Upload
shel
View
31
Download
0
Embed Size (px)
DESCRIPTION
SPECIFIKA ANALÝZY BAKTERIÁLNÍCH SPOLEČENSTEV SEDIMENTŮ POMOCÍ MOLEKULÁRNÍCH DETEKČNÍCH METOD. UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI Katedra ekologie a životního prostředí Jana CUPALOVÁ. BAKTERIÁLNÍ SPOLEČENSTVO SEDIMENT Ů HYPOREÁLU A JEHO ANALÝZA. - PowerPoint PPT Presentation
Citation preview
SPECIFIKA ANALÝZY BAKTERIÁLNÍCH SPOLEČENSTEV SEDIMENTŮ POMOCÍ
MOLEKULÁRNÍCH DETEKČNÍCH METOD
UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCIUNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI
Katedra ekologie a životního prostředíKatedra ekologie a životního prostředí
Jana CUPALOVÁ
BAKTERIÁLNÍ SPOLEČENSTVO SEDIMENTŮ HYPOREÁLU A JEHO ANALÝZA
• hlavní formou výskytu bakterií v hyporeálu je biofilm, tj. komplex organických látek, mikroorganismů a jejich extracelulárních produktů, pevně vázaný na podklad (substrát)
•využití běžných molekulárních detekčních metod není možné bez předchozí úpravy sedimentu (sonifikace, detergenty, hustotní centrifugace)
Problémy spojené s izolací a detekcí baktérií I.
1. Volba zrnitostní frakce sedimentu pro analýzu
2. ukotvení bakterie k substrátu i v matrix je velmi pevné a často je možné přerušit je fyzikálními nebo chemickými prostředky pouze u určitého procenta organismů, část tak zůstává nedetekovatelná.
3. Velikost a aktivita baktérií - bakterie sedimentu jsou často velmi malé a pomalu rostoucí a tím pádem hůře detekovatelné než bakterie volné vody
Grain size < 1mm represents ~ 20 % of total sediment weight,however, 60 % of total POC of the sediment
60 %
TPOC
< 1 mm
Grain size < 1mm
20 %< 1 mm
Dry sediment
Grain size fraction < 1 mm
1 : 9
< 0.063 mm 0.063 < 1
mm
Parameter fine fraction (n) coarse fraction (n)
TPOC (mg. g-1 DW) 27.1 ± 1.3 (52) 4.0 0.2 (52)Carbohydrates (mgC. g-1DW) 26.2 4.2 (16) 0.4 0.1 (16) Bacteria (1010cells.g-1DW) 21.9 38.3 (36) 0.4 ± 0.5 (16)Proteins (g.g-1DW) 189.5 8.3 (32) 95.4 2.7 (31)FDA (mol.g-1DW.h-1) 19.3 23.3 (16) 2.9 1.8 (16)
Fine fraction Coarse fraction
Celková bakteriální abundance
snímek DAPI z epifluorescenčního mikroskopu
sediment volná voda, kultivace s přídavkem DOC
4. Nízký obsah cílových nukleových kyselin je příčinou slabého nebo dokonce nezachytitelného signálu (excitačního paprsku) a tím často podhodnocení celkové bakteriální abundance (FISH)(Amann et al., 1995).
5. K tomuto problému se v případě detekce in situ často přidružuje ještě tzv. maskování („masking effect“) buněk nečistotami, resp. sedimentem (Kepner et al, 1993).
Problémy spojené s izolací a detekcí baktérií II.
