Stanovení struktury neurotoxinu II vázaného na nikotin acetylcholinový receptor – přístup

nukleární magnetické rezonance v pevném stavu

Biofyzika

Seminář z biofyziky biol. membrán II

Ladislav Šigut

Nukleární magnetická rezonance

• Vychází z magnetických vlastností atomových jader popsaných kvantovou mechanikou

• Všechna jádra mající liché nukleonové číslo mají vlastní magnetický moment (1H, 13C, 15N)

• Působením vnějšího magnetického pole dochází k vysokému spektrálnímu štěpení (popsáno Zeemanovým efektem a chemickým posunem)

• NMR látek v pevném stavu má nízké rozlišení x NMR roztoků

MAS NMR v pevném stavu

• Vhodná metoda pro stanovení rezonancí a struktury pevných látek

─ dokázáno na SH3 mikrokrystalickém proteinu

• Spektra s vysokým rozlišením můžeme obdržet i u systému složeného z komplexu receptor-toxin

• Použitý NMR vzorek se skládá z membránového preparátu nicotin acetylcholinového receptoru elektrického orgánu parejnoka kalifornského, který byl inkubován stejnoměrně 13C-, 15N-označeným neurotoxinem II.

─ výsledky jsou podobné jako u NMR roztoků, výrazné změny pozorovány pouze pro jeden izoleucin

Nicotin acetylcholinový receptor (nAChR)

• Nachází se v postsynaptických membránách synapsí centralního nervového systému a nervosvalových ploténkách (motorických ploténkách)

Nervosvalová ploténka

1: zakončení neuronu, 2: mitochondrie, 3: váčky s mediátorem, 4:biomembrána

svalového vlákna, 5: štěrbina ploténky (převzato z Jelínek, Zicháček (1998))

Nicotin acetylcholinový receptor (nAChR)

• Chemicky řízený iontový kanál reagující na ligand

• Skládá se z pěti homologních podjednotek se stechiometrií α2βγδ každá o velikosti cca. 200 zbytků na extracelulární straně 4 membránu překlenující segmenty intracelulární segmenty různých délek

• Má kationt-selektivní pór, který se otevře po navázáníacetylcholinu

• Dvě vazebná místa lokalizována na α podjednotkách (Obr.)poblíže styčných ploch podjednotek

• Kompetitivně blokována působením α-neurotoxinů

Postsynaptické neurotoxiny

Dvě třídy toxinů:

1. dlouhé (délka polypeptidového řetězce 66-74 zbytků)

2. krátké (60-62 zbytků)

Neurotoxin II (NTII)

• v jedu asijské kobry Naja oxiana

• patří do skupiny krátkých toxinů (61 zbytků)

Struktura NTII v roztoku určená pomocí NMR roztoků

Postsynaptické neurotoxiny

• Ustálená struktura - velký počet neurotoxinů obsahuje NTII

• Známé 3D struktury

• Způsoby pozorování interakce neurotoxinu s receptorem:─ „cross-linking“ experimenty zkoumajícími propojení molekul─ elektronová paramagnetická rezonance (EPR)─ fluorescence ─ NMR analýza roztoků*

• Vysoká afinita neurotoxinů k nAChR a specifita─ neurotoxiny jako nástroj při popisu struktury a funkce receptoru

* Při vazbě na analog α-podjednotky nAChR ukázala analýza změny ve struktuře toxinu

„Magic-angle spinning“ NMR spektroskopie látek v pevném stavu

• Efektivní metoda pro studia struktury kvazi-immobilních biomolekul

• Jestliže je sesbírán dostatečný počet molekul s korigovanou strukturou, je možné vypočítat strukturu

• Dva předpoklady:

1. dostupnost izotopicky značených proteinů (toxinů s 13C-uhlíkem a 15N-dusíkem ─ umožněno rekombinantní expresí NTII u Escherichia coli

2. strukturní homogenita daného místa vzorku, která ovlivňuje rozlišení spektra─ nAChR vazebné místo slouží jako matrice

Stanovení koncentrace pomocí vazby na filtr

• Afinitu mezi dvěma molekulami (např. protein – DNA) je možné určit na základě vazebné konstanty (poměr vázaných a nevázaných molekul)

• Metoda stanovení koncentrace pomocí vazby na filtr měří afinitu mezi dvěma molekulami využitím filtru (nitrocelulózový papír)

• Proteiny mají převážně pozitivní náboj

• Na filtr se váže pouze protein a komplex protein - DNA – vyhodnotí se procentuální zastoupení vázané složky (DNA může být značena radioaktivními izotopy)

• Po provedení několika měření se odečte střední hodnota z křivky závislosti procentuálního zastoupení vázané složky na koncentraci peptidu

„Magic-angle spinning“ NMR spektroskopie látek v pevném stavu

• Na základě vazebné konstanty lze určit, že rovnováha mezi volným a vázaným stavem toxinu je silně posunutá směrem k stavu s navázaným receptorem

• Nadbytečný NTII může být tedy odstraněn vymytím bez snížení signifikantního počtu obsazených vazebných míst receptoru

Materiál a metody

Zisk NTII:

• Použity buňky E. coli BL21 obsahující vektor exprese NTII • Byly pěstovány při 28°C za určitých podmínek • Genová exprese byla indukována zvýšením teploty na 37°C

Zisk komplexu neurotoxin-receptor:

• Byla získána suspenze membrán bohatých na nAChR receptory z elektrické tkáně T. californica jak již bylo řečeno

• Po přidání roztoků a aditiv (Triton X-100 aj.) byla suspenze inkubována v NTII a následně třikrát centrifugována po dlouhou dobu při vysokých otáčkách

Výsledky a diskuze

• nAChr má dvě vazná místa pro NTII umístěná na rozhraní podjednotek α/γ a α/δ

• V membráně bohaté na receptory nejsou obě vazebné místa plně přístupné kvůli těsnému sbalení podjednotek receptoru nAChR

• Postup vedoucí ke zvýšení přístupnosti k vazebným místům NTII je užitečný pro zvýšení koncentrace značených vázaných složek ve vzorku

• Pružnost membrán se zvýší aplikací Tritonu X-100 a tím se zvýší počet dostupných vazebných míst

Výsledky a diskuze

• Použitím metody stanovení koncentrace pomocí vazby na filtr byl naměřen nárůst počtu vazebných míst o 50% po přidání dílu Tritonu na 0,02 objemových procent

─ místo NTII použit jeho homolog [125I]Bgtx (značený izotopem 125I)

• Vyšší koncentrace vedou ke zvýšení počtu vazebných míst, ale zároveň k výraznému zvýšení počtu solvatovaných receptorů

• Pro NMR spektroskopickou analýzu byly tedy nakonec využity vzorky s průměrnou vazebnou stechiometrií 1,5 molekuly toxinu na každý receptor

Závěr

• Označený NTII byl analyzován pomocí MAS NMR v pevném stavu, navázán na receptor nAChR

• Komplex toxin-receptor byl zkoumán ve svém nativním membránovém prostředí

• 1D a 2D NMR spektra pevného stavu ukázala, že NTII byl v definovaném prostředí nejspíše zajištěném vazebnými kapsami receptoru

Literatura

• Krabben, L. et col.: Towards structure determination of neurotoxin II bound to nicotinic acetylcholine receptor: a solid-state NMR approach, FEBS Letters 564 (2004) 319-324

• Jelínek J., Zicháček, V.: Biologie pro gymnázia, 327 stran [Nakladatelství Olomouc, Olomouc, 1998] [ISBN 80-7182-050-4]