ dinh dưỡng để nuôi nhiều loại nấm sợi tạo

amylase, ngoài ra còn có các muối khác như NH4NO3, Mg(NO3)2, (NH4)2SO4.... Cho

nguồn nitơ nhất định vào môi trường có thể kích thích tổng hợp amylase này và ức chế

tổng hợp amylase khác. Theo mức độ tiêu thụ muối, môi trường sẽ chuyển dịch mạnh

về phía tổng hợp glucoamylase và ức chế tổng hợp α-amylase.

Sự tạo amylase cực đại thường thấy ở các nồng độ nitơ cao (0,25 – 0,4 %). Khi

làm môi trường nuôi cấy nấm mốc tạo amylase thường dùng NaNO3 là tốt nhất. Cũng

có thể bổ sung nitơ hữu cơ (gelatin, casein, nước chiết ngô) để nấm sinh trưởng tốt,

nhưng lại không có tác dụng kích thích tạo amylase. Thêm nước chiết mầm mạch hay

14

nước chiết ngô cũng như các amino acid riêng rẽ sẽ làm tăng sinh tổng hợp α-amylase

ngoại bào, song hiệu quả không bằng NaNO3 (Nguyễn Đức Lượng, 2004).

Tính cân bằng của môi trường dinh dưỡng về carbon và nitơ có ý nghĩa lớn đối

với sinh tổng hợp sinh khối vi sinh vật và sự tạo thành amylase. Chỉ khi nào trong môi

trường có đủ lượng carbon và nitơ cần thiết thì vi sinh vật mới có khả năng tích lũy

amylase cực lớn. Sự thiếu hụt cấu tử này không thể bù đắp bằng sự thừa cấu tử kia.

Thông thường, tỉ lệ carbon gấp từ 1 đến 40 lần hàm lượng nitơ trong môi trường là

thích hợp nhất. Trong môi trường Zapeck thì tỉ lệ này là 18 : 1.

2.4.2.3. Các nguyên tố khoáng

Các nguyên tố khoáng đa lượng và vi lượng có ảnh hưởng lớn tới sinh trưởng

và tổng hợp các enzyme amylase của vi sinh vật. Và các nguyên tố khoáng này cần

được bổ sung vào môi trường theo tỷ lệ thích hợp để kích thích sự sinh tổng hợp

amylase. Nếu môi trường thiếu hoặc thừa khoáng đều có ảnh hưởng đến sự tạo enzyme

của các vi sinh vật.

Mg2+ có ảnh hưởng đến độ bền nhiệt. Thiếu MgSO4 sẽ có ảnh hưởng xấu đến sự

tổng hợp enzyme amylase của nấm sợi. Khi đó sự tổng hợp α-amylase sẽ bị ức chế

hoàn toàn, còn lượng γ-amylase sẽ bị giảm hàng chục lần ( Fenikxova, Muxaeva,

1967). Nồng độ tối ưu khoảng 0,05%. Tuy nhiên, muối này không ảnh hưởng đến sự

tạo oligo-1,6-glucosidase (Silova, 1967).

Phospho cần để tổng hợp các hợp phần quan trọng của sinh chất và nhiều

coenzyme, đồng thời để phosphoril hóa glucide trong quá trình oxy hóa sinh học.

Phospho ảnh hưởng trực tiếp tới sinh sản của nấm sợi cũng như các vi sinh vật khác, vì

vậy cũng ảnh hưởng đến sự sinh tổng hợp enzyme của chúng. Nhiều nhà nghiên cứu

cho biết nếu thêm phospho hữu cơ (như dạng fitin) vào môi trường sẽ làm tăng sự tổng

hợp amylase lên 2 – 3 lần.

Canxi cần cho sự tổng hợp và ổn định α-amylase hoạt động vì nó là cấu tử

không thể thiếu của enzyme này. Canxi còn có tác dụng bảo vệ amylase khoải tác

động của proteinase (Hsiu, 1964). Lượng Canxi cần thiết chiếm khoảng 0,01 – 0,05 %.

Nhiều nguyên tố vi lượng cũng có ảnh hưởng đến sự sinh tổng hợp enzyme

amylase như coban, mangan, đồng, thủy ngân, vân vân. Chúng có thể có khả năng kích

thích tạo amylase như coban, Ca, nitơ, hoặc cũng có thể có tác dụng kìm hãm sự tổng

hợp enzyme này như thủy ngân.

15

2.4.2.4. Nhiệt độ nuôi cấy

Nhiệt độ là yếu tố có ảnh hưởng mạnh mẽ đến sự phát triển và tổng hợp enzyme

của vi sinh vật. Hoạt động của các loài vi sinh vật dựa trên sự chuyển hoá của hàng

loạt các phản ứng dựa theo những trình tự xác định. Khi nhiệt độ tăng sẽ ảnh hưởng

đến quá trình sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật vì thế nó có ảnh hưởng đến sự

sinh tổng hợp enzyme của chúng.

2.4.2.5. pH ban đầu

pH của môi trường cũng có ảnh hưởng rất lớn đến sự phát triển và khả năng

sinh tổng hợp amylase từ vi sinh vật. pH của môi trường có những ảnh hưởng rất khác

nhau đối với các chủng vi sinh vật khác nhau. Nhiều loài nấm phát triển và phân giải

tinh bột mạnh ở pH 4 - 6. Sự sinh trưởng của vi sinh vật có thể làm thay đổi đáng kể

pH trong cơ chất. Sự thay đổi này phụ thuộc chủ yếu vào sự trao đổi chất của vi sinh

vật và khả năng đệm của cơ chất rắn. Trong môi trường lên men bán rắn rất khó để

điều chỉnh và kiểm soát pH. Tuy nhiên nếu nuôi cấy bằng phương pháp lên men bán

rắn thì pH môi trường sẽ có ít ảnh hưởng hơn so với phương pháp nuôi cấy chìm do

môi trường của phương pháp nuôi cấy bề mặt sẽ có dung lượng đệm cao và hàm ẩm

thấp nên pH không thay đổi nhiều trong quá trình nuôi.

2.4.2.6. Độ ẩm

Độ ẩm không chỉ ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và trao đổi chất của vi sinh vật

mà còn ảnh hưởng đáng kể đến đặc tính lý hoá của cơ chất. Các cơ chất khác nhau có

khả năng giữ nước khác nhau. Do đó, quá trình lên men bán rắn được thực hiện với

hàm lượng nước trong cơ chất khác nhau từ 30 - 80%.

2.4.2.7. Môi trường không khí

Vi sinh vật hiếu khí thì môi trường nuôi cấy phải đảm bảo cung cấp đủ oxi để vi

sinh vật sinh trưởng và phát triển. Khi nuôi cấy trên môi trường lỏng thường để trên

máy lắc, môi trường bán rắn thì cơ chất phải có độ xốp tạo sự thông thoáng giữa các

tiểu phần cơ chất. Ngược lại vi sinh vật kị khí chỉ phát triển trên môi trường không có

sự hiện diện của oxi. Ngoài ra cũng có vi khuẩn sống được ở cả hai điều kiện trên.

2.5. Môi trường lên men bán rắn

2.5.1. Cám gạo

Cám gạo là sản phẩm phụ của quá trình xay xát và chế biến gạo. Cám gạo có

giá trị dinh dưỡng khá cao. Cám được thu hồi dưới 2 dạng là cám thô và cám ướt.

16

Chúng thường có dạng bột, màu hơi vàng, mềm và mịn, chiếm khoảng 10-12% khối

lượng lúa chưa xay xát. Trong 100 g cám gạo có khoảng 28 g tinh bột, vì vậy đây là

nguồn cơ chất khá lí tưởng để dùng trong lên men bán rắn thu nhận amylase từ các vi

sinh vật do nguồ cung ổn định, giá thành rẻ và có lượng tinh bột khá cạo

Bảng 2.1 Thành phần dinh dưỡng của cám gạo

Thành phần Khối lượng/100g

Calori 316 KJ

Tổng số lipit 21g

Chất béo bảo hòa 4 g

Chất xơ tiêu hóa được 21g

Carbohydrat 28 g

Đường 0,9 g

Protein 13,3 g

Vitamin E 4,9 mg

Vitamin B6 4,1 mg

Canxi 57 mg

Kali 20 mg

(http://www.nutritiondata.com/).

Theo bảng trên thì cám có lượng dinh dưỡng rất cao với lượng chất béo chưa

bão hoà cao, vitamin nhóm E, nhóm B, phylate, kẽm, can xi, kali đều rất cao, ngoài ra

trong cám còn có chức chất béo omega 3 khá cao. Theo nhiều nghiêu cứu cho thấy

65% chất dinh dưỡng của gạo tập trung ở cám, thành phần của cám có nhiều loại

vitamin và chất béo tốt, lại cân đối và có nhiều xơ dễ tiêu nên có thể xem là nguồn

lương thực rất tốt cho cả con người.

Tuy nhiên cám thường được cho các loại gia súc và thủy sản ăn chứ không cho

người. Nguyên nhân là do cám có một số enzyme (chất men) nội tại hoạt động rất

mạnh sẽ oxy hóa các nhóm béo chưa no của cám rất nhanh chỉ vài giờ sau khi chế biến

tạo mùi hôi khó chịu. Thêm vào đó do công nghệ xay xát gạo chưa cao, lại ít được đầu

tư theo hướng thu cám sạch nên cám thường lẫn rất nhiều loại tạp chất (vỏ trấu, sạn đá

vân vân). Vì lý do đó mà hầu hết lượng cám thu được thường được bà con nông dân

dùng nuôi các loại gia súc, gia cầm. Hàng năm trên thế giới có khoảng 40 – 45 triệu

17

http://www.nutritiondata.com/

tấn cám được sản suất và 90% là nằm ở châu Á (http://www.bannhanong.com/, xử lý

cám gạo để thay thế ngũ cốc).

2.5.2. Bã đậu nànhBã đậu nành có hàm lượng xơ cao, bao gồm chất xơ hoà tan và chất xơ không

hoà tan. Chất xơ không hoà tan có tác động chống táo bón, ngăn ngừa ung thư ruột kết,

ung thư đại tràng, giảm nguy cơ trĩ, chống béo phì và bệnh tiểu đường.

Chất xơ hoà tan có khả năng tan trong nước thành dung dịch keo. Khi đi qua

ruột sẽ tạo ra thể đông làm chậm quá trình hấp thụ một số chất có hại như cholesterol

vào máu. Ngoài ra, trong bã đậu nành còn có chất isoflavones có khả năng phòng

chống nhiều loại bệnh ung thư và bệnh tim mạch. Theo tổ chức Y tế thế giới (WHO),

lượng chất xơ sử dụng mỗi ngày nên đảm bảo 27 – 40 g xơ tổng, 16 – 27 g xơ không

hoà tan.

Tuy nhiên, trong thực tế bã đậu nành khó xay mịn và có cấu trúc nhám, rời rạc

nên không thể dùng trong chế biến thực phẩm. Vì vậy, các nhà nghiên cứu đã dùng

phương pháp vi sinh để xử lý bã đậu nành. Họ đã dùng hai loại enzyme (men) có tên là

Pectinase và Cellulase với tỷ lệ thích hợp để thủy phân bã đậu nành. Nhờ đó, đã giúp

bã đậu nành qua xử lý trở nên mịn và làm thay đổi hàm lượng các hợp chất xơ trong bã

đậu nành theo cách có lợi nhất (http:// www.Vietnamnet.com).

2.6. Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật sản xuất enzyme

Hiện nay trên thế giới chủ yếu áp dụng hai phương pháp sản xuất enzyme là

nuôi cấy bề mặt (lên men bán rắn) và nuôi cấy chìm.

2.6.1. Phương pháp nuôi cấy bề mặt

Là phương pháp nuôi cấy mà vi sinh vật sẽ mọc trên bề mặt môi trường. Trong

nuôi cấy bề mặt vi sinh vật sẽ được nuôi cấy trên môi trường lỏng hoặc môi trường đặc

(còn gọi là môi trường len men bán rắn), nhưng chủ yếu vẫn là nuôi cấy trên môi

trường đặc. Phần lớn các nhà máy sản xuất enzyme thường sử dụng môi trường đặc để

nuôi cấy thu nhận enzyme từ vi sinh vật.

Môi trường lên men bán rắn thường dùng nguyên liệu tự nhiên như cám gạo,

cám mì, bã đậu nành, ngô mảnh,… Tùy theo đối tượng vi sinh vật và mục đích nuôi

cấy khác nhau mà bổ sung thêm các chất khác nhau và một số thành phần khác cho

thích hợp.

18

http://www.bannhanong.com/

Khi nuôi cấy theo phương pháp lên men bán rắn, vi sinh vật phát triển trên bề

mặt môi trường, nhận chất dinh dưỡng từ hạt môi trường, rồi sinh tổng hợp ra enzyme

ngoại bào và nội bào. Các enzyme ngoại bào sẽ thẩm thấu vào trong các hạt môi

trường, còn enzyme nội bào sẽ nằm trong sinh khối vi sinh vật.

Phương pháp này có ưu điểm là hàm lượng và hoạt tính enzyme cao, chế phẩm

dễ sấy khô, ít bị giảm hoạt tính, dễ vận chuyển và sử dụng, không cần sử dụng những

thiết bị đặc biệt, tiêu thụ năng lượng ít nên có thể áp dụng ở nhiều địa phương. Tuy

nhiên nhược điểm của nó là tốn diện tích mặt bằng và đòi hỏi lượng nhân công lớn,

khó cơ giớ hóa trong sản xuất.

Ưu điểm khác của phương pháp này là dễ thực hiện và khi bị nhiễm bởi các vi

sinh vật khác, thường chỉ xảy ra hiện tượng nhiễm cục bộ nên dễ xử lí. Tuy nhiên,

phương pháp này có nhược điểm rất lớn là tốn nhiều diện tích và khó cơ giới hóa, tự

động hóa.

2.6.2. Phương pháp nuôi cấy chìm

Còn gọi là phương pháp nuôi cấy bề sâu. Phương pháp này vi sinh vật được

nuôi trong môi trường lỏng và được nuôi trong các thùng lên men. Các thiết bị lên men

được lắp đặt hệ thống điều khiển cánh khuấy, hệ thống cung cấp õi, hệ thống điều

chỉnh pH và nông độ các chất dinh dưỡng. Trong đó hệ thống điều hòa không khí và

hệ thống khuấy trộn có ý nghĩa rất lớn (Nguyễn Đức Lượng, 2004). Tùy theo chủng

loại vi sinh vật mà thành phần của môi trường lỏng sẽ được thay đổi cho thích hợp.

Phương pháp này được dùng phổ biến trong lên men qui mô công nghiệp. So

với phương pháp nuôi cấy bề mặt, phương pháp nuôi cấy chìm ít choáng diện tích bề

mặt, dễ cơ giới hóa và tự động hóa trong quá trình theo dõi. Tuy nhiên phương pháp

này đòi hỏi đầu tư nhiều chi phí cho trang thiết bị.

Phương pháp này có ưu điểm là dễ dàng cơ giới hóa, tự động hóa, ít tốn diện

tích, song chúng đòi hỏi sự đầu tư lớn, khó được thực hiện ở nhiều nơi, và sẽ rất khó

khăn trong việc xử lí sự xâm nhập của các vi sinh vật lạ.

19

2.7. Thu nhận enzyme từ môi trường nuôi cấy bề mặt

2.7.1. Trích ly enzyme từ môi trường nuôi cấy bề mặt

Enzyme ngoại bào sẽ tồn tại trong tế bào vi sinh vật với hàm lượng rất thấp so

với các thành phần khác. Khi chiết rút enzyme từ canh trường ta thu được không chỉ

enzyme hòa tan trong nước mà còn thu được rất nhiều sản phẩm thủy phân từ cơ chất

môt trường và các chất do nấm mốc tạo ra trong quá trình sinh trưởng và phát triển.

Các enzyme thường là những chất hữu cơ không bền dễ bị biến tính khi bị tác

động bởi các yếu tố bên ngoài. Do đó, việc tách và thu nhận enzyme là điều không dễ.

Để chiết rút enzyme từ môi trường bán rắn, ta thường dùng nước, các dung dịch

muối trung tính hay các dung dịch đệm thích hợp. Trong đó, nước thường được dùng

nhiều nhất vì sự thuận tiện và cho kết quả cao. Enzyme từ môi trường khuếch tán vào

nước do sự chênh lệch nồng độ. Nước có thể chiết tách 90 – 95% enzyme trong canh

trường. Nước thường dùng chiết tách có nhiệt độ 25 - 280C.

Trong quá trình nấm mốc sinh trưởng trên môi trường bán rắn, các vật chất khô

trong môi trường sẽ bị hòa tan thủy phân khoảng 33 - 35%, tinh bột sẽ bị thủy phân

hoàn toàn và trong môi trường sẽ còn lại phần đường mà sinh vật chưa sử dụng hết.

2.7.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình li trích

Tỉ lệ nước có ảnh hưởng rất lớn đến sự thu nhận ezyme từ canh trường nuôi cấy

vi sinh vật. Canh trường khô cần nhiều nước để trích li enzyme hơn canh trường ẩm.

