Struktura, funkcjonowanie i regulacja systemów metabolizmu … w... · 2019-05-22 · trzy. Białko EIIC (permeaza) zakotwiczone jest w błonie komórkowej i umożliwia specyficzny

Tamara Aleksandrzak-Piekarczyk Załącznik nr 2 Autoreferat w języku polskim

1

Tamara Aleksandrzak-Piekarczyk

Struktura, funkcjonowanie i regulacja systemów

metabolizmu cukrów u bakterii fermentacji mlekowej.

AUTOREFERAT


2

1. Imię i Nazwisko: Tamara Aleksandrzak-Piekarczyk

2. Posiadane dyplomy, stopnie naukowe / artystyczne – z podaniem nazwy, miejsca i roku

ich uzyskania oraz tytułu rozprawy doktorskiej.

2004 Doktor Nauk Biologicznych w zakresie biochemii (z wyróżnieniem)

Instytut Biochemii i Biofizyki, Polska Akademia Nauk, Warszawa

Tytuł rozprawy doktorskiej: „Lactose and -glucosides catabolism in Lactococcus lactis

– biochemistry and genetic regulation”.

Promotor: Prof. dr hab. Jacek Bardowski

1997 Magister biologii, specjalizacja biologia molekularna

Wydział Biologii Uniwersytetu Warszawskiego

Tytuł pracy magisterskiej: „Nowe geny katabolizmu laktozy u Lacococcus lactis”.

Promotor: Prof. dr hab. Andrzej Jerzmanowski

3. Informacje o dotychczasowym zatrudnieniu w jednostkach naukowych / artystycznych.

05/2005 - obecnie IBB PAN na stanowisku asystenta w Zakładzie Biochemii

Drobnoustrojów

04/2004 - 04/2005 IBB PAN na stanowisku biologa w Zakładzie Biochemii Drobnoustrojów

4. Wskazanie osiągnięcia* wynikającego z art. 16 ust. 2 ustawy z dnia 14 marca 2003 r. o

stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki (Dz. U.

2016 r. poz. 882 ze zm. w Dz. U. z 2016 r. poz. 1311.):

a) tytuł osiągnięcia naukowego/artystycznego:

Struktura, funkcjonowanie i regulacja systemów metabolizmu cukrów u bakterii fermentacji

mlekowej.

b) publikacje wchodzące w skład osiągnięcia naukowego

Na osiągnięcie naukowe składa się cykl siedmiu prac eksperymentalnych, czterech

monografii naukowych oraz jednego doniesienia konferencyjnego. IF czasopisma i liczbę

cytowań podano wg wskazań WoS Core Collection. W przypadku braku czasopisma w bazie

WOS liczbę cytowań podano za bazą Scopus i wskazano to właściwą informacją. IF, impact

factor podano dla pięciu lat (IF5) oraz dla roku publikacji, z wyjątkiem najnowszych prac, dla

których podano IF z roku 2017 (IF2017).

Przy wydawnictwach konferencyjnych pominięto IF czasopisma (zgodnie z

Oświadczeniem Ministra Nauki I Szkolnictwa Wyższego w sprawie naruszania zasad dobrej

praktyki naukowej przy stosowaniu bibliometrycznego wskaźnika impact factor do oceny

dorobku jednostek naukowych z 11.07.2008).

* - autor korespondencyjny


3

1. Tymoszewska A, Diep DB, Aleksandrzak-Piekarczyk T*

The extracellular loop of Man-PTS subunit IID is responsible for the sensitivity of

Lactococcus garvieae to garvicins A, B and C.

Scientific Reports. 2018. 8:15790

IF2017: 4,122; IF5: 4,609; Liczba cytowań: 0

2. Aleksandrzak-Piekarczyk T*, Szatraj K, Kosiorek K

GlaR (YugA)-a novel RpiR-family transcription activator of the Leloir pathway of galactose

utilization in Lactococcus lactis IL1403.

Microbiologyopen. 2018. 11:e00714.

IF2017: 2,682 IF5: 2,722; Liczba cytowań: 0

3. Tymoszewska A, Diep DB, Wirtek P, Aleksandrzak-Piekarczyk T*

The non-lantibiotic bacteriocin Garvicin Q targets Man-PTS in a broad spectrum of

sensitive bacterial genera.

Scientific Reports. 2017. 7:8359


4. Aleksandrzak-Piekarczyk T*, Stasiak-Różańska L, Cieśla J, Bardowski J

ClaR – a novel key regulator of cellobiose and lactose metabolism in Lactococcus lactis

IL1403.

Applied Microbiology and Biotechnology. 2015. 99(1):337-47


5. Koryszewska-Baginska A, Bardowski J, Aleksandrzak-Piekarczyk T*

Genome sequence of the probiotic strain Lactobacillus rhamnosus (formerly Lactobacillus

casei) LOCK908.

Genome Announcements. 2014. Feb 20:2(1)

Brak IF; Liczba cytowań: 12 cytowań wg bazy Scopus; brak czasopisma w bazie WoS Core

Collection

6. Aleksandrzak-Piekarczyk T*, Koryszewska-Baginska A, Bardowski J

Genome sequence of the probiotic strain Lactobacillus rhamnosus (formerly Lactobacillus

casei) LOCK900.

Genome Announcements. 2013. Aug 15;1(4)

Brak IF; Liczba cytowań: 17 cytowań wg bazy Scopus; brak cytowań czasopisma w bazie

WoS Core Collection


4

7. Koryszewska-Baginska A, Aleksandrzak-Piekarczyk T, Bardowski J

Complete genome sequence of the probiotic strain Lactobacillus casei (formerly

Lactobacillus paracasei) LOCK919.

Genome Announcements. 2013. 26(1):5

Brak IF; Liczba cytowań: 19 cytowań wg bazy Scopus; brak cytowań czasopisma w bazie

WoS Core Collection.

Prace monograficzne (rozdziały w książkach):

8. Kowalczyk M, Mayo B, Fernández M, Aleksandrzak-Piekarczyk T*

Updates on metabolism in lactic acid bacteria in light of “omic” technologies.

In: Biotechnology of Lactic Acid Bacteria - second edition. Mozzi F, Raya RR and Vignolo

GM (eds). 2016.

Liczba cytowań w bazie WoS: 2

9. Aleksandrzak-Piekarczyk T*

Lactose and β-glucosides metabolism and its regulation in Lactococcus lactis: a review.

In: Lactic acid bacteria - R & D for food, health and livestock purposes. J. Marcelino Kongo

(ed.). 2013.

10. Aleksandrzak-Piekarczyk T, Kowalczyk M, Bardowski JK

Bacteriocins - alternatives to antibiotics.

Chapter in: Biotechnology and Animal Food Quality, Part III, Biotechnology and Quality of

Animal Products, (p.160). Peter Chrenek et al., Slovak University of Agriculture in Nitra,

Animal Production Research Centre Nitra, ISBN 978-80-552-0965-4. 2013. Strony:99-108.

11. Mayo B, Aleksandrzak-Piekarczyk T, Fernández M, Kowalczyk M, Álvarez-Martín and

Bardowski J

Updates in the metabolism of lactic acid bacteria.

In: Biotechnology of Lactic Acid Bacteria. Mozzi F, Raya RR and Vignolo GM (eds).

Blackwell Publishing, San Miguel de Tucumán, Argentina. 2010.

Liczba cytowań wg bazy Scopus: 63

Recenzowane doniesienia konferencyjne:

12. Szatraj K, Bardowski J, Aleksandrzak-Piekarczyk T*

The hypothetical YugA protein is involved in the positive regulation of galactose and

maltose assimilation in L. lactis IL1403.

New Biotechnology. 2016. 3: S211-S211. DOI: 10.1016/j.nbt.2016.06.1449


5

c) omówienie celu naukowego/artystycznego ww. pracy/prac i osiągniętych wyników wraz

z omówieniem ich ewentualnego wykorzystania. Publikacje wchodzące w skład osiągnięcia

wyróżniono niebieskim drukiem.

Bakterie mlekowe – LAB (ang. lactic acid bacteria) to heterogenna grupa

mikroorganizmów, których wspólną cechą jest zdolność do przeprowadzania procesu

fermentacji mlekowej, czyli fermentacji różnych węglowodanów z wytworzeniem kwasu

mlekowego, jako głównego produktu. Do tej fizjologicznej grupy bakterii zalicza się Gram-

dodatnie, niesporulujące ziarenkowce lub pałeczki, obejmujące takie rodzaje, jak

Carnobacterium, Enterococcus, Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Streptococcus

Tetragenococcus, Vagococcus i Weissella (Stiles and Holzapfel, 1997).

Są wszechobecne w wielu bogatych w składniki odżywcze środowiskach, takich jak

mleko, mięso, materiał roślinny, a niektóre z nich są stałymi lub czasowymi mieszkańcami

przewodu pokarmowego ssaków i innych organizmów. Ze względu na ich zróżnicowany

potencjał metaboliczny obejmujący m.in. zdolność do katabolizowania różnych źródeł węgla z

wytworzeniem kwasu mlekowego, hydrolizy białek oraz produkcji związków aromatycznych,

bakterie mlekowe są stosowane jako kultury starterowe w różnych procesach fermentacji

żywności. Znaczenie LAB dla przemysłu spożywczego i społeczeństwa można docenić na

podstawie szacunków, że około 8,5 miliarda kg fermentowanego mleka jest rocznie

wytwarzanych w Europie, co prowadzi do spożycia przez ludzi 8,5 × 1020 LAB (Franz et al.,

2010).

