PRAKTIKUM ANALISA OBAT II

SPEKTROFOTOMETRI DAN KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS

DISUSUN OLEH

WENDY OCTAVIANSYAH (1143050043)

GRUP A / SET 3

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS 17 AGUSTUS 1945 JAKARTA

2014

Spektrofotometri

A. Pengertian

Spektrofotometri merupakan salah satu metode dalam kimia analisis yang digunakan

untuk menentukan komposisi suatu sampel baik secara kuantitatif dan kualitatif yang

didasarkan pada interaksi antara materi dengan cahaya. Cahaya yang dimaksud dapat berupa

cahaya visibel, UV dan inframerah, sedangkan materi dapat berupa atom dan molekul

namun yang lebih berperan adalah elektron valensi.

B. Komponen Utama Spektrofotometri

1. Sumber Cahaya

2. Pengatur Intensitas

3. Monokromator

4 Kuvet

5. Detektor

6. Penguat (amplifier)

C. Hukum Lambert-Beer

Berdasarkan hukum Lambert-Beer, rumus yang digunakan untuk menghitung

banyaknya cahaya yang dihamburkan:

Dan absorbansi dinyatakan dengan rumus:

Dimana I0 merupakan intensitas cahaya datang dan It atau I1 adalah intensitas

cahaya setelah melewati sampel.

Rumus yang diturunkan dari Hukum Beer dapat ditulis sebagai:

Dimana :

A = Absorbansi

a = Tetapan absorbtivitas (jika konsentrasi larutan yang diukur dalam ppm)

c = Konsentrasi larutan yang diukur

ε = Tetapan absorbtivitas molar (jika konsentrasi larutan yang diukur dalam

ppm)

b atau terkadang digunakan l = Tebal larutan (tebal kuvet diperhitungkan juga

umumnya 1cm)

Secara eksperimen hukum Lambert-beer akan terpenuhi apabila peralatan yang digunakan

memenuhi kriteria-kriteria berikut:

1. Sinar yang masuk atau sinar yang mengenai sel sampel berupa sinar dengan dengan panjang

gelombang tunggal (monokromatis).

2. Penyerapan sinar oleh suatu molekul yang ada di dalam larutan tidak dipengaruhi oleh

molekul yang lain yang ada bersama dalam satu larutan.

3. Penyerapan terjadi di dalam volume larutan yang luas penampang (tebal kuvet) yang sama.

4. Penyerapan tidak menghasilkan pemancaran sinar pendafluor. Artinya larutan yang diukur

harus benar-benar jernih agar tidak terjadi hamburan cahaya oleh partikel-partikel koloid atau

suspensi yang ada di dalam larutan.

5. Konsentrasi analit rendah. Karena apabila konsentrasi tinggi akan menggangu kelinearan

grafik absorbansi versus konsntrasi.

D. Jenis-jenis Spektrofotometri Berdasarkan Sumber Cahaya Yang Digunakan

1. Spektrofotometri Visible (Spektro Vis) Pada spektrofotometri ini yang digunakan sebagai

sumber sinar/energi adalah cahaya tampak (visible). Cahaya visible termasuk spektrum

elektromagnetik yang dapat ditangkap oleh mata manusia. Panjang gelombang sinar

tampak adalah 380 sampai 750 nm. Sehingga semua sinar yang dapat dilihat oleh kita,

entah itu putih, merah, biru, hijau, apapun, selama ia dapat dilihat oleh mata, maka sinar

tersebut termasuk ke dalam sinar tampak (visible). Sumber sinar tampak yang umumnya

dipakai pada spektro visible adalah lampu Tungsten. Tungsten yang dikenal juga dengan

nama Wolfram merupakan unsur kimia dengan simbol W dan no atom 74. Tungsten

mempunyai titik didih yang tertinggi (3422 ºC) dibanding logam lainnya. karena sifat

inilah maka ia digunakan sebagai sumber lampu. Sampel yang dapat dianalisa dengan

metode ini hanya sample yang memiliki warna. Hal ini menjadi kelemahan tersendiri dari

metode spektrofotometri visible. Oleh karena itu, untuk sample yang tidak memiliki

warna harus terlebih dulu dibuat berwarna dengan menggunakan reagent spesifik yang

akan menghasilkan senyawa berwarna. Reagent yang digunakan harus betul-betul

spesifik hanya bereaksi dengan analat yang akan dianalisa. Selain itu juga produk

senyawa berwarna yang dihasilkan harus benar-benar stabil. Salah satu contohnya adalah

pada analisa kadar protein terlarut (soluble protein). Protein terlarut dalam larutan tidak

memiliki warna. Oleh karena itu, larutan ini harus dibuat berwarna agar dapat dianalisa.