Với các tỉ lệ nước: canh trường nuôi cấy khác nhau ta sẽ thu được những lượng

enzyme khác nhau. Thường lượng nước dùng li trích gấp 3 – 3,5 lần so với lượng canh

trường nuôi cấy nấm mốc.

Tiếp đến là sự ảnh hưởng của thời gian li trích. Enzyme thủy phân dễ dàng hòa

tan vào nước, thời gian trích li càng lâu càng có khả năng trích li được nhiều enzyme

hơn nhưng làm tăng hàm lượng tạp chất trong dịch chiết và giảm hoạt tính enzyme.

Khi nhiệt độ trích li càng tăng thì vận tốc trích li cũng tăng theo nhưng cũng

làm tăng lượng tạp chất trong dịch chiết làm giảm hiệu suất trích enzyme và giảm hoạt

tính của enzyme. Nhiệt độ trích li tối thích là từ 28 – 300C. Trong công nghiệp nước

máy với pH 7 thường được dùng để li trích enzyme.

20

Chương 3

VÂT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1. Thời gian và địa điểm thí nghiệm

Thí nghiệm được tiến hành từ tháng 2 đến tháng 7 năm 2009, tại phòng các chất

có hoạt tính sinh học – Viện sinh học nhiệt đới.

3.2. Vật liệu thí nghiệm

3.2.1. Đối tượng thí nghiệm

Nấm mốc Aspergillus niger và Mucor do Viện Sinh Học Nhiệt Đới cung cấp

được nuôi cấy trong ống nghiệm thạch nghiêng trên môi trường PGA ở nhiệt độ

thường là 300C trong thời gian 2 - 3 ngày, sau đó đem bảo quản ở nhiệt độ 40C.

3.2.2. Cơ chất

Cơ chất sử dụng trong đề tài bao gồm lúa, cám gạo, trấu và bã đậu nành. Lúa,

cám gạo, trấu được mua ở chợ Thủ Đức, cám phải tương đối xốp dễ thông khí, không

có mùi ôi. Bã đậu nành được cung cấp bởi Viện Sinh Học Nhiệt Đới. Các cơ chất sẽ

được phối trộn với nhau trong môi trường nuôi cấy.

3.2.3. Hóa chất và thiết bị

3.2.3.1. Hóa chất

Hóa chất pha thuốc thử Lugol, hóa chất pha môi trường Czapeck, môi trường

Zapeck, hóa chất pha môi trường PGA, môi trường dinh dưỡng Mandel, hóa chất dùng

để xác định hàm lượng protein, bao gồm dung dịch Abumin chuẩn và thuốc thử

Bradford, hóa chất dùng chỉnh pH cho môi trường dinh dưỡng (HCl 0,1M, NaOH

0,1M), cồn 700, 900, tinh bột tan và dung dịch đệm Na-acetate 50 mM ở pH 5.

3.2.3.2. Thiết bị

Các thiết bị gồm có cân phân tích, bể ổn nhiệt, phòng đếm hồng cầu, kính hiển

vi quang học Olympus, nồi hấp Tommy-SS-325, máy xay sinh tố, máy khuấy từ, tủ

lạnh, máy đo pH, máy đo quang phổ UV-Vis cùng các dụng cụ phòng thí nghiệm như

que cấy, pipet, pipetman, ống nghiệm, ống đong, becher, erlen, vân vân.

3.3. Phương pháp nghiên cứu

3.3.1. Phương pháp cấy truyền

Do cả hai loại nấm trên đều sinh sản bằng bào tử nên ta sử dụng phương pháp

giữ giống trên môi trường thạch nghiêng, bằng cách cấy theo đường dích dắc. Khi

21

khuẩn lạc mọc đều sẽ cho vào tủ lạnh giữ ở nhiệt độ 5 - 90C để tránh nấm mốc bị già

làm ảnh hưởng đến các thí nghiệm sau.

Đầu tiên, cân 50g khoai tây, 5 g agar, 5 g glucose. Khoai tây rửa sạch gọt vỏ,

cắt lát mỏng đem cân, cho vào nồi đun sôi với 250 ml nước cất trong khoảng 30 phút.

Tiến hành lọc qua vải lọc, lấy phần nước trong, cho thêm nước cất vừa đủ 250 ml, cho

agar và glucose vào đun sôi đến khi tan hết.

Sau đó tiến hành tạo môi trường thạch nghiêng. Phân phối môi trường vào các

ống nghiệm, khoảng 1/4 chiều cao ống nghiệm. Làm nút bông và bao gói hấp khử

trùng ở 1210C và 1 atm, trong 15 phút. Sau khi hấp khử trùng xong, thạch trong ống

nghiệm còn lỏng ta để ống thạch ở vị trí nghiêng thích hợp cho đến khi thạch đông đặc

hoàn toàn. Vị trí nghiêng phải để đầu trên của mặt nghiêng không vượt qua 2/3 chiều

dài ống nghiệm, không được để thạch chạm vào nút bông, mặt thạch bằng phẳng,

không bị đứt, chiều dài vừa phải không quá ngắn hoặc quá dài.

Tiếp theo sẽ thực hiện việc cấy giữ giống trên môi trường thạch nghiêng. Dùng

que cấy móc đã khử trùng cấy truyền giống từ ống giống sang các ống nghiệm đã

chuẩn bị ở trên. Động tác này được thực hiện trong tủ cấy vô trùng. Sau đó để bào tử

phát triển ở nhiệt độ phòng khoảng 2 ngày, bào tử mọc đều, rồi chuyển vào tủ lạnh trữ

ở nhiệt độ 5 - 90C để dùng cho các thí nghiệm sau.

3.3.2. Phương pháp nhân giống cấp 2 (giữ giống trên môi trường lúa)

Chuẩn bị các dụng cụ thí nghiệm và pha môi trường dinh dưỡng, cồn và các

ống nghiệm giống A. niger và Mucor. Dụng cụ thí nghiệm cần thiết cho các thí nghiệm

này bao gồm becher, ống đong, ống nghiệm, đũa khuấy, que cấy và pipet đã khử trùng,

erlen. Từ các dung dịch stock tiến hành pha dung dịch môi trường dinh dưỡng gồm có

môi trường Mandel và Czapeck, chỉnh về pH 6. Thêm nước cất với tỉ lệ thích hợp để

môi trường nhân giống đạt độ ẩm 55%.

Tiến hành cân 20g lúa cho vào 4 erlen, bổ sung thành phần khoáng đã chuẩn bị

ở trên. Dùng đũa thủy tinh đánh tơi môi trường. Sau đó đem các erlen hấp khử trùng ở

1210C, 1atm trong 15 phút. Để nguội. Thực hiện cấy giống trong tủ vô trùng. Dùng

pipetman hút 1 ml nước cất đã được vô trùng cho vào ống nghiệm chứa giống, dùng

que cấy vòng hòa bào tử nấm mốc trong nước. Sau đó chuyển vào trong erlen. Tiến

hành tương tự cho cả 4 erlen. Khuấy đều, đánh tơi bào tử của mốc giống vừa cấy vào

môi trường bằng đũa thủy tinh vô trùng. Đem ủ ở nhiệt độ phòng. Sau 3 ngày quan sát

22

thấy lượng bào tử mọc nhiều, đem các erlen cho vào trữ trong tủ lạnh ở nhiệt độ 5 -

90C để dùng cho các thí nghiệm sau.

3.3.3. Phương pháp mô tả hình thái A. niger và Mucor

3.3.3.1. Quan sát hình thái đại thể

Dùng que cấy móc (vô trùng) gạt nhẹ bào tử đính của nấm sợi, chuyển sang đĩa

petri chứa môi trường PGA đã vô trùng và để nguội, cắm đầu móc xuống mặt thạch

thành 3 điểm. Các động tác trên được thực hiện trong tủ cấy. Sau đó ủ đĩa petri ở nhiệt

độ phòng trong khoảng thời gian 2 ngày. Quan sát khuẩn lạc của nấm sợi (hình dạng

và màu sắc).

3.3.3.2. Quan sát hình thái vi thể

Làm phòng ẩm để quan sát hình thái vi thể. Lót giấy thấm ở đáy petri (đường

kính 12 cm) rồi đặt vào miếng lame, gói giấy và đem khử trùng. Nấu chảy môi trường

PGA (vô trùng) rót chảy dọc theo nửa tấm lame và chờ đông lại, làm ẩm giấy thấm

bằng nước cất vô trùng (vừa đủ ướt tờ giấy). Cấy một ít bào tử thành một hoặc hai

điểm trên phần thạch của miếng lame trong phòng ẩm, nuôi ủ ở nhiệt độ phòng. Sau 2

đến 3 ngày lấy miếng lame ra khỏi hộp petri và quan sát. Quan sát dưới kính hiển vi

(độ phóng đại 40 và 100 lần) hình dạng vi thể của hai chủng thí nghiệm.

Đầu tiên dùng que cấy hình móc câu một ít hệ sợi nấm dàn mỏng trên phiến

kính. Tiếp theo cho vài giọt cồn 95% để một lúc, dùng giấy thấm lau khô sau đó cho

vài giọt NaOH 10% đậy lá kính lên, đem soi. Hoặc cho vài giọt cồn 600 có vết

amoniac, thấm khô rồi cho thêm vài giọt glycerin loãng lên tấm lame, đậy lá kính lên,

đem soi. Mục đích của các tác dụng trên là tăng cường khả năng thấm nước của sợi

nấm, đuổi bọt khí trong sợi nấm, làm sợi nấm nở to ra để dễ quan sát.

3.3.4. Xác định trực tiếp số lượng bào tử nấm sợi bằng buồng đếm hồng cầu

Buồng đếm hồng cầu dùng để đếm vi sinh vật có kích thước lớn (nấm men, bào

tử nấm mốc). Người ta thường dùng 2 loại buồng đếm hồng cầu; buồng đếm Thomas

và buồng đếm Goriep. Nguyên tắc cấu tạo của 2 loại buông đếm này đều giống nhau.

Buồng đếm đều là 1 phiến kính hình chữ nhật, chia thành 3 khoảng ngang. Khoảng

giữa chia thành 2 khoảng nhỏ. Trên mỗi khoảng nhỏ này có kẻ một lưới đếm, gồm rất

nhiều ô vuông. Mỗi ô vuông có diện tích là 1/25 mm2 lại được chia thành các ô nhỏ

(thường là 16 ô), mỗi ô nhỏ có diện tích là 1/400 mm2 và chiều cao là 1/10.

Như vậy V ô nhỏ = 1/400 mm2 x 0,1 mm = 1/4000 mm3 hay 1/4000000 ml.

23

Tiến hành cân 1 g canh trường lấy từ canh trường nhân giống cấp 2 đã thực

hiện trong mục 3.3.2 đem đi pha loãng 10-1, 10-2, 10-3, 10-4…. Sau đó tiến hành đếm

trên phòng đếm.

Chuẩn bị một số ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch sinh lí chứa Tween 80 0,1%

vô trùng và một số ống hút 1 ml vô trùng để tiến hành việc pha loãng mẫu. Cân 1 g

bào tử nấm sợi cho vào ống nghiệm số 1 chứa 9 ml dung dịch muối sinh lí chứa Tween

80 0,1% vô trùng, huyền phù đều. Ta được độ pha loãng 1/10 hay 10-1. Sau đó lại hút 1

ml ở ống nghiệm 1 cho vào ống số 2, trộn đều, ta được độ pha loãng 1/1000 hay10-2.

Tiếp tục như vậy từ ống 2 sang ống 3, ống 3 sang ống 4. Ta sẽ được các độ pha loãng

tương ứng 10-3, 10-4.

Đếm số lượng bào tử bằng buồng đếm hồng cầu. Lắc đều ống nghiệm pha

loãng. Đậy lá kính lên lưới đếm. Dùng ống hút vô trùng lấy mẫu, cho vài giọt vào mép

lá kính, do sức mao dẫn, dịch mẫu tràn vào mặt trên lưới đếm. Chú ý không để hình

thành bọt khí trong lưới đếm hoặc tràn dịch mẫu xuống rãnh. Đặt buồng đếm lên bàn

kính hiển vi và để yên trong 3 - 5 phút, sau đó tiến hành đếm bào tử trong năm ô lớn

chéo nhau, chỉ đếm các bào tử nằm trong lòng ô nhỏ và những bào tử nằm trên 2 cạnh

liên tiếp cùng chiều. Đếm lần lượt từ ô con 1 đến ô con 16.

Chú ý nồng độ dịch huyền phù pha loãng sao cho mật độ trong mỗi ô nhỏ

không quá 10 bào tử. Số bào tử đếm được trong 5 ô lớn phải lớn hơn 200 và phải đảm

bảo được độ chính xác của phương pháp. Sau khi sử dụng xong buồng đếm phải được

rửa ngay và lau thật khô để bảo quản.

Kết quả đếm được tính theo công thức như bên dưới.

Công thức :

a*4000*103*n

b

N : số lượng bào tử trong 1 ml dịch huyền phù.

a : số lượng bào tử trong 5 ô lớn (80 ô con).

b : số ô con trong năm ô lớn (16 ô x 5 = 80 ô).

103 : số đổi mm3 thành ml (1000 mm3 = 1 ml).

n : độ pha loãng của mẫu.

24

N =

3.3.5. Phương pháp xác định độ ẩmCông thức tính độ ẩm

F = A*(B% - C%) / 100%.

Cách tính độ ẩm % :

Ví dụ: Ta có 100 g cơ chất có độ ẩm 10% nhưng cần độ ẩm 50%.

Theo công thức trên ta có:

100*(50 – 10)

100

Như vậy: trong 10g cơ chất ta bổ sung thêm 40ml nước cất sẽ được độ ẩm 50%.

Với :

A : khối lượng cơ chất có trong môi trường nuôi cấy (g).

B : độ ẩm muốn bổ sung vào môi trường (%).

C : độ ẩm trong cơ chất (%) ( với cơ chất là lúa, cám gạo, bã đậu nành, trấu thì

độ ẩm thông thường của chúng là 10%). (Trần Anh Tuấn, 2005).

100 : độ ẩm 100%.

F : lượng nước cần bổ sung vào môi trường để đạt độ ẩm thích hợp (ml).

3.3.6. Phương pháp lên men bán rắn để thu nhận enzyme amylase

Phối trộn cám: trấu: bã đậu nành theo tỉ lệ (phụ thuộc vào từng giai đoạn của đề

tài), cân 20g hỗn hợp cho vào mỗi erlen. Từ những dung dịch stock tiến hành pha môi

trường dinh dưỡng gồm cả môi trường Mandel và Zapeck. Tiến hành điều chỉnh theo

độ ẩm, pH, nồng độ môi trường theo từng thí nghiệm. Cho dung dịch dinh dưỡng vào

các erlen chuẩn bị ở trên, đánh tơi. Khử trùng môi trường ở 1210C trong 15 phút,sau

đó làm nguội môi trườn.

Cân 1 g canh trường lúa từ các erlen trong mục 3.3.2, cho thêm 3 ml nước cất

vào, khuấy bằng đũa khuấy vô trùng. Tiến hành đếm bào tử, pha loãng để đạt được

lượng bào tử mỗi loại là 0,8*108 bào tử/g canh trường.

Chuyển huyền phù bào tử của nấm mốc trên vào các bình tam giác đã được

chuẩn bị như trên, nuôi ủ ở nhiệt độ phòng trong thời gian thích hợp tùy theo từng thí

nghiệm. Để xác định thành phần môi trường và các điều kiện tối ưu cho sự sinh trưởng

và sinh tổng hợp enzyme, nấm sợi được nuôi cấy trên môi trường có tỉ lệ bã đậu nành:

cám mì: cám gạo khác nhau (1:2:1, 2:1:1, 1:1:2), độ ẩm môi trường (từ 40 - 75%), pH

(từ 3 - 8), nồng độ dinh dưỡng (x1 - x8 hay từ 1 - 8lần), tỉ lệ giống (từ 0,8*108 đến

25

F = = 40 (ml)

3,2*108 bào tử/g môi trường), thời gian nuôi cấy (từ 8 đến 44 giờ) và yếu tố cuối cùng

là nhiệt độ nuôi cấy (từ 30 - 550C).

Sau quá trình nuôi cấy, tiến hành li trích enzyme từ canh trường với dung môi

là nước cất. Bổ sung nước cất với tỷ lệ 1 g canh trường: 3 g nước cất, khuấy trong 40

phút, lọc thu dịch chiết enzyme.

3.3.7. Phương pháp xác định hàm lượng amylase

Phương pháp này dựa trên sự thay đổi bước sóng hấp thụ cực đại của thuốc thử

Coomassie Brilliant Blue khi tạo phức với protein. Trong dung dịch mang tính acid,

khi chưa kết hợp với protein thì thuốc nhuộm có bước sóng hấp thụ cực đại ở 465 nm,

khi kết hợp với protein thì thuốc nhuộm hấp thụ cực đại ở bước sóng 595 nm. Độ hấp

thụ ở bước sóng 595 nm có liên hệ một cách trực tiếp với nồng độ protein. Đặc biệt

nếu có mặt các acid amin nhân thơm sẽ bắt màu mạnh hơn. Phương pháp này có độ

nhạy cao cho phép phát hiện tới vài µg protein/ml, dễ thực hiện và tiết kiệm thời gian.