Zrozumienie mechanizmów metabolizmu węglowodanów i ich regulacji w komórkach

LAB ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia ich ekologii i ewolucji, a także racjonalnego

doboru szczepów o znaczeniu przemysłowym i ukierunkowanej modyfikacji właściwości tych

mikroorganizmów dla celów biotechnologicznych.

Pierwszym etapem metabolizmu węglowodanów jest zazwyczaj ich transport do

komórki. W przypadku bakterii, dyfuzja prosta lub ułatwiona mają dużo mniejsze znaczenie

niż transport aktywny, w obrębie którego wyróżniamy transport pierwotny, wtórny oraz

translokację grupową. W każdym z tych procesów przemieszczenie zachodzi wbrew

gradientowi stężeń transportowanych związków, z nakładem energii i udziałem białka

transportowego (permeazy).


6

Motorem napędowym transportu pierwotnego jest przekształcanie energii świetlnej

lub chemicznej (np. zmagazynowanej w ATP lub innych związkach wysokoenergetycznych) w

elektrochemiczną.

Transport wtórny napędzany działaniem siły protonomotorycznej. Ze względu na

funkcję białka transportującego wyróżnia się uniport, symport i antyport. Uniport to system

transportu, w którym do wnętrza komórki przenoszone są cząsteczki tylko jednego typu. W

symporcie dochodzi do przenoszenia dwóch (lub więcej) rodzajów cząsteczek w jednym

kierunku – elektrochemiczny gradient jednej cząsteczki (zazwyczaj protonu lub Na+),

wykorzystywany jest do transportu innej. W antyporcie następuje równoczesne

przemieszczanie dwóch cząsteczek w przeciwnych kierunkach (Poolman and Konings, 1993).

Ostatni rodzaj transportu ma zupełnie inny charakter. Translokacja grupowa

związana jest z chemiczną modyfikacją substratu podczas przechodzenia przez błonę

cytoplazmatyczną. Przykład takiego transportu to system fosfotransferazy zależny od

fosfoenolopirogronianu (PTS:PEP). Jest to prawdopodobnie najbardziej korzystny pod

względem bioenergetycznym system transportu występujący u bakterii. Cukier ulega

przeniesieniu przez błonę komórkową i jednoczesnej fosforylacji. Źródłem energii i zarazem

dawcą grupy fosforanowej jest jedna cząsteczka PEP (Poolman, 1993). Reszta fosforanowa z

PEP przenoszona jest przez kolejne białka: EI, HPr, EII (EIIA, EIIB), a następnie przekazywana

do ostatecznego akceptora – cukru połączonego z permeazą (EIIC) (Lorca et al., 2015).

Podstawowe składniki systemu PTS – EI i HPr - są strukturalnie identyczne u wszystkich

zbadanych mikroorganizmów i występują w cytoplazmie. Białko EII ma zmienną strukturę w

różnego typu systemach PTS. Zazwyczaj składa się z trzech podjednostek (EIIA, EIIB, EIIC), które

mogą występować pojedynczo lub łączyć się po dwie, w każdej możliwej kombinacji, lub po

trzy. Białko EIIC (permeaza) zakotwiczone jest w błonie komórkowej i umożliwia specyficzny

transport węglowodanów (Postma et al., 1993).

Większość mikroorganizmów zaadaptowała się do wzrostu w środowisku mleka

poprzez nabycie zdolności do wykorzystywania jako źródła węgla najłatwiej dostępnego tam

cukru, laktozy. Ten disacharyd, zbudowany z D-galaktozy i D-glukozy połączonych wiązaniem

β-1,4-glikozydowym, występuje w mleku ssaków (Fox and McSweeney, 1998). Ze względu na

znaczną wydajność i ekonomiczne znaczenie jego fermentacji, wiele badań skupiło się na

wykorzystaniu laktozy przez LAB. U bakterii mlekowych efektywne wykorzystanie laktozy jako

źródła węgla związane jest z obecnością odpowiednich genów, kodujących poszczególne


7

enzymy laktozo-specyficznego systemu PTS:PEP oraz szlaku tagatozo-6-fosforanowego. W

transporcie laktozy do komórki bakteryjnej może uczestniczyć kilka systemów, takich jak

fosfotransferaza specyficzna dla laktozy (lac-PTS), systemy zależne od białka ABC i wtórne

transportery, takie jak antyportery laktozo-galaktozowe i symportery laktozo-H+ (de Vos i

Vaughan, 1994). Podczas gdy transport laktozy zależny od białka ABC został zidentyfikowany

tylko w nienależącej do grupy LAB Gram-ujemnej bakterii Agrobacterium radiobacter

(Williams et al., 1992), systemy lac-PTS, jak również wtórne systemy transportu laktozy zostały

opisane w wielu gatunkach LAB.

Lac-PTS ma bardzo wysokie powinowactwo do laktozy i jest bioenergetycznie

najbardziej wydajnym systemem transportu, ponieważ jedna cząsteczka tego cukru jest

przemieszczana i fosforylowana na jednym etapie, kosztem pojedynczej cząsteczki ATP. Po

translokacji przez lac-PTS, ufosforylowana laktoza jest hydrolizowana przez P-β-galaktozydazę

do glukozy i galaktozy-6-P. Podczas gdy po fosforylacji przez glukokinazę glukoza wchodzi do

szlaku glikolitycznego (szlak Embden-Meyerhof-Parnas; EMP), galaktoza-6-P jest

metabolizowana w szlaku D-tagatozo-6-P (Tag-6-P). Jego działanie warunkuje obecność trzech

enzymów: (i) izomerazy galaktozy-6-P (LacAB); (ii) kinazy tagatozo-6-P (LacC); i (iii) aldolazy

tagatozo-1,6-difosforanowej (LacD) (van Rooijen et al., 1991). Uważa się, że opisana zdolność

do szybkiej fermentacji laktozy, charakterystyczna dla szczepów mlecznych, została wtórnie

nabyta przez szczepy roślinne typu dzikiego, w wyniku ich adaptacji do środowiska mlecznego

(Kelly et al., 2010).

Inna strategia metabolizmu laktozy przez LAB związana jest z jej pobieraniem przy

udziale wtórnych systemów transportu. Systemy te przenoszą laktozę w postaci

nieufosforylowanej przez specyficzne permeazy należące do podrodziny LacS (nr TC 2.A.2.2.3)

z rodziny GPH (2.A.2 - glycoside-pentoside-hexuronide). W zależności od gatunku bakterii,

LacS może pośredniczyć w sprzężonym z H+ symporcie laktozy lub w antyporcie laktozy z

galaktozą. Wewnątrz komórki laktoza jest hydrolizowana przez β-galaktozydazę (David et al.,

1992; Vaughan et al., 1996), w wyniku czego powstaje glukoza i galaktoza. Glukoza jest

następnie metabolizowana w szlaku glikolitycznym, podczas gdy galaktoza ulega przemianom

różnymi drogami w zależności od konkretnej LAB. I tak, niektóre termofilne LAB (np.

Lactobacillus bulgaricus i Streptococcus thermophilus) eksportują powstałą z laktozy galaktozę

na zewnątrz komórki, inne LAB (np. Lactobacillus helveticus, Leuconostoc lactis i Streptococcus

salivarius) metabolizują ten cukier w szlaku Leloir’a (de Vos, 1996; Poolman, 1993; Vaughan


8

et al., 2001). Szlak ten był jednym z pierwszych odkrytych centralnych szlaków metabolicznych

i została opisana przez L. F. Leloir’a i współpracowników na początku lat 50. XX wieku.

Obejmuje ona kluczowy enzym galaktokinazę (GalK), urydylotransferazę galaktozo-1-

fosforanową (GalT) oraz 4-epimerazę UDP-galaktozową (GalE), które biorą udział w konwersji

galaktozy do glukozo-1-P. Wytworzony glukozo-1-P, po konwersji do glukozo-6-P przez

fosfoglukomutazę, wchodzi do szlaku glikolitycznego. Epimeraza-1-aldozy, (mutarotaza;

GalM), jest dodatkowym, enzymem niezbędnym do szybkiego metabolizmu galaktozy

(Bouffard et al., 1994), który katalizuje interkonwersję α- i β-anomerów galaktozy.

Prowadzone przez naszą grupę badawczą poszukiwania genów kodujących wtórne

systemy transportu galaktozy wśród szczepów L. lactis wykazały ich niską reprezentację,

ponieważ zostały zidentyfikowane tylko w genomach pochodzenia mlecznego szczepu IL1403

(Aleksandrzak-Piekarczyk et al., 2018; Bolotin et al., 2001; Szatraj et al., 2016), nie-mlecznego

NCDO2054 (Vaughan et al., 1998) i izolowanego z kiełków fasoli KF147 (Siezen et al., 2010).