Reagent yang biasa digunakan adalah reagent Folin. Saat protein terlarut direaksikan

dengan Folin dalam suasana sedikit basa, ikatan peptide pada protein akan membentuk

senyawa kompleks yang berwarna biru yang dapat dideteksi pada panjang gelombang

sekitar 578 nm. Semakin tinggi intensitas warna biru menandakan banyaknya senyawa

kompleks yang terbentuk yang berarti semakin besar konsentrasi protein terlarut dalam

sample.

2. Spektrofotometri Ultraviolet (UV) Berbeda dengan spektrofotometri visible, pada

spektrofotometri UV berdasarkan interaksi sample dengan sinar UV. Sinar UV memiliki

panjang gelombang 190-380nm. Sebagai sumber sinar dapat digunakan lampu deuterium.

Deuterium disebut juga heavy hidrogen. Dia merupakan isotop hidrogen yang stabil yang

terdapat berlimpah di laut dan daratan. Inti atom deuterium mempunyai satu proton dan

satu neutron, sementara hidrogen hanya memiliki satu proton dan tidak memiliki neutron.

Nama deuterium diambil dari bahasa Yunani, deuteros, yang berarti ‘dua’, mengacu pada

intinya yang memiliki dua pertikel. Karena sinar UV tidak dapat dideteksi oleh mata kita,

maka senyawa yang dapat menyerap sinar ini terkadang merupakan senyawa yang tidak

memiliki warna. Bening dan transparan. Oleh karena itu, sample tidak berwarna tidak

perlu dibuat berwarna dengan penambahan reagent tertentu. Bahkan sample dapat

langsung dianalisa meskipun tanpa preparasi. Namun perlu diingat, sample keruh tetap

harus dibuat jernih dengan filtrasi atau centrifugasi. Prinsip dasar pada spektrofotometri

adalah sample harus jernih dan larut sempurna. Tidak ada partikel koloid apalagi

suspensi. Sebagai contoh pada analisa protein terlarut (soluble protein). Jika

menggunakan spektrofotometri visible, sample terlebih dulu dibuat berwarna dengan

reagent Folin, maka bila menggunakan spektrofotometri UV, sample dapat langsung

dianalisa. Ikatan peptide pada protein terlarut akan menyerap sinar UV pada panjang

gelombang sekitar 280 nm. Sehingga semakin banyak sinar yang diserap sample

(Absorbansi tinggi), maka konsentrasi protein terlarut semakin besar. Spektrofotometri

UV memang lebih simple dan mudah dibanding spektrofotometri visible, terutama pada

bagian preparasi sample. Namun harus hati-hati juga, karena banyak kemungkinan terjadi

interferensi dari senyawa lain selain analat yang juga menyerap pada panjang gelombang

UV. Hal ini berpotensi menimbulkan bias pada hasil analisa.

3. Spektrofotometri UV-VIS Spektrofotometri ini merupakan gabungan antara

spektrofotometri UV dan Visible. Menggunakan dua buah sumber cahaya berbeda,

sumber cahaya UV dan sumber cahaya visible. Meskipun untuk alat yang lebih canggih

sudah menggunakan hanya satu sumber sinar sebagai sumber UV dan Vis, yaitu

photodiode yang dilengkapi dengan monokromator. Untuk sistem spektrofotometri, UV-

Vis paling banyak tersedia dan paling populer digunakan. Kemudahan metode ini adalah

dapat digunakan baik untuk sample berwarna juga untuk sample tak berwarna. 4.