Hoá chất bao gồm dung dịch mẫu protein (cụ thể trong bài này là dịch chiết

enzyme amylase thu từ các canh trường nuôi cấy), dung dịch albumin 0,1 mg/ml và

dung dịch thuốc thử Bradford. Pha dung dịch albumin bằng cách cân chính xác 10 mg

albumin pha trong 10 ml nước cất. Lắc đều cho tan. Giữ ở nhiệt độ lạnh 200C, khi

dùng pha loãng 100 lần, được dung dịch albumin có nồng độ 0,1 mg/ml. Sau đó tiến

hành pha dung dịch thuốc thử Bradford. Để pha thuốc thử Bradford, đầu tiên cân 0,001

g Coomassie Brilliant Blue, 4,7 g dung dịch ethanol 990 và 8,5 g dung dịch acid

phosphoric 85%. Phẩm màu Coomassie Brilliant Blue được làm tan trong dung dịch

ethanol 990 trong bình định mức có thể tích là 100ml, thêm vào bình 60 ml nước cất,

rồi thêm từ từ acid phosphoric 85% và chỉnh đến 100ml bằng nước cất.

Để xác định hàm lượng protein trong mẫu, đầu tiên ta xây dựng một đường

chuẩn với dung dịch protein chuẩn đã biết trước nồng độ. Dung dịch protein chuẩn

thường là Bovine plasma-globulin hoặc Bovine serum albumin. Sau khi cho dung dịch

protein vào dung dịch thuốc nhuộm, màu sẽ xuất hiện trong 2 phút và bền tới 1 giờ.

Tiến hành đo dung dịch bằng máy quang phổ kế ta được ODx độ hấp thụ sẽ tỉ lệ với

lượng protein trong mẫu.

Thực hiện một mẫu đối chứng với nước cất (OD0), lấy giá trị ODx:

ODx = ODx – OD0

26

Lượng protein mẫu trong dung dịch đo được xác định bằng cách chấm trên

đường chuẩn theo ODx, lấy giá trị của điểm đó trên trục hoành đó chính là lượng

protein trong mẫu dung dịch đo.

Xây dựng đường chuẩn (chú ý rửa sạch cuvette bằng cồn, tráng lại bằng nước

cất trước và sau khi đổi mẫu đo). Để có dung dịch albumin chuẩn có nồng độ từ 0-50

μg/ml ta thực hiện các bước như bảng 3.1.

Bảng 3.1 Các bước tiến hành tạo dung dịch albumin chuẩn

Ống nghiệm số 1 2 3 4 5 6Nồng độ albumin (μg/ml) 0 10 20 30 40 50Dung dịch albumin (mg/ml) 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5Nước cất (ml) 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5Thuốc thử Coomassie (ml) 2 2 2 2 2 2

Dùng đồng hồ bấm giây, canh thời gian 0 phút, cho 5 ml thuốc thử Bradford

vào ống nghiệm 1. Lắc đều, để yên. Thực hiện việc bổ sung 5 ml dịch thuốc thử tuần

tự vào các ống từ 2 đến 6 ở các thời điểm cách nhau 1 phút. Lắc đều, để yên. Tính thời

gian ống 1 được 20 phút, tiến hành đo độ hấp thu của dung dịch ở bước sóng 595nm

(OD595 nm). Tuần tự tiến hành đo OD595 của các ống còn lại ở các thời điểm cách nhau 1

phút. Lấy OD595 của ống thử thật (có protein) trừ OD595 của ống thử không (không có

protein) được OD595. Vẽ đường tuyến tính giữa nồng độ protein (μg/ml) với mật độ

quang OD595. Đo mẫu thu được, tính hàm lượng protein. Việc đo mẫu cũng tiến hành

tương tự với thời gian cho phản ứng là 20 phút. Mẫu được đo pha loãng sao cho giá trị

OD595 nằm trong đường chuẩn. Từ lượng protein tính được trong dung dịch đem đo,

suy ra tổng lượng protein có trong nguyên liệu ban đầu.

Hàm lượng protein tính theo công thức:

b*m*V w

Với:

b : nồng độ protein trong mẫu suy ra từ đường chuẩn (μg/ml).

m : hệ số pha loãng.

V: tổng số ml dịch chiết thu được.

w: tổng khối lượng canh trường thu được.

27

(mg/g) HL =

3.3.8. Phương pháp xác định hoạt tính amylase

Enzyme amylase là enzyme thủy phân tinh bột. Nó phân cắt amylose và

amylopectin của tinh bột thành các loại đường maltose, glucose,…Hoạt tính của

enzyme amylase được xác định dựa trên sự thay đổi màu sắc của phức hợp tinh bột –

iod trước và sau khi thủy phân. Mật độ quang của phức hợp tinh bột – iod sẽ được đo ở

bước sóng 595 nm trên máy đo quang phổ.

Hóa chất cần thiết cho thí nghiệm này bao gồm dung dịch Lugol, dung dịch

đệm Na-acetate 50 mM ở pH 5, dung dịch hồ tinh bột 1%. Dung dịch này được pha

bằng cách cân 1 g tinh bột tan cho vào berche đựng 100 ml dung dịch đệm, đun cách

thủy cho sôi trong 5 phút, khuấy đều cho tan.

Đối với ống nghiệm chứa enzyme mẫu (An) sẽ được chuẩn bị bàng cách hút 1

ml dung dịch enzyme mẫu cho vào ống nghiệm. Cho thêm 1 ml dung dịch cơ chất

(dung dịch hồ tinh bột 1%), cho thêm 1 ml dung dịch đệm pH 5 và 0,5 ml NaCl 3%

vào. Cho ống nghiệm vào bể ủ nhiệt 500C, 30 phút. Sau đó cho vào ống nghiệm 1 ml

HCl 1N, thêm nước cất vừa đủ 10 ml. Nhỏ 1 giọt dung dịch Lugol, đợi 20 phút rồi

đem so màu ở bước sóng 595 nm trên máy quang phổ.

Mẫu chuẩn được pha tương tự mẫu enzyme nhưng thay 1 ml dung dịch enzyme

bằng 1 ml dung dịch nước cất.

Mẫu trắng cũng được pha tương tự mẫu enzyme nhưng dùng 1 ml nước cất thay

cho 1 ml dung dịch hồ tinh bột.

Một đơn vị hoạt tính (UI) của amylase là lượng enzyme cần để làm giảm màu

tinh bột tan bởi iodine trong 1 phút dưới các điều kiện phản ứng như trên.

Hoạt tính amylase tính theo gam canh trường:

(A0-An)*100*V*n

A0*30*w

Nếu tính hoạt lực enzyme amylase trong 1ml dịch enzyme:

(A0-An)*100*n

A0*30

Trong đó:

A0 : là mật độ quang của mẫu đối chứng ở bước sóng 595 nm.

An : là mật độ quang của mẫu enzyme ở bước sóng 595 nm.

n : hệ số pha loãng

28

HT =

HT = (UI/ml)

(UI/g CT)

V : thể tích dịch chiết enzyme thu được sau khi lọc (ml).

w : khối lượng canh trường ban đầu đem ly trích (g).

Hoạt tính riêng tính theo công thức:

HT chung

HL protein

3.3.9. Phương pháp quy hoạch thực nghiệm

Phương pháp quy hoạch thực nghiệm không chỉ cho phép nghiên cứu tác động

đồng thời của nhiều yếu tố lên quá trình mà còn cho phép đánh giá một cách định

lượng mức độ ảnh hưởng của từng yếu tố đó.

Sau khi thực hiện các thí nghiệm khảo sát sự ảnh hưởng của từng yếu tố, ta rút

ra được thành phần môi trường và các điều kiện nuôi cấy cơ sở được gọi là môi trường

cơ sở cho hai chủng trên sinh trưởng và tạo thành enzyme amylase.

Từ môi trường cơ sở ta tiến hành tối ưu hoá các yếu tố trên bằng cách tiến hành

các thí nghiệm theo kế hoạch thực hiện đầy đủ các yếu tố (gọi tắt là TĐY). Cơ sở của

việc qui hoạch thực nghiệm theo yếu tố 2n là việc thể hiện tất cả các tổ hợp có thể có

giữa các yếu tố nghiên cứu. Mỗi yếu tố đều được kiểm tra đồng thời và không phụ

thuộc lẫn nhau ở hai mức độ là trên (+) và dưới (-). Trung tâm của thí nghiệm là môi

trường cơ sở đã xác định được (Nguyễn Cảnh, 1993).

3.3.10. Phương pháp bố trí và xử lí số liệu thí nghiệm

Tất cả các thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp

lại. Số liệu thu được của các nghiệm thức sẽ được phân tích biến lượng đơn yếu tố

(One-way ANOVA) để đánh giá sự khác biệt của chúng. Đây là phương pháp phân

tích số liệu thí nghiệm dựa trên những biến động gây ra các sai số trong thí nghiệm.

Mục đích của ANOVA là xác định mức độ sai khác giữa các trung bình nghiệm thức

của chỉ tiêu nghiên cứu là do nghiệm thức hay chỉ mang yếu tố ngẫu nhiên. Ngoài ra,

ANOVA còn cho phép so sánh nhiều số trung bình đồng thời với nhau để có kết luận

chung về sự khác biệt. Nói cách khác, nếu qua ANOVA mà xác định được giữa các

trung bình nghiệm thức khác nhau có ý nghĩa thì chứng tỏ rằng sự sai khác đó là do

các nghiệm thức thí nghiệm gây ra.

29

HTR = (UI/mg protein)

Chương 4

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUÂN

4.1. Khả năng sinh tổng hợp amylase của nấm mốc Aspergillus niger trên môi

trường lên men bán rắn

4.1.1. Nấm mốc A .niger

Bào tử A. niger từ ống nghiệm thạch nghiêng được cấy sang đĩa Petri và miếng

lame trong phòng ẩm chứa môi trường PGA theo phương pháp đã mô tả ở mục 3.3.3,

nuôi ủ ở nhiệt độ phòng 2 - 3 ngày. Kết quả quan sát đại thể và vi thể được trình bày ở

hình 4.1 và 4.2.

Hình 4.1 Hình ảnh đại thể và vi thể của A. niger. (a)hình ảnh đại thể, (b) hình ảnh vi thể.

Kết quả quan sát hình ảnh đại thể cho thấy A. niger tạo khuẩn lạc tròn, mọc

nhanh trên môi trường PGA ở nhiệt độ phòng, có dạng nhung, phẳng và nhẵn, có

nhiều rãnh. Khuẩn lạc còn non có màu trắng, khi già chuyển sang màu nâu đen hoặc

đen than do màu của bào tử đính. Mặt trái có sắc tố vàng, xếp nếp.

Quan sát hình ảnh vi thể ta thấy khuẩn ty phân nhánh, có vách ngăn, bào tử

đính không nằm trong bọc bào tử, bọng hình cầu sinh ra nhiều thể bình kề nhau và bao

phủ toàn bộ bề mặt bọng, thể bình sinh ra bào tử đính. Bào tử đính có màu đen, hình

cầu, xếp thành chuỗi, cuốn đỉnh bào tử đơn bào.

4.1.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ cám gạo: bã đậu nành: trấu

Trong thí nghiệm này tiến hành pha chế các môi trường có tỷ lệ cơ chất khác

nhau, làm ẩm với nước có bổ sung dung dịch dinh dưỡng có nồng độ X1 đến độ ẩm

30

(a) (b)

55%, pH 5. Thực hiện các bước như mục 3.3.6. Cấy huyền phù bào tử A. niger với mật

độ 0,8*108 bào tử/g vào các môi trường chuẩn bị ở trên.

Sau 36 giờ nuôi cấy, thu dịch chiết enzyme từ canh trường, đem xác định hoạt

tính và hàm lượng enzyme amyase thu được. Kết quả phân tích phương sai ANOVA

cho thấy sự khác nhau giữa các nghiệm thức là có ý nghĩa.

Đồ thị 4.1 Biểu diễn hoạt tính amylase và hàm lượng protein từ canh trường nuôi cấy

A. niger với các tỷ lệ cơ chất khác nhau.

Hoạt tính amylase và hàm lượng protein cao nhất (358,552 UI/g CT và 41,484

mg/g) ở môi trường có tỷ lệ cám: trấu: bã đậu nành là 2:1:1. Hàm lượng và hoạt tính

amylase ở môi trường có tỷ lệ cám: trấu: bã đậu nành là 1:2:1 cũng khá cao. Môi

trường có tỷ lệ cám: trấu: bã đậu nành là 1:1:2 cho hàm lượng và hoạt tính amylase

thấp. Điều này cho thấy việc tăng tinh bột (có trong cám gạo) trong trường hợp này là

cơ chất của enzyme có tác động đến việc kích thích vi sinh vật sinh tổng hợp enzyme

tương ứng. Kết quả thí nghiệm cũng chỉ ra rằng việc tăng cường lượng bã đậu nành

làm giảm đáng kể hàm lượng và hoạt tính của amylase. Có thể do trong bã đậu nành

chứa nhiều lipid, là cơ chất cho việc tổng hợp enzyme lipase nên ức chế sự tổng hợp

enzyme amylase. Tuy nhiên, việc bổ sung thêm bã đậu nành với tỷ lệ thấp vào môi

trường sẽ cung cấp thêm nguồn Nitơ cho vi sinh vật.

Nồng độ carbon và các nguồn carbon khác nhau cũng có ảnh hưởng lớn đến sự

tạo thành các enzyme riêng biệt của hệ enzyme amylase khi nuôi nấm mốc. Trong đó,

để đảm bảo có hoạt lực α-amylase cao cần có ít nhất 6% tinh bột, còn muốn có hoạt

31

lực oligo-1,6-glucosidase cao chỉ cần 2% tinh bột. Bột đậu nành sẽ ức chế việc tạo

thành α-amylase, nhưng lại kích thích mạnh mẽ oligo-1,6-glucosidase.

Tỷ lượng giữa carbon và nitơ cũng có ý nghĩa rất lớn đối với sự sinh tổng hợp

enzyme amylase từ vi sinh vật. Chỉ khi nào trong môi trường có đủ lượng carbon và

nitơ cần thiết mới tích lũy được lượng enzyme amylase cực lớn. Vì vậy, trong môi

trường có tỷ lệ cơ chất là 2 cám: 1 trấu: 1bã đậu nành có được tỷ lệ giữa carbon và nitơ

thích hợp nhất, vì vậy, lượng enzyme và hoạt tính amylase thu được ở canh trường này

là cao nhất.

Chất lượng của cám gạo cũng có ảnh hưởng lớn tới hoạt lực của các enzyme

amylase. Cám phải chứa tinh bột trên 20%, nên sử dụng cám mới, còm tốt, không có

dư vị chua hay đắng, không hôi mùi mốc. Độ ẩm của cám khoảng 10%, tạp chất độc

không quá 0,05%. Tuy là phế liệu của ngành công nghiệm xay xát nhưng cám lại có

thành phần dưỡng chất rất thích hợp để nuôi vi sinh vật.

Tuy cám gạo và bã đậu nành là phế liệu của các ngành công nghiệp, nhưng cả

hai đều tương đối đắt tiền. Hơn nữa trong quá trình nuôi vi sinh vật, nguồn dinh dưỡng

không được sử dụng hết, vì thể có thể thay một phần cám và bã bằng các cấu tử rẻ tiền

hơn, như trấu chẳng hạn. Cấu tử bổ xung này sẽ góp phần làm xốp môi trường. Có thể

dùng cặn bã của canh trường rắn sau khi li trích enzyme làm cấu tử chính của canh

trường nuôi cấy nhưng phải đảm bảo chế độ tiệt trùng.

4.1.3. Ảnh hưởng của pH

Trong thí nghiệm này, chọn tỷ lệ cám gạo: trấu: bã đậu nành theo tỷ lệ 2:1:1 và

độ ẩm 55% để khảo sát ảnh hưởng của pH. Bằng cách thêm nước cất và môi trường có

nồng độ dinh dưỡng X1 và điều chỉnh pH của chúng để có được môi trường nuôi cấy

có độ ẩm 55% và có pH 2 , pH 3, pH 4, pH 5, pH 6, pH 7, pH 8. Các bước tiếp theo

thực hiện như mục 3.3.6. Cấy dịch huyền phù bào tử A. niger với mật độ 0,8*108 bào

tử/g vào các môi trường chuẩn bị ở trên.




32

Đồ thị 4.2 Biểu diễn hoạt tính amylase và hàm lượng protein từ môi trường nuôi cấy

A. niger với các pH môi trường ban đầu khác nhau.

pH có ảnh hưởng rất mạnh đến sinh tổng hợp amylse của A. niger. Khoảng pH

tối ưu cho loại nấm mốc này sinh tổng hợp amylase là từ 4 - 6, trong đó tối ưu nhất là

tại pH 5. Tại pH này, A. niger tổng hợp lượng amylase nhiều nhất và có hàm lượng

cao nhất (354,333 UI/g CT và 41,961 mg/g). pH nằm ngoài khoảng tối ưu này, A.

niger tổng hợp rất ít amylase và hoạt tính enzyme cũng rất thấp.