Co godne uwagi, oprócz genów transportu i metabolizmu galaktozy (szlak Leloir’a), szczepy te

zawierają geny potrzebne do asymilacji laktozy, takie jak lacZ (β-galaktozydaza) i lacA

(acetylotransferaza tiogalaktozydu), tworząc tzw. operon gal-lac. Bezpośrednio powyżej

wspomnianych genów wymaganych do hydrolizy laktozy i późniejszej konwersji galaktozy, ale

w ramach wspólnego operonu, znajduje się gen kodujący permeazę LacS. Wszystkie te geny

tworzą tzw. system permeazy-β-galaktozydazy (Aleksandrzak-Piekarczyk et al., 2018).

Fakt odnalezienia w ramach moich badań pełnego systemu metabolizmu laktozy

(permeazy-β-galaktozydazy) w genomie L. lactis IL1403 (Aleksandrzak-Piekarczyk et al., 2018;

Szatraj et al., 2016) był zaskakujący i wydał mi się niezmiernie interesującą obserwacją. Ten

modelowy szczep, powszechnie wykorzystywany w badaniach nad LAB, został otrzymany po

usunięciu wszystkich plazmidów ze szczepu L. lactis IL594. Ze względu na fakt, że pozbawiono

go plazmidu niosącego geny kodujące białka systemu lac-PTS oraz szlaku tagatozowego,

powszechnie uważa się go za szczep laktozo-negatywny. Z moich wcześniejszych badań, które

realizowałam jeszcze w czasie pracy doktorskiej, i które opisuję tutaj w celu przedstawienia

tematu moich badań w szerszym kontekście, wynikło jednak, że L. lactis IL1403 zaczyna

powoli rosnąć w pożywce zawierającej laktozę, jako jedyne źródło węgla, ale dopiero po około

40 godzinach inkubacji (Aleksandrzak-Piekarczyk et al., 2005). Postawiłam dwie hipotezy na

temat przyczyn tej niewydajnej asymilacji laktozy: (i) mało wydajny transport laktozy z powodu

niskiego powinowactwa LacS do laktozy i / lub (ii) nieefektywna hydroliza laktozy z powodu


9

niskiej funkcjonalności β-galaktozydazy. Przeprowadzone analizy wskazały, iż gen lacS z

L. lactis IL1403 wykazuje bardzo wysokie podobieństwo do galP z laktozo-ujemnego szczepu

L. lactis MG1363. Obydwie permeazy, kodowane przez w/w geny, należą do tej samej

podrodziny (TC # 2.A.2.2.3), która obejmuje transportery specyficzne dla transportu galaktozy,

w przeciwieństwie do permeaz LacS, które należą innej podrodziny (TC # 2.A.2.2.1) i mają

udowodnioną rolę w wydajnym pobieraniu laktozy. Brak zaangażowania LacS w transport

laktozy potwierdza fakt, że mutacja w lacS miała niewielki wpływ na asymilację laktozy przez

L. lactis IL1403 (Aleksandrzak-Piekarczyk el al., 2005). Kolejną przyczyną niewydajnego

wzrostu na laktozie, pomimo posiadania pełnego układu permeaza-β-galaktozydaza i

aktywnego szlaku Leloir’a, mogła być niska aktywność enzymu β-galaktozydazy.

Przeprowadzona przeze mnie analiza porównawcza białek LacZ z L. lactis IL1403 i ze szczepu

NCDO2054, w którym ten enzym posiada znaczną aktywność, wykazała wysokie

podobieństwo obu sekwencji aminokwasowych (Aleksandrzak-Piekarczyk el al., 2005).

Jednakże badania wskazują, że pomimo tak wysokiego podobieństwa na poziomie sekwencji

aminokwasowych, gen lacZ z L. lactis IL1403 może ulegać niewydajnej ekspresji lub jego

produkt białkowy, enzym, może być bardzo słabo aktywny / nieaktywny, ponieważ ten szczep

nie wykazuje aktywności β-galaktozydazy (Aleksandrzak-Piekarczyk el al., 2005). Idąc tym

tropem, w kolejnych pracach wykazaliśmy, że komplementacja w L. lactis IL1403 w układzie in

trans chromosomalnego lacZ przez gen kodujący aktywną β-galaktozydazę nie poprawiła

wydajności asymilacji laktozy. Taki wynik wskazuje, iż brak aktywności β-galaktozydazy nie jest

jedyną przeszkodą w zdolności szczepu do wydajnego fermentowania laktozy i dodatkowo

wspiera hipotezę, iż pierwotną przyczyną braku wydajnego wykorzystania laktozy jest

galaktozo-specyficzna permeaza LacS, która wykazuje nikłe powinowactwo do laktozy i

funkcjonuje głównie jako transporter galaktozy (Aleksandrzak-Piekarczyk, 2013; Aleksandrzak-

Piekarczyk et al., 2018).

Poza środowiskiem mleka, powierzchnie roślin i fermentujący materiał roślinny są

również ważnymi ekosystemami zajmowanymi przez LAB. Postuluje się nawet, że rośliny

stanowią pierwotne środowisko bytowania tej grupy bakterii, z którego zasiedliły wtórnie inne

biotopy takie jak mleko i przewody pokarmowe różnych organizmów.

W porównaniu do środowiska mleka, materiał roślinny różni się bardzo pod

względem składu chemicznego, wykazując na przykład znacznie niższe stężenie białka i szerszą

dostępność węglowodanów innych niż laktoza. Wśród nich wyróżnia się m. in. cukry należące


10

do β-glukozydów (cząsteczek składających się z dwóch jednostek połączonych wiązaniem β-

1,4-glukozydowym) np. arbutyna, celobioza, eskulina i salicyna. Zdolność roślinnych szczepów

L. lactis do wykorzystania tak dużej różnorodności węglowodanów roślinnych znajduje

odzwierciedlenie w ich genomach i zdolnościach fermentacji cukrów. Porównanie laktokoków

związanych ze środowiskami mleka z roślinnymi wskazuje, że te ostatnie mają większą liczbę

genów zaangażowanych w transport i hydrolizę węglowodanów, co powoduje ich zwiększoną

zdolność do fermentacji cukrów (Siezen et al., 2008). We wcześniejszych badaniach, których

wyniki stanowią w niektórych aspektach punkt wyjścia do badań prowadzonych w ramach tej

rozprawy habilitacyjnej, wykazałam, iż L. lactis IL1403 może wykorzystywać szeroki zakres β-

glukozydów (Aleksandrzak-Piekarczyk et al., 2011). Przeprowadzona analiza funkcji genów

chromosomalnych tego szczepu wskazała, że potencjał katabolizmu tych cukrów może być

niesiony przez przynajmniej pięć genów lub operonów, które kodują permeazy EIIC β-

glukozydo-specyficznych systemów PTS, zaangażowanych w transport β-glukozydów. Dwa z

nich kodują trójskładnikowe EIIABC PTS (PtbA i YedF), kolejne trzy to pojedyncze permeazy

EIIC (CelB, PtcC i YidB). Ponadto, spośród grupy białek uczestniczących w fosforylacji β-

glukozydów zidentyfikowano jeden składnik EIIA (PtcA) i jeden składnik EIIB (PtcB). CelB, PtcA,

PtcB, PtcC i YidB należą do rodziny Lac (TC nr 4.A.3), która obejmuje kilka transporterów

laktozy z bakterii Gram-dodatnich, jak również E. coli. Udział permeaz CelB i PtcC w transporcie

celobiozy został eksperymentalnie przez nas potwierdzony w L. lactis IL1403 (Rys. 1;

Aleksandrzak-Piekarczyk el al., 2011). Chociaż L. lactis IL1403 ma tak dużą liczbę systemów PTS

specyficznych dla β-glukozydów, CelB jest jedyną permeazą niezbędną w internalizacji

celobiozy, podczas gdy PtcC, wydaje się nie uczestniczyć w transporcie tego, jak i innych

cukrów (Aleksandrzak-Piekarczyk el al., 2011). Przeprowadzone przez nas badania ekspresji

ptcC wskazały na brak jego transkrypcji, co może stanowić powód braku zaangażowania tego

genu w metabolizm cukrów. Z drugiej strony wykazaliśmy, że składniki EIIAB, mianowicie PtcA

i PtcB, są bardziej uniwersalne, uczestnicząc w metabolizmie licznych cukrów (arbutyna,

celobioza, glukoza, salicyna) w L. lactis IL1403 (Aleksandrzak-Piekarczyk et al., 2011). Z kolei

białko EIIABC PtbA bierze udział w transporcie arbutyny, eskuliny i salicyny, ale nie wykazuje

powinowactwa do celobiozy u L. lactis IL1403 (Rys. 1). Wykazaliśmy, że w tym szczepie

inaktywacja genu ptbA doprowadziła do poważnych defektów wzrostu w podłożu

wzbogacanym każdym z tych trzech cukrów (Aleksandrzak-Piekarczyk, 2013).


11

Istotne siedlisko zamieszkiwane przez LAB stanowią przewody pokarmowe zwierząt.

Spośród grupy bakterii fermentacji mlekowej, w jelitach stałymi rezydentami są szczepy

bakterii należących do rodzaju Lactobacillus. Pomimo specyficznych warunków tego

środowiska odnośnie zawartości substancji odżywczych (w dużej części łatwo wchłanialne

substancje proste) wydaje się, iż rezydenci nie utracili możliwości katabolizmu β-glukozydów.