Spektrofotometri Infra Red (IR) Dari namanya sudah bisa dimengerti bahwa

spektrofotometri ini berdasar pada penyerapan panjang gelombang infra merah. Cahaya

infra merah terbagi menjadi infra merah dekat, pertengahan, dan jauh. Infra merah pada

spektrofotometri adalah infra merah jauh dan pertengahan yang mempunyai panjang

gelombang 2.5-1000μm. Pada spektro IR meskipun bisa digunakan untuk analisa

kuantitatif, namun biasanya lebih kepada analisa kualitatif. Umumnya spektro IR

digunakan untuk mengidentifikasi gugus fungsi pada suatu senyawa, terutama senyawa

organik. Setiap serapan pada panjang gelombang tertentu menggambarkan adanya suatu

gugus fungsi spesifik. Hasil analisa biasanya berupa signal kromatogram hubungan

intensitas IR terhadap panjang gelombang. Untuk identifikasi, signal sample akan

dibandingkan dengan signal standard. Perlu juga diketahui bahwa sample untuk metode

ini harus dalam bentuk murni. Karena bila tidak, gangguan dari gugus fungsi kontaminan

akan mengganggu signal kurva yang diperoleh. Terdapat juga satu jenis spektrofotometri

IR lainnya yang berdasar pada penyerapan sinar IR pendek. Spektrofotometri ini di sebut

Near Infrared Spectropgotometry (NIR). Aplikasi NIR banyak digunakan pada industri

pakan dan pangan guna analisa bahan baku yang bersifat rutin dan cepat Dari 4 jenis

spektrofotometri ini (UV, Vis, UV-Vis dan Ir) memiliki prinsip kerja yang sama yaitu

“adanya interaksi antara materi dengan cahaya yang memiliki panjang gelombang

tertentu”. Perbedaannya terletak pada panjang gelombang yang digunakan.

E. Fungsi Masing-masing Alat

1. Sumber sinar polikromatis berfungsi sebagai sumber sinar polikromatis dengan

berbagai macam rentang panjang gelombang. Untuk spektrofotometer:

a. UV menggunakan lampu deuterium atau disebut juga heavi hidrogen

b. VIS menggunakan lampu tungsten yang sering disebut lampu wolfram

c. UV-VIS menggunan photodiode yang telah dilengkapi monokromator.

d. Infra merah, lampu pada panjang gelombang IR.

2. Monokromator berfungsi sebagai penyeleksi panjang gelombang yaitu mengubah

cahaya yang berasal dari sumber sinar polikromatis menjadi cahaya monaokromatis.

Jenis monokromator yang saat ini banyak digunakan adalah gratting atau lensa prisma

dan filter optik. Jika digunakan grating maka cahaya akan dirubah menjadi spektrum

cahaya. Sedangkan filter optik berupa lensa berwarna sehingga cahaya yang diteruskan

sesuai dengan warnya lensa yang dikenai cahaya. Ada banyak lensa warna dalam satu

alat yang digunakan sesuai dengan jenis pemeriksaan.

3. Sel sampel berfungsi sebagai tempat meletakan sampel.

a. UV, VIS dan UV-VIS menggunakan kuvet sebagai tempat sampel. Kuvet biasanya

terbuat dari kuarsa atau gelas, namun kuvet dari kuarsa yang terbuat dari silika

memiliki kualitas yang lebih baik. Hal ini disebabkan yang terbuat dari kaca dan

plastik dapat menyerap UV sehingga penggunaannya hanya pada spektrofotometer

sinar tampak (VIS). Cuvet biasanya berbentuk persegi panjang dengan lebar 1 cm.

b. IR, untuk sampel cair dan padat (dalam bentuk pasta) biasanya dioleskan pada dua

lempeng natrium klorida. Untuk sampel dalam bentuk larutan dimasukan ke dalam

sel natrium klorida. Sel ini akan dipecahkan untuk mengambil kembali larutan yang

dianalisis, jika sampel yang dimiliki sangat sedikit dan harganya mahal.

