Stanovenie intracelulárnych cytokínov u pacientiek s poruchami reprodukcie

Elena Tibenská, Mária Ondrejíčková, Simona Duranková, Barbora Onderová

Neplodnosť- definícia, incidencia

• Definícia - WHO – neschopnosť počať dieťa

po 1 roku pravidelného nechráneného

sexuálneho styku

• Incidencia - celosvetovo cca 10-15% párov vo fertilnom veku

- vyspelé krajiny až 20-25% (u nás asi každý 5. pár)

Z toho cca 30% - mužský faktor, 30- 40% ženský a v 15-30% -

porucha u oboch partnerov

• Trend narastania počtu neplodných párov - genotoxické faktory

prostredia, stres, pohlavné choroby, infekcie a zápaly v uro-gyn.

oblasti a ich následky, tehotenstvo v neskoršom veku

• Diagnostika má zásadný význam- liečba býva úspešná až v 50-60%

Imunológia gravidity

• „imunologický paradox“ = tolerancia IS tehotnej ženy voči „semialogénnemu“ plodu s Ag cudzieho pôvodu

• 1953- dr. Peter Medawar –

problematika semialogénneho

plodu v maternici matky – koncepcia

funkčnej supresie maternálnych lymfocytov

„The immunological problem of pregnancy may be formulated thus: How does the pregnant mother contrive to nourish within itself, for many weeks or months, a fetus that is an antigenically foreign body?... By the immunological indolence or inertness of the mother“

Paradigma Th1/Th2 v tehotenstve – Wegmann a kol. (1993) – popísali posun k Th2 ako – indukcia tolerancie plodu

Úloha cytokínov v tehotenstve

Th1 cytokíny - IL-2, IFN-γ, TNF-α - hrá úlohu pri

implantácii (cez produkciu VEGF) (Chung et al. 2000)

embryotoxické, môžu spôsobovať deštrukciu buniek trofoblastu a aktivovať cytotoxické bunky, čo negatívne vplýva na rast a vývoj embrya, ich vysoké zastúpenie môže preto viesť k potratom

hodnoty Th1 cytokínov v deciduu spôsobujú potraty u myší (podanie IL-10 môže zabrániť) (Chaouat et al. 1995, Clark et al. 1998)

TNF-α – stimuluje apoptózu buniek trofoblastu, IFN-γ túto vlastnosť ešte zvyšuje - môže zvyšovať aktivitu NK buniek (Yui et al. 1994)

hodnoty u žien s opak. potratmi (Ragupathy et al. 2000, Makhseed et al. 2001,...)

dôkazy na zvieracích modeloch aj klinických pozorovaniach

Th1/Th2 koncepcia

Th2 cytokíny - IL-4, IL-10, TGF- - protizápalové - ochrana plodu (allograftu)

ochranný vplyv na placentu a pozitívny vplyv na graviditu najmä supresívnym pôsobením na Th1 lymfocyty

úloha hormónov – progesteron - produkcie LIF (leukemia inhitor factor) a IL-12 (chýbanie LIF u myší problém s implantáciou) a

IFN-γ, TNF-α (Piccini et al. 1998, NG et al. 2001)

normálne tehotenstvo – znižujú sa Th1 aj Th2 cytokíny, hlavne v 3.trimestri význam – pomer Th1/Th2 cytokínov (NG et al. 2001)

návrat k pôvodným hodnotám – skoro po pôrode – vplyv hormónov

Th1/Th2 koncepcia

Fyziologické tehotenstvo (predominancia Th2/supresia Th1 - maternofetálna tolerancia)

Patologické tehotenstvo (embryotoxické pôsobenie Th1 - zlyhanie implantácie)

KONCEPCIA TH1/TH2/TH17/Treg

Saito S., Am J Reprod Immunol. 2010

TNF-α & IFN-γ

TNF-α IFN-γ

indukuje apoptózu trofoblastových

buniek inhibuje embryonálny a fetálny vývoj

podporuje TNF-α mediovanú „smrť“

trofoblastu

inhibuje rast TH2 buniek

inhibujú rast ľudských trofoblastových buniek in vitro

spôsobujú trombotické a zápalové procesy v maternálnych

uteroplacentárnych krvných cievach

spočiatku potrebný pre

embryonálnu implantáciu do

maternice

nevyhnutný pre remodeláciu

spirálnych artérií

Th1/Th2 cytokíny v tehotenstve – klinické aspekty

hodnotiť vždy komplexne

klinický význam – Th1

- Th2

kľúčový cytokín – TNF-α:

- aj mierne zvýšenie môže byť prejavom infekcie (často chronickej a bezpríznakovej) vylúčiť a preliečiť prípadné infekčné fokusy, dôkladné vyšetrenie a preliečenie oboch partnerov na prítomnosť urogenitálnych (aj atypických) infektov

- pri pretrvávajúcich vysokých hodnotách (60%) – zváženie imunomodulačnej terapie (kortikosteroidy, inhibítory fosfodiesterázy, IVIG)

Detekcia intracelulárnych cytokínov princíp metódy

Princíp metódy

POK

NK

PK

CD3+CD4

CD3+CD4

CD3+CD4

CD3+CD4+

CD69

CD3+CD4

ʘ A

ʘ A

Lyse

ʘ B

ʘ B

PBS meranie

CD69

IFNγ+IL4

IL2+TNFα

IL2+TNFα

IFNγ+IL4

PBS

PBS

meranie

meranie

IC: IFN-γ, TNF-α, Il-, IL-4 v CD3+T-ly

IC: IFN-γ, TNF-α, Il-, IL-4 v CD3+CD4+Th-ly

Súbor pacientiek

474 pacientiek ( júl 2013 – marec 2015)

42

283

149

2013

2015

2014

19

67

19

68

19

69

19

70

19

71

19

72

19

73

19

74

19

75

19

76

19

77

19

78

19

79

19

80

19

81

19

82

19

83

19

84

19

85

19

86

19

87

19

88

19

89

19

90

19

91

19

92

1 0 1 2 2 3

12 14

22

30

42 43

58

41 40 39 38

32

14 14 12

4

7

0 2 1

Cytokín CD3/CD4 Ly CD3/CD4 Ly

IFN-γ 11-31% 2,3-55,6 / 0,7-51,5

IL-4 2-8% 1,2-40,9 / 0,2-54

TNF-α 12-44% 3,7-73,4 / 2,5-81,7

IL-2 8-28% 0,5-42,5 / 1-56,4

28,21

14,01

43,2

18,3

20,79

9,47

43,91

23,61

IFN-γ IL-4 TNF-α IL-2

CD3 CD4

Pacientky Kontrola

p-value n = 46 n = 13

Priemer SD Priemer SD

CD3+ IFN-γ (%) 23,01 ± 9,61 21,42 ± 6,16 0,479

CD3+ IL-4 (%) 10,96 ± 8,18 8,25 ± 6,28 0,212

CD3+ TNF (%) 42,98 ± 12,40 35,79 ± 9,70 0,037

CD3+ IL-2 (%) 19,13 ± 8,30 17,36 ± 8,01 0,493

CD4+ IFN-γ (%) 15,18 ± 9,04 13,02 ± 5,53 0,297

CD4+ IL-4 (%) 7,73 ± 5,80 5,75 ± 3,91 0,161

CD4+ TNF (%) 45,94 ± 15,36 37,54 ± 10,43 0,03

CD4+ IL-2 (%) 26,43 ± 11,29 20,41 ± 9,74 0,071

výsledky

intracelulárne cytokíny IFN-γ, IL-4, TNF a IL-2 (CD3+ a CD4+) u pacientiek

s poruchami plodnosti a fertilných žien

Pacientky Kontrola

p-value n = 46 n = 13

Priemer SD Priemer SD.

CD3+

IFN-γ/IL-4 4,01 ± 4,65 4,69 ± 4,87 0,659

TNF/IL-4 7,43 ± 8,69 7,62 ± 6,95 0,936

IL-2/IL-4 3,57 ± 6,13 3,77 ± 4,08 0,895

CD4+

IFN-γ/IL-4 3,83 ± 4,33 3,26 ± 3,15 0,605

TNF/IL-4 12,94 ± 15,35 9,92 ± 8,68 0,366

IL-2/IL-4 7,85 ± 15,63 5,05 ± 4,40 0,286

výsledky

Pomer TH1-/TH2 cytokínov u pacientiek s poruchami plodnosti a fertilných žien

Porovnávané

parametre

Sterilita Rekurentné tehotenské

straty p-value

n = 21 n = 17

Priemer Smer. odch. Priemer Smer. odch.