W ramach badań prowadzonych na trzech szczepach LAB pochodzenia jelitowego uzyskaliśmy

pełne sekwencje genomowe szczepów należących do gatunków Lactobacillus casei i

Lactobacillus rhamnosus, które są składnikiem probiotycznego preparatu Latopic

(Aleksandrzak-Piekarczyk et al., 2013; Koryszewska-Baginska et al., 2013; Koryszewska-

Baginska et al., 2014). Sekwencje te zostały zdeponowane przez nas w bazie GenBank i są

często wykorzystywane do badań porównawczych przez innych badaczy. Przeprowadzona

analiza otrzymanych sekwencji genomowych ukierunkowana na identyfikację genów

systemów PTS zaangażowanych w transport β-glukozydów wskazuje na obecność w tych

szczepach aż od 8 do 10 specyficznych dla β-glukozydów permeaz EIIC. Analizy innych

sekwencji szczepów jelitowych i innego pochodzenia szczepów Lactobacillus casei i

Lactobacillus rhamnosus zdeponowanych w GenBanku wskazują na podobną reprezentację

tych genów. Odmienną sytuację zaobserwowaliśmy analizując zsekwencjonowany przez nas

genom (nieopublikowane dane) innego gatunku LAB – Lactobacillus salivarius. W genomie tej

bakterii, jak i genomach innych szczepów tego gatunku zdeponowanych w GenBanku,

zidentyfikowaliśmy tylko jedną specyficzną dla β-glukozydów permeazę EIIC. Zatem, w

przypadku Lactobacillus casei i Lactobacillus rhamnosus tak duża liczba β-glukozydo-

specyficznych permeaz może sugerować, że gatunki te są raczej stabilnymi rezydentami

obfitujących w te cukry materiału roślinnego, natomiast przewody pokarmowe zasiedlają

tylko czasowo. Z drugiej strony redukcja liczby transporterów β-glukozydów u Lactobacillus

salivarius może sugerować, że u tego gatunku w wyniku przystosowania się do zamieszkiwanej

przez niego niszy, nastąpiła redukcja zdolności do katabolizmu tych cukrów.

Po translokacji przez błonę komórkową przy udziale PTS, P-β-glukozyd jest

hydrolizowany przez P-β-glukozydazę do glukozy i glukozo-6-P lub odpowiedniego aglikonu

(Tobisch el al., 1997). Istnieje wiele genów kodujących P-β-glukozydazy, obecnych w

chromosomach szczepów bakterii fermentacji mlekowej, zwłaszcza tych bytujących na

roślinach. Ich duża liczba jest prawdopodobnie wynikiem adaptacji tych bakterii do życia na

roślinach obfitujących w β-glukozydy, z których wtórnie zasiedliły przewody pokarmowe


12

zwierząt i mleko. W genomie L. lactis IL1403 zidentyfikowano sześć genów kodujących β-

glukozydazy, z czego dwa kodują P-β-glukozydazy specyficzne wobec ufosforylowanych β-

glukozydów, czyli takich, które do komórki zostały przetransportowane za pomocą systemu

PTS, lub ufosforylowane wewnątrz komórki za pomocą odpowiednich enzymów.

Wykazaliśmy, że jedna z nich, P-β-glukozydaza BglS, jest odpowiedzialna za hydrolizę

celobiozy, ale nie salicyny, w L. lactis IL1403 (Rys. 1; Aleksandrzak-Piekarczyk et al., 2005). Z

drugiej strony, żadnej funkcji nie przypisaliśmy innej P-β-glukozydazie kodowanej przez gen

bglA tworzący jeden operon z ptcC. Mutacja bglA nie wpływała na wzrost niosącego tę mutację

szczepu L. lactis IL1403 w pożywce uzupełnionej szeroką gamą cukrów (Aleksandrzak-

Piekarczyk, 2013).

Białka zaangażowane w transport i hydrolizę rożnych cukrów zwykle wykazują dużą

specyficzność w stosunku do metabolizowanego substratu. Odrębne systemy dedykowane

wyłącznie laktozie, i inne dla różnych β-glukozydów, zostały opisane w literaturze naukowej

(Aleksandrzak-Piekarczyk, 2013). W trakcie prowadzonych przez nas badań

zidentyfikowaliśmy w L. lactis IL1403 unikatowy system PTS, który wykazuje powinowactwo

zarówno do celobiozy, jak i laktozy. Wykazaliśmy, że ten alternatywny, do opisanych

dotychczas, system metabolizmu laktozy stanowią produkty genów celB, ptcBA oraz bglS

wykazujące homologię odpowiednio do permeazy, przenośników grup fosforanowych i P-β-

glukozydazy. Szczegółowe badania dotyczące analiz funkcjonalnych tego systemu zostały

opisane w przeze mnie w publikacji z 2011 (Aleksandrzak-Piekarczyk et al., 2011). Ze względu

na fakt, że część tych doświadczeń prowadziłam jeszcze w czasie realizacji pracy doktorskiej, a

drugą część po jej zakończeniu, a rozdzielenie tych badań byłoby trudne do opisu,

zdecydowałam nie włączać tej pracy do listy publikacji wchodzących w skład osiągnięcia

naukowego, jednak opisuję tutaj część wyników, bo stanowią punkt wyjścia do niektórych

badań prowadzonych w ramach rozprawy habilitacyjnej. Badania te ujawniły, że

zidentyfikowany przeze mnie alternatywny system katabolizmu laktozy jest powiązany z

katabolizmem celobiozy i uwarunkowany podwójną specyficznością CelB i BglS, które mają

powinowactwo zarówno do celobiozy, jak i laktozy (Rys. 1; Aleksandrzak-Piekarczyk el al.,

2011). Poprzez badania funkcjonalne mutantów delecyjnych, analizy ekspresji genów i testy

enzymatyczne wskazaliśmy, że mechanizm transportu laktozy przez CelB zależy od indukcji

permeazy przez celobiozę (celobiozo-indukowalny system metabolizmu laktozy), a z kolei

hydroliza obu cukrów jest możliwa dzięki podwójnej aktywności BglS – jako P-β-glukozydazy i


13

P-β-galaktozydazy (Rys. 1; Aleksandrzak-Piekarczyk el al., 2005; 2011). Co więcej, wykazano,

że u L. lactis IL1403 ten alternatywny system katabolizmu laktozy podlega ścisłej kontroli przez

nadrzędny regulator represji katabolicznej – białko CcpA (Rys. 1). Jest to kontrola negatywna,

ponieważ inaktywacja genu ccpA prowadzi do derepresji transkrypcji genów bglS, celB, ptcA i

ptcB, znosząc represję glukozową i umożliwiając wykorzystanie laktozy przez szczep mutanta

(Aleksandrzak-Piekarczyk el al., 2011). W ten sposób wykazaliśmy, że laktozo-negatywny

szczep L. lactis IL1403 można jednak zaindukować do wydajnego metabolizmu laktozy poprzez

mutację genu ccpA lub dodatek niewielkiego (indukującego) stężenia celobiozy.

W prowadzonych przeze mnie badaniach genów / operonów L. lactis IL1403

zaangażowanych w metabolizm szerokiej gamy cukrów uwzględniłam również badania

mechanizmów regulujących procesy transkrypcji genów zaangażowanych w metabolizm

cukrów. W celu przeprowadzenia tych badań wnioskowałam o ich finansowanie z agencji NCN

w ramach programu OPUS, które uzyskałam w 2011 roku, a w poniższym opisie przedstawię

najistotniejsze osiągnięcia uzyskane w wyniku realizacji projektu. W bakteriach transkrypcja

może być aktywowana lub reprymowana przez różne czynniki transkrypcyjne (TF), które

rozpoznają specyficzne elementy DNA (operatory) w regionach promotora regulowanych

genów. Zbiór genów lub operonów znajdujących się pod bezpośrednią kontrolą tego samego

TF jest zdefiniowany jako regulon. Zestaw wszystkich regulonów w pewnym organizmie

tworzy transkrypcyjną sieć regulacyjną. W ostatnich latach liczba poznanych sekwencji

genomowych LAB znacznie zwiększa się. W każdej sekwencji część genów koduje białka

dedykowane regulacji transkrypcji. Analiza zsekwencjonowanych przedstawicieli LAB

wskazuje, iż zawartość TF mieści się w zakresie od około 3,5% (np. Streptococcus

thermophillus, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus helveticus) do 7,5% (Lactobacillus

plantarum) całego proteomu. Ponadto, w obrębie genomu LAB, całkowita liczba TF zmienia

się znacząco w zależności od gatunku i waha się od około 60 (S. thermophilus i L. helveticus)

do aż 240 (L. plantarum). W 30 genomach rzędu Lactobacillales, potencjalne TF należą do 49

rodzin białek regulacyjnych, a około 90% z nich należy do 24 głównych rodzin z co najmniej

dwoma przedstawicielami kodowanymi w genomie. Największa liczba reprezentantów rodzin