MOLEKULÁRNÍ DETEKČNÍ METODY- taxonomické složení bakteriálního společenstva
sediment volná voda, kultivace s přídavkem DOC
snímek FISH z epifluorescenčního mikroskopu
Postup při analýze vzorkuPostup při analýze vzorku
Odběr vzorkůOdběr vzorků
Extrakce buněk ze sedimentuExtrakce buněk ze sedimentu
Mikroskopická analýzaMikroskopická analýza
Barvení DAPI a FISHBarvení DAPI a FISH
Freeze-core (N2)
sonikace
DETERGENT, SONIKACE A HUSTOTNÍ CENTRIFUGACE
PŮSOBENÍ DETRERGENTU A ULTRAZVUKOVÝCH VLN
přerušení vazeb bakterie- částice,
resp. bakterie- bakterie
PO CENTRIFUGACIPŘED CENTRIFUGACÍ
rozdělení částic vzorku podle jejich
hustoty
5-(N-2,3-dihydroxypropylacetamido) – 2,4,6 – trijodo –N, N´- bis(2,3- dihydroxypropyl) isophtalamide
ZHODNOCENÍ EFEKTIVITY HUSTOTNÍ CENTRIFUGACE
0,00
5,00
10,00
15,00
20,00
25,00
0- 10 10-- 20 20- 30 30- 40 40- 50
vrstva [cm]
Prů
měrn
á a
bundance
bakte
rií
10
6 g-1
ABUNDANCE VEVZORCÍCH POHUSTOTNÍCENTRIFUGACI
ABUNDANCE VEVZORCÍCH PŘEDHUSTOTNÍCENTRIFUGACÍ
0,00
5,00
10,00
15,00
20,00
25,00
a b c d
frakce
Prů
měrn
á a
bundance
bakte
rií
10
6 g-1 ABUNDANCE VE
VZORCÍCH POHUSTOTNÍCENTRIFUGACIi
ABUNDANCE VEVZORCÍCH PŘEDHUSTOTNÍCENTRIFUGACÍ
frakcerozměr [mm]
a < 1
b 1- 3
c 3- 5,6
d 5,6- 22,4
signifikantní rozdíl vzorků před a po centrifugaci (ANOVA, repeated measures; p< 0,05)
signifikantní rozdíl vzorků před a po centrifugaci (ANOVA, repeated measures; p< 0,05)
- kombinace využití sonifikace, detergentu a hustotní centrifugace byla posouzena jako vhodná a efektivní pro separaci bakterií a sedimentu
- zařazení těchto „přípravných“ metod před vlastní molekulárně- detekční postupy významně zvýšilo počet detekovatelných bakteriálních buněk
SHRNUTÍ
cílový roztok detergentu
požadované množství 400 ml
složka koncentrace složky, molární hmotnost
množství
difosforečnan sodný M = 446 g.mol-1
0,1 M výsl. koncentrace m = 17,84 g
Tween 20 0,5% výsledná koncentrace V = 2 ml
NaCl 9,0 g. l-1 m = 3,6 g
destilovaná voda doplníme do výsledného objemu
doplníme do výsledného objemu
Ultrazvukové vlny o vysoké energii rozrušují agregáty sedimentů, destruují vlákna fibril i kotvící vrstvy exopolymerů, kterými jsou bakterie přichyceny k povrchu, nebo dokonce odtrhávají celé kusy biofilmu. Kromě toho však při určité vlnové délce a intenzitě porušují také struktury vlastních buněk, zapříčiňují jejich praskání a tím možné zkreslení následných detekčních metod
isopyknická centrifugace v hustotním gradientu probíhá výhradně na principu různé hustoty částic, tedy nezávisle na jejich ostatních vlastnostech (velikosti, tvaru, viskozitě aj). Základem je prostředí o měnící se hustotě (hustotní gradient), přičemž rozsah hustot média leží v oblasti očekávaných hustot dělených částic. Hustoty obvykle přibývá od horního okraje centrifugační zkumavky ke dnu.
Chemické postupy, jejichž cílem je oddělit bakterie od substrátu, pracují především s nejrůznějšími detergenty, tedy obecně látkami, které mají schopnost snižovat povrchové napětí vody a tím výrazně zesilovat její vlastnosti rozpouštědla. Účinnost takových látek však závisí na charakteru vazby bakterie- substrát; jsou-li cílové buňky součástí biofilmu, efektivita použití detergentu může být velmi nízká.
HYPOREÁL
ZÁSADNÍ VÝZNAM PRO:
• hydrogeologický režim krajiny
• ekologii toku (biomineralizace, samočištění)
HYPOREÁL
= veškeré propustné prostředí dna a břehů vodního toku, v němž dochází k mísení vody z toku s vodou podzemní (White, 1993)
Sediment analysis
GranulometryBiofilm organic carbon (BPOC)Bacterial abundance and biomassRespirationCarbohydrates and proteinsBacterial productionEnzyme activity Gas production potentialPlant detritus organic carbon
Freeze-core with liquid nitrogen
Two layers (0-20 cm and 20-50 cm) were separated