4. Detektor berfungsi menangkap cahaya yang diteruskan dari sampel dan mengubahnya

menjadi arus listrik. Syarat-syarat sebuah detektor :

a. Kepekaan yang tinggi

b. Perbandingan isyarat atau signal dengan bising tinggi

c. Respon konstan pada berbagai panjang gelombang

d. Waktu respon cepat dan signal minimum tanpa radiasi

e. Signal listrik yang dihasilkan harus sebanding dengan tenaga radiasi

Macam - macam detektor:

a. Detektor foto (Photo detector)

b. Photocell, misalnya CdS

c. Phototube

d. Hantaran foto

e. Dioda foto

f. Detektor panas

5. Read out merupakan suatu sistem baca yang menangkap besarnya isyarat listrik yang

berasal dari detektor.

F. Cara Kerja

1. Sumber cahaya polikromatis masuk ke dalam monokromator (disini terjadi penyebaran

cahaya)

2. Dari monokromator kemudian keluar menuju ke sel sampel, pada sel sampel ini terjadi

proses penyerapan cahaya oleh zat yang ada dalam sel sampel (dimana cahaya yang

masuk lebih terang dibandingkan cahaya setelah keluar)

3. Selanjutnya cahaya ditangkap oleh detektor dan mengubahnya menjadi arus listrik

PENETAPAN KADAR SIRUP PARASETAMOL SECARA SPEKTROFOTOMETRI

Parasetamol

Parasetamol atau 4-hidroksiasetanilida dengan rumus molekul C8H9NO2 dan bobot molekul 152.16, Parasetamol berupa serbuk hablur putih, tidak berbau dan rasa sedikit pahit dengan titik lebur 169-170.5◦C. Parasetamol mudah larut dalam air mendidih, sangat mudah larut dalam chloroform, larut dalam etanol, metanol, dimetil formamida, aseton dan etil asetat, praktis tidak larut dalam benzen.(Ditjen POM, 1995).

Parasetamol memiliki serapan maksimum dalam larutan asam pada panjang gelombang 245 nm (A11=668a) dan dalam larutan basa pada panjang gelombang 257 nm (A11=715a) sedangkan pada inframerah memperlihatkan puncak pada 1506, 1657, 1565, 1263, 1227, 1612 cm−1. (Moffat A.C., dkk, 2005).

Parasetamol dengan pKa 9.5 diabsorpsi cepat melalui usus dan konsentrasi tertinggi dalam plasma dicapai dalam waktu ½ jam dan masa paruh dalam plasma antara 1-3 jam, dimetabolisme oleh enzim mikrosom dan dieksresikan melalui ginjal. Turunan dari para-aminofenol ini bekerja sebagai analgetik-antipiretik serta memiliki aktivitas antiinflamasi yang rendah dan dapat diberikan secara oral, intravena serta rektal. Parasetamol merupakan obat pilihan pertama dalam penanganan nyeri dan demam karena relatif aman, tidak mengiritasi lambung dan dapat digunakan untuk anak-anak serta pasien asma. Efek samping yang ditimbulkan adalah methemoglobin dan hepatotoksik (Ditjen Binfar, 2006; Mycek.J.M., 2001).

Sebagai antipiretik parasetamol dapat meningkatkan eliminasi panas pada penderita suhu tinggi dengan cara menimbulkan dilatasi pembuluh darah perifer dan mobilisasi air sehingga terjadi pengenceran darah dan pengeluaran keringat. Pengaruh obat pada suhu badan normal relatif kecil. Penurunan suhu tersebut adalah hasil kerja obat pada system saraf pusat yang melibatkan pusat kontrol suhu di hipotalamus (Siswandono dan Soekardjo, B., 2000).

Secara Spektrofototmetri UV-VIS

Jika dilihat dari strukturnya parasetamol memiliki gugus kromofor yang dapat menyerap radiasi pada daerah ultraviolet, Menurut Moffat, dkk., (2005) parasetamol memiliki serapan maksimum dalam larutan asam pada panjang gelombang 245 nm (A11=668a) dan dalam larutan basa pada panjang gelombang 257 nm (A11=715a).