TF jest przypisana rodzinie Xre (łącznie 298 TF). Liczba przedstawicieli rodziny Xre osiąga

kilkanaście, a nawet kilkadziesiąt na genom. Inne rodziny są znacznie słabiej reprezentowane,

a te, które mają co najmniej czterech przedstawicieli na genom, obejmują rodziny TetR, GntR,

MarR, OmpR, LacI, LysR, MerR i AraC (Kowalczyk et al., 2015; Ravcheev et al., 2013). Na


14

podstawie ich specyfiki wyodrębniono dwie grupy regulatorów, nadrzędne (globalne) i

drugorzędne (lokalne, wtórne). W większości bakterii Gram-dodatnich o niskiej zawartości GC

głównym regulatorem nadrzędnym jest białko CcpA (Control Catabolite Protein), które działa

poprzez wiązanie z 14-nukleotydowymi sekwencjami DNA określanymi jako cre (catabolite

responsive element), przeprowadzając aktywację (CCA) lub represję (CCR) transkrypcji około

15% genów gospodarza. Miejsca cre znajdują się w regionach promotorowych genów

podlegających CCR i CCA, a wiązanie przez nie CcpA jest silnie stymulowane przez białko HPr

ufosforylowane w miejscu Ser46. W szczepach L. lactis wykazano, że CcpA hamuje

transkrypcję różnych genów związanych z metabolizmem β-glukozydów, fruktozy, galaktozy i

laktozy oraz aktywuje operon glikolityczny (Aleksandrzak-Piekarczyk el al., 2005;

Aleksandrzak-Piekarczyk el al., 2011, Barrière el al., 2005, Luesink el al., 1998, Monedero el al.,

2001). Katabolizm cukrów może być również kontrolowany przez działające lokalnie

regulatory, powszechne w LAB i należące do różnych rodziny białek takich jak LacI, LysR, AraC,

GntR, DeoR, RpiR lub BglG. W laktokokach regulatory należące do niektórych z tych rodzin

przeprowadzały pozytywną lub negatywną kontrolę genów zaangażowanych w wykorzystanie

cukrów, takich jak α-galaktozydy, β-glukozydy, fruktoza, laktoza, maltoza, sacharoza i ksyloza.

Opisanego powyżej przeglądu prac dotyczących dotychczasowego stanu wiedzy na temat

mechanizmów regulacji transkrypcji ze szczególnym uwzględnieniem metabolizmu cukrów w

bakteriach fermentacji mlekowej dokonałam w dwóch monografiach stanowiących rozdziały

w książkach – cytowanej już powyżej “Updates on metabolism in lactic acid bacteria in light of

‘omic’ technologies” (Kowalczyk et al., 2015) oraz “Updates in the metabolism of lactic acid

bacteria” (Mayo et al., 2010).

Kolejne dwie prace, które opisuję poniżej powstały w wyniku badań

eksperymentalnych prowadzonych w ramach realizacji otrzymanego przeze mnie w 2011

finansowania projektu badawczego OPUS. O ile regulacja operonu bglAH została już wcześniej

opisana i udowodniono wpływ należącego do rodziny BglG antyterminatora transkrypcji BglR

(Bardowski et al., 1994), to regulacja ekspresji genów celB, ptcB, ptcA, bglS oraz operonu gal-

lac nie była dotychczas poznana. Wyniki badań hipotetycznego regulatora transkrypcji, białka

YebF, wskazały na jego nadrzędną rolę w celobiozo-zależnej aktywacji genów regulonu celB i

bglS (Aleksandrzak-Piekarczyk el al., 2015). Białku temu, ze względu na pełnioną przez niego

funkcję, nadaliśmy nową nazwę, mianowicie ClaR (Celobiose-lactose metabolism Regulator)

(Aleksandrzak-Piekarczyk el al., 2015). Regulator ten należy do rodziny regulatorów RpiR, która


15

obejmuje białka wiążące ufosforylowane cukry (Sorensen i Hove-Jensen, 1996), a poza

domeną wiążącą cukier (Sugar ISomerase domain; SIS) niesie domenę wiążącą DNA (HTH;

Helix-Turn-Helix). Wykazano, że delecja claR spowodowała całkowitą niezdolność mutanta do

fermentacji celobiozy i laktozy. Dodatkowo, w odpowiedzi na obecność celobiozy i ClaR,

odnotowano wysoki poziom ekspresji bglS, celB i, w mniejszym stopniu, ptcA i ptcB. Taki efekt

nie był obserwowany gdy w podłożu zastosowano inny niż celobioza cukier (np. glukoza,

galaktoza) lub kiedy testowano ekspresję genów w nieobecności ClaR (w mutancie ∆claR)

(Aleksandrzak-Piekarczyk el al., 2015). Na podstawie otrzymanych wyników

zaproponowaliśmy model katabolizmu, w którym celobioza lub laktoza, ufosforylowane przez

PtcAB, wiążą się z domeną SIS ClaR. Takie połączenie może powodować zmianę konformacji

tego TF i umożliwić jego wiązanie z odpowiednimi regionami DNA, co efekcie skutkuje zależną

od ClaR aktywacją ekspresji genów. Stawiamy hipotezę, że poprzez ten mechanizm w

obecności celobiozy lub laktozy regulowana jest ekspresja bglS i celB (Rys. 1).

Kontynuując badania nad genami regulatorowymi, zidentyfikowanymi przez nas w

genomie IL1403, postawiłam hipotezę, że kolejnym białkiem o istotnej funkcji w odniesieniu

do regulacji ekspresji genów zaangażowanych w metabolizm cukrów jest hipotetyczny

regulator transkrypcji YugA. Podobnie jak ClaR, regulator ten należy do rodziny RpiR i ze

wzgląd na pełnioną przez niego funkcję, nadałam mu nową nazwę – GlaR (Galactose-lactose

operon Regulator). W serii różnorodnych eksperymentów, obejmujących testy wzrostowe

uzyskanego mutanta ∆glaR, analizy poziomu ekspresji genów potencjalnie regulowanych

przez GlaR oraz testy EMSA, wykazaliśmy, że białko to, poprzez wiązanie do promotora lacS

(Rys. 1), reguluje pozytywnie ekspresję genów położonego poniżej operonu gal-lac,

kodującego komponenty szlaku Leloira (galMKTE), a ponadto ekspresję genów thgA i lacZ

potencjalnie zaangażowanych w asymilację laktozy (Aleksandrzak-Piekarczyk et al., 2018;

Szatraj et al., 2016). Postulujemy, że jest to bardzo ścisła regulacja, ponieważ przy

nieobecności galaktozy (która jest induktorem tego systemu) lub / i braku funkcjonalnego GlaR

(szczep ∆glaR) ekspresja lacS jest praktycznie niewykrywalna. Kolejne geny operonu gal-lac w

pewnym stopniu uniezależniły się od tej ścisłej regulacji dzięki obecności potencjalnych

promotorów transkrypcji, które poprzedzają galM, galT, thgA i galE i nie wiążą białka

regulatorowego GlaR (Aleksandrzak-Piekarczyk et al., 2018; Szatraj et al., 2016).

W wielu bakteriach mannozo-specyficzny PTS jest także głównym systemem

odpowiedzialnym za transport innych cukrów takich jak np. glukoza. W trakcie naszych badań


16

prowadzonych w L. lactis IL1403 udowodniliśmy, że w tym szczepie system Man-PTS jest

jedynym transporterem mannozy (Rys. 1), natomiast w przypadku glukozy możliwe jest

również jej pobieranie przez inne, niepoznane dotąd permeazy (Tymoszewska et al., 2017).

Nieoczekiwanym odkryciem w badaniach nad Man-PTS była obserwacja, że system ten jest

zaangażowany w oddziaływanie niskocząsteczkowych białek o przeciwbakteryjnych

właściwościach (bakteriocyn; Aleksandrzak-Piekarczyk et al., 2013a) z komórkami wrażliwych

bakterii. Te obserwacje były impulsem do zapoczątkowania nowego kierunku moich badań,

jakim są bakteriocyny i molekularne mechanizmy ich przeciwbakteryjnego działania. Aby

realizować te badania przygotowaliśmy we współpracy z ośrodkiem naukowym z Norwegii

(Uniwersytet Przyrodniczy w Norwegii (NMBU)) i w 2013 roku otrzymaliśmy finasowanie z

NCN pięcioletniego projektu zatytułowanego „Molekularne podstawy rozwoju oporności na

bakteriocyny u Lactococcus lactis”. Ciekawym odkryciem w ramach tych badań wydaje się fakt,

iż Man-PTS stanowi receptor dla wielu niehomologicznych i mających odmienne spektra

aktywności bakteriocyn. We wcześniejszych pracach wskazano, że składniki tego systemu,

białka EIIC i EIID, pełnią funkcję „kotwic” wiążących bakteriocyny z grupy pediocyn i dwóch

innych bakteriocyn (podobnych do laktokokcyny A; LcnA) należących do klasy IId (Diep et al.,

2007). Wiązanie bakteriocyny powoduje prawdopodobnie zmianę konformacji tych białek,

prowadząc do otwarcia kanału i wycieku wewnątrzkomórkowych substancji

drobnocząsteczkowych, co prowadzi do śmierci komórki. W pierwszej z prac dotyczących

bakteriocyn (Tymoszewska et al., 2017) udało nam się poszerzyć zakres tych związków

oddziałujących z Man-PTS o garwicynę Q, bakteriocynę produkowaną przez Lactococcus

garvieae (Rys. 1). Wykazaliśmy, że spektrum przeciwbakteryjnej aktywności tej bakteriocyny

oraz jej sekwencja są odmienne od wcześniej analizowanych bakteriocyn odziaływujących z

Man-PTS, co sugeruje, że sposób odziaływania bakteriocyna-receptor również jest odmienny.