Khi nuôi cấy bằng phương pháp bề mặt, pH môi trường ít bị thay đổi do môi

trường có dung lượng đệm cao và hàm ẩm thấp. Vì vậy, pH ban đầu có ý nghĩa rất lớn

đến sự phát triển của nấm mốc và sự tạo enzyme. Môi trường có pH trong khoảng từ

4,5 – 5,0 sẽ tạo điều kiện chọn lọc cho nấm mốc phát triển do đa số nấm mốc sinh

trưởng tốt và tạo enzyme trong môi trường acid yếu. Và cũng ở pH này, nấm mốc tạo

hệ amylase tốt nhất. Vì thế, ở canh trường nuôi cấy có pH 5, lượng enzyme và hoạt

tính amylse thu được là cao nhất. Điều này là phù hợp với các nghiên cứu trước đây.

pH cũng có ảnh hưởng đến việc tạo enzyme riêng biệt của hê enzyme amylase

của nấm sợi. Trong môi trường acid, quá trình tạo enzyme sẽ chuyển dịch mạnh về

phía tổng hợp tích cực glucoamylase và ức chế sự tổng hợp α-amylase. pH thích hợp

cho việc tạo glucoamylase namwg trong khoảng từ 3 đến 3,5, trong khi pH thích hợp

cho việc tạo thành α-amylase nằm trong khoảng pH 5.

33

4.1.4. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy

Trong thí nghiệm này, chọn tỷ lệ cám gạo: trấu: bã đậu nành theo tỷ lệ 2:1:1.

Bằng cách thêm nước cất và môi trường có nồng độ dinh dưỡng X1 và điều chỉnh pH

của chúng để có được môi trường nuôi cấy có độ ẩm 55% và có pH 5. Các bước tiếp

theo thực hiện như mục 3.3.6. Cấy dịch huyền phù bào tử A. niger với mật độ 0,8*108

bào tử/g vào các môi trường chuẩn bị ở trên.

Thu nhận enzyme từ canh trường ở các mốc thời gian khác nhau: sau 8 giờ, 12

giờ, 16 giờ, 20 giờ, 24 giờ, 28 giờ, 32 giờ, 36 giờ, 40 giờ và sau 44 giờ nuôi cấy, thu

dịch chiết enzyme từ canh trường, đem xác định hoạt tính và hàm lượng enzyme

amyase thu được. Kết quả phân tích phương sai ANOVA cho thấy sự khác nhau giữa

các nghiệm thức là có ý nghĩa.

Đồ thị 4.3 Biểu diễn hoạt tính enzyme và hàm lượng protein từ canh trường nuôi cấy

A. niger với các mốc thời gian thu nhận khác nhau.

Khoảng thời gian A. niger tạo enzyme amylase mạnh mẽ là sau 24 – 32 giờ

nuôi cấy. Hoạt tính và hàm lượng enzyme cao nhất đạt được sau 28 giờ nuôi cấy.

Trong khoảng thời gian từ 8 đến trước 24 giờ nuôi cấy, lượng enzyme tăng rất chậm.

Hoạt tính và hàm lượng enzyme tăng mạnh sau 24 đến 28 giờ nuôi cấy. Sau 28 giờ

nuôi cấy, hoạt tính enzyme giảm nhanh nhưng hàm lượng protein giảm chậm. Sau 36

giờ nuôi cấy, hoạt tính của amylase còn rất thấp. Có thể sau 36 giờ nuôi cấy, A. niger

bắt đầu tạo bào tử, nên hàm lượng protein giảm và hoạt tính amylase giảm nhanh.

34

Khi nuôi vi sinh vật thu enzyme amylase, có hai quá trình liên quan mật thiết

với nhau, đó là quá trình tổng hợp sinh khối vi sinh vật và quá trình tích lũy enzyme

trong môi trường. Và trong thực tế, hai quá trình này không hề khớp với nhau về mặt

thời gian.

Theo nhiều ý kiến, sự tạo thành amylase cực đại thường xảy ra sau khi quần thể

tế bào đạt đỉnh sinh trưởng. Trong quá trình sinh trưởng, vi sinh vật chỉ tổng hợp nên

một lượng amylase ngoại bào rất ít, và chỉ sau khi kết thúc pha sinh trưởng mới xảy ra

sự tổng hợp enzyme amylase cực lớn. Người ta cho rằng sự tổng hợp enzyme amylase

bắt đầu khi mà việc tạo protein của tế bào đã kết thúc hoặc gần kết thúc và cạnh tranh

với quá trình này.

Thời gian nuôi để tạo lượng amylase cực lớn thường được xác định bằng thực

nghiệm. Tùy thuộc tính chất sinh sinh lí của từng vi sinh vật và sự ngừng tổng hợp

enzyme mà có thể ngừng sinh trưởng của nấm mốc vào bất kì lúc nào thấy cần thiết.

Sự tạo bào tử là hiện tượng không mong muốn vì thường làm giảm hoạt lực của

enzyme. Đối với đa số nấm mốc Aspergillus sự tạo enzyme cực đại thường kết thúc

khi nấm mốc bắt đầu sinh đính bào tử.

4.1.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ


độ ẩm 55%. Bằng cách thêm nước cất và môi trường có nồng độ dinh dưỡng X1 và

điều chỉnh pH của chúng để có được môi trường nuôi cấy có độ ẩm 55% và có pH 5.

Các bước tiếp theo thực hiện như mục 3.3.6. Cấy dịch huyền phù bào tử A. niger với

mật độ 0,8*108 bào tử/g vào các môi trường chuẩn bị ở trên.

Đem nuôi cấy trong các tủ sấy với các nhiệt độ như sau: 300C, 350C, 400C,

450C, 500C và 550C. Thu dịch chiết enzyme từ canh trường sau 28 giờ nuôi cấy, đem

xác định hoạt tính và hàm lượng enzyme amyase thu được. Kết quả phân tích phương

sai ANOVA cho thấy sự khác nhau giữa các nghiệm thức là có ý nghĩa.

35


A. niger với các nhiệt độ nuôi cấy khác nhau.

Ở môi trường nuôi cấy trong nhiệt độ 350C cho kết quả hàm lượng protein và

hoạt tính amylase cao nhất (631,443 UI/g CT và 55,386 mg/g), và ở nhiệt độ nuôi cấy

300C canh trường cho hàm lượng protein và hoạt tính amylase cũng khá cao (580,875

UI/g CT và 52,449 mg/g). Vậy nhiệt độ tối ưu cho sự tổng hợp amylase ở A. niger là

từ 30 – 350C. Khoảng nhiệt độ này thích ứng với sự tăng trưởng và phát triển của nấm

mốc do đó, nấm mốc tổng hợp enzyme tốt nhất và đạt giá trị cực đại. Còn ở nhiệt độ từ

40 – 550C do nấm mốc không thích nghi được nên khả năng phát triển kém dẫn đến

khả năng tổng hợp enzyme thấp. Có thể do nhiệt độ trên 400C là quá cao và chúng ảnh

hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển của nấm mốc A. niger.

Toàn bộ chu kì sinh trưởng của nấm mốc trên cám có thể chia thành 3 thời kì.

Đầu tiên là thời kì trương mầm của đính bào tử. Trong thời kì này phải duy trì nhiệt độ

trong khoảng 30 - 320C. Tiếp đến là thời kì sinh trưởng nhanh của hệ sợi. Ở giai đoạn

này, nấm mốc hô hấp rất mạnh và sinh ra một lượng nhiệt rất lớn. Kết quả là trong lớp

sợi nấm đang mọc nhiệt độ tăng lên đến 37 - 400C. Vì vậy trong lúc này cần chú ý để

giảm nhiệt độ phòng giúp sợi nấm mọc đều và đẹp. Cuối cùng là thời kì tạo amylase

mạnh mẽ. Trong thời kì này các quá trình trao đổi chất dần dần yếu đi, sự tỏa nhiệt

giảm mạnh, các enzyme amylase được tổng hợp mạnh mẽ. Trong giai đoạn này, nên

hạ nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ của giai đoạn đầu từ 3 - 40C. Nhìn chung, nhiệt độ thích

hợp để nấm sợi sinh trưởng và tổng hợp amylase trên môi trường rắn nằm trong

khoảng từ 28 – 350C.

36

4.1.6. Ảnh hưởng của độ ẩm ban đầu

Độ ẩm vừa ảnh hưởng đến sinh trưởng vừa ảnh hưởng đến trao đổi chất của vi

sinh vật trong quá trình lên men bán rắn. Trong thí nghiệm này, tiếp tục chọn tỷ lệ cám

gạo: trấu: bã đậu nành theo tỷ lệ 2:1:1 để khảo sát ảnh hưởng của độ ẩm. Bằng cách

thêm nước cất và môi trường có nồng độ dinh dưỡng X1 và pH 5 để điều chỉnh độ ẩm

các môi trường đến 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% và các bước tiếp

theo thực hiện như mục 3.3.6. Cấy dịch huyền phù bào tử A. niger với mật độ 0,8*108



tính và hàm lượng enzyme amyase thu được từ canh trường nuôi cấy. Kết quả phân

tích phương sai ANOVA cho thấy sự khác nhau giữa các nghiệm thức là có ý nghĩa.


A. niger với các độ ẩm môi trường ban đầu khác nhau.

Độ ẩm môi trường thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của A. niger là

55%. Ở môi trường có độ ẩm này hàm lượng protein và hoạt lực enzyme amylase thu

được là cao nhất (583,331 UI/g CT và 55,375 mg/g). Trong khi ở môi trường có độ ẩm

từ 40% đến 50% có hoạt lực amylase và hàm lượng protein thấp hơn nhiều. Điều này

có thể do tăng độ ẩm thích hợp có tác dụng làm cơ chất phồng lên, tăng độ xốp tạo

điều kiện cho nấm dễ dàng tiếp xúc với cơ chất hơn. Còn ở các môi trường còn lại, độ

ẩm càng cao thì cơ chất càng ướt nên kết dính vào nhau, môi trường không có độ xốp

nên ảnh hưởng đến khả năng tổng hợp enzyme của nấm mốc. Hiện tượng này có thể

37

do cơ chất quá ẩm, dẫn đến độ xốp của môi trường giảm, ngăn cản sự khuếch tán O2 từ

bên ngoài vào môi trường (theo Pandey, 1992).

Trong điều kiện sản xuất, độ ẩm ban đầu tối thích của môi trường lên men bán

rắn cho nấm sợi sinh trưởng và tổng hợp enzyme amylase là 55 – 60% và phải giữ cho

việc ổn định của độ ẩm trong suốt quá trình nuôi. Độ ẩm tăng quá 70% sẽ làm giảm độ

thoáng khí, còn thấp hơn 50% sẽ kìm hãm sự sinh trưởng và tổng hợp enzyme của vi

sinh vật. Còn nếu nuôi trong điều kiện môi trường không được vô trùng tuyệt đối cần

lưu ý độ ẩm môi trường sau khi cấy giống không được vượt quá 60%, vì cao hơn nữa

sẽ rất dễ bị nhiễm các vi sinh vật khác.

4.1.7. Ảnh hưởng của nồng độ dinh dưỡng

Cơ chất mà có khả năng cung cấp tất cả các chất dinh dưỡng cho vi sinh vật là

cơ chất lí tưởng. Tuy nhiên, nhiều chất dinh dưỡng có thể ở dưới mức tối ưu thậm chí

không có trong cơ chất, vì vậy cần bổ sung thêm các chất dinh dưỡng từ bên ngoài khi

pha chế môi trường lên men. Trong phần này chọn tỷ lệ cám gạo: trấu: bã đậu nành

theo tỷ lệ 2:1:1 và độ ẩm 55%, pH 5 và các nồng độ dinh dưỡng X1, X2, X3, X4, X5,

X6, X7, X8. Các bước tiếp theo thực hiện như mục 3.3.6. Cấy dịch huyền phù bào tử

A. niger với mật độ 0,8*108 bào tử/g vào các môi trường chuẩn bị ở trên.




Đồ thị 4.6 Biểu diễn hoạt tính amylase và hàm lượng protein từ canh trường nuôi cấy A. niger với các nồng độ dinh dưỡng trong môi trường khác nhau.

38

Hoạt lực amylase cao nhất thu được ở nồng độ môi trường dinh dưỡng X2.

Nhưng hàm lượng protein thu được hơi thấp hơn so với môi trường có nồng độ dinh

dưỡng X1, nên ở môi trường X2, hoạt tính riêng của amylase là cao nhất so với các

mức môi trường còn lại. Điều này có lẽ là do A. niger không chịu được áp suất thẩm

thấu cao từ môi trường nuôi cấy nên ở những môi trường có nồng độ dinh dưỡng quá

sẽ cao ảnh hướng đến khả năng sinh trưởng và phát triển của nấm A.niger, vì thế mà

ảnh hưởng đến khả năng tạo enzyme của chúng.

Yêu cầu cơ bản đối với thành phần môi trường dinh dưỡng nuôi nấm sợi tạo

amylase cũng giống như yêu cầu đối với môi trường nuôi vi sinh vật tạo enzyme là

tính hoàn thiện. Vì vậy, để tăng cường sự sinh trưởng của vi sinh vật cũng như tăng

khả năng tạo enzyme mong muốn, ngoài các thành phần dinh dưỡng có trong cơ chất,

môi trường nuôi cấy sẽ được bổ sung thêm các chất khoáng vi lượng và đa lượng vốn

là những cấu tử không thể thiếu cho sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật.

Nồng độ khoáng bổ sung vào môi trường phải vừa đủ, vì nếu thấp sẽ không đủ

cho nhu cầu của vi sinh vật, còn nếu cao, vi sinh vật sẽ sinh trưởng kém do không chịu

được áp suất thẩm thấu.

4.1.8. Ảnh hưởng của tỷ lệ giống

Mật độ giống đôi khi cũng có ảnh hưởng đáng kể đến sự sinh trưởng của vi sinh

vật trong lên men bán rắn. Trong thí nghiệm này, chọn tỷ lệ cám gạo: trấu : bã đậu

nành theo tỷ lệ 2:1:1 và độ ẩm 55% để khảo sát ảnh hưởng của pH. Bằng cách thêm

nước cất và môi trường có nồng độ dinh dưỡng X2 và điều chỉnh pH của chúng để có

được môi trường nuôi cấy có độ ẩm 55% và có pH 5. Các bước tiếp theo thực hiện như

mục 3.3.6. Cấy dịch huyền phù bào tử A. niger với các mật độ 0,8*108; 1,6*108;

2,4*108; 3,2*108 bào tử/g vào các môi trường chuẩn bị ở trên.

Thu nhận enzyme từ canh trường sau 28 giờ nuôi cấy, thu dịch chiết enzyme từ

canh trường, đem xác định hoạt tính và hàm lượng enzyme amyase thu được. Kết quả

phân tích phương sai ANOVA cho thấy sự khác nhau giữa các nghiệm thức là có ý

nghĩa về mặt thống kê học.

39


A. niger với các tỷ lệ giống khác nhau.

Ở môi trường có tỷ lệ giống là 0,8*108 có hoạt tính và hàm lượng là cao nhất

(619,68 IU/g CT và 51,833 mg/g). Mật độ bào tử phải là 0,8*108 để đảm bảo các tiểu

phần cơ chất phải được bao phủ bởi hệ sợi nấm nhằm hạn chế sự tạp nhiễm. Nếu tỷ lệ

giống quá cao dẫn đến sự cạnh tranh về dinh dưỡng giữa các cá thể nấm dẫn đến giảm

sự sinh trưởng và phát triển, nên hàm lượng protein và hoạt tính amylase sẽ giảm theo.

Khi vi sinh vật được nuôi trong môi trường kín, không được cung cấp môi

trường dinh dưỡng mới trong quá trình ủ, thì số lượng chất dinh dưỡng sẽ giảm và

lượng chất thải trong môi trường sẽ tăng lên. Vì vậy, cùng một lượng cơ chất ban đầu

như nhau và thu hoạch sau một thời gian nuôi cấy như nhau, nếu các nồng độ giống

cho vào là khác nhau sẽ cho các kết quả thu nhận enzyme khác nhau do khả năng sinh

trưởng của quần thể vi sinh vật cho vào.

Nếu lượng vi sinh vật cho vào thấp, thì thời gian thu hoạch vi sinh vật chưa tích

lũy đủ lượng amylase trong canh trường do thời gian sinh trưởng để đạt đến phase cấp

số quá dài. Còn nếu lượng vi sinh vật cho vào là quá nhiều, nồng độ dinh dưỡng trong

quần thể là không đủ, vì vậy chúng sẽ nhanh chóng chuyển sang phase tử vong do

thiếu dinh dưỡng và tích tụ độc tố trong môi trường.

40

Vì vậy cần tính toán lượng vi sinh vật cho vào phù hợp với môi trường nuôi cấy

để đảm bảo thu được lượng enzyme cao nhất để không rơi vào trường hợp thừa chất

dinh dưỡng hoặc thừa giống.

Sự sinh trưởng của vi sinh vật trải qua 4 giai đoạn. Đầu tiên là phase tiềm phục.