Menurut Farmakope Indonesia edisi III tahun 1979, parasetamol dalam sediaan tablet dapat ditetapkan secara spektrofotometri ultraviolet pada larutan basa pada panjang gelombang 257 nm dan menurut Shrestha dan Pradhananga, tahun 2009, parasetamol dapat ditetapkan kadarnya secara spektrofotometri visibel berdasarkan pembentukan warna setelah direaksikan dengan 1-naftol atau resorsinol kemudian dianalisis pada panjang gelombang 505 nm.

Spektrofotometer inframerah

Secara umum spektrofotometer inframerah digunakan untuk menentukan gugus fungsi suatu senyawa organik dan untuk mengetahui informasi struktur suatu senyawa organik dengan membandingkan daerah sidik jarinya. Pengukuran pada spektrum inframerah dilakukan pada daerah cahaya inframerah tengah (mid-infrared) yaitu pada panjang gelombang 4000-200 cm-1 (Dachriyanus, 2004).

KROMATOGRAFI

1. PENGERTIAN KROMATOGRAFI

Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan molekul  berdasarkan perbedaan pola

pergerakan antara fase gerak dan fase diam untuk memisahkan komponen (berupa molekul) yang

berada pada larutan. Molekul yang terlarut dalam fase gerak, akan melewati kolom yang

merupakan fase diam. Molekul yang memiliki ikatan yang kuat dengan kolom akan cenderung

bergerak lebih lambat dibanding molekul yang berikatan lemah. Dengan ini, berbagai macam

tipe molekul dapat dipisahkan berdasarkan pergerakan pada kolom.

Kromatografi dapat dibedakan atas berbagai macam tergantung pada

pengelompokannya. Contoh pada mekanisme pemisahannya kromatografi dibedakan

menjadi berdasarkan pada alat yang dignakn kromatografi dibedakan atas

a. kromatografi lapis tipis

b. kromatografi penukar ion

c. Kromatografi Penyaringan Gel

d. Kromatografi Elektroforesis

e. Kromatografi kertas

f. kromatografi gas

Macam-macam kromatografi :

a. Kromatografi Lapis Tipis

Kromatografi lapis tipis (KLT) adalah salah satu metode pemisahan komponen menggunakan

fasa diam berupa plat dengan lapisan bahan adsorben inert. KLT merupakan salah satu

jenis kromatografianalitik. KLT sering digunakan untuk identifikasi awal, karena banyak

keuntungan menggunakan KLT, di antaranya adalah sederhana dan murah. KLT termasuk dalam

kategori kromatografi planar, selain kromatografi kertas.

Peralatan KLT

Kromatografi lapis tipis menggunakan plat tipis yang dilapisi dengan adsorben seperti silika gel,

aluminium oksida (alumina) maupun selulosa. Adsorben tersebut berperan sebagai fasa diam.

Fasa gerak yang digunakan dalam KLT sering disebut dengan eluen. Pemilihan eluen didasarkan

pada polaritas senyawa dan biasanya merupakan campuran beberapa cairan yang berbeda

polaritas, sehingga didapatkan perbandingan tertentu. Eluen KLT dipilih dengan cara trial and

error. Kepolaran eluen sangat berpengaruh terhadap Rf (faktor retensi) yang diperoleh.

Faktor Retensi

Faktor retensi (Rf) adalah jarak yang ditempuh oleh komponen dibagi dengan jarak yang

ditempuh oleh eluen. Rumus faktor retensi adalah:

Nilai Rf sangat karakterisitik untuk senyawa tertentu pada eluen tertentu. Hal tersebut dapat

digunakan untuk mengidentifikasi adanya perbedaan senyawa dalam sampel. Senyawa yang

mempunyai Rf lebih besar berarti mempunyai kepolaran yang rendah, begitu juga sebaliknya.

Hal tersebut dikarenakan fasa diam bersifat polar. Senyawa yang lebih polar akan tertahan kuat

pada fasa diam, sehingga menghasilkan nilai Rf yang rendah. 

Rf KLT yang bagus berkisar antara 0,2 - 0,8. Jika Rf terlalu tinggi, yang harus dilakukan adalah

mengurangi kepolaran eluen, dan sebaliknya.