W ramach tej pracy wytypowaliśmy szereg aminokwasów w Man-PTS prawdopodobnie

oddziałujących z garwicyną Q, których substytucja prowadziła do wzrostu lub całkowitej

oporności na badaną bakteriocynę. Aminokwasy te wydają się nie brać udziału w wiązaniu

pediocyn, ani LcnA-podobnych bakteriocyn (Tymoszewska et al., 2017). W kolejnej pracy

opublikowaliśmy wyniki, które dostarczają dalsze dowody dla postawionej wyżej hipotezy.

Wskazaliśmy, że laktokokowe, kolejne niehomologiczne bakteriocyny garwicyny A, B i C o

odmiennych spektrach aktywności przeciwdrobnoustrojowej również wykorzystują Man-PTS

jako receptor (Fig. 1; Tymoszewska et al., 2018). Wykazaliśmy, że w odniesieniu do siebie,


17

GarQ, jak i pediocyn, do wiązania na powierzchni komórki bakteriocyny te wykorzystują

odmienne aminokwasy podjednostek Man-PTS. Ze względu na obecność licznych

transmebranowych domen żadna z podjednostek Man-PTS nie została dotąd skrystalizowana,

ani trójwymiarowa struktura tego systemu nie została poznana. Jako pierwsi, za pomocą

narzędzi bioinformatycznych, opracowaliśmy trzeciorzędową strukturę tego kompleksu i

zaproponowaliśmy sposób jego lokalizacji w błonie komórkowej. Skonstruowane modele 3D

Man-PTS EIICD wskazały na transmembranową lokalizację podjednostki EIIC i powierzchniową

lokalizację EIID, sugerując ich odmienne funkcje w odniesieniu do bakteriocyn - dokującą (EIID)

oraz kanału (EIIC), przez który następuje wypływ zawartości komórki bakterii (Tymoszewska

et al., 2018).

Ponieważ, bazując na wstępnych analizach in silico, spodziewam się, iż bakteriocyny

wiążące Man-PTS tworzą znacznie większą rodzinę niż te cztery badane przez nas dotychczas,

moje przyszłe badania skupią się na poszukiwaniu innych peptydów ukierunkowanych na

podjednostki błonowe Man-PTS. Ich szczegółowe badania pozwolą zbudować pełen obraz

interakcji między bakteriocynę a Man-PTS i może ostatecznie uzasadnić zaproponowanie

oddzielnej grupy bakteriocyn, w dodatku do obecnie rozpoznawanych IIa-IId.

Ponadto, wyniki uzyskane przez nas w ramach badań nad bakteriocynami i Man-PTS

obalają obowiązującą dotychczas tezę, że niehomologiczne bakteriocyny o różnych spektrach

aktywności oddziałują z odmiennymi receptorami błonowymi komórek bakterii. Postulujemy,

że odziaływanie to jest możliwe ze względu na różnice w sekwencji aminokwasowej /

strukturze Man-PTS, które decydują o selektywności wiązania określonych grup bakteriocyn.


18

Rysunek 1. Systemy transportu wybranych cukrów i ich regulacja u L. lactis IL1403.


19

Bibliografia

Aleksandrzak-Piekarczyk, T. (2013). “Lactose and β-glucosides metabolism and its regulation in Lactococcus lactis: a review,” in Lactic Acid Bacteria - R & D for Food, Health and Livestock Purposes, ed. J. M. Kongo (InTech). doi:10.5772/50889.

Aleksandrzak-Piekarczyk, T., Kok, J., Renault, P., and Bardowski, J. (2005). Alternative lactose catabolic pathway in Lactococcus lactis IL1403. Appl. Environ. Microbiol. 71, 6060–6069. doi:10.1128/AEM.71.10.6060-6069.2005.

Aleksandrzak-Piekarczyk, T., Koryszewska-Baginska, A., and Bardowski, J. (2013). Genome sequence of the probiotic strain Lactobacillus rhamnosus (formerly Lactobacillus casei) LOCK900. Genome Announc. 1, e00640-13-e00640-13. doi:10.1128/genomeA.00640-13.

Aleksandrzak-Piekarczyk, T., Kowalczyk, M., and Bardowski, J. (2013a). Bacteriocins - alternatives

to antibiotics. Chapter in: Biotechnology and Animal Food Quality, Part III, Biotechnology and Quality

of Animal Products, (p.160). Peter Chrenek et al., Slovak University of Agriculture in Nitra, Animal

Production Research Centre Nitra, ISBN 978-80-552-0965-4. Pages:99-108.

Aleksandrzak-Piekarczyk, T., Polak, J., Jezierska, B., Renault, P., and Bardowski, J. (2011). Genetic characterization of the CcpA-dependent, cellobiose-specific PTS system comprising CelB, PtcB and PtcA that transports lactose in Lactococcus lactis IL1403. Int. J. Food Microbiol. 145, 186–194. doi:10.1016/j.ijfoodmicro.2010.12.011.

Aleksandrzak-Piekarczyk, T., Stasiak-Różańska, L., Cieśla, J., and Bardowski, J. (2015). ClaR—a novel key regulator of cellobiose and lactose metabolism in Lactococcus lactis IL1403. Appl. Microbiol. Biotechnol. 99, 337–347. doi:10.1007/s00253-014-6067-y.

Aleksandrzak-Piekarczyk, T., Szatraj, K., Kosiorek K. (2018). GlaR (YugA) - a novel RpiR-family

transcription activator of the Leloir pathway of galactose utilization in Lactococcus lactis IL1403.

MicrobiologyOpen. Aug 11:e00714. doi:10.1002/mbo3.714.

Bolotin, A., Wincker, P., Mauger, S., Jaillon, O., Malarme, K., Weissenbach, J., et al. (2001). The complete genome sequence of the lactic acid bacterium Lactococcus lactis ssp. lactis IL1403. Genome Res. 11, 731–753. doi:10.1101/gr.169701.

Bouffard, G. G., Rudd, K. E., and Adhya, S. L. (1994). Dependence of lactose metabolism upon mutarotase encoded in the gal operon in Escherichia coli. J. Mol. Biol. 244, 269–278. doi:10.1006/jmbi.1994.1728.

David, S., Stevens, H., van Riel, M., Simons, G., and de Vos, W. M. (1992). Leuconostoc lactis beta-galactosidase is encoded by two overlapping genes. J. Bacteriol. 174, 4475–4481.

de Vos, W. M. (1996). Metabolic engineering of sugar catabolism in lactic acid bacteria. Antonie Van Leeuwenhoek 70, 223–242.

Diep, D. B., Skaugen, M., Salehian, Z., Holo, H., and Nes, I. F. (2007). Common mechanisms of target cell recognition and immunity for class II bacteriocins. Proc. Natl. Acad. Sci. 104, 2384–2389. doi:10.1073/pnas.0608775104.

Fox, P. F., and McSweeney, P. L. H. (1998). Dairy chemistry and biochemistry. 1st ed. London ; New York: Blackie Academic & Professional.

Franz, C. M. A. P., Cho, G.-S., Holzapfel, W. H., and Glvez, A. (2010). “Safety of Lactic Acid Bacteria,” in Biotechnology of Lactic Acid Bacteria, eds. F. Mozzi, R. R. Raya, and G. M. Vignolo (Oxford, UK: Wiley-Blackwell), 341–359. doi:10.1002/9780813820866.ch19.

Kelly, W. J., Ward, L. J. H., and Leahy, S. C. (2010). Chromosomal diversity in Lactococcus lactis and the origin of dairy starter cultures. Genome Biol. Evol. doi:10.1093/gbe/evq056.

Koryszewska-Baginska, A., Aleksandrzak-Piekarczyk, T., and Bardowski, J. (2013). Complete genome sequence of the probiotic strain Lactobacillus casei (formerly Lactobacillus paracasei) LOCK919. Genome Announc. 1, e00758-13-e00758-13. doi:10.1128/genomeA.00758-13.

Koryszewska-Baginska, A., Bardowski, J., and Aleksandrzak-Piekarczyk, T. (2014). Genome sequence of the probiotic strain Lactobacillus rhamnosus (formerly Lactobacillus casei) LOCK908. Genome Announc. 2, e00120-14-e00120-14. doi:10.1128/genomeA.00120-14.

https://doi.org/10.1002/mbo3.714


20

Kowalczyk, M., Mayo, B., Fernández, M., and Aleksandrzak-Piekarczyk, T. (2015). “Updates on metabolism in lactic acid bacteria in light of ‘omic’ technologies,” in Biotechnology of Lactic Acid Bacteria, eds. F. Mozzi, R. R. Raya, and G. M. Vignolo (Chichester, UK: John Wiley & Sons, Ltd), 1–24. doi:10.1002/9781118868386.ch1.