Khi vi sinh vật được đưa vào một môi trường nuôi cấy mới sẽ không có sự gia tăng

ngay lập tức số lượng hay sinh khối tế bào. Đây là lúc những thành phần mới của tế

bào được hình thành. Sau đó sẽ chuyển sang phase cấp số. Trong phase này, vi sinh

vật sẽ phát triển và phân chia với tốc độ cực đại. Sau đó quần thể vi sinh vật sẽ bước

vào phase ổn định. Sự tăng trưởng về dân số của vi sinh vật sẽ dừng lại. Lúc này quần

thể vi sinh vật đạt mật độ dân số tối đa. Kích thước quần thể phụ thuộc vào chất dinh

dưỡng, các nhân tố khác và tùy vào loại vi sinh vật. Có nhiều lí do khiến dân số vi sinh

vật đi vào phase ổn định, dễ thấy là sự giới hạn về chất dinh dưỡng và sự tích tụ chất

thải độc hại. Cuối cùng là phase tử vong, số lượng tế bào sống sẽ bị giảm do môi

trường thiếu dưỡng chất và độc tố tích tụ. Vì vậy cần phải cho một lượng giống thích

hợp vào môi trường để chúng đạt mật độ tốt nhất tại phase ổn định. Điều này sẽ làm

tăng khả năng thu enzyme từ canh trường nuôi cấy.

4.2. Khả năng sinh tổng hợp amylase của nấm mốc Mucor trên môi trường lên

men bán rắn

4.2.1. Nấm mốc Mucor

Bào tử Mucor từ ống nghiệm thạch nghiêng được cấy sang đĩa Petri và miếng

lame trong phòng ẩm chứa môi trường PGA theo phương pháp đã mô tả ở mục 3.3.3,

nuôi ủ ở nhiệt độ phòng 2 - 3 ngày.

41

(a) (b)

Hình 4.2 Hình ảnh đại thể của Mucor. (a)hình ảnh đại thể, (b) hình ảnh vi thể.

Hình ảnh đại thể cho thấy Mucor tạo khuẩn lạc hình tròn, mọc nhanh trên môi

trường PGA ở nhiệt độ phòng, có dạng nhung, có tơ mịn. Khuẩn lạc còn non có màu

trắng đục, khi già chuyển sang màu trắng sữa, có tơ dài.

Hình ảnh vi thể quan sát được cho thấy Mucor có cuống bào tử phân nhánh

và mọc lên ở bất kì chỗ nào của sợi nấm, bào tử đính nằm trong bọc bào tử. Bọc bào

tử dạng tròn hoặc hình quả lê, chứa nhiều bào tử ở phía trong.

4.2.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ cám gạo: bã đậu nành: trấu

Tiến hành pha chế các môi trường có tỷ lệ cơ chất cám gạo: trấu: bã đậu nành

khác nhau, làm ẩm với nước có bổ sung dung dịch dinh dưỡng với nồng độ X1 để đạt

độ ẩm 55%, chỉnh về pH 5. Các bước tiếp theo thực hiện như mục 3.3.6. Cấy dịch

huyền phù bào tử Mucor với mật độ 0,8*108 bào tử/g vào các môi trường chuẩn bị.





Mucor với các tỷ lệ cơ chất khác nhau.

Hàm lượng protein thu được cao nhất ở môi trường có tỷ lệ cám: trấu: bã đậu

nành là 1:1:2, nhưng ở môi trường này, hoạt tính amylase thu được lại là thấp nhất.

Điều này cho thấy, với tỷ lệ bã đậu nành trong môi trường cao, nấm Mucor sẽ sinh

42

tổng hợp loại enzyme khác phù hợp với cơ chất cảm ứng là bã đậu nành. Trong môi

trường có tỷ lệ cám: trấu: bã đậu nành là 2:1:1, hàm lượng protein thu được cũng

tương đối cao, và hoạt tính amylase thu được là cao nhất (20,651 mg/g và 250,999

UI/g CT). Điều này chứng tỏ đây là môi trường có tỷ lệ cơ chất thích hợp nhất cho

việc cảm ứng Mucor sinh tổng hợp enzyme amylase. Dù bã đậu nành có thể sẽ kích

thích Mucor tạo enzyme không mong muốn, nhưng với số lượng ít trong môi trường

nó có tác dụng bổ sung thêm nguồn Nitơ cho môi trường nuôi cấy.

Nồng độ carbon và các nguồn carbon khác nhau có ảnh hưởng lớn đến sự tạo

thành các enzyme riêng biệt của hệ enzyme amylase khi nuôi nấm mốc. Trong đó, để

đảm bảo có hoạt lực α-amylase cao cần có ít nhất 6% tinh bột, còn muốn có hoạt lực

oligo-1,6-glucosidase cao chỉ cần 2% tinh bột. Bột đậu nành sẽ ức chế việc tạo thành

α-amylase, nhưng lại kích thích mạnh mẽ oligo-1,6-glucosidase.

Tuy cám gạo và bã đậu nành là phế liệu của các ngành công nghiệp, nhưng cả

hia đều tương đối đắt tiền. Hơn nữa trong quá trình nuôi vi sinh vật, nguồn dinh dưỡng

không được sử dụng hết, vì thể có thể thay một phần cám và bã bằng các cấu tử rẻ tiền

hơn, như trấu chẳng hạn. Cấu tử bổ xung này sẽ góp phần làm xốp môi trường. Có thể

dùng cặn bã của canh trường rắn sau khi li trích enzyme làm cấu tử chính của canh

trường nuôi cấy nhưng phải đảm bảo chế độ tiệt trùng. Cám và các chất phụ gia chứa

nhiều bào tử của các vi sinh vật khác nên cần thanh trùng kĩ để bảo đảm chúng nuôi

phát triển bình thường và canh trường sản xuất không chứa vi sinh vật ngoại lai.

Tỷ lượng giữa carbon và nitơ cũng có ý nghĩa rất lớn đối với sự sinh tổng hợp

enzyme amylase từ vi sinh vật. Chỉ khi nào trong môi trường có đủ lượng carbon và

nitơ cần thiết mới tích lũy được lượng enzyme amylase cực lớn. vì vậy, trong môi

trường có tỷ lệ cơ chất là 2 cám: 1 trấu: 1bã đậu nành có được tỷ lệ giữa carbon và nitơ

thích hợp nhất, vì vậy, lượng enzyme và hoạt tính amylase thu được ở canh trường này

là cao nhất.

4.2.3. Ảnh hưởng của pH

Chọn tỷ lệ cám gạo: trấu: bã đậu nành theo tỷ lệ 2:1:1, khảo sát ảnh hưởng của

pH. Thêm nước cất, môi trường dinh dưỡng để môi trường nuôi cấy có nồng độ dinh

dưỡng X1, và độ ẩm 55%. Điều chỉnh pH để có môi trường nuôi cấy có pH từ 2 đến 8.

Các bước tiếp theo thực hiện như mục 3.3.6. Cấy dịch huyền phù bào tử Mucor với

mật độ 0,8*108 bào tử/g vào các môi trường chuẩn bị ở trên.

43





Mucor với các pH môi trường khác nhau.

Hoạt tính và hàm lượng thu được từ môi trường pH5 là cao nhất (23,046 mg/g

và 263,427 UI/g CT). Ở các môi trường có pH 4 và pH 6, hàm lượng protein và hoạt

tính amylase cũng tương đối cao hơn những môi trường còn lại. Vậy có lẽ pH từ 4 đến

6 trong môi trường ban đầu là thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của Mucor.

Trong môi trường có pH 2, cả giá trị hàm lượng và hoạt tính thu được đều thấp, có thể

do Mucor không sinh trưởng được trong môi trường có tính chất acid qua mạnh. Ở

môi trường pH 7 và 8, hoạt tính amylase thu được là thấp nhưng hàm lượng protein

trong canh trường vẫn tương đối cao do lượng protein có sẵn trong môi trường. Và từ

biểu đồ trên ta cũng thấy được sự ảnh hưởng của pH đến sự ion hóa của cơ chất và độ

bền bên trong cơ chất.

pH có ảnh hưởng rõ rệt lên sự tăng trưởng của vi sinh vật. Mỗi loài chỉ phát

triển trong một khoảng pH xác định. Đa số nấm mốc phát triển trong môi trường hơi

acid và chúng là những vi sinh vật ưa acid thuộc nhóm acidophile.

Mặc dù chúng sống trong pH acid yếu, nhưng chúng lại có pH nội bào gần với

giá trị trung tính. Đây có thể là kết quả của sự thẩm thấu của các proton qua màng tế

bào chất. Có thể là các ion OH- và H+ bị loại ra bên ngoài để duy trì một pH nội bào

44

phù hợp. Thê nhưng pH môi trường trong len men bán rắn lại ít bị thay đổi trong suốt

quá trình nuôi cấy do chúng có một hệ đệm tốt.

Nấm mốc tuy có khả năng sinh trưởng trong vùng pH tương đối rộng, tuy nhiên

vẫn có mức giới hạn cho sự chịu đựng của chúng. Những thay đổi mạnh về pH của

môi trường ngoài cũng có thể làm biế đổi sự ion hóa các phân tử dưỡng chất và phản

ứng khử của chúng sẽ làm cho nấm bị thiếu chất dinh dưỡng.

4.2.4. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy


độ ẩm 55%. Thêm nước cất và môi trường có nồng độ dinh dưỡng X1 và điều chỉnh

pH của chúng để có được môi trường nuôi cấy có độ ẩm 55% và có pH 5. Các bước

tiếp theo thực hiện như mục 3.3.6. Cấy dịch huyền phù bào tử Mucor với mật độ

0,8*108 bào tử/g vào các môi trường chuẩn bị ở trên.

Thu nhận enzyme từ canh trường ở các mốc thời gian khác nhau: sau 8 giờ, 12

giờ, 16 giờ, 20 giờ, 24 giờ, 28 giờ, 32 giờ, 36 giờ, 40 giờ và sau 44 giờ nuôi cấy, thu

dịch chiết enzyme từ canh trường, đem xác định hoạt tính và hàm lượng enzyme

amyase thu được. Kết quả phân tích phương sai ANOVA cho thấy sự khác nhau giữa

các nghiệm thức là có ý nghĩa.


Mucor với các mốc thời gian thu nhận khác nhau.

Thời gian thích hợp nhất để thu amylase từ môi trường nuôi cấy Mucor là 32

giờ sau khi cấy (34,084 mg/g và 414,722 UI/g CT). Khoảng thời gian từ sau 28 giờ

45

cấy, Mucor bắt đầu sinh tổng hợp mạnh mẽ enzyme amylase. Trước đó, lượng amylase

thu được không nhiều và hoạt tính cũng không cao. Nhưng từ sau 36 giờ nuôi cấy,

hoạt tính amylase giảm nhanh chóng, song hàm lượng protein lại giảm chậm hơn, điều

lày có thể do từ sau 36 giờ nuôi cấy, Mucor chuyển sang dạng bào tử nên hàm lượng

amylase không còn nhiều trong canh trường, dẫn dến hoạt tính của amylase giảm. Vậy

thời gian nuôi cấy có ý nghĩa rất quan trọng trong việc thu nhận amylase từ môi trường

nuôi cấy vi sinh vật.

Theo lý thuyết hiện đại thì giữa vận tốc sinh trưởng riêng của vi sinh vật và tốc

độ sinh tổng hợp enzyme có mối tương quan phụ thuộc. Kiểu phụ thuộc thứ nhất là

vận tốc sinh trưởng của vi sinh vật hoàn toàn phù hợp chính xác với vận tốc sinh tổng

hợp enzyme. Kiểu phụ thuộc thứ hai là ngoài sự tổng hợp enzyme trong pha sinh

trưởng, còn có sự tổng hợp enzyme thêm. Sự tạo thêm này không liên quan tỷ lệ thuận

với sự sinh trưởng của vi sinh vật. Sự tạo thêm này được thực hiện bởi các tế bào

chuyển sang quá trình tự phân và phụ thuộc vào độ bền vững của các ribonucleic acid

thông tin. Như vậy là khả năng không trùng khớp của các giai đoạn sinh trưởng với

giai đoạn sinh tổng hợp enzyme được xác đinh bằng độ bền của ribonucleic acid thông

tin (ribonucleic acid khuôn). Vì vậy mà qua trình tích lũy enzyme cực đại trong canh

trường chỉ xảy ra sau quá trình sinh sản của nấm.

Thời gian nuôi để tạo lượng amylase cực lớn thường được xác định bằng thực

nghiệm. Tùy thuộc tính chất sinh sinh lí của từng vi sinh vật và sự ngừng tổng hợp

enzyme mà có thể ngừng sinh trưởng của nấm mốc vào bất kì lúc nào thấy cần thiết.

Sự tạo bào tử là hiện tượng không mong muốn vì t làm giảm hoạt lực của enzyme.

4.2.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ


độ ẩm 55%. Thêm nước cất và môi trường có nồng độ dinh dưỡng X1 và điều chỉnh

pH của chúng để có được môi trường nuôi cấy có độ ẩm 55% và có pH 5. Các bước

tiếp theo thực hiện như mục 3.3.6. Cấy dịch huyền phù bào tử Mucor với mật độ 8*108


Đem nuôi cấy trong các tủ sấy với các nhiệt độ như sau: 300C, 350C, 400C,

450C, 500C và 550C, thu dịch chiết enzyme từ canh trường sau 32 giờ, đem xác định

hoạt tính và hàm lượng enzyme amyase thu được. Kết quả phân tích phương sai

ANOVA cho thấy sự khác nhau giữa các nghiệm thức là có ý nghĩa.

46


Mucor với các nhiệt độ nuôi cấy khác nhau.

Nhiệt độ tối ưu cho sự sinh tổng hợp amylase là 300C, ở nhiệt độ này hàm

lượng và hoạt tính đều cao. Chứng tỏ tỷ lệ hàm lượng amylase trong canh trường khi

Mucor được nuôi ở 300C là tốt nhất. Hàm lượng và hoạt tính amylase giảm nhanh

chóng ở những môi trường nuôi cấy trên 400C, do nhiệt độ cao ức chế khả năng sinh

trưởng của Mucor. Đến 550C, lượng protein còn rất thấp, kéo theo hoạt tính của

amylase trong môi trường cũng rất thấp.

Cũng như mọi sinh vật sống, nấm mốc cũng chịu ảnh hưởng sâu sắc của nhiệt

độ môi trường. Chúng đặc biệt nhạy cảm do có cấu tạo đơn bào và tính biến nhiệt. Vì

thế mà có sự biến thiên rất mạnh của hoạt tính enzyme khi có sự thay đổi của nhiệt độ

nuôi cấy. Thân nhiệt của cơ thể nấm phản ánh trực tiếp nhiệt độ của môi trường.

Một trong những nhân tố quan trọng nhất có liên quan đến tác động của nhiệt

độ trên sự tăng trưởng, đó là nhiệt cảm ứng của những phản ứng thủy phân được xúc

tác bởi enzyme. Ở mức nhiệt độ thấp, sự tăng nhiệt độ sẽ tỉ lệ thuận với sự tăng vận

tốc tăng trưởng. Khi đó hoạt động biến dưỡng sẽ được gia tăng và vi sinh vật cũng sẽ

phát triển nhanh hơn. Nhưng nếu vượt quá một điểm nào đó (điểm tối ưu), sự tăng

trưởng của sinh vật sẽ giảm và nếu tiếp tục tăng nhiệt độ sẽ gây chết vi sinh vật. Nhiệt

độ cao sẽ làm các vi sinh vật bị tổn thương do enzyme bị biến tính, đồng thời cũng ảnh

hưởng rất lớn đến các hệ thống vận chuyển và các protein khác. Nếu các enzyme chức

47

năng hoạt động với vận tốc nhanh hơn ở nhiệt độ cao vi sinh vật có thể bị tổn thương

và sự tăng trưởng sẽ bị ức chế.

Sự tăng trưởng của nấm nói riêng và của vi sinh vật nói chung phụ thuộc đặc

biệt vào nhiệt độ. Có ba mức của nhiệt sinh trưởng, gồm nhiệt độ tối thiểu, nhiệt độ tối

đa và nhiệt độ tối thích. Và dù đường cong tăng trưởng theo nhiệt độ có thể biến đổi,

nhưng nhiệt độ tối thích bao giờ cũng gần với nhiệt độ tối đa hơn là nhiệt độ tối thiểu.

Tuy nhiên, nhiệt độ sinh trưởng cũng còn phụ thuộc nhiều vào các yếu tố khác của môi

trường nuôi cấy như pH, chất dinh dưỡng có sẵn.

4.2.6. Ảnh hưởng của độ ẩm ban đầu

Độ ẩm vừa ảnh hưởng đến sinh trưởng vừa ảnh hưởng đến trao đổi chất của vi

sinh vật trong quá trình lên men bán rắn. Trong thí nghiệm này, chọn tỷ lệ Cám gạo:

trấu: bã đậu nành theo tỷ lệ 2:1:1 để khảo sát ảnh hưởng của độ ẩm. Thêm nước cất và

môi trường có nồng độ dinh dưỡng X1 và pH 5 để điều chỉnh độ ẩm các môi trường

đến 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, các bước tiếp theo thực hiện như

mục 3.3.6. Cấy dịch huyền phù bào tử Mucor với mật độ 0,8*108 bào tử/g vào các môi

trường chuẩn bị ở trên.

Sau 32h nuôi cấy, thu dịch chiết enzyme từ canh trường, đem xác định hoạt tính

và hàm lượng enzyme amyase thu được. Kết quả phân tích phương sai ANOVA cho

thấy sự khác nhau giữa các nghiệm thức là có ý nghĩa.