Cara Menggunakan KLT

KLT sangat berguna untuk mengetahui jumlah komponen dalam sampel. Peralatan yang

digunakan untuk KLT adalah chamber (wadah untuk proses KLT), pinset, plat KLT, dan eluen.

Inilah langkah-langkah memakai KLT:

1. Potong plat sesuai ukuran. Biasanya, untuk satu spot menggunakan plat selebar 1 cm.

Berarti jika menguji 3 sampel (3 spot) berarti menggunakan plat selebar 3 cm.

2. Buat garis dasar (base line) di bagian bawah, sekitar 0,5 cm dari ujung bawah plat, dan

garis akhir di bagian atas.

3. Menggunakan pipa kapiler, totolkan sampel cairan yang telah disiapkan sejajar, tepat di

atas base line. Jika sampel padat, larutkan pada pelarut tertentu. Keringkan totolan.

4. Dengan pipet yang berbeda, masukkan masing-masing eluen ke dalam chamber dan

campurkan.

5. Tempatkan plat pada chamber berisi eluen. Base line jangan sampai tercelup oleh eluen.

Tutuplah chamber.

6. Tunggu eluen mengelusi sampel sampai mencapai garis akhir, di sana pemisahan akan

terlihat.

7. Setelah mencapai garis akhir, angkat plat dengan pinset, keringkan dan ukur jarak spot.

Jika spot tidak kelihatan, amati pada lampu UV. Jika masih tak terlihat, semprot dengan

pewarna tertentu seperti kalium kromat, asam sulfat pekat dalam alkohol 96%, atau

ninhidrin.

Untuk lebih jelasnya, perhatikan gambar di bawah ni.

b. Kromatografi Penyaringan Gel

Merupakan proses pemisahan dengan gel yang terdiri dari modifikasi dekstran-molekul

polisakarida linier yang mempunyai ikatan silang. Bahan ini dapat menyerap air dan membentuk

susunan seperti saringan yang dapat memisahkan molekul-molekul berdasarkan ukurannya.

Molekul dengan berat antara 100 sampai beberapa juta dapat dipekatkan dan dipisahkan.

Kromatografi permeasi gel merupakan teknik serupa yang menggunakan polistirena yang

berguna untuk pemisahan polimer.

c. Elektroforesis

Merupakan kromatografi yang diberi medan listrik disisinya dan tegak lurus aliran fasa gerak.

Senyawa bermuatan positif akan menuju ke katode dan anion menuju ke anoda. Sedangkan

kecepatan gerak tergantung pada besarnya muatan

1. KROMATOGRAFI KERTAS

Kromatografi kertas merupakan salah satu metode pemisahan berdasarkan distribusi suatu

senyawa pada dua fasa yaitu fasa diam dan fasa gerak. Pemisahan sederhana suatu campuran

senyawa dapat dilakukan dengan kromatografi kertas, prosesnya dikenal sebagai analisis

kapiler dimana lembaran kertas berfungsi sebagai pengganti kolom.

Kromatografi kertas adalah salah satu pengembangan dari kromatografi partisi yang

menggunakan kertas sebagai padatan pendukung fasa diam. Oleh karena itu disebut

kromatografi kertas. Sebagai fasa diam adalah air yang teradsorpsi pada kertas dan sebagai

larutan pengembang biasanya pelarut organik yang telah dijenuhkan dengan air.

Dalam kromatografi kertas fasa diam didukung oleh suatu zat padat berupa bubuk selulosa.

Fasa diam merupakan zat cair yaitu molekul H2O yang teradsorpsi dalam selulosa kertas.fasa

gerak berupa campuran pelarut yang akan mendorong senyawa untuk bergerak disepanjang

kolom kapiler. Analisis kualitatif menggunakan kromatografi kertas dilakukan dengan cara

membandingkan harga relative response factor (Rf). Nilai Rf identik dengan time retention

(tR) atau volume retention (VR).

Nilai Rf dapat ditentukan dengan cara:

Rf = jarak yang ditempuh noda jarak yang ditempuh pelarut.Harga Rf zat baku dapat diidentifikasikan komponen campuran, karena harga besaran ini

bersifat khas untuk setiap zat asal digunakan jenis pengembang yang sama. Kadang-kadang pemisahan dalam satu arah belum memberikan hasil yang memuaskan. Untuk mendapatkan hasil yang lebih baik, dapat dipakai cara kromatografi kertas dua dimensi, yang mana letak kertas diubah sehingga arah pemisahan juga berubah.