Lorca, G. L., Twiddy, T. A., and Saier, M. H. (2015). “Lactic acid bacteria: comparative genomic analyses of transport systems,” in Biotechnology of LAB, 55–79. doi:10.1002/9781118868386.ch4.

Mayo, B., Aleksandrzak-Piekarczyk, T., Fernández, M., Kowalczyk, M., Álvarez-Martín, P., Bardowski, J. (2010). Updates in the metabolism of lactic acid bacteria. In: Biotechnology of Lactic Acid Bacteria. Mozzi F, Raya RR and Vignolo GM (eds). Blackwell Publishing, San Miguel de Tucumán. Argentina. 10.1002/9780813820866.ch1.

Poolman, B. (1993). Energy transduction in LAB. FEMS Microbiol. Rev. 12, 125–147. Poolman, B., and Konings, W. N. (1993). Secondary solute transport in bacteria. Biochim.

Biophys. Acta BBA - Bioenerg. 1183, 5–39. doi:10.1016/0005-2728(93)90003-X. Postma, P. W., Lengeler, J. W., and Jacobson, G. R. (1993). Phosphoenolpyruvate:carbohydrate

phosphotransferase systems of bacteria. Microbiol. Rev. 57, 543–594. Ravcheev, D. A., Best, A. A., Sernova, N. V., Kazanov, M. D., Novichkov, P. S., and Rodionov, D. A.

(2013). Genomic reconstruction of transcriptional regulatory networks in lactic acid bacteria. BMC Genomics 14, 94. doi:10.1186/1471-2164-14-94.

Siezen, R. J., Bayjanov, J., Renckens, B., Wels, M., van Hijum, S. A. F. T., Molenaar, D., et al. (2010). Complete genome sequence of Lactococcus lactis subsp. lactis KF147, a plant-associated lactic acid bacterium. J. Bacteriol. 192, 2649–2650. doi:10.1128/JB.00276-10.

Siezen, R. J., Starrenburg, M. J. C., Boekhorst, J., Renckens, B., Molenaar, D., and van Hylckama Vlieg, J. E. T. (2008). Genome-scale genotype-phenotype matching of two Lactococcus lactis isolates from plants identifies mechanisms of adaptation to the plant niche. Appl. Environ. Microbiol. 74, 424–436. doi:10.1128/AEM.01850-07.

Stiles, M. E., and Holzapfel, W. H. (1997). Lactic acid bacteria of foods and their current

taxonomy. Int. J. Food Microbiol. 36, 1–29.

Szatraj, K., Bardowski, J., Aleksandrzak-Piekarczyk, T. (2016) The hypothetical YugA protein is

involved in the positive regulation of galactose and maltose assimilation in L. lactis IL1403. New

Biotechnology. 3: S211-S211. DOI: 10.1016/j.nbt.2016.06.1449.

Tymoszewska, A., Diep, D.B., Aleksandrzak-Piekarczyk, T. (2018). The extracellular loop of Man-

PTS subunit IID is responsible for the sensitivity of Lactococcus garvieae to garvicins A, B and C. Sci.

Rep. 8:15790. doi:10.1038/s41598-018-34087-2.

Tymoszewska, A., Diep, D. B., Wirtek, P., and Aleksandrzak-Piekarczyk, T. (2017). The non-lantibiotic bacteriocin garvicin Q targets Man-PTS in a broad spectrum of sensitive bacterial genera. Sci. Rep. 7. doi:10.1038/s41598-017-09102-7.

van Rooijen, R. J., van Schalkwijk, S., and de Vos, W. M. (1991). Molecular cloning, characterization, and nucleotide sequence of the tagatose 6-phosphate pathway gene cluster of the lactose operon of Lactococcus lactis. J. Biol. Chem. 266, 7176–7181.

Vaughan, E. E., David, S., and de Vos, W. M. (1996). The lactose transporter in Leuconostoc lactis is a new member of the LacS subfamily of galactoside-pentose-hexuronide translocators. Appl. Environ. Microbiol. 62, 1574–1582.

Vaughan, E. E., Pridmore, R. D., and Mollet, B. (1998). Transcriptional regulation and evolution of lactose genes in the galactose-lactose operon of L. lactis NCDO2054. J. Bacteriol. 180, 4893–4902.

Vaughan, E. E., van den Bogaard, P. T. C., Catzeddu, P., Kuipers, O. P., and de Vos, W. M. (2001). Activation of silent gal genes in the lac-gal regulon of Streptococcus thermophilus. J. Bacteriol. 183, 1184–1194. doi:10.1128/JB.183.4.1184-1194.2001.

Williams, S. G., Greenwood, J. A., and Jones, C. W. (1992). Molecular analysis of the lac operon encoding the binding-protein-dependent lactose transport system and beta-galactosidase in Agrobacterium radiobacter. Mol. Microbiol. 6, 1755–1768.

https://doi.org/10.1002/9780813820866.ch1


21

5. Omówienie pozostałych osiągnięć naukowo - badawczych.

5.1. Prace opublikowane po uzyskaniu stopnia doktora (w spisie nie uwzględniono prac

wchodzących w skład osiągnięcia naukowego):

W skład prac, których nie uwzględniono w osiągnięciu naukowym wchodzi 15

publikacji eksperymentalnych oraz dwa recenzowane doniesienia konferencyjne. W czterech

pracach byłam pierwszym autorem, i również w czterech autorem korespondencyjnym.

Wyniki przedstawione w poniższych publikacjach najczęściej zostały otrzymane w ramach

realizacji projektów badawczych, w których uczestniczyłam jako kierownik / wykonawca, są

efektem moich szerokich zainteresowań naukowych, na których realizację nie uzyskałam

dotąd finansowania lub powstały w efekcie mojej współpracy z grupami badawczymi IBB PAN

i innych jednostek naukowych.

Mój udział w przeprowadzeniu badań do części tych publikacji dotyczył przede

wszystkim charakterystyki fizjologicznej i genetycznej nowo wyizolowanych środowiskowych

szczepów bakterii fermentacji mlekowej, w tym testów zdolności do metabolizmu

sacharydów, adherencji do powierzchni biotycznych i abiotycznych, oporności na zasolenie i

zakwaszenie, produkcji bakteriocyn i aktywności przeciwdrobnoustrojowej, oporności na

antybiotyki oraz identyfikacji genetycznej bakterii izolowanych z przewodów pokarmowych

zwierząt. W wyniku tych prac zidentyfikowano bakterie z rodzaju Lactobacillus o aktywności

anty-Campylobacter (Kobierecka el al., 2017), o silnej adherencji i przeżywalności w jelicie

kurzym po podaniu in ovo (Aleksandrzak-Piekarczyk el al., 2018) i bakterie Lactococcus lactis

niosące plazmidy z genami oporności na tetracyklinę (Zycka-Krzesinska el al., 2015), które

obecnie wykorzystujemy do konstrukcji unikatowego wektora ekspresyjnego. Z kolei analiza

qRT-PCR pozwoliła nam na ilościowe oszacowanie obecności trzech pochodzących z polskiego

preparatu probiotycznego szczepów z rodzaju Lactobacillus w jelicie mysim, co, w dodatku do

szeregu innych badań, pozwoliło nam na przypisanie poszczególnym szczepom pozytywnego

wpływu na integralność enerocytów i co z tym się łączy, wyciszania powstawania reakcji

alergicznych (Kozakova el al., 2016).

Osobny rozdział badań, który niedawno zapoczątkowałam w naszej grupie

badawczej, stanowią publikacje dotyczące charakterystyki bakteriocyn. Bakteriocyny są

substancjami, w których pokłada się duże nadzieje w walce z bakteriami patogennymi, w

związku z ich wydajnym działaniem przeciwbakteryjnym. Gruntowne badania tych ciągle słabo

poznanych związków mogą umożliwić ich szersze zastosowania jako naturalnych

konserwantów żywności, i poza tym w farmacji lub nawet medycynie. W badaniach, w których

uczestniczyłam m. in. zidentyfikowaliśmy metalo-zależną proteazę jako nowy błonowy

receptor, z którym wiążą się niemodyfikowane potranslacyjnie bakteriocyny enterocyna K1

oraz LsbB, oddziałując na Enterococcus faecium oraz Lactococcus lactis (Ovchinnikov el al.,

2017; Uzelac el al., 2013).

Kolejne prace stanowią zbiór poświęcony globalnym badaniom fenotypowym

szerokiej grupy mikroorganizmów. Badania były prowadzone w oparciu o technikę


22

mikromacierzy fenotypowych (Biolog®), która pozwala na określenie aktywności

metabolicznej komórek w odpowiedzi na obecność 2000 różnorodnych substratów /

warunków. W ramach tych badań oszacowano fenotypy szeregu bakterii izolowanych z

środowisk polarnych (Gawor el al., 2016; Grzesiak el al., 2015a i 2015b) oraz grzybów z rzędu

pleśniakowców (Mucorales) (Pawłowska el al., 2016).