CD3+ IFN-γ (%) 25,15 ± 7,93 22,4 ± 8,36 0,310

CD3+ IL-4 (%) 8,26 ± 9,02 9,84 ± 7,05 0,549

CD3+ TNF (%) 41,58 ± 14,28 40,312 ± 14,89 0,793

CD3+ IL-2 (%) 19,36 ± 9,65 17,66 ± 9,21 0,585

CD4+ IFN-γ (%) 15,48 ± 7,70 14,26 ± 10,18 0,687

CD4+ IL-4 (%) 5,54 ± 6,40 7,82 ± 5,84 0,260

CD4+ TNF (%) 42,51 ± 18,47 43,08 ± 17,53 0,923

CD4+ IL-2 (%) 25,89 ± 13,15 23,62 ± 12,96 0,598

výsledky

intracelulárne cytokíny IFN-γ, IL-4, TNF a IL-2 (CD3+ a CD4+) u pacientiek s primárnou

sterilitou a rekurentnými tehotenskými stratami

Sterilita Rekurentné tehotenské straty

p-value n = 21 n = 17

Priemer Smer. odch. Priemer Smer. odch.

CD3+

IFN-γ/IL-4 6,77 ± 5,94 3,47 ± 2,47 0,028

TNF/IL-4 11,25 ± 11,61 5,86 ± 3,41 0,055

IL-2/IL-4 5,53 ± 8,61 2,56 ± 1,79 0,137

CD4+

IFN-γ/IL-4 6,69 ± 5,42 2,78 ± 2,31 0,006

TNF/IL-4 21,04 ± 20,06 9,59 ± 7,31 0,023

IL-2/IL-4 12,96 ± 22,15 5,11 ± 3,91 0,125

výsledky

Pomer TH1-/TH2 cytokínov u u pacientiek s primárnou sterilitou a rekurentnými

tehotenskými stratami

Kontrola

n = 13

Priemer SD.

4,69 ± 4,87

7,62 ± 6,95

3,77 ± 4,08

3,26 ± 3,15

9,92 ± 8,68

5,05 ± 4,40

IC Výsledky

pac. J.P. (1976)

- ANA, APLA, CE, anti-sp., ovaria, ZP –

negat.

- bunková im.: CD8+ - 13,7%

CD56+ 21,1-13,6-9,6-34,4%

– Medrol 8mg – IVF momentálne

neodporúčané

začala so stimuláciou – IVF neúspešné

pac.K.CH (1977):

- ANA, APLA, CE, anti-sp., ovaria, ZP –

negat.

- bunková im.: CD56+ - 21,5%

Medrol 4mg

intralipidy

IC výsledky

0

10

20

30

40

50

60

1 2 3

IC - pac. M.M.

CD4+ IFN CD4+ IL4 CD4+ TNF CD4+ IL2

24.1.2013

17.7.2013

21.t.gravidity

1.12.2012

pac.M.M. (1977) - opak. slabá

pozit.ANA

prekoncepčne nízke dávky

Prednisonu

na pac.žiadosť vysadené po

skončení I.trimestra

predčasný pôrod – zdravé dievčatko

pac.J.V (1981)

ANA – opakovane slabá pozit.

Medrol prekoncepčne

tehotná – termín pôrodu február

2015?

Záver- zhrnutie

• medzi reprodukčným a imunitným systémom – veľké množstvo

zložitých interakcií

• k zaisteniu tolerancie antigénov reprodukčných orgánov,

pohlavných buniek i semialogénneho embrya -

nevyhnutné množstvo imunoregulačných mechanizmov

• možnosť veľkého množstva porúch na rôznych stupňoch

- imbalancia Th1/Th2 len jednou z možných porúch

- infertilít nejasnej etiológie asi 20%

• rozširujúce sa možnosti diagnostiky a často aj úspešnej liečby (50-60%)

Ďakujem za pozornosť