Secara umum kromatografi kertas dilakukan dengan menotolkan larutan yang berisi sejumlah komponen pada jarak 0,5 sampai 1cm dari tepi kertas. Setelah penetesan larutan pada kertas, maka bagian bawah kertas dicelupkan dalam larutan pengambang(developing solution). Larutan ini umumnya terdiri atas campuran beberapa pelarut organik yang telah dijenuhkan dengan air.

Sistem ini akan terserap oleh kertas dan sebagai akibat dari gaya kapiler akan merambat sepanjang kertas tersebut. Rambatan ini dapat diusahakan dalam modus naik atau menurun. Selama proses pemisahan dilakukan, sistem secara keseluruhannya disimpan dalam tempat tertutup, ruang didalamnya telah jenuh dengan uap sistem pelarut ini.Kromatografi gas

Campuran gas dapat dipisahkan dengan kromatografi gas. Fasa stationer dapat berupa padatan (kromatografi gas-padat) atau cairan (kromatografi gas-cair).Umumnya, untuk kromatografi gas-padat, sejumlah kecil padatan inert misalnya karbon teraktivasi, alumina teraktivasi, silika gel atau saringan molekular diisikan ke dalam tabung logam gulung yang panjang (2-10 m) dan tipis. Fasa mobil adalah gas semacam hidrogen, nitrogen atau argon dan disebut gas pembawa. Pemisahan gas bertitik didih rendah seperti oksigen, karbon monoksida dan karbon dioksida dimungkinkan dengan teknik ini.

Dalam kasus kromatografi gas-cair, ester seperti ftalil dodesilsulfat yang diadsorbsi di permukaan alumina teraktivasi, silika gel atau penyaring molekular, digunakan sebagai fasa diam

dan diisikan ke dalam kolom. Campuran senyawa yang mudah menguap dicampur dengan gas pembawa disuntikkan ke dalam kolom, dan setiap senyawa akan dipartisi antara fasa gas (mobil) dan fasa cair (diam) mengikuti hukum partisi. Senyawa yang kurang larut dalam fasa diam akan keluar lebih dahulu

Metoda ini khususnya sangat baik untuk analisis senyawa organik yang mudah menguap seperti hidrokarbon dan ester. Analisis minyak mentah dan minyak atsiri dalam buah telah dengan sukses dilakukan dengan teknik ini.

Efisiensi pemisahan ditentukan dengan besarnya interaksi antara sampel dan cairannya. Disarankan untuk mencoba fasa cair standar yang diketahui efektif untuk berbagai senyawa. Berdasarkan hasil ini, cairan yang lebih khusus kemudian dapat dipilih. Metoda deteksinya, akan mempengaruhi kesensitifan teknik ini. Metoda yang dipilih akan bergantung apakah tujuannya analisik atau preparatif.HPLC (high precision liquid chromatography atau high performance liquid chromatography)

Akhir-akhir ini, untuk pemurnian (misalnya untuk keperluan sintesis) senyawa organik skala besar, HPLC (high precision liquid chromatography atau high performance liquid chromatography) secara ekstensif digunakan. Bila zat melarut dengan pelarut yang cocok, zat tersebut dapat dianalisis. Ciri teknik ini adalah penggunaan tekanan tinggi untuk mengirim fasa mobil kedalam kolom. Dengan memberikan tekanan tinggi, laju dan efisiensi pemisahan dapat ditingkatkan dengan besar.

Silika gel atau oktadesilsilan yang terikat pada silika gel digunakan sebagai fasa stationer. Fasa stationer cair tidak populer. Kolom yang digunakan untuk HPLC lebih pendek daripada kolom yang digunakan untuk kromatografi gas. Sebagian besar kolom lebih pendek dari 1 m. Kromatografi penukar ion menggunakan bahan penukar ion sebagai fasa diam dan telah berhasil digunakan untuk analisis kation, anion dan ion organik.