Moje zainteresowanie genetycznym aspektami adherencji szczepów zaowocowało

kilkoma pracami, wśród których dwie opisują plazmidy jako źródło genów kodujących białka

zaangażowane w adhezję. W pierwszej z nich (Aleksandrzak-Piekarczyk el al., 2016)

zidentyfikowano w probiotycznym szczepie polskiego pochodzenia Lactobacillus casei LOCK

0919 unikatowy plazmid niosący geny spaCBA kodujące białka pilusa. Wyjątkowość tego

odkrycia stanowi fakt, iż wszystkie opisane dotychczas geny kodujące struktury pilusa mają

chromosomową lokalizację i w dodatku większość z nich jest niefunkcjonalna, natomiast w

przypadku Lactobacillus casei LOCK 0919 udowodniliśmy ich rolę w adhezji gospodarza do

powierzchni biotycznych i abiotycznych. W kolejnej pracy (Radziwill-Bienkowska el al., 2016)

opisaliśmy genom i scharakteryzowaliśmy plazmidowo zlokalizowane determinanty

warunkujące adhezję bakterii z rodzaju Lactococcus lactis. Jest to ciekawe odkrycie ze względu

na fakt, iż wśród grupy bakterii fermentacji mlekowej zdolność do adhezji występuje głownie

u bakterii z rodzaju Lactobacillus, a u Lactcococcus lactis jest unikatowa.

Dwie pozostałe prace (Aleksandrzak-Piekarczyk 2005; 2011) dotyczą

funkcjonowanie i regulacji genów metabolizmu cukrów u Lactococcus lactis ze szczególnym

uwzględnieniem katabolizmu laktozy i celobiozy i ze względu na ich związek z tematem

wniosku habilitacyjnego zostały opisane w Autoreferacie.

Dla publikacji podano pięcioletni IF (IF5). IF czasopisma i liczbę cytowań podano

głównie wg wskazań WoS Core Collection. W przypadku braku czasopisma w bazie WOS, liczbę

cytacji podano za bazą Scopus i wskazano to właściwą informacją. Przy wydawnictwach

konferencyjnych pominięto IF czasopisma (zgodnie z Oświadczeniem Ministra Nauki I

Szkolnictwa Wyższego w sprawie naruszania zasad dobrej praktyki naukowej przy stosowaniu

bibliometrycznego wskaźnika impact factor do oceny dorobku jednostek naukowych z

11.07.2008).

* - autor korespondencyjny

1. Gientka I, Aleksandrzak-Piekarczyk T, Bzducha-Wróbel A, Synowiec A, Błażejak S

Deproteinated potato wastewater as a sustainable nitrogen source in Trichosporon

domesticum yeast lipids biosynthesis—a concept of valorization of wastewater from

starch industry.

Potato Research. 2019. pp 1–17

IF5: 1,089 / Liczba cytowań: 0


23

2. Aleksandrzak-Piekarczyk T, Puzia W, Żylińska J, Cieśla J, Gulewicz KA, Bardowski JK,

Górecki RK

Potential of Lactobacillus plantarum IBB3036 and Lactobacillus salivarius IBB3154 to

persistence in chicken after in ovo delivery.

Microbiologyopen. 2019. 8(1):e00620


3. Kobierecka PA, Wyszyńska AK, Aleksandrzak-Piekarczyk T, Kuczkowski M, Tuzimek A,

Piotrowska W, Górecki A, Adamska I, Wieliczko A, Bardowski J, Jagusztyn-Krynicka EK

In vitro characteristics of Lactobacillus spp. strains isolated from the chicken digestive

tract and their role in the inhibition of Campylobacter colonization.

MicrobiologyOpen. 2017. 6(5)


4. Ovchinnikov KV, Kristiansen PE, Straume D, Jensen MS, Aleksandrzak-Piekarczyk T,

Nes IF, Diep DB

The leaderless bacteriocin enterocin K1 is highly potent against Enterococcus faecium: a

study on structure, target spectrum and receptor.

Frontiers in Microbiology. 2017. 8:774


5. Aleksandrzak-Piekarczyk T*, Koryszewska-Bagińska A, Grynberg M, Nowak A,

Cukrowska B, Kozakova H, Bardowski J

Genomic and functional characterization of the unusual pLOCK 0919 plasmid harboring the

spaCBA pili cluster in Lactobacillus casei LOCK 0919.

Genome Biology and Evolution. 2016. 8 (4)


6. Kozakova H, Schwarzer M, Tuckova L, Srutkova D, Czarnowska E, Rosiak I, Hudcovic T,

Schabussova I, Hermanova P, Zakostelska Z, Aleksandrzak-Piekarczyk T, Koryszewska-

Baginska A, Tlaskalova-Hogenova H, Cukrowska B

Colonization of germ-free mice with a mixture of three lactobacillus strains enhances the

integrity of gut mucosa and ameliorates allergic sensitization.

Cellular & Molecular Immunology. 2016. 13:251–262


7. Radziwill-Bienkowska JM, Doan Thanh Lam Le, Szczesny P, Duviau M-P, Aleksandrzak-

Piekarczyk T, Bardowski J, Loubière P, Mercier-Bonin M, Kowalczyk M

Adhesion of the genome-sequenced Lactococcus lactis subsp. cremoris IBB477 strain is

mediated by specific molecular determinants.

Applied Microbiology and Biotechnology. 2016. 100(22):9605-9617



24

8. Pawłowska J, Aleksandrzak-Piekarczyk T, Banach A, Kiersztyn B, Muszewska A, Serewa

L, Szatraj K, Wrzosek M

Preliminary studies on the evolution of carbon assimilation abilities within Mucorales.

Fungal Biology. 2016. 120(5):752-63


9. Gawor J, Grzesiak J, Sasin-Kurowska J, Borsuk P, Gromadka R, Górniak D, Świątecki A,

Aleksandrzak-Piekarczyk T, Zdanowski MK

Evidence of adaptation, niche separation and microevolution within the genus

Polaromonas on Arctic and Antarctic glacial surfaces.

Extremophiles. 2016. 20:403


10. Grzesiak J, Górniak D, Świątecki A, Aleksandrzak-Piekarczyk T, Szatraj K, Zdanowski M

Microbial community development on the surface of Hans and Werenskiold Glaciers

(Svalbard, Arctic): a comparison.

Extremophiles; 2015a. 19(5):,885–897


11. Grzesiak, J, Zdanowski, MK, Górniak D, Świątecki A, Aleksandrzak-Piekarczyk T, Szatraj

K, Sasin-Kurowska J, Nieckarz M

Microbial community changes along the Ecology Glacier ablation zone (King George Island,

Antarctica).

Polar Biology. 2015b. 38:2069


12. Zycka-Krzesinska J, Boguslawska J, Aleksandrzak-Piekarczyk T, Jopek J, Bardowski J

Identification and characterization of tetracycline resistance in Lactococcus lactis isolated

from Polish raw milk and fermented artisanal products.

International Journal of Food Microbiology. 2015. 211(15):134–141


13. Uzelac G, Kojic M, Lozo J, Aleksandrzak-Piekarczyk T, Gabrielsen C, Kristensen T, Nes

F, Diep B, Topisirovic L

A Zn-dependent metallopeptidase is responsible for sensitivity to LsbB, a class II leaderless

bacteriocin of Lactococcus lactis subsp. lactis BGMN1-5.

Journal of Bacteriology. 2013. 195(24):5614-21.



!Ą. Aleksandrzak-Piekarczvk T*, Polak J, Jezierska B, Renault P, Bardowski J

Genetic characterization of the CcpA-dependent, cellobiose-specific PTS system comprising

CelB, PtcB and PtcA that transports lactose in Lactacoccus lactis lL1403.

lntern ational Jotlrnal of Food M icrobi ology. 2011. t45 :t86-L9 4

lFs: 3,972 / Liczba cytowań: 24

15. Aleksandrzak-Piekarczyk T, Kok J, Renau|t P, Bardowski J

Alternative lactose catabolic pathway in Loctococcus lactis lL1403.

Applied and Environmental Microbiology. 2005, 71(10):6060-5069,

IFs: 4,272 / Liczba cytowań: 25

Recenzowane doniesienia konferencvine:

16. Szatraj K, Bardowski J, Aleksandrzak-Piekarczvk T*

YebF {ClaR) - a novel positive regulator and its role in the regulation of the celB, ptcB, ptcA

and bglS lactose and cellobiose assimilation genes in Lactococcus lactis IL1"4a3.

FEBS JOU§NAL, 2012, ż7 9|1):ż82-ż8ż

17. Koryszewska-Baginska, A, BardowskiJ,Aleksandrzak-PiekarczykT*The analysis of putative antiallergic potential of three Lactobacillus strains in the global

phenotypic approach,

FEBS JOURN.AL. 2012, 279(1}:108-109

5.2. Prace opublikowane przed uzyskaniem stopnia doktora:

18. Aleksandrzak T, Kowalczyk M, Kok J, Bardowski J

Regulation of carbon catabolism ln Lactococcus lactis.

ln: S, Bielecki, J.Tramper, J.Polak (eds.) - Food BiotechnologyProgress in Biotechnology. 2000, 17:61-66

Liczba cytawań: 7

ż5

D r Ta ma ra Aleksa n d rza k- Piekó rczyk

Documents

Struktura, funkcjonowanie i regulacja systemów metabolizmu … w... · 2019-05-22 · trzy. Białko EIIC (permeaza) zakotwiczone jest w błonie komórkowej i umożliwia specyficzny