Đồ thị 4.12 Biểu diễn hoạt tính amylse và hàm lượng protein từ canh trường nuôi cấy Mucor với các độ ẩm môi trường ban đầu khác nhau.

48

Hoạt tính amylase và hàm lượng protein cao nhất thu được từ môi trường có độ

ẩm ban đầu là 55%. Sau đó độ ẩm giảm mạnh có thể do môi trường quá ẩm nên ngăn

cản sự khuếch tán O2 vào môi trường. Còn trước đó, hàm lượng và hoạt tính lại có xu

hướng tăng dần vì khi tăng độ ẩm trong phạm vi thích hợp kéo theo tốc độ sinh trưởng

và tiêu thụ O2 tăng theo, nhờ đó, amylase cũng được sinh ra nhiều hơn.

Trong điều kiện sản xuất, độ ẩm ban đầu tối thích của môi trường lên men bán

rắn cho nấm sợi sinh trưởng và tổng hợp enzyme amylase là 55 – 60% và phải giữ cho

việc ổn định của độ ẩm trong suốt quá trình nuôi. Độ ẩm tăng quá 70% sẽ làm giảm độ

thoáng khí, còn thấp hơn 50% sẽ kìm hãm sự sinh trưởng và tổng hợp enzyme của vi

sinh vật. Còn nếu nuôi trong điều kiện môi trường không được vô trùng tuyệt đối cần

lưu ý độ ẩm môi trường sau khi cấy giống không được vượt quá 60%, vì cao hơn nữa

sẽ rất dễ bị nhiễm các vi sinh vật khác.

4.2.7. Ảnh hưởng của nồng độ dinh dưỡng

Do nhiều chất dinh dưỡng có thể ở dưới mức tối ưu thậm chí không có trong cơ

chất đang sử dụng, nên cần bổ sung thêm các chất dinh dưỡng từ bên ngoài khi pha

chế môi trường lên men. Trong phần này chọn tỷ lệ cám gạo: trấu: bã đậu nành theo tỷ

lệ 2:1:1 và độ ẩm 55%, pH 5 và các nồng độ dinh dưỡng X1, X2 , X3, X4, X5, X6,

X7, X8. Các bước tiếp theo thực hiện như mục 3.3.6. Cấy dịch huyền phù bào tử

Mucor với mật độ 0,8*108 bào tử/g vào các môi trường chuẩn bị ở trên.


tính và hàm lượng enzyme amyase thu được. Kết quả thu nhận ở đồ thị 4.13. Kết quả


nghĩa về mặt thống kê học.

Nồng độ dinh dưỡng X3 là thích hợp nhất cho sự tổng hợp enzyme amylase. Ở

nồng độ dinh dưỡng này, hàm lượng protein và hoạt tính amylase thu được đều cao

nhất (43,391 mg/g và 488,279 UI/g CT). Sau đó thì hàm lượng và hoạt tính đều giảm

dần, có thể là do nồng độ thẩm thấu của môi trường ảnh hưởng lên Mucor.

49

Đồ thị 4.13 Biểu diễn hoạt tính amylse và hàm lượng protein từ canh trường nuôi cấy

Mucor với các nồng độ dinh dưỡng trong môi trường khác nhau.

Nồng độ dinh dưỡng X3 là thích hợp nhất cho sự tổng hợp enzyme amylase. Ở

nồng độ dinh dưỡng này, hàm lượng protein và hoạt tính amylase thu được đều cao

nhất (43,391 mg và 488,279 UI/g CT). Sau đó thì hàm lượng và hoạt tính đều giảm

dần, có thể là do nông độ thẩm thấu của môi trường ảnh hưởng lên Mucor.

Yêu cầu cơ bản đối với thành phần môi trường dinh dưỡng nuôi nấm sợi tạo

amylase cũng giống như yêu cầu đối với môi trường nuôi vi sinh vật tạo enzyme là

tính hoàn thiện. Vì vậy, để tăng cường sự sinh trưởng của vi sinh vật cũng như tăng

khả năng tạo enzyme mong muốn, ngoài các thành phần dinh dưỡng có trong cơ chất,

môi trường nuôi cấy sẽ được bổ sung thêm các chất khoáng vi lượng và đa lượng vốn

là những cấu tử không thể thiếu cho sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật.

Vi sinh vật chịu ảnh hưởng rất lớn nếu thay đổi nồng độ thẩm thấu của môi

trường sống. Điều này là do nó chỉ được phân cách với môi trường bằng một màng

bán thấm chọn lọc. Nếu cho nồng độ dinh dưỡng vào môi trường qua niều háy quá ít

sẽ ảnh hưởng lớn đến áp suất thẩm thấu gây hại cho tế bào sinh vật. Nếu vi sinh vật

sống trong môi trường có nồng độ dinh dưỡng quá cao, nước sẽ từ cơ thể sinh vật thoát

ra noài môi trường. Khi đó, tế bào và màng tế bào sẽ co lại – đây là quá trình co

nguyên sinh. Và như vậy, tế bào sẽ bị mất nước và màng tế bào bị tổn thương. Điều

này làm tế bào bị bất hoạt về mặt biến dưỡng và sẽ ngừng phát triển.

50

Nước có sẵn của vi sinh vật có thể bị giảm, là do sự tương tác với các phân tử

chất tan hoặc sự hấp thu lên bề mặt các chất rắn. Nồng độ thẩm thấu của môi trường

sống có ảnh hưởng lớn lên vi sinh vật và được dùng để diễn tả mức độ nước có sẵn.

Các nhà vi sinh vật học thường gọi đó là độ hoạt động của nước. Các vi sinh vật khác

nhau đáng kể về khả năng thích ứng với môi trường ngoại cảnh có độ hoạt đọngcủa

nước thấp. Tuy nhiên đa số vi sinh vật chỉ sinh sản tốt tại độ hoạt động của nước

khoảng 0,98 (xấp xỉ giá trị của nước biển). Vì vậy nếu nồng độ dinh dững quá cao sẽ

là tăng độ hoạt động của nước, ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và tổng hợp enzyme.

4.2.8. Ảnh hưởng của tỷ lệ giống

Mật độ giống đôi khi cũng có ảnh hưởng đáng kể đến sự sinh trưởng của vi sinh

vật trong lên men bán rắn. Với thí nghiệm này, chọn tỷ lệ Cám gạo: trấu: bã đậu nành

theo tỷ lệ 2:1:1 và độ ẩm 55%.Thêm nước cất và môi trường có nồng độ dinh dưỡng

X3, điều chỉnh pH của chúng để có được môi trường nuôi cấy có độ ẩm 55% và có pH

5. Các bước tiếp theo thực hiện như mục 3.3.6. Cấy dịch huyền phù bào tử Mucor với

các mật độ 0,8*108; 1,6*108; 2,4*108; 3,2*108 bào tử/g vào các môi trường chuẩn bị.

Thu nhận enzyme từ canh trường sau 32 giờ nuôi cấy, thu dịch chiết enzyme từ

canh trường, đem xác định hoạt tính và hàm lượng enzyme amyase thu được. Kết quả


nghĩa xét về mặt thống kê học.

Đồ thị 4.14 Biểu diễn hoạt tính amylse và hàm lượng protein từ canh trường nuôi cấy Mucor với các nồng độ giống cho vào môi trường khác nhau.

51

Ở môi trường có tỷ lệ giống là 1,6*108 có hoạt tính và hàm lượng là cao nhất

(522,643 IU/g CT và 44,991 mg/g). Mật độ bào tử 1,6*108 đảm bảo các tiểu phần cơ

chất phải được bao phủ bởi hệ sợi nấm nhằm hạn chế sự tạp nhiễm, và cũng vừa đủ để

không xảy ra sự cạnh tranh về dinh dưỡng giữa các cá thể nấm nên không bị ức chế sự

sinh trưởng và phát triển của chúng.

Sự sinh trưởng của vi sinh vật trải qua 4 giai đoạn. Đầu tiên là phase tiềm phục.

Khi vi sinh vật được đưa vào một môi trường nuôi cấy mới sẽ không có sự gia tăng

ngay lập tức số lượng hay sinh khối tế bào. Đây là lúc những thành phần mới của tế

bào được hình thành. Sau đó sẽ chuyển sang phase cấp số. Trong phase này, vi sinh

vật sẽ phát triển và phân chia với tốc độ cực đại. Sau đó quần thể vi sinh vật sẽ bước

vào phase ổn định. Sự tăng trưởng về dân số của vi sinh vật sẽ dừng lại. Có nhiều lí do

khiến dân số vi sinh vật đi vào phase ổn định, dễ thấy là sự giới hạn về chất dinh

dưỡng và sự tích tụ chất thải độc hại. Cuối cùng là phase tử vong, số lượng tế bào sống

sẽ bị giảm do môi trường thiếu dưỡng chất và độc tố tích tụ. Nếu lượng vi sinh vật cho

vào thấp, thì thời gian thu hoạch vi sinh vật chưa tích lũy đủ lượng amylase trong canh

trường do thời gian sinh trưởng để đạt đến phase cấp số quá dài. Còn nếu lượng vi sinh

vật cho vào là quá nhiều, nồng độ dinh dưỡng trong quần thể không đủ, vì vậy chúng

sẽ chuyển sang phase tử vong do thiếu dinh dưỡng và tích tụ độc tố trong môi trường.

4.3. Qui hoạch thực nghiệm

4.3.1. Xác định giá trị tối ưu của một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng

hợp amylase của A. niger và Mucor

Sau khi thực hiện các thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố như bên

trên, nhận thấy rằng các yếu tố pH, độ ẩm ban đầu, nồng độ dinh dưỡng và thời gian

nuôi cấy có tác động mạnh. Vì vậy ta bố trí qui hoạch thực nghiệm để nghiên cứu khả

năng tác động tổng hợp của các yếu tố này.

52

4.3.1.1. Xác định giá trị tối ưu của một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp amylase của A. nigerBảng 4.1 Mã hóa các biến số các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp amylase của A. niger

Các biến số Mức dưới

(-)

Mức cơ sở

(0)

Mức trên

(+)

X1: pH pH 4 pH 5 pH 6

X2: Thời gian nuôi cấy (h) 20 28 36

X3: Độ ẩm ban đầu (%) 45% 55% 65%

X4: nồng độ dinh dưỡng X1 X2 X3

Bảng 4.2 Ma trận kế hoạch hóa đối với TĐY-24

Số thí nghiệm

Biến số mã hóa Kí hiệu hàng (các yếu tố và tác dụng tương hỗ của chúng)X1 X2 X3 X4

1 - - - - "1"2 + - - - X1

3 - + - - X2

4 + + - - X1X2

5 - - + - X3

6 + - + - X1X3

7 - + + - X2X3

8 + + + - X1X2X3

9 - - - + X4

10 + - - + X1X4

11 - + - + X2X4

12 + + - + X1X2X4

13 - - + + X3X4

14 + - + + X1X3X4

15 - + + + X2X3X4

16 + + + + X1X2X3X4

17 0 0 0 0

Từ bảng trên, tiến hành chuẩn bị 17 môi trường mà trong đó có đủ các yếu tố

khảo sát ở trên hai mức. Cấy dịch huyền phù bào tử A. niger với mật độ 0,8*108 bào

tử/g môi trường. Sau thời gian nuôi cấy theo bảng 4.16 tiến hành li trích enzyme

53

Bảng 4.3 Hoạt lực amylase của A. niger theo thực nghiệm và phương trình hồi qui

Stt thí nghiệm

Biến số mã hóa

X1 X2 X3 X4 Y Y^

1 - - - - 435.331 435.94682 + - - - 395.221 395.83683 - + - - 412.149 411.53284 + + - - 384.872 384.25565 - - + - 212.273 210.696456 + - + - 210.185 208.608057 - + + - 262.625 264.201958 + + + - 259.129 260.705959 - - - + 261.129 262.7059510 + - - + 356.950 358.5271511 - + - + 377.451 375.8740512 + + - + 352.539 350.9624513 - - + + 197.898 197.281614 + - + + 188.092 187.475615 - + + + 189.58 190.196416 + + + + 157.949 158.565617 0 0 0 0 621.4618 0 0 0 0 625.66919 0 0 0 0 623.132

Phương trình hồi qui có dạng:

Yî=bo+b1X1+b2X2+b3X3+b4X4+b12X1X2+b13X1X3+b14X1X4+b23X2X3

+b24X2X4+b34X3X4+b123X1X2X3+b124X1X2X4+b134X1X3X4+b234X2X3X4

+b1234X1X2X3X4

Các hệ số trong phương trình hồi qui như sau:

16

Σxjiyi i=1

bj = 16

Các hiệu ứng tương tác được xác định như những hiệu ứng tuyến tính

54

16

Σ(xj xi)iyii=1

bjl = 16

Theo công thức trên ta tính được các hệ số của phương trình hồi qui như sau:

b1 = -2.719 b24 = 0.480

b2 = 8.701 b34 = 4.301

b3 = -81.12 b123 = 5.291

b4 = -30.64 b124 = -9.624

b12 = -8.196 b134 = -10.88

b13 = -3.159 b234 = -17.7

b14 = 6.403 b1234 = 7.072

b23 = -1.096 b0 = 290.84

Đánh giá về mặt thống kê học ý nghĩa của các hệ số hồi qui theo tiêu chuẩn Student.

- Giá trị trung bình của ba thí nghiệm tại tâm:

y1o + y2

o + y3

o

yo = = 623.419 n – 1

- Phương sai tái hiện:

Sth = 2.12111268

- Phương sai các hệ số:

Sth

Sbj = = 0.53027817 (với N = 16)

- Đánh giá mức ý nghĩa theo tiêu chuẩn Student:

bj

tbj = > tlt bbj có ý nghĩa Sbj

Với mức tlt : ở mức p = 0,05, bậc tự do f = n-1 = 2)

tlt = t(0,05;2) = 4,3 (tra bảng student)

55

Ta tính được các mức ý nghĩa như sau:

t1 = 5.127 > 4,3 t24 = 0.906 <4,3

t2 = 16.408 > 4,3 t34 = 8.110 > 4,3

t3 = 152.975 > 4,3 t123 = 9.979 > 4,3

t4 = 57.776 > 4,3 t124 = 18.149 > 4,3

t12 = 15.456 > 4,3 t134 = 20.526 > 4,3

t13 = 5.957 > 4,3 t234 = 33.378 > 4,3

t14 = 12.074 > 4,3 t1234 = 13.336 > 4,3

t23 = 2.067 <4,3 t0 = 548.459 > 4,3

Vì t23 và t24 đều nhỏ hơn 4,3 (t(0,05;2)) nên b23 và b24 bị loại ra khỏi phương trình

hồi qui do không có ý nghĩa.

Vậy phương trình hồi qui như sau:

Yî=290.84-2.719X1+8.701X2-81.12X3-30.64X4

-8.196X1X2-3.159X1X3+7.403X1X4+4.3015X3X4

+5.291X1X2X3-9.624X1X2X4-10.88X1X3X4

-17.7X2X3X4+7.072X1X2X3X4 (4.1)

Đánh giá mức độ tương thích của phương trình theo tiêu chuẩn Fisher.

- Tính các giá trị y^: kết quả trình bày ở bảng 4.17.- Phương sai tương thích:

16

Σ(yi - yi^)2

i=1

S2tt = = 9.4309

N-l với N : số thí nghiệm = 16

l: số hệ số có nghĩa = 14

Ta có: S2tt

Ftn = = 2.09617504 S2

th

- Giá trị chuẩn Fisher ở mức p = 0.05; f1 = N-l; f2 = n-1 là:

F lt (0,05;2;2 )= 19,0

=> Ftn < F lt

Vậy phương trình hồi qui 4.1 tương thích với thực nghiệm.

56

Trong bốn yếu tố tác động đến khả năng sinh tổng hợp amylase của A. niger,

yếu tố độ ẩm ban đầu có tác động lớn nhất (b3 = -81,12), tiếp theo là nồng độ dinh

dưỡng (b4 = -30,64), thời gian (b2 = 8,701), và cuối cùng là pH (b1 = -2,719).

Xét về sự tương tác các yếu tố, kết quả cho thấy cả 4 yếu tố đều có sự tương

tác với nhau. Trong đó, sự tương tác giữa yếu tố thời gian, độ ẩm ban đầu và nồng độ

dinh dưỡng là có tương tác lớn nhất (b234 = 14,539).

4.3.1.2. Xác định giá trị tối ưu của một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh

tổng hợp amylase của Mucor

Bảng 4.4 Mã hóa các biến số các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp

amylase của Mucor

Các biến số Mức dưới(-)

Mức cơ sở (0)

Mức trên(+)

X1: pH pH 4 pH 5 pH 6X2: Thời gian nuôi cấy (h) 24 32 40X3: Độ ẩm ban đầu (%) 45% 55% 65%X4: nồng độ dinh dưỡng X1 X3 X5

Bảng 4.5 Ma trận kế hoạch hóa đối với TĐY-24

Số thí nghiệm

Biến số mã hóa Kí hiệu hàng (các yếu tố và tác dụng tương hỗ của chúng)X1 X2 X3 X4

1 - - - - "1"2 + - - - X1

3 - + - - X2

4 + + - - X1X2

5 - - + - X3

6 + - + - X1X3

7 - + + - X2X3

8 + + + - X1X2X3

9 - - - + X4

10 + - - + X1X4

11 - + - + X2X4

12 + + - + X1X2X4

13 - - + + X3X4

14 + - + + X1X3X4

15 - + + + X2X3X4

16 + + + + X1X2X3X4

17 0 0 0 0

57

Từ bảng trên, tiến hành chuẩn bị 17 môi trường mà trong đó có đủ các yếu tố

khảo sát ở trên hai mức. Cấy dịch huyền phù bào tử Mucor với mật độ 1,6*108 bào

tử/g môi trường. Sau thời gian nuôi cấy theo bảng 4.5 tiến hành li trích enzyme

amylase từ canh trường.

Bảng 4.6 Hoạt lực amylase của Mucor theo thực nghiệm và theo phương trình hồi qui

Stt thí nghiệm

Biến số mã hóa

X1 X2 X3 X4 Y Y^

1 - - - - 384.107 384.13582 + - - - 295.175 295.1473 - + - - 193.030 191.85014 + + - - 172.615 173.79525 - - + - 218.142 218.58746 + - + - 161.876 161.43147 - + + - 179.793 180.50048 + + + - 100.464 99.757729 - - - + 255.177 253.997310 + - - + 177.848 179.028211 - + - + 149.388 149.417112 + + - + 145.4104 145.381913 - - + + 158.206 158.912614 + - + + 147.338 146.631315 - + + + 110.523 110.967616 + + + + 75.544 75.0995617 0 0 0 0 480.13718 0 0 0 0 485.27919 0 0 0 0 479.215

Phương trình hồi qui có dạng:

Yî=bo+b1X1+b2X2+b3X3+b4X4+b12X1X2+b13X1X3+b14X1X4+b23X2X3

+b24X2X4+b34X3X4+b123X1X2X3+b124X1X2X4+b134X1X3X4+b234X2X3X4

+b1234X1X2X3X4

Các hệ số trong phương trình hồi qui như sau:

16

Σxjiyi i=1

bj = 16

58

Các hiệu ứng tương tác được xác định như những hiệu ứng tuyến tính

16

Σ(xj xi)iyii=1

bjl = 16

Theo công thức trên ta tính được các hệ số của phương trình hồi qui như sau:

b1 = -23.256 b24 = 9.731

b2 = -41.944 b34 = 9.277

b3 = -38.804 b123 = -11.815

b4 = -30.361 b124 = 0.237

b12 = 5.9184 b134 = 3.857

b13 = 0.576 b234 = -12.195

b14 = 7.362 b1234 = -0.367

b23 = 14.539 b0 = 182.79

Đánh giá về mặt thống kê học ý nghĩa của các hệ số hồi qui theo tiêu chuẩn Student.

- Giá trị trung bình của ba thí nghiệm tại tâm:

y1o + y2

o + y3

o

yo = = 481.54 n – 1

- Phương sai tái hiện:

3

Σ(yoi - yo)2

i=1

S2th = = 10.677 (với n = 3)

n-1 Sth = 3.2676

- Phương sai các hệ số:

Sth

Sbj = = 0.8169 (với N = 16)

- Đánh giá mức ý nghĩa theo tiêu chuẩn Student:

bj

tbj = > tlt bbj có ý nghĩa Sbj

59

Với mức tlt : ở mức p = 0,05, bậc tự do f = n-1 = 2

tlt = t(0,05;2) = 4,3 (tra bảng student)

Ta tính được các mức ý nghĩa như sau:

t1 = 28.468 > 4,3 t24 = 11.912 >4,3

t2 = 51.345 > 4,3 t34 = 11.357 > 4,3

t3 = 47.502 > 4,3 t123 = 14.463 > 4,3

t4 = 37.166 > 4,3 t124 = 0.289 < 4,3

t12 = 7.245 > 4,3 t134 = 4.721 > 4,3

t13 = 0.705 < 4,3 t234 = 14.929 > 4,3

t14 = 9.012 > 4,3 t1234 = 0.449 < 4,3

t23 = 17.798 >4,3 t0 = 223.762 > 4,3

Vì t13, t124 và t1234 đều nhỏ hơn 4,3 (t(0,05;2)) nên b13, b124 và b1234 bị loại ra khỏi

phương trình hồi qui do không có ý nghĩa.

Vậy phương trình hồi qui như sau:

Yî=182.79-23.256X1-41.944X2-38.804X3-30.361X4+5.918X1X2

+7.362X1X4+14.539X2X3+9.731X2X4+9.277X3X4

-11.815X1X2X3+3.857X1X3X4 -12.195X2X3X4 (4.2)

Đánh giá mức độ tương thích của phương trình theo tiêu chuẩn Fisher.

- Tính các giá trị y^: kết quả trình bày ở bảng 4.20.

- Phương sai tương thích:

16

Σ(yi - yi^)2

i=1

S2tt = = 2.8568

N-l với N : số thí nghiệm = 1, l: số hệ số có nghĩa = 13.

Ta có: S2tt

Ftn = = 0.2676 S2

th

- Giá trị chuẩn Fisher ở mức p = 0.05; f1 = N-l; f2 = n-1 là:

F lt (0,05;3;2 )= 19,2

=> Ftn < F lt

Vậy phương trình hồi qui 4.2 tương thích với thực nghiệm.

60

Trong bốn yếu tố tác động đến khả năng sinh tổng hợp amylase của

Mucor, yếu tố thời gian có tác động lớn nhất (b2 = -41,944), tiếp theo là độ ẩm

ban đầu (b3 = -38, 804), nồng độ dinh dưỡng (b4 = -30,361), và cuối cùng là pH

(b1 = -23,256).

Xét về sự tương tác các yếu tố, kết quả cho thấy cả 4 yếu tố đều có sự

tương tác với nhau. Trong đó, sự tương tác giữa yếu tố thời gian và độ ẩm ban

đầu là có tương tác lớn nhất (b23 = 14,539).

61

Chương 5

KẾT LUÂN VÀ ĐỀ NGHỊ

5.1. Kết luận

Giá trị các yếu tố ảnh hưởng tương đối thích hợp để A. niger sinh tổng hợp

enzyme amylase là tỷ lệ C:T:B (2:1:1), pH 5, thời gian nuôi cấy 28 giờ, nhiệt độ nuôi

cấy 300C, độ ẩm ban đầu 55%, 2 lần nồng độ dinh dưỡng, tỷ lệ giống 0,8*108 bt/g CT.

Trong các yếu tố trên các yếu tố có tác động mạnh đến hàm lượng protein và hoạt tính

enzyme amylase là pH, thời gian nuôi cấy, độ ẩm và nồng độ dinh dưỡng. Trong đó

yếu tố độ ẩm là có tác động mạnh nhất.

Giá trị các yếu tố ảnh hưởng tương đối thích hợp để Mucor sinh tổng hợp

enzyme amylase là tỷ lệ C:T:B (2:1:1), pH 5, thời gian nuôi cấy 32 giờ, nhiệt độ nuôi

cấy 350C, độ ẩm ban đầu 55%, 3 lần nồng độ dinh dưỡng, tỷ lệ giống 1,6*108 bt/g CT.

Trong các yếu tố trên các yếu tố có tác động mạnh đến hàm lượng protein và hoạt tính

enzyme amylase là pH, thời gian nuôi cấy, độ ẩm và nồng độ dinh dưỡng. Trong đó

yếu tố thời gian là có tác động mạnh nhất.

A. niger sinh tổng hợp enzyme amylase mạnh hơn chủng Mucor, hàm lượng

protein và hoạt tính enzyme amylas do A. niger tạo ra đều cao hơn do Mucor tạo ra.

Hơn nữa, nấm mốc Mucor có sức sinh trưởng kém hơn A. niger và rất dễ bị xâm

nhiễm bởi các loại vi sinh vật khác.

5.2. Đề nghị

- Thực hiện kế hoạch leo dốc để tìm ra môi trường thích hợp nhất cho hai chủng

nấm mốc nghiên cứu tạo enzyme amylase mạnh mẽ nhất.

- Thử nghiệm độc tính canh trường nuôi cấy Asp. niger và Mucor trên chuột

bạch.

- Thử nghiệm làm chế phẩm enzyme dùng trong thức ăn chăn nuôi.

- Thực hiện tinh sạch enzyme amylase từ các canh trường nuôi cấy trên để thu

nhận enzyme tinh khiết hơn.

- Thử nghiệm cố định chế phẩm enzyme amylase từ canh trường nuôi cấy tối ưu

trên cơ chất là Chitosan và Natrialginate.

62

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Trong nước

1. Nguyễn Cảnh. 1993. Qui hoạch thực nghiệm. Trương đại học Bách Khoa tp Hồ Chí Minh.

2. Nguyễn Lân Dũng và các tác giả. 1979. Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật, tập 2. NXB Khoa học và kĩ thuật Hà Nội.

3. Phạm Thị Ánh Hồng.2004. Kỹ thuật sinh hoá. NXB Đại Học Quốc Gia Tp.HCM.

4. Nguyễn Đức Lượng và các tác giả.2004. Công nghệ enzyme. NXB Đại học Quốc gia tp.HCM.

5. Lương Đức Phẩm.2004. Công nghệ vi sinh vật. NXB Nông nghiệp Hà Nội.

6. Trần Thạnh Phong.2004. Khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase từ Trichoderma reesei và Asperillus niger trên môi trường lên men bán rắn. Luận văn thạc sĩ khoa học sinh học, Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên Tp.HCM.

7. Hoàng Trọng. 2002. Xử lí dữ liệu nghiên cứu với SPSS for windows. NXB Thống kê, Hà Nội.

8. Trần Anh Tuấn. 2005. Khỏa sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh tổng hợp enzyme lipase từ Aspergillus niger trên môi trường lên men bán rắn. Khóa luận tốt nghiệp khoa sinh học, Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên Tp.HCM

Nước ngoài

9. Amano Pharmaceutical Co.,Ltc. (APC), (2000), Assay method for amylase activity. Amano Enzyme inc.

10. Helmut Uhlig, PH.D., Industial enzymes and their applications, Franslate and updated by ELFRIEDE M. LINSMAIER-BED. NAR, PH.D,pp.180.

Trang web

11. http://www.bannhanong.com

12. http://www.wikipedia.com

63

http://www.bannhanong.com/

PHỤ LỤC

Hình 1 Đường chuẩn protein.

Hình 2 Asp. niger.

Hình 3 Mucor.

Hình 4 Môi trường lên men bán rắn.

Kế hoạch leo dốc

Tối ưu hóa thực nghiệm bằng phương pháp leo dốc trên mặt mục tiêu là giai

đoạn thứ hai của quá trình tối ưu hóa thực nghiệm. Do nghiên cứu đi từ mô hình tuyến

tính mô tả cục bộ mặt mục tiêu khi tiến dần đến miền cực trị thì mô tả tương thích này

sẽ không còn phù hợp nên phải tiến hành xác định điểm tối ưu bằng phương pháp leo

dốc. Mục đích của kế hoạch leo dốc là tìm ra tọa độ của cực trị của mặt mục tiêu bằng

thực nghiệm.

Nội dung: kế hoạch leo dốc mang nội dung của phương pháp lặp bao gồm

những bước cơ bản sau:

1. Chọn điểm xuất phát: thường môi trường tại tâm thí nghiệm sẽ được chọn

làm điểm xuất phát.

2. Chọn hướng di chuyển của gradient: từ điểm cơ sở xác định mức các yếu tố

và tiến hành xây dựng kế hoạch thực nghiệm trực giao cấp 1.

3. Di chuyển theo hướng gradient (cần tìm khoảng cách di chuyển thích hợp)

4. Tìm điều kiện dừng (trong khóa luận này, điều kiện để dừng thí nghiệm leo

dốc là khi tìm thấy giá trị yn <y n-1)

Như vậy mỗi lần di chuyển theo hướng dốc đứng trên mặt mục tiêu mà chưa

tìm được tối ưu cần phải tiến hành lặp đi lặp lại các bước trên đến khi tìm được

tối ưu.

1. Ảnh hưởng tỷ lệ cơ chất đến khả năng sinh tổng hợp enzyme amylase của Asp.

niger

1.1. Ảnh hưởng đến hàm lượng protein

Bảng 1.1 Bảng số liệu hàm lượng (mg/g)

Nghiệm thức Lần lặp lại Trung bình

Cơ chất 1 2 3

2C:1T:1B 40.417 41.481 42.494 41.484

1C:2T:1B 36.075 36.863 37.974 36.971

1C:1T:2B 40.372 41.17 42.271 41.271

Bảng 1.2 Bảng ANOVA cho hàm lượng dựa trên số liệu bảng 1.1

ANOVA Table for ham luong by ty le co chat

Analysis of VarianceSource Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-ValueBetween groups 38.9025 2 19.4513 20.70 0.0020Within groups 5.6384 6 0.939734Total (Corr.) 44.5409 8

The StatAdvisor

The ANOVA table decomposes the variance of ham luong into two components: a between-

group component and a within-group component. The F-ratio, which in this case equals

20.6987, is a ratio of the between-group estimate to the within-group estimate. Since the P-

value of the F-test is less than 0.05, there is a statistically significant difference between the

mean ham luong from one level of ty le co chat to another at the 95.0% confidence level.

1.2. Ảnh hưởng đến hoạt tính amylase

Bảng 1.3 Bảng số liệu hoạt tính (UI/gCT)


Cơ chất 1 2 3

2C:1T:1B 357.45 358.44 359.76 358.552

1C:2T:1B 307.27 310.26 308.59 308.373

1C:1T:2B 199.48 200.47 201.8 200.584

Bảng 1.4 Bảng ANOVA cho hoạt tính dựa trên số liệu bảng 1.3

ANOVA Table for hoat tinh by ty le co chat

Analysis of VarianceSource Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-ValueBetween groups 39090.3 2 19545.1 14523.67 0.0000Within groups 8.07446 6 1.34574Total (Corr.) 39098.4 8The StatAdvisor

The ANOVA table decomposes the variance of hoat tinh into two components: a between-




mean hoat tinh from one level of ty le co chat to another at the 95.0% confidence level.

2. Ảnh hưởng của pH môi trường đến khả năng sinh tổng hợp enzyme amylase

của Asp. niger




pH 1 2 3

2 19.934 20.723 21.811 20.822

3 22.709 23.812 24.621 23.714

4 29.705 32.650 30.404 30.586

5 40.861 41.849 43.173 41.961

6 27.531 28.519 29.843 28.631

7 24.465 25.453 26.777 25.565

8 22.224 23.212 24.536 23.324


ANOVA Table for ham luong by pH


The StatAdvisor





mean ham luong from one level of pH to another at the 95.0% confidence level.




pH 1 2 3

2 135.36 136.35 137.68 136.463

3 178.22 179.2 180.53 179.315

4 250.59 251.57 252.9 251.686

5 353.23 354.22 355.55 354.333

6 241.02 242.01 243.33 242.12

7 176.77 177.76 179.08 177.869

8 126.22 127.21 128.53 127.321


ANOVA Table for hoat tinh by pH

Analysis of Variance

Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio

P-Value

Between groups 113456.0 6 18909.4 14051.26

0.0000

Within groups 18.8404 14 1.34574

Total (Corr.) 113475.0 20

The StatAdvisor





mean hoat tinh from one level of pH to another at the 95.0% confidence level.

3. Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp enzyme amylase của

Asp. niger




Thời gian (giờ) 1 2 3

8 18.546 19.534 20.858 19.646

12 21.721 22.709 24.033 22.821

16 28.802 29.79 31.114 29.902

20 39.513 40.501 41.825 40.613

24 43.907 44.895 46.219 45.007

28 51.424 52.412 53.736 52.524

32 41.294 42.282 43.606 42.394

36 39.553 40.541 41.865 40.653

40 35.046 36.034 37.358 36.146

44 30.375 31.363 32.687 31.475


ANOVA Table for ham luong by thoi gian nuoi cay






mean ham luong from one level of thoi gian nuoi cay to another at the 95.0% confidence

level.




Thời gian nuôi cấy (h) 1 2 3

8 109.83 110.82 112.14 110.929

12 171.14 172.13 173.46 172.244

16 255.84 256.82 258.15 256.935

20 309.32 310.31 311.63 310.421

24 383.74 384.73 386.05 384.841

28 581.16 582.15 583.47 582.262

32 378.88 379.87 381.2 379.984

36 353.51 354.5 355.83 354.613

40 225.14 226.13 227.45 226.242

44 101.73 102.72 104.04 102.832


ANOVA Table for hoat tinh by thoi gian nuoi cay






mean hoat tinh from one level of thoi gian nuoi cay to another at the 95.0% confidence level.

4. Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp enzyme amylase của

Asp. niger




nhiệt độ nuôi cấy (0C) 1 2 3

30 51.349 52.337 53.661 52.449

35 54.286 55.274 56.598 55.386

40 43.549 44.537 45.861 44.649

45 36.336 37.324 38.648 37.436

50 23.671 24.659 25.983 24.771

55 15.572 16.56 17.884 16.67166


ANOVA Table for ham luong by nhiet do nuoi cay






mean ham luong from one level of nhiet do nuoi cay to another at the 95.0% confidence level.

4.2 Ảnh hưởng đến hoạt tính amylase


Nghiệm thức Lần lặp lại Trung bìnhnhiệt độ nuôi cấy (0C) 1 2 3

30 579.78 580.76 582.09 580.87635 630.34 631.33 632.66 631.44340 408.69 409.68 411 409.79245 267.17 268.16 269.49 268.27350 176.61 177.6 178.92 177.70955 89.468 90.456 91.78 90.568


ANOVA Table for hoat tinh by nhiet do nuoi cay






mean hoat tinh from one level of nhiet do nuoi cay to another at the 95.0% confidence level.

5. Ảnh hưởng của độ ẩm đến khả năng sinh tổng hợp enzyme amylase của Asp.

niger



Nghiệm thức Lần lặp lại Trung bìnhĐộ ẩm (%) 1 2 3

40 36.072 37.06 38.384 37.17245 42.975 43.963 45.287 44.075250 49.776 50.764 52.088 50.87655 54.275 55.263 56.587 55.37560 51.336 52.324 53.648 52.43665 47.425 48.413 49.737 48.52570 41.268 42.256 43.58 42.36875 36.259 37.247 38.571 37.3589


ANOVA Table for ham luong by do am


The StatAdvisor





mean ham luong from one level of do am to another at the 95.0% confidence level.



Nghiệm thức Lần lặp lại Trung bìnhĐộ ẩm (%) 1 2 3

40 198.92 199.91 201.23 200.02145 331.62 332.6 333.93 332.71650 408.26 409.24 410.57 409.35655 582.23 583.22 584.54 583.33160 266.66 267.65 268.97 267.75865 168.71 169.7 171.02 169.81270 155.25 156.24 157.56 156.35175 142.26 143.25 144.57 143.358







mean hoat tinh from one level of do am to another at the 95.0% confidence level.

6. Ảnh hưởng của nồng độ dinh dưỡng đến khả năng sinh tổng hợp enzyme amylase của Asp. niger




Nồng độ dinh dưỡng 1 2 3

X1 53.527 54.515 55.839 54.627

X2 52.313 53.301 54.625 53.413

X3 48.848 49.836 51.16 49.948

X4 47.965 48.953 50.277 49.065

X5 44.079 45.067 46.391 45.179

X6 39.867 40.855 42.179 40.967

X7 39.581 40.569 41.893 40.681

X8 37.004 37.992 39.316 38.104


Analysis of Variance for ham luong - Type III Sums of Squares

Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value

MAIN EFFECTS

A:nong do dinh duong 807.055 7 115.294 85.67 0.0000

RESIDUAL 21.5319 16 1.34574

TOTAL (CORRECTED) 828.587 23

All F-ratios are based on the residual mean square error.

The StatAdviso

The ANOVA table decomposes the variability of ham luong into contributions due to

various factors. Since Type III sums of squares (the default) have been chosen, the

contribution of each factor is measured having removed the effects of all other factors. The P-

values test the statistical significance of each of the factors. Since one P-value is less than

0.05, this factor has a statistically significant effect on ham luong at the 95.0% confidence

level.

6.2. Ảnh hưởng đến hoạt tính amylase :




X1 575.72 576.71 578.03 576.821

X2 623.87 624.86 626.18 624.969

X3 546.19 547.18 548.51 547.294

X4 460.54 461.53 462.85 461.642

X5 415.79 416.78 418.1 416.887

X6 377.53 378.52 379.84 378.631

X7 372.79 373.77 375.1 373.885

X8 337.02 338.01 339.34 338.123


ANOVA Table for hoat tinh by nong do dinh duong



P-Value

Between groups 237154.0 7 33879.2 25175.05 0.0000

Within groups 21.5319 16 1.34574

Total (Corr.) 237176.0 23

The StatAdvisor





mean hoat tinh from one level of nong do dinh duong to another at the 95.0% confidence

level.

7. Ảnh hưởng của tỷ lệ giống đến khả năng sinh tổng hợp enzyme amylase của Asp. niger




Tỷ lệ giống (*108bt/g) 1 2 3

0.8 50.733 51.721 53.045 51.833

1.6 47.592 48.48 49.704 48.592

2.4 43.317 44.805 46.629 44.917

3.2 42.514 43.502 44.826 43.614


ANOVA Table for ham luong by ty le giong






mean ham luong from one level of ty le giong to another at the 95.0% confidence level




Tỷ lệ giống (*108bt/g) 1 2 3

0.8 618.58 619.57 620.89 619.678

1.6 546.96 547.95 549.27 548.061

2.4 434.47 435.45 436.78 435.566

3.2 404.75 405.74 407.07 405.853


ANOVA Table for hoat tinh by ty le giong






mean hoat tinh from one level of ty le giong to another at the 95.0% confidence level.

8. Ảnh hưởng của tỷ lệ cơ chất đến khả năng sinh tổng hợp enzyme amylase của

Mucor



Nghiệm thức Lần lặp lại Trunng bình

Tỷ lệ cơ chất 1 2 3

2C:1T:1B 19.351 21.181 21.421 20.651

1C:2T:1B 16.734 18.564 18.804 18.034

1C:1T:2B 23.165 24.995 25.235 24.465


ANOVA Table for ham luong by ty le co chat

Analysis of VarianceSource Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-ValueBetween groups 62.753 2 31.3765 24.48 0.0013Within groups 7.6914 6 1.2819Total (Corr.) 70.4444 8The StatAdviso





mean ham luong from one level of ty le co chat to another at the 95.0% confidence level.

8.2. Ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme amylase



Tỷ lệ cơ chất 1 2 3

2C:1T:1B 249.699 251.529 251.769 250.999

1C:2T:1B 224.825 226.655 226.895 226.125

1C:1T:2B 170.2 172.03 172.27 171.5Bảng 8.4 Bảng ANOVA cho hoạt tính dựa trên số liệu bảng 8.3

ANOVA Table for hoat tinh by ty le co chat






mean hoat tinh from one level of ty le co chat to another at the 95.0% confidence level. To

determine

9. Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh tổng hợp enzyme amylase của Mucor




pH 1 2 32 6.883 8.713 8.953 8.1833 11.83 13.66 13.9 13.134 17.938 19.768 20.008 19.2385 21.746 23.576 23.816 23.046

6 17.271 19.101 19.341 18.5717 13.742 15.572 15.812 15.0428 13.023 14.853 15.093 14.323


ANOVA Table for ham luong by pH






mean ham luong from one level of pH to another at the 95.0% confidence level.

9.2. Ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme amylase:



pH 1 2 3

2 88.855 90.685 90.925 90.155

3 153.414 155.244 155.484 154.714

4 203.367 205.197 205.437 204.667

5 262.127 263.957 264.197 263.427

6 168.495 170.325 170.565 169.795

7 109.209 111.039 111.279 110.509

8 84.309 86.139 86.379 85.609


ANOVA Table for hoat tinh by pH

Analysis of Varianc

Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-

Value

Between groups 76308.8 6 12718.1 9921.32 0.0000

Within groups 17.9466 14 1.2819

Total (Corr.) 76326.8 20

The StatAdvisor





mean hoat tinh from one level of pH to another at the 95.0% confidence level. To determine

which means

10. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp enzyme

amylase của Mucor





8 12.857 14.686 14.925 14.155

12 15.159 16.983 17.226 16.456

16 17.063 19.992 20.365 19.163

20 20.619 22.449 22.689 21.919

24 22.472 24.302 24.542 23.772

28 25.295 27.125 27.365 26.595

32 32.784 34.614 34.854 34.084

36 22.009 23.839 24.079 23.309

40 19.013 24.743 20.183 21.313

44 16.365 18.195 18.435 17.665


ANOVA Table for ham luong by thoi gian nuoi cay






mean ham luong from one level of thoi gian nuoi cay to another at the 95.0% confidence

level.


Bảng 10.3 Bảng số liệu hoạt tính (UI/g CT)

Nghiệm thức Lần lặp lại

Trunng

bình


8 67.312 69.038 69.48 68.61

12 106.655 108.485 108.725 107.955

16 153.333 155.163 155.403 154.633

20 201.764 203.190 203.638 202.864

24 230.111 232.060 232.242 231.471

28 268.188 270.018 270.258 269.488

32 413.422 415.252 415.492 414.722

36 249.564 250.394 255.634 251.864

40 137.901 139.631 140.071 139.201

44 45.875 47.705 47.945 47.175


ANOVA Table for hoat tinh by thoi gian nuoi cay






mean hoat tinh from one level of thoi gian nuoi cay to another at the 95.0% confidence level.

11. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp enzyme

amylase của Mucor



Nghiệm thức Lần lặp lạiTrunng

bình

Nhiệt độ nuôi cấy (0C) 1 2 340 23.860 25.691 25.932 25.161

45 27.958 29.793 29.926 29.159

50 33.121 34.951 35.191 34.421

55 38.656 40.486 40.726 39.956

60 33.986 35.816 36.056 35.286

65 30.633 32.463 32.703 31.933

70 23.667 25.407 25.827 24.967

75 22.187 24.017 24.257 23.487


ANOVA Table for ham luong by nhiet do


Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-

Value

Between groups 1176.66 5 235.332 183.58 0.0000

Within groups 15.3828 12 1.2819

Total (Corr.) 1192.04 17

The StatAdvisor

The ANOVA table decomposes the variance of ham luong into two components: a

between-group component and a within-group component. The F-ratio, which in this case

equals 183.581, is a ratio of the between-group estimate to the within-group estimate. Since

the P-value of the F-test is less than 0.05, there is a statistically significant difference between

the mean ham luong from one level of

nhiet do to another at the 95.0% confidence level.




Trunng

bình

Nhiệt độ nuôi cấy (0C) 1 2 3

40 23.861 25.691 25.931 25.161

45 27.859 29.089 30.829 29.159

50 33.121 34.951 35.191 34.421

55 38.656 39.486 41.726 39.956

60 33.985 35.817 36.056 35.286

65 30.633 32.460 32.706 31.933

70 23.667 25.497 25.737 24.967

75 22.186 24.015 24.258 23.487



Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value

Between groups 529782.0 5 105956.0 82655.72 0.0000

Within groups 15.3828 12 1.2819

Total (Corr.) 529797.0 17

The StatAdvisor





mean hoat tinh from one level of nhiet do to another at the 95.0% confidence level.

12. Ảnh hưởng của độ ẩm đến khả năng sinh tổng hợp enzyme amylase của Mucor


Bảng 12.1 Bảng số liệu hàm lượng (mg)

Nghiệm thức Lần lặp lại Trunng bìnhĐộ ẩm (%) 1 2 3

40 23.863 25.691 25.928 25.16145 27.861 29.690 29.932 29.15950 33.121 34.951 35.191 34.42155 37.656 40.986 41.226 39.95660 33.987 35.815 36.056 35.28665 30.036 32.460 33.303 31.93370 23.667 25.497 25.737 24.96775 22.187 24.017 24.257 23.487


Analysis of VarianceSource Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-ValueBetween groups 423.243 7 60.4633 47.17 0.0000Within groups 20.5104 16 1.2819Total (Corr.) 443.754 23 The ANOVA table decomposes the variance of ham luong into two components: a between-




mean ham luong from one level of do am to another at the 95.0% confidence level.




Độ ẩm (%) 1 2 340 164.261 164.091 165.331 164.56145 264.405 266.235 266.475 265.70550 284.545 286.775 286.815 286.04555 409.743 411.573 411.813 411.043

60 165.133 166.963 167.203 166.43365 142.998 144.828 145.068 144.29870 116.833 117.663 119.903 118.13375 115.695 117.525 117.765 116.995


ANOVA Table for hoat tinh by do am



P-Value

Between groups 69808.4 7 9972.63 7779.57 0.0000

Within groups 20.5104 16 1.2819

Total (Corr.) 69828.9 23

The StatAdvisor

The ANOVA table decomposes the variance of hoat tinh into two components: a

between-group component and a within-group component. The F-ratio, which in this case

equals 7779.57, is a ratio of the between-group estimate to the within-group estimate. Since

the P-value of the F-test is less than 0.05, there is a statistically significant difference between

the mean hoat tinh from one level of do am to another at the 95.0% confidence level.

13. Ảnh hưởng của nồng độ dinh dưỡng đến khả năng sinh tổng hợp enzyme

amylase của Mucor




Trunng

bình


X1 38.207 40.037 40.577 39.607

X2 38.781 40.611 40.851 40.081

X3 42.091 43.921 44.161 43.391

X4 37.3871 39.2171 39.4571 38.6871

X5 35.591 37.421 37.661 36.891

X6 32.634 34.464 34.704 33.934

X7 30.117 31.947 32.187 31.417

X8 29.316 30.146 32.386 30.616


ANOVA Table for ham luong by nong do dinh duong



P-Value

Between groups 423.243 7 60.4633 47.17 0.0000

Within groups 20.5104 16 1.2819

Total (Corr.) 443.754 23

The StatAdvisor





mean ham luong from one level of nong do dinh duong to another at the 95.0% confidence

level.




bình

Nồng độ dinh dưỡng 1 2 3X1 402.621 404.451 404.691 403.921X2 417.348 418.078 419.918 418.548X3 486.979 488.809 489.049 488.279X4 417.529 419.359 419.599 418.829

X5 410.567 412.397 412.637 411.867X6 389.136 389.466 391.206 389.936X7 334.487 336.317 336.557 335.787X8 295.962 297.792 298.032 297.262


ANOVA Table for hoat tinh by nong do dinh duong






mean hoat tinh from one level of nong do dinh duong to another at the 95.0% confidence

level.

14. Ảnh hưởng của tỷ lệ giống đến khả năng sinh tổng hợp enzyme amylase của

Mucor




bìnhTỷ lệ giống (*108bt/gCT) 1 2 3

0.8 38.398 40.228 40.468 39.6981.6 43.691 45.021 46.261 44.9912.4 37.474 38.304 40.544 38.7743.2 33.423 35.253 35.493 34.723


Analysis of VarianceSource Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-ValueBetween groups 160.585 3 53.5284 41.76 0.0000Within groups 10.2552 8 1.2819Total (Corr.) 170.841 11 The ANOVA table decomposes the variance of ham luong into two components: a between-group

component and a within-group component. The F-ratio, which in this case equals 41.7571, is a ratio of

the between-group estimate to the within-group estimate. Since the P-value of the F-test is less than

0.05, there is a statistically significant difference between the mean ham luong from one level of ty le

giong to another at the 95.0% confidence level.




bình

Tỷ lệ giống (*108bt/gCT) 1 2 30.8 485.805 487.635 487.875 487.1051.6 520.343 523.173 524.413 522.6432.4 423.038 424.868 425.108 424.3383.2 380.165 381.995 382.235 381.465




group The F-ratio, which in this case equals 9321.25, is a ratio of the between-group estimate

to the within-group estimate. Since the P-value of the F-test is less than 0.05, there is a

statistically significant difference between the mean hoat tinh from one level of ty le giong to

another at the 95.0% confidence level.

15. Xác định giá trị tối ưu của một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp amylase của Asp. niger


STT thí nghiệmLần lặp lại

Trung bình1 2 31 388.9 389.8 389.98 389.562 298.97 299.87 300.05 299.633 217.32 218.23 218.4 217.984 175.51 176.41 176.59 176.175 222.94 223.84 224.01 223.66 167.27 168.17 168.35 167.937 183.59 184.49 184.66 184.258 104.36 105.26 105.43 105.029 268.97 269.87 270.05 269.6310 166.45 167.36 167.53 167.1111 155.18 156.08 156.26 155.8412 151.12 152.02 152.19 151.7813 160 160.9 161.08 160.6614 151.13 152.03 152.21 151.7915 107.32 108.22 108.39 107.9816 87.337 88.24 88.414 87.99717 483.14 485.22 487.28 485.21


ANOVA Table for hoat tinh by STT

Analysis of VarianceSource Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Valueetween groups 709835.0 16 44364.7 123691.54 0.0000Within groups 12.1948 34 0.358672Total (Corr.) 709847.0 50The StatAdvisor





mean hoat tinh from one level of STT to another at the 95.0% confidence level.

16. Xác định giá trị tối ưu của một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng

hợp amylase của Mucor


STT thí nghiệm

Lần lặp lạiTrung bìnhY1 Y2 Y3

1 434.67 435.57 435.75 435.332 384.56 385.46 385.64 385.223 411.49 412.39 412.57 412.154 384.21 385.11 385.29 384.875 211.61 212.52 212.69 212.276 209.52 210.43 210.6 210.187 261.97 262.87 263.04 262.638 258.47 259.37 259.55 259.139 260.47 261.37 261.55 261.13

10 356.29 357.19 357.37 356.9511 376.79 377.69 377.87 377.4512 351.88 352.78 352.96 352.5413 197.24 198.14 198.31 197.914 187.43 188.33 188.51 188.0915 188.92 189.82 190 189.5816 157.29 158.19 158.37 157.9517 623.46 624.67 625.13 624.42


ANOVA Table for hoat tinh by STT






mean hoat tinh from one level of STT to another at the 95.0% confidence level.

Documents

SINH TỔNG HỢP ENZYME AMYLASE TỪ NẤM Aspergillus niger VÀ